WO2020090903A1 - 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 Download PDF

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pluripotent stem
stem cells
laminin
differentiation
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浩之 江藤
明憲 杠
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国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pluripotent stem cells in which resistance to differentiation into mesendoderm lineage is released. More specifically, the present invention includes the treatment of pluripotent stem cells to a treatment that activates the signaling pathways mediated by the integrins ⁇ 1 and ⁇ -catenin, in which the resistance to differentiation into the mesendoderm lineage is released. The present invention relates to a method for producing a potent stem cell.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • differentiability the reason has not been clarified. .. It was required to verify whether the factor of the difference in the easiness of differentiation from iPS cells to blood cells is the characteristics of the cell line itself or the extracellular environment.
  • the present inventors have previously cultured pluripotent stem cells on various laminin used as an extracellular matrix in feeder-free culture, and found that pluripotent stem cells maintained on laminin 511 were resistant to differentiation into mesoendoderm lineage. In contrast, it was found that pluripotent stem cells maintained on laminin 421 or laminin 121 released this differentiation resistance and tended to be easily differentiated into mesendoderm lineage, particularly blood cells. Further, in the pluripotent stem cells maintained on the above specific laminin and in which the differentiation resistance to the mesoendoderm lineage was released, the expression of the downstream gene group of the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway is increased. Have also been found (Patent Document 1). This finding is consistent with previous reports that activation of Wnt / ⁇ -catenin signals is important for mesoderm and blood differentiation from ES cells and epiblasts (for example, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the object of the present invention is to elucidate the mechanism by which a specific laminin cancels the differentiation resistance of the pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage, and from the pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage, particularly to blood cells, It is to provide a more efficient method of inducing differentiation.
  • Another object of the present invention is to provide means for evaluating the easiness of differentiation of pluripotent stem cell clones into mesoendoderm lineages by utilizing the mechanism.
  • the present inventors considered that it is important to activate the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway in order to cancel the differentiation resistance of pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage. Therefore, first, pluripotent stem cells were maintained and cultured at the recommended concentration of laminin 511 in the presence of an inhibitor of GSK3 ⁇ that phosphorylates ⁇ -catenin and promotes constitutive degradation by the ubiquitin proteasome system. It was found that the induction of differentiation improved the differentiation ability and increased the number of hematopoietic progenitor cells.
  • ITGB1 integrin ⁇ 1
  • laminin receptor a cell surface protein known as a laminin receptor
  • Pluripotent stem cells maintained on laminin 421 or laminin 121 and low pluripotency maintained on laminin 511 with low ability to induce differentiation into hematopoietic progenitor cells (herein also referred to as "non-hematopoietic")
  • ITGB1 changes the amount of ⁇ -catenin accumulated via ILK / pGSK3 ⁇ and regulates the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway.
  • the amount of ILK / pGSK3 ⁇ / ⁇ -catenin was compared between pluripotent stem cells maintained on laminin 421 and laminin 121 and pluripotent stem cells maintained on laminin 511. As a result, it was revealed that the former had a higher amount of ILK / pGSK3 ⁇ / ⁇ -catenin and consequently the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway was activated.
  • Hematopoietic laminin 421 and laminin 121 both contain ⁇ 2 and ⁇ 1 as ⁇ and ⁇ subunits, but hematopoietic progenitor cells were induced from pluripotent stem cells maintained on laminin 321 which also contained ⁇ 2 and ⁇ 1. Therefore, the mechanism other than the combination of ⁇ subunits was considered.
  • the present inventors have a tendency that hematopoietic laminin 421 and laminin 121 have weaker cell-matrix adhesion than non-hematopoietic laminin 511. I was finding that.
  • pluripotent stem cells maintained on serially diluted laminin 511 were induced to differentiate into hematopoietic progenitor cells, the differentiation potential was improved compared to the pluripotent stem cells maintained at the recommended concentration, and the number of hematopoietic progenitor cells increased.
  • pluripotent stem cell clones did not show differentiation resistance even when maintained at the recommended concentration of laminin 511. It was revealed that pluripotent stem cells that do not show such differentiation resistance have sufficient expression of ITGB1 on laminin 511 of any dilution series.
  • ITGB1 which is a cell surface molecule as an index
  • the present inventors also found that when the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway was activated using the aforementioned GSK3 ⁇ inhibitor, cells that maintain pluripotency before initiation of induction of differentiation into hematopoietic progenitor cells.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of further research based on these findings.
  • the present invention provides the following.
  • a method for producing pluripotent stem cells in which resistance to differentiation into mesoendoderm lineage is released which comprises subjecting pluripotent stem cells to treatment for activating the integrin ⁇ 1- ⁇ -catenin signal transduction pathway.
  • the method according to [1] wherein the pluripotent stem cells are further deprived of resistance to differentiation into mesodermal lineage.
  • the pluripotent stem cells are further deprived of resistance to blood cell differentiation.
  • the activation treatment is to bring pluripotent stem cells into contact with laminin 511 or its fragment corresponding to 0.005 to 0.25 ⁇ g / cm 2 in terms of laminin 511 E8 fragment, [1] to [3] The method according to any one of 1.
  • the activation treatment is to bring pluripotent stem cells into contact with laminin 511 or its fragment corresponding to 0.03 to 0.07 ⁇ g / cm 2 in terms of laminin 511 E8 fragment, [1] to [3] The method according to any one of 1.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein 90% or more of pluripotent stem cells are Oct3 / 4 positive and Sox2 positive.
  • [7] The method according to any one of [1] to [3], wherein the activation treatment is contacting pluripotent stem cells with a GSK3 ⁇ inhibitor for 2 to 5 days.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the pluripotent stem cells are of human origin.
  • [9] (1) A step of producing pluripotent stem cells in which resistance to differentiation into mesendoderm lineage is released by the method according to any one of [1] to [8], and step (2)
  • the method for producing mesodermal or endodermal cells which comprises a step of inducing differentiation of the cells obtained in 1) into mesodermal or endodermal cells.
  • mesodermal cells are blood cells, vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, chondrocytes, renal cells, cardiomyocytes or adipocytes.
  • mesodermal cells are blood cells.
  • the endodermal cells are pancreatic ⁇ cells, hepatocytes, intestinal cells, lung cells or thyroid cells.
  • a method for evaluating differentiation resistance of the pluripotent stem cells to the mesoendodermal lineage which comprises measuring the expression level of integrin ⁇ 1 in the pluripotent stem cells.
  • the present invention by activating the integrin ⁇ 1 (ITGB1) - ⁇ -catenin signaling pathway, it is possible to cancel the differentiation resistance of pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage. It is possible to provide pluripotent stem cells suitable for inducing differentiation of cells of the lineage. In particular, by diluting laminin 511 or a fragment thereof to a concentration lower than the recommended concentration, it is possible to cancel the differentiation resistance of pluripotent stem cells to mesoendoderm lineage, thus reducing the cost and efficiency of maintenance culture. And differentiation induction can be achieved at the same time.
  • the present invention it is possible to cancel the differentiation resistance to the mesendoderm lineage while sufficiently maintaining the pluripotency of the pluripotent stem cells, so the induction of differentiation into mesendoderm lineage cells is possible. It can be done more efficiently. Further, according to the present invention, the differentiation resistance of pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage can be easily evaluated using the expression level of ITGB1 as an index.
  • FIG. 2 shows that pluripotent stem cells (PSCs) maintained and cultured on laminin 511E8 fragment (LM511) show resistance to hematopoietic differentiation.
  • FIG. 7 is a diagram showing that treatment with a Wnt signal agonist (GSK3 ⁇ inhibitor) releases the differentiation resistance of PSCs cultured and maintained on LM511 to hematopoietic progenitor cells.
  • FIG. 2 shows that PSCs cultured and maintained on hematopoietic laminin highly express integrin ⁇ 1 (ITGB1).
  • FIG. 7 Hematopoietic laminin activates ITGB1- ⁇ -catenin signaling.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the LM511 concentration used for maintenance culture of PSCs (AK5) and ITGB1 expression in the PSCs.
  • FIG. 3 is a diagram showing that PSCs (AK5) maintained and cultured on a diluted LM511 highly express ITGB1 and efficiently induce differentiation into hematopoietic progenitor cells.
  • GSK3 ⁇ inhibitors prevents maintenance of pluripotency of PSCs, whereas maintenance of PSCs on diluted LM511 or LM421 / LM121 can achieve both maintenance of pluripotency and release of differentiation resistance. It is a figure.
  • hematopoietic laminin 421 and laminin 121 have weaker cell-matrix adhesion than non-hematopoietic laminin 511.
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • B relative expression level of
  • C number of HPCs and ITGB1 expression level of three types of PSCs maintained and cultured on a dilution series of LM511 It is a figure which shows a relationship.
  • the present invention relates to a method for canceling differentiation resistance of pluripotent stem cells to mesoendoderm lineage, that is, with the differentiation resistance canceled.
  • a method for producing a competent stem cell hereinafter referred to as "the production method (I) of the present invention" is provided. Therefore, it is preferable that the pluripotent stem cells used in the production method (I) of the present invention have differentiation resistance.
  • differentiation resistance means the property of being difficult to differentiate into the desired cells when the pluripotent stem cells are induced to differentiate into the desired cells.
  • “Differentiation resistance to mesendoderm” in the present invention refers to, for example, a recommended concentration (0.5 ⁇ g / cm 2 in terms of laminin 511 E8 fragment) of laminin 511 or a human iPS cell line AK5 (mainly cultured on the fragment thereof). Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014) is difficult to differentiate into the desired cells when differentiated into mesendoderm cells, or the amount equal to or higher than that. It can be expressed as difficulty. Whether or not the pluripotent stem cells have differentiation resistance can be determined by the “evaluation method of the present invention” described below.
  • the differentiation resistance is released means that the efficiency of differentiation into desired cells is significantly increased as compared with that before the release treatment. Preferably, it means that the efficiency of differentiation into desired cells is increased by 2 times or more, more preferably 4 times or more, further preferably 8 times or more as compared with that before the release treatment.
  • mesoderm line is used to include mesodermal cells and endodermal cells, and mesendoderm cells that are a common precursor of both. Therefore, “eliminating the differentiation resistance to the mesendoderm lineage” means at least increasing the efficiency of differentiation from pluripotent stem cells to mesendoderm cells as compared with before the desensitization treatment.
  • a pluripotent stem cell in which at least further differentiation resistance to mesodermal cells, more preferably at least further differentiation resistance to blood cells, is released is obtained. Provided.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are not particularly limited as long as they are undifferentiated cells having “self-renewal ability” capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and “pluripotent pluripotency” capable of differentiating into all three germ layer lineages.
  • embryonic stem (ES) cells and iPS cells embryonic germ (EG) cells derived from primordial germ cells, mutipotent germline stem (isolated in the process of establishing GS cells from testis tissue mGS) cells, multipotent adult progenitor cells (MAPC) isolated from bone marrow, MUSE cells and the like.
  • the ES cell may be an ES cell generated by nuclear reprogramming from a somatic cell. ES cells or iPS cells are preferred.
  • Pluripotent stem cells may be derived from mammals, preferably human-derived pluripotent stem cells.
  • ES cells can be established by removing an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized mammalian egg and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, the maintenance of cells by subculture, leukemia inhibitory factor (leukemia inhibitory factor (LIF)), basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor (bFGF)) using a culture medium added substances such as It can be carried out.
  • leukemia inhibitory factor leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a culture medium added substances such as It
  • human ES cell lines for example, WA01 (H1) and WA09 (H9), from WiCell Reserch Institute, KhES-1, KhES-2, KhES-3 and KthES11, Kyoto University Institute for Virus and Regenerative Medicine ( (Kyoto, Japan).
  • iPS cells can be produced by introducing a specific reprogramming factor into somatic cells in the form of DNA or protein, and have almost the same characteristics as ES cells, such as pluripotency and proliferative capacity by self-renewal, It is an artificial stem cell derived from somatic cells that has (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu, et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); WO 2007/069666).
  • embryonic cell means any animal cell (preferably a mammalian cell including human) excluding germline cells such as eggs, oocytes, ES cells or totipotent cells, and fetuses (pups). ) Somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, and also includes primary cultured cells, passaged cells, and established cells. To be done.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells (somatic stem cells) such as dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (exocrine pancreatic cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells And differentiated cells such as adipocytes.
  • neural stem cells hematopoietic stem cells
  • mesenchymal stem cells such as dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells such as dental pulp stem cells
  • lymphocytes epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.)
  • hair cells hepatocytes
  • gastric mucosal cells intestinal cells
  • somatic cells should be collected from the patient or another person with the same or substantially the same HLA type from the viewpoint that no rejection reaction occurs.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from the somatic cell-derived iPS cells are transplanted into a patient by the use of an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are It means that the HLA types are matched to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci including HLA-C) is the same can be mentioned.
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, or a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be composed of a low molecular weight compound.
  • a gene contained in the reprogramming factor for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15.
  • Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1 and the like are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the pluripotent stem cells can be maintained and cultured immediately after their production in a state in which the resistance to differentiation into the mesendoderm lineage has been canceled by the production method (I) of the present invention, but before being subjected to the production method (I) of the present invention
  • maintenance culture can be performed by a method known per se.
  • the basic medium for maintenance culture include Neurobasal medium, Neural Progenitor Basal medium, NS-A medium, BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, minimum essential medium (MEM), Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified medium.
  • DMEM fetal bovine serum
  • IMDM IMDM medium
  • Medium 199 medium DMEM / F12 medium
  • ham medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium a commercially available medium for pluripotent stem cells (eg StemFit, AK02N, Essential 8 etc.) may be used.
  • the medium can be serum-containing medium or serum-free medium.
  • serum-free medium can be used.
  • Serum-free medium (SFM) means a medium that does not contain untreated or unpurified serum, and thus includes a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (growth factors, etc.). Can be done.
  • the concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum etc.
  • the concentration of serum is 0 to 20%, preferably 0 to 5%, more preferably 0 to 2%, most preferably 0% (that is, serum-free).
  • the SFM may or may not contain any serum replacement.
  • serum substitutes examples include albumin (eg, albumin substitutes such as lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolysates), transferrin (or other iron transporter), fatty acid, insulin , A collagen precursor, a trace element, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol, or an equivalent thereof may be included.
  • albumin eg, albumin substitutes such as lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolysates
  • transferrin or other iron transporter
  • fatty acid insulin
  • insulin e.g., transferrin (or other iron transporter)
  • a collagen precursor, a trace element, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol, or an equivalent thereof may be included.
  • Such a serum substitute can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product can be used. Examples of such commercially available substances
  • the medium may contain other additives known per se.
  • growth factors such as insulin
  • polyamines such as putrescine
  • minerals such as sodium selenate
  • sugars such as glucose
  • organic acids such as pyruvic acid and lactic acid
  • Amino acids eg non-essential amino acids (NEAA), L-glutamine etc.
  • reducing agents eg 2-mercaptoethanol etc.
  • vitamins eg ascorbic acid, d-biotin etc.
  • steroids eg [beta]) -Estradiol, progesterone etc.
  • antibiotics eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.
  • buffers eg HEPES etc.
  • nutritional additives eg B27 supplement, N2 supplement, StemPro-Nutrient Supplement etc.
  • Pluripotent stem cells may be cultured in the presence or absence of feeder cells, but many feeder cells that can be used for culturing pluripotent stem cells such as ESC and iPSC are themselves pluripotent. Since it is possible to cancel the differentiation resistance of the sex stem cells to the mesendoderm lineage, it is often unnecessary to use the production method (I) of the present invention. In consideration of clinical application to humans, pluripotent stem cells are preferably cultured in the absence of feeder cells. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, pluripotent stem cells are cultured under feeder-free conditions.
  • the incubator used for culturing the pluripotent stem cells is not particularly limited, but is not limited to flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, microwell plates, multi-culture plates. Plates, multiwell plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles can be mentioned.
  • the incubator can be cell adhesive.
  • the cell-adhesive incubator may be coated with any cell-adhesive substrate such as extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving the adhesion of the incubator surface to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the substrate for cell adhesion can be any substance intended to adhere pluripotent stem cells or feeder cells (if used).
  • Substrates for cell adhesion include laminin, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ornithine, and fibronectin and mixtures thereof such as matrigel, and lysed cell membrane preparation. preparations) (Klimanskaya I et al 2005. Lancet365: p1636-1641). These cell-adhesive substrates are coated on an incubator at a concentration usually used for culturing pluripotent stem cells, depending on their type.
  • pluripotent stem cells are seeded on the above incubator, for example, at a cell density of about 10 4 to 10 5 cells / cm 2 , and in an incubator under an atmosphere of 1-10% CO 2 / 99-90% air. Incubation can be carried out at about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the medium can be replaced during the culture period.
  • the medium used for medium exchange may be a medium having the same components as the medium before the medium exchange or a medium having different components.
  • a medium having the same components is used.
  • the timing of medium exchange is not particularly limited, but is, for example, every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, or every 5 days after the culture in a fresh medium is started.
  • the production method (I) of the present invention is characterized in that pluripotent stem cells are treated to activate the integrin ⁇ 1- ⁇ -catenin signal transduction pathway. By this treatment, differentiation resistance of pluripotent stem cells to the mesoendoderm lineage can be released.
  • integrin ⁇ 1- ⁇ -catenin signaling pathway means that integrin ⁇ 1 (ITGB1) activates integrin-binding kinase (ILK) in response to stimulation from a binding ligand, and activated ILK activates glycogen synthase.
  • IGB1 integrin ⁇ 1
  • ILK integrin-binding kinase
  • GSK3 ⁇ 9th Ser of kinase 3 ⁇
  • Wnt / ⁇ - It means a pathway in which the catenin signaling pathway is activated and expression of a gene downstream thereof is induced.
  • Examples of the treatment for activating the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway include a treatment for increasing the expression of ITGB1 in pluripotent stem cells and / or a treatment for changing ITGB1 to the activated state.
  • Such treatment preferably includes, but is not limited to, contacting the pluripotent stem cells with a binding ligand of ITGB1 at a concentration capable of imparting sufficient ITGB1 expression to the pluripotent stem cells. ..
  • the binding ligand of ITGB1 is not particularly limited as long as it can impart an expression level of ITGB1 sufficient to activate the ITGB1- ⁇ -catenin signal transduction pathway in a specific concentration range, for example, when using a laminin 511 or a fragment thereof to pluripotent stem cells having differentiation-resistant, laminin 511 E8 fragment terms 0.005 ⁇ 0.25 [mu] g / cm 2 (recommended concentration 0.5 [mu] g / cm 2 of 1 / 100-1 / 2), Corresponding to 0.025 to 0.125 ⁇ g / cm 2 (1/20 to 1/4 of the recommended concentration), more preferably 0.03 to 0.07 ⁇ g / cm 2 (about 1/16 to 1/7 of the recommended concentration) By contacting the pluripotent stem cells at a concentration, the resistance of the pluripotent stem cells to differentiation into the mesendoderm lineage can be released.
  • the recommended concentration of laminin 511 can be preferably used.
  • the fragment of laminin 511 is not particularly limited as long as it has the same adhesive strength to ITGB1 as intact laminin 511, but it is preferably a fragment containing at least the region of E8 fragment.
  • laminin 411 laminin 411, laminin 311, laminin 111 and fragments thereof
  • ITGB1 non-laminin binding ligands for ITGB1 (eg collagen, fibronectin, E-cadherin, ADAM etc.) in the pluripotent stem cells of interest.
  • concentration that gives an expression level of ITGB1 sufficient to activate the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway can be appropriately selected.
  • the contact between the ITGB1 binding ligand and pluripotent stem cells is performed by coating the surface of the incubator used for maintaining and culture of pluripotent stem cells with the binding ligand as a substrate for cell adhesion, and The cells can be seeded with pluripotent stem cells and maintained in the same manner as above.
  • laminin 511 or a fragment thereof when laminin 511 or a fragment thereof is used as a binding ligand of ITGB1 and is applied to pluripotent stem cells having differentiation resistance, 0.005 to 0.25 ⁇ g / cm 2 in terms of laminin 511 E8 fragment (recommended concentration 0.5 ⁇ g / cm 2 of 1 / 100-1 / 2), preferably, 0.025 ⁇ 0.125 ⁇ g / cm 2 ( 1/20 ⁇ 1/4 of the recommended concentration), more preferably, 0.03 ⁇ 0.07 ⁇ g / cm 2 (recommended concentration Add a solution of laminin 511 or a fragment thereof to the incubator to a concentration equivalent to about 1/16 to 1/7) and leave it for a certain period of time to allow it to remain on the surface of the incubator for laminin 511 or a fragment thereof. Can be coated.
  • the contact time between the ITGB1 binding ligand and pluripotent stem cells is not particularly limited as long as it is sufficient to activate the ITGB1- ⁇ -catenin signal transduction pathway, for example, 2 days or more, preferably 3 days or more. is there.
  • the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway is activated by contacting ITGB1 with a binding ligand, pluripotency occurs during contact, that is, throughout the culture period in an incubator coated with the ligand as a substrate for cell adhesion. Since the number of cells that retain pluripotency in the stem cell population is maintained sufficiently (90% of the cells positive for both Oct3 / 4 and Sox2, preferably 95% or more of the total), there is no upper limit to the contact time.
  • the treatment for activating the ITGB1- ⁇ -catenin signal transduction pathway includes, for example, ITGB1 expression promoters (e.g., hibamata, rosemary, kiwi, fukuro, burdock, carrot or kouzo).
  • Extract JP-A-11-246428
  • substances that inhibit the expression / function of substances that suppress ITGB1 expression eg, ZFYVE21, miR-29C, miR-124, etc.
  • substances that inhibit the expression / function of substances that suppress ITGB1 expression eg, ZFYVE21, miR-29C, miR-124, etc.
  • substances that inhibit the expression / function of substances that suppress ITGB1 expression eg, ZFYVE21, miR-29C, miR-124, etc.
  • antibodies, antisense nucleic acids, siRNA or shRNA eg, antibodies, antisense nucleic acids, siRNA or shRNA
  • a nucleic acid encoding ITGB1 e.g
  • the treatment for activating the ITGB1- ⁇ -catenin signal transduction pathway is a treatment for increasing the expression of ILK in pluripotent stem cells and / or changing the ILK to an activated state.
  • a nucleic acid encoding ILK e.g., a constitutive activator of ILK (e.g., by adding a myristoylation signal sequence to the N-terminus of ILK, or by adding a CaaX motif to the C-terminus, (It can be a membrane-localized constitutive activator) is introduced into pluripotent stem cells.
  • the treatment for activating the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway includes inhibiting GSK3 ⁇ activity in pluripotent stem cells, particularly the activity of phosphorylating ⁇ -catenin. .. GSK3 ⁇ phosphorylates ⁇ -catenin and promotes constitutive degradation by the ubiquitin proteasome system.Inhibiting GSK3 ⁇ causes intracellular ⁇ -catenin to accumulate, resulting in activation of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway. Be converted.
  • a method of inhibiting GSK3 ⁇ activity for example, a method of contacting pluripotent stem cells with a small molecule GSK3 ⁇ inhibitor, a method of contacting a peptide mimicking the target phosphorylation site of ⁇ -catenin to pluripotent stem cells, etc.
  • a method using a low molecular weight GSK3 ⁇ inhibitor is preferable.
  • a GSK-3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (eg, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many are already known.
  • Lithium chloride (LiCl) which was first discovered as a -3 ⁇ inhibitor
  • BIO also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime
  • SB216763 which is a maleimide derivative.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a cell membrane-permeable phosphorylated peptide L803-mts (also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH 2 ), and CHIR99021 (6- [2 -[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin-2-ylamino] ethylamino] pyridine-3 -carbonitrile). These compounds are commercially available from Calbiochem, Biomol, etc., for example.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor may preferably be CHIR99021.
  • Contact of pluripotent stem cells with a GSK3 ⁇ inhibitor can be performed by culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor added to the medium varies depending on the type of drug, for example, in the case of CHIR99021, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, It is, but not limited to, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, 50 ⁇ M and the like. It is preferably 5 ⁇ M or more (eg, 5 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 5 ⁇ M to 10 ⁇ M).
  • the contact between the pluripotent stem cells and the GSK3 ⁇ inhibitor can be performed for 2 to 5 days, preferably 3 to 4 days.
  • the present invention also comprises any of the above substances that activate the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway.
  • the present invention also provides a reagent for canceling differentiation resistance of pluripotent stem cells to mesoendoderm lineage.
  • the substance that activates the ITGB1- ⁇ -catenin signaling pathway is a binding ligand of ITGB1 at a concentration capable of imparting a sufficient expression level of ITGB1 to pluripotent stem cells.
  • the binding ligand is preferably provided in the form of an incubator coated with it.
  • the present invention also provides a culture kit (hereinafter, also referred to as “the kit of the present invention”) for canceling the differentiation resistance of pluripotent stem cells to mesoendoderm lineage, which comprises the incubator as a component. To do.
  • the incubator coated with the binding ligand contained in the kit of the present invention for example, when the binding ligand is laminin 511 or a fragment thereof, 0.005 to 0.25 ⁇ g / cm 2 in terms of laminin 511 E8 fragment (recommended concentration 0.5 ⁇ g / cm 2 2 of 1 / 100-1 / 2), preferably, 0.025 ⁇ 0.125 [mu] g / cm 2 (recommended concentration 1/20 to 1/4), more preferably, from about 0.03 ⁇ 0.07 ⁇ g / cm 2 (recommended concentration An incubator coated with laminin 511 or a fragment thereof corresponding to 1/16 to 1/7) can be mentioned.
  • the incubator those described above as the incubator for the maintenance culture of pluripotent stem cells can be similarly used.
  • the kit of the present invention can further contain a medium, medium additives, reagents for detaching cells from the incubator and dissociating cell-cell adhesion for transferring cells to subculture or differentiation-inducing culture.
  • the present invention also provides a pluripotent stem cell in which the resistance to differentiation into the mesendoderm cell, which is produced by the above-mentioned production method (I) of the present invention, is released.
  • the method for producing mesodermal or endodermal cells (hereinafter, also referred to as “production method (II) of the present invention”), which comprises the step of inducing differentiation into mesodermal or endodermal cells. Since the pluripotent stem cells produced by the production method (I) of the present invention have the resistance to differentiation into mesoendodermal lineages canceled, they can be efficiently induced to differentiate into mesodermal or endoderm lineage cells. it can.
  • the mesodermal cells that can be produced by the production method (II) of the present invention may be any cells belonging to the mesodermal system, as long as a differentiation induction system from pluripotent stem cells is established.
  • Examples include blood cells, vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, chondrocytes, kidney cells, cardiomyocytes, adipocytes and the like.
  • blood cell means any cell contained in blood that differentiates from hematopoietic stem cells, such as erythrocyte, platelet, neutrophil, eosinophil, basophil, macrophage, NK cell, and dendritic cell. , T cells, B cells, and their progenitor cells.
  • the endoderm line cells that can be produced by the production method (II) of the present invention may be any cells belonging to the endoderm lineage as long as a differentiation induction system from pluripotent stem cells is established. Examples include pancreatic ⁇ cells, hepatocytes, intestinal cells, lung cells, cells such as thyroid cells, or their precursor cells.
  • mesodermal and endodermal systems use mesendoderm cells as a common precursor. Therefore, differentiation into mesendoderm cells is induced in the early stage of the step of inducing differentiation into mesoderm or endoderm cells. Differentiation into mesendoderm cells can be confirmed by examining the expression of mesoendoderm markers such as T, Foxa2, Gsc, and Mixl1.
  • the pluripotent stem cells obtained by the production method (I) of the present invention are particularly excellent in the efficiency of differentiation into blood cells. Therefore, in a preferred embodiment, the mesodermal cells produced in the production method (II) of the present invention are blood cells.
  • the method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to hematopoietic progenitor cells include the PSC-Sac method, which is a co-culture method with mouse stromal cells C3H10TR (Takayama and Eto Methods Mol Mol Biol. 2012; 788; : 205-17, Takayama et.al. J Exp.Med. 2010207 (13): 2817-2830).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • MMC mitomycin C
  • hematopoietic progenitor cells obtained as described above can be further differentiated into various blood cells by a method known per se.
  • WO2018 / 038242 details the method of inducing differentiation into megakaryocyte progenitor cells and platelets.
  • the present invention also comprises measuring the expression level of ITGB1 in pluripotent stem cells, a method for evaluating the differentiation resistance of the pluripotent stem cells to the mesoendoderm line (hereinafter, "the evaluation method of the present invention Also referred to as ".”
  • the pluripotent stem cells used in the evaluation method of the present invention are those whose resistance to differentiation into the mesendoderm lineage is unknown.
  • the expression level of ITGB1 can be measured, for example, by contacting a test pluripotent stem cell with a fluorescently labeled anti-ITGB1 antibody to visualize ITGB1-expressing cells, and then by image analysis using flow cytometry or a fluorescence microscope. it can.
  • the ITGB1 expression level obtained was compared with a control expression level (for example, a cut-off value set based on the ITGB1 expression level in a number of pluripotent stem cell clones known to be deprived of differentiation resistance) as a control.
  • a control expression level for example, a cut-off value set based on the ITGB1 expression level in a number of pluripotent stem cell clones known to be deprived of differentiation resistance
  • a pluripotent stem cell derived from a cell expressing a reporter gene (eg, fluorescent protein gene) under the control of the promoter of the ITGB1 gene is used, and the pluripotent stem cell is .
  • the GBG- ⁇ -catenin signal transduction pathway is activated by maintaining the culture level in an incubator coated with a cell adhesion substrate of unknown concentration that can give an expression level of ITGB1 sufficient to activate the above evaluation method By doing so, it is possible to determine the concentration of the substrate for cell adhesion capable of imparting an ITGB1 expression level sufficient to activate the ITGB1- ⁇ -catenin signal transduction pathway.
  • the present invention also provides a pluripotency in which differentiation resistance to mesendoderm cells has been released, which comprises contacting the pluripotent stem cells with the cell adhesion substrate at the concentration thus determined.
  • a method for producing a stem cell is provided.
  • Pluripotent stem cell line The human iPS cell line AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014) used for differentiation experiments, imaging, Western blotting, flow cytometry, intracellular staining, and cell adhesion assay was used in Kyoto. It was distributed within the University iPS Cell Research Institute.
  • the human iPS cell line 692D2 (Okita et al., Stem Cells, 31: 458-466 (2013)) used in Example 8 was a gift from Dr. Keisuke Okita, Institute for iPS Cell Research, Kyoto University.
  • Human ES cell line KthES11S was kindly provided by Dr. Hirofumi Suemori, Institute of Viral and Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • MEF mouse embryo fibroblast
  • MEM non-essential amino acids 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% KnockOut (trademark) Serum Replacement (Gibco / Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 5 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Wako, Dulbecco modified Eagle medium / Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) added with Osaka, Japan) was used.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Wako Dulbecco modified Eagle medium / Nutrient Mixture F-12 Ham
  • Laminin 511E8 0.5 ⁇ g / cm 2 condition was set to [x1], and the above conditions were [x1 / 2], [x1 / 4], [x1 / 8], and [x1 / 16].
  • Coating was performed in the same manner as in. Specifically, the recombinant laminin E8 fragment was suspended in PBS (-), added on dish, and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour or more. A small amount of AK02N medium (Ajinomoto) was added for acclimation, and the laminin-PBS solution was removed by suction, and then replaced with AK02N medium supplemented with Y-27632. These dishes were seeded with PSCs. After the next day, while observing the state of the cells, the medium was replaced with AK02N medium supplemented with Y-27632 as appropriate, and the culture was continued.
  • the cells were peeled off from the dish with a cell scraper, and the number of cells was counted with Trypan Blue and a hemocytometer.
  • the other well was exposed with Dispase I (Wako, Osaka, Japan) and allowed to stand at 37 ° C for 2 minutes, then the cells were detached with a cell scraper and gently suspended in the medium.
  • C3H10TR (Riken Bio-Resource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan) feeder cells were treated with mitomycin C, seeded on a 10 cm dish coated with gelatin, and allowed to stand overnight at 37 ° C, 5% CO 2 environment.
  • PSCs were seeded at a cell number of 0.7-1x10 ⁇ 5 to initiate differentiation. Culture was performed in a 5% O 2 environment until Day 0-7.
  • Hematopoietic cell differentiation medium from the start of differentiation induction [IMDM media (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), insulin / transferrin / selenite solution (Gibco / Thermo Fisher, Waltham, MA , USA), Ascorbic acid, 1-thioglycerol (Sigma-Aldrich, St.
  • CHIR99021 ADOOQ Bioscience, Irvine, CA, USA
  • CHIR99021 6 nM was added to each.
  • the same amount of DMSO was added to the group to which CHIR99021 was not added on the same day.
  • FCM Flow cytometry
  • Imaging Fluorescence micrographs were obtained with a fast multiphoton confocal laser microscopy system (Nikon A1R system). Briefly, iPS cells were seeded on ⁇ -Dish 35 mm (ibidi, GmbH, Martinsried, Germany) coated with various laminin fragments and cultured for 4 days. When colony formation was observed, it was fixed with 4% PFA for 15 minutes, washed, and then BB515 Mouse Anti-human CD29 (BD bioscience, Bedford, MA, USA) diluted with 3% FBS-containing PBS was added, Let stand for 30 minutes. After thorough washing, observation was performed. The images were analyzed by NIS-Elements software (Nikon).
  • Intracellular Staining (ICS) and Flow Cytometry (FCM) Analysis In order to detect the pluripotency markers SOX2 and OCT3 / 4, intracellular staining by flow cytometry was performed. Briefly, dead cell staining was performed with Zombie TM Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, CA, USA), washed, and then allowed to stand for 15 minutes at room temperature with PerFix-nc kit Reagent1. , Cells were fixed. Subsequently, the cells were fixed with ice-cooled 100% methanol for 5 minutes, incubated with room temperature for 10 minutes using 0.5% saponin, and permeabilized.
  • Zombie TM Aqua Fixable Viability Kit BioLegend, San Diego, CA, USA
  • V450 Mouse anti-Sox2 and Alexa Fluor (registered trademark) 488 conjugated Mouse anti-OCT3 / 4 were added, and the mixture was put on ice. And incubated for 30 minutes. After washing the excess antibody, analysis was performed with FACSVerse (trademark) (BD Biosciences).
  • Floating cells were washed and removed twice with DMEM / F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 4% PFA (Wako, Osaka, Japan) was added, the mixture was allowed to stand for 15 minutes to be fixed, 100% ethanol was added and allowed to stand for 5 minutes. The mixture was replaced with methanol to which 0.4% Crystal Violet was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. It was washed 3 times with demineralized water and the supernatant was removed. After washing with 250 ⁇ l of 1% SDS, the supernatant was measured for optical density with NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) at a wavelength of 595 nm.
  • NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
  • Example 1 Wnt Signal Agonist Cancels Hematopoietic Cell Differentiation Resistance of PSCs Culture-Maintained on LM511
  • the present inventors have previously described that pluripotent stem cells maintained on laminin 511 resist resistance to mesendoderm differentiation.
  • the pluripotent stem cells maintained on laminin 421 or laminin 121 release this differentiation resistance and show a tendency to differentiate into mesendoderm lineage, especially blood cells, and differentiation resistance. It has been reported that the expression of the downstream gene group of the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway is increased in the pluripotent stem cells in which the release has been released (WO 2018/0378242).
  • Example 2 PSCs cultured and maintained on laminin capable of inducing hematopoietic cell differentiation highly express integrin ⁇ 1
  • ITGB1 is a cell surface protein known as a laminin receptor, and it has been reported that it is important for cell survival and maintenance in PSCs.
  • FCM and a fluorescence microscope PSCs cultured and maintained in LM421 and LM121, which have hematopoietic characteristics, showed higher expression of ITGB1 than LM511, which has non-hematopoietic characteristics (FIG. 3).
  • Example 3 Laminin capable of inducing hematopoietic cell differentiation activates ITGB1- ⁇ -catenin signaling
  • ITGB1 changes ⁇ -catenin accumulation through ILK / pGSK3 ⁇ , and Wnt It is believed to regulate the / ⁇ -catenin signaling pathway. Therefore, Western blotting analysis was performed to confirm whether a similar pathway is working in the relationship between laminin and PSCs. As a result, the amount of ILK / pGSK3 ⁇ / ⁇ -catenin maintained in MEF was the highest.
  • Example 4 Relationship between LM511 Concentration and ITGB1 Expression
  • LM421 / LM121 tends to have weaker cell-matrix adhesion than LM511. Therefore, it was confirmed whether the above results depend on the type of laminin or whether it depends on the "bonding strength" between ITGB1 and laminin.
  • Example 5 PSCs cultured and maintained on diluted LM511 are efficiently induced into hematopoietic progenitor cells.
  • the recommended concentration of LM511 The number of hematopoietic progenitor cells differentiated from PSCs cultured and maintained in diluted LM511 was higher than the number of hematopoietic progenitor cells differentiated from PSCs cultured and maintained in x1). It was possible to cancel the differentiation resistance to cells (Fig. 6). Further, PSCs with high expression levels of ITGB1 had higher hematopoietic ability when differentiated into blood cells (Fig. 6).
  • Example 6 Regulation by GSK3 ⁇ Inhibitor Prevents Maintenance of Pluripotency of PSCs
  • CHIR99021 was added to release the differentiation resistance of PSCs cultured and maintained in LM511 to blood cells, but C3H10TR.
  • the number of cells in which the OCT3 / 4 / SOX2-positive pluripotency was maintained was decreased in the PSCs.
  • the method of serially diluting LM511 was used, or when it was maintained using other laminin such as LM421 / 121, the cells that maintained the pluripotency of both OCT3 / 4 and SOX2 positive were maintained.
  • the ratio was high, and both "maintenance of pluripotency" and "elimination of differentiation resistance" were compatible (Fig. 7).
  • Example 7 Cell-Substrate Adhesion Strength of Various Laminins
  • the hematopoietic LM421 and LM121 and the non-hematopoietic LM511 were compared in cell-substrate adhesion strength.
  • hematopoietic LM421 and LM121 were confirmed to have weaker cell-matrix adhesion than non-hematopoietic LM511 (FIG. 8).
  • Example 8 The concentration of laminin 511 capable of canceling differentiation resistance is different for each pluripotent stem cell clone.
  • human iPS cell line AK5 hPSC1
  • human iPS cell line 692D2 hPSC2
  • human ES cell line KthES11 hPSC3
  • hPSC1 the maintenance culture with diluted LM511 has a higher expression level of ITGB1 and the efficiency of differentiation into hematopoietic progenitor cells is higher than the maintenance culture with LM511 at the recommended concentration (x1).
  • hPSC2 showed a sufficient ITGB1 expression level even when maintained on LM511 at the recommended concentration (x1), and no differentiation resistance to hematopoietic progenitor cells was observed.
  • LM511 was serially diluted, the ITGB1 expression level did not change significantly, and it was found that the efficiency of differentiation into hematopoietic progenitor cells was rather high at the recommended concentration or 2-fold concentration (FIGS. 9A and 9B).
  • hPSC3 hardly differentiated into hematopoietic progenitor cells at the recommended concentration of LM511 and showed high differentiation resistance, but by using LM511 in serial dilution, a certain level of differentiation potential into hematopoietic progenitor cells was obtained (Fig. 9A and B).
  • a positive correlation was observed between the ITGB1 relative expression level of PSCs and the efficiency of differentiation into hematopoietic progenitor cells (FIG. 9C). From the above results, the pluripotent stem cell clones can be evaluated for their easiness of differentiation into the mesendoderm lineage using the expression level of ITGB1 as an index, and pluripotency determined to have differentiation resistance at the recommended concentration of LM511. It has been shown that, with respect to the sex stem cells, the differentiation resistance can be canceled by diluting LM511 to a concentration lower than the recommended concentration.
  • laminin 511 or a fragment thereof diluted to a concentration lower than the recommended concentration it is possible to cancel the differentiation resistance of pluripotent stem cells to the mesendoderm lineage.
  • the cost reduction and the efficient induction of differentiation can be achieved at the same time, and it is extremely useful in the production of mesoendodermal cells.

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Abstract

本発明は、多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すこと（但し、多能性幹細胞を、ラミニン421もしくはその断片及び／又はラミニン121もしくはその断片に接触させることを除く）を含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法等を提供する。

Description

中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法
　本発明は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。より詳細には、本発明は、多能性幹細胞を、インテグリンβ1及びβカテニンを介するシグナル伝達経路を活性化する処理に付すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。
　従来より、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から血液細胞への分化のし易さ（易分化性）は、iPS細胞株ごとに異なることが知られていたが、その理由は不明であった。iPS細胞から血液細胞への易分化性の違いの要因が、細胞株自身の特性にあるのか、あるいは細胞外の環境にあるのかを検証することが求められていた。
　本発明者らは以前、フィーダーフリー培養で細胞外マトリクスとして用いられる種々のラミニン上で多能性幹細胞を培養したところ、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すことを見出した。また、上記特定のラミニン上で維持され、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることも見出した（特許文献１）。この発見は、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化が、ES細胞やエピブラストからの中胚葉、血液分化に重要であるという以前の報告（例えば、非特許文献１～３）と一致する。
　しかし、特定のラミニンのみが、なぜ多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るのかについては、依然として不明のままであった。
国際公開第2018/038242号公報
Liu, P. et al., Nat. Genet., 22: 361-365 (1999) Huelsken, J. et al., J. Cell. Biol., 148: 567-578 (2000) Woll, P.S. et al., Blood, 111(1): 122-123 (2008)
　従って、本発明の目的は、特定のラミニンが多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するメカニズムを解明し、多能性幹細胞から中内胚葉系、特に血液細胞への、より効率的な分化誘導方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該メカニズムを利用して、多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価する手段を提供することである。
　本発明者らは、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するには、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することが重要であると考えた。そこでまず、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すGSK3βの阻害剤の存在下に、多能性幹細胞を推奨濃度のラミニン511上で維持培養した後、造血前駆細胞へと分化誘導すると、分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。
　次に、本発明者らは、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質であるインテグリンβ1（ITGB1）に着目し、造血前駆細胞への分化誘導能の高い（本明細書において「造血性」ともいう。）ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、造血前駆細胞への分化誘導能の低い（本明細書において「非造血性」ともいう。）ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ITGB1の発現量を比較したところ、前者の方がITGB1を高発現していることを見出した。がん細胞において、ITGB1はILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していることが報告されていたので、本発明者らは、ラミニン421及びラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ILK/pGSK3β/β-カテニン量を比較した。その結果、前者の方がILK/pGSK3β/β-カテニン量が多く、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化されていることが明らかとなった。
　造血性のラミニン421とラミニン121は、β及びγサブユニットとして、ともにβ2及びγ1を含むが、同じくβ2及びγ1を含むラミニン321上で維持した多能性幹細胞からは、造血前駆細胞が誘導されなかったことから、βγサブユニットの組み合わせ以外の機序が考えられた。また、本発明者らは、多能性幹細胞の維持培養研究の過程で、造血性のラミニン421やラミニン121は、非造血性のラミニン511に比べて、細胞-基質間接着が弱い傾向があることを見出していた。そこで、ラミニン421やラミニン121と、ラミニン511との間における造血前駆細胞への分化誘導能の違いが、ラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンとの間の接着強度によるものなのかを調べるため、非造血性のラミニン511を段階希釈して、ITGB1との接着強度を低下させたところ、分化抵抗性を示す多能性幹細胞では、細胞-基質間接着が弱くなるに従ってITGB1の発現が上昇することが明らかとなった。さらに、段階希釈したラミニン511上で維持した当該多能性幹細胞を造血前駆細胞へ分化誘導したところ、推奨濃度で維持した多能性幹細胞に比べて分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。
　一方で、多能性幹細胞クローンによっては、推奨濃度のラミニン511で維持しても分化抵抗性を示さないものも存在することが分かった。このような分化抵抗性を示さない多能性幹細胞では、いずれの希釈系列のラミニン511上でも十分なITGB1の発現があることが明らかとなった。即ち、細胞表面分子であるITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系、特に血液細胞への易分化性を評価することができ、分化抵抗性を示すと判定された多能性幹細胞に対しては、ラミニン511濃度を低下させて用いることで、分化抵抗性を解除し得ることが示された。
　本発明者らはまた、前述のGSK3β阻害剤を用いてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化した場合は、造血前駆細胞への分化誘導を開始する前に、多能性を維持する細胞数が減少してしまうのに対し、ITGB1との接着強度が弱いラミニン421やラミニン121を用いたり、ラミニン511を希釈し接着強度を弱くして用いた場合には、多能性を維持する細胞数を減らすことなく分化能が改善されることを見出した。即ち、ラミニン511を推奨濃度より低い濃度で用いることで、多能性幹細胞の維持培養に要するコストを削減しつつ、多能性の維持と分化抵抗性の解除とを両立させることに成功した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
［２］前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、［１］に記載の方法。
［３］前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、［２］に記載の方法。
［４］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［６］多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2～5日間接触させることである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞がヒト由来である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］（１）［１］～［８］のいずれかに記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
［１０］前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、［９］に記載の方法。
［１２］前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、［９］に記載の方法。
［１３］ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
［１４］前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、［１３］に記載のキット。
［１５］多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
　本発明によれば、インテグリンβ1（ITGB1）-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導に適した多能性幹細胞を提供することができる。特に、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞の多能性を十分に維持したまま中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導をより効率的に行うことができる。また、本発明によれば、ITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を簡便に評価することができる。
ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養した多能性幹細胞（PSCs）は造血細胞への分化抵抗性を示すことを示す図である。 Wntシグナル作動薬（GSK3β阻害剤）処理が、LM511上で培養維持したPSCsの造血前駆細胞への分化抵抗性を解除することを示す図である。 造血性のラミニン上で培養維持したPSCsは、インテグリンβ1（ITGB1）を高発現することを示す図である。 造血性のラミニンは、ITGB1-β-カテニンシグナリングを活性化することを示す図である。 PSCs（AK5）の維持培養に用いたLM511濃度と該PSCsにおけるITGB1発現との関係を示す図である。 希釈したLM511上で維持培養したPSCs（AK5）は、ITGB1を高発現し、効率よく造血前駆細胞に分化誘導されることを示す図である。 GSK3β阻害剤による調節はPSCsの多能性維持を妨げるのに対し、希釈したLM511や、LM421/LM121上でPSCsを維持培養すると、多能性維持と分化抵抗性の解除とを両立できることを示す図である。 造血性のラミニン421やラミニン121は、非造血性のラミニン511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことを示す図である。 LM511の希釈系列上で維持培養した3種のPSCsの、（Ａ）造血前駆細胞（HPCs）への分化能、（Ｂ）ITGB1の相対発現量及び（Ｃ）HPCs数とITGB1発現量との相関関係を示す図である。
（Ｉ）分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法
　本発明は、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除する方法、即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（Ｉ）」という）を提供する。従って、本発明の製法（Ｉ）に供される多能性幹細胞は、分化抵抗性を有するものであることが好ましい。
　ここで「分化抵抗性」とは、多能性幹細胞を所望の細胞に分化誘導した際に、当該所望の細胞に分化しにくい性質を意味する。本発明における「中内胚葉系への分化抵抗性」は、例えば、推奨濃度（ラミニン511 E8断片換算で0.5μg/cm2）のラミニン511もしくはその断片上で維持培養したヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)を、中内胚葉系の細胞へと分化誘導した場合の、当該所望の細胞への分化のしにくさ、あるいはそれと同等もしくはそれ以上の分化しにくさとして表すことができる。多能性幹細胞が分化抵抗性を有するか否かは、後述の「本発明の評価方法」により判定することができる。
　また、「分化抵抗性が解除される」とは、解除処理前に比べて、所望の細胞への分化効率が有意に増加することを意味する。好ましくは、解除処理前に比べて2倍以上、より好ましくは4倍以上、さらに好ましくは8倍以上、所望の細胞への分化効率が増加することをいう。
　「中内胚葉系」とは、中胚葉系の細胞及び内胚葉系の細胞、並びに両者の共通の前駆体である中内胚葉細胞を包含する意味で用いられる。従って、「中内胚葉系への分化抵抗性を解除する」とは、少なくとも、多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化効率を解除処理前より増加させることを意味する。好ましくは、本発明の製法（Ｉ）によれば、少なくとも、さらに中胚葉系細胞への分化抵抗性、より好ましくは、少なくとも、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞が提供される。
　本発明で用いられる多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、胚性幹（ES）細胞、iPS細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（EG）細胞、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmutipotent germline stem（mGS）細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell（MAPC）、MUSE細胞等が挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。好ましくはES細胞またはiPS細胞である。多能性幹細胞は哺乳動物に由来するものであってもよく、好ましくはヒト由来の多能性幹細胞である。
　ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　また、ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2、KhES-3およびKthES11は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
　iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。ここで「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味し、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
　初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。
　多能性幹細胞は、作製直後から本発明の製法（Ｉ）により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された状態で維持培養することもできるが、本発明の製法（Ｉ）に供する前に、自体公知の方法により維持培養することができる。維持培養用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、市販の多能性幹細胞用の培地（例、StemFit、AK02N、Essential 8等）を用いてもよい。
　培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0～20％、好ましくは0～5％、より好ましくは0～2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2－メルカプトエタノール、3’－チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically－defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
　培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L－グルタミンなど）、還元剤（例えば、2－メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d－ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］－エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro－Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
　多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下にて培養されてよいが、ESC、iPSCなどの多能性幹細胞の培養に使用することができるフィーダー細胞の多くは、自体、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るので、本発明の製法（Ｉ）に供する必要がない場合が多い。また、ヒトへの臨床応用を考慮すれば、多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下で培養されることが望ましい。従って、本発明の好ましい実施態様において、多能性幹細胞は無フィーダー条件下で培養される。
　多能性幹細胞を維持培養するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－L－リジン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636-1641）。これらの細胞接着用基質は、それらの種類に応じて、通常多能性幹細胞の培養に使用される濃度で培養器にコーティングされる。
　この培養において、多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104～105細胞／cm2の細胞密度とし、1～10％ CO2／99～90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で培養することができる。
　多能性幹細胞を培養する工程において、培養期間の途中で培地交換を行うことができる。培地交換に用いられる培地は、培地交換前の培地と同じ成分を有する培地であっても、異なる成分を有する培地であってもよい。好ましくは、同じ成分を有する培地が用いられる。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。
　本発明の製法（Ｉ）は、多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを特徴とする。当該処理により、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。
　本明細書において「インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路」とは、結合リガンドからの刺激を受けてインテグリンβ1（ITGB1）が、インテグリン結合キナーゼ（ILK）を活性化し、活性化ILKがグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β）の9番目のSerをリン酸化してこれを不活性化し、それによってβ-カテニンのリン酸化が抑制されて細胞内にβ-カテニンが蓄積し、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化され、その下流遺伝子の発現が誘導される経路を意味する。
　ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理としては、例えば、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を上昇させる、及び／又はITGB1を活性化状態に変化させる処理等が挙げられる。そのような処理としては、好ましくは、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドを、当該多能性幹細胞に接触させることが挙げられるが、これに限定されない。ITGB1の結合リガンドとしては、ある特定の濃度範囲において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得るものであれば、特に制限されないが、例えば、分化抵抗性を有する多能性幹細胞にラミニン511もしくはその断片を用いる場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当する濃度で、多能性幹細胞と接触させることにより、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。一方、本明細書における「分化抵抗性」を有しない多能性幹細胞の場合には、推奨濃度のラミニン511を好ましく用いることができる。
　ラミニン511の断片は、インタクトなラミニン511と同等のITGB1への接着強度を有する限り特に制限はないが、少なくともE8断片の領域を含む断片であることが望ましい。
　他のラミニン（例えばラミニン411、ラミニン311、ラミニン111及びそれらの断片）やラミニン以外のITGB1の結合リガンド（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、E-カドヘリン、ADAM等）については、対象の多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を指標として、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与する濃度を適宜選択することができる。
　ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触は、多能性幹細胞を維持培養するために使用される前記培養器の表面に、該結合リガンドを細胞接着用基質としてコーティングし、該培養器上に多能性幹細胞を播種して、前記と同様に維持培養することにより行うことができる。例えば、ITGB1の結合リガンドとしてラミニン511もしくはその断片を使用して、分化抵抗性を有する多能性幹細胞に適用する場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当する濃度となるように、ラミニン511もしくはその断片の溶液を培養器に添加し、一定時間静置することにより、培養器表面上にラミニン511もしくはその断片をコーティングすることができる。
　ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触時間は、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分であれば特に制限はないが、例えば2日以上、好ましくは3日以上である。ITGB1の結合リガンドとの接触によりITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する場合、接触の間、即ち、該リガンドを細胞接着用基質としてコーティングした培養器内での培養期間を通じて、多能性幹細胞集団において多能性を保持する細胞数は十分に維持されるので（Oct3/4及びSox2の両陽性の細胞が全体の90%、好ましくは95%以上）、接触時間に特に上限はない。
　本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、例えば、ITGB1の発現促進剤（例、ヒバマタ、ローズマリー、キウイ、フクリョウ、ゴボウ、ニンジン又はコウソウの抽出液（特開平11-246428）等）、ITGB1の発現を抑制する物質（例、ZFYVE21、miR-29C、miR-124等）の発現・機能を阻害する物質（例、抗体、アンチセンス核酸、siRNA又はshRNA等）、ITGB1をコードする核酸などを、多能性幹細胞に接触させることが挙げられる。これらの処理は、上記の物質を多能性幹細胞の培地に添加することにより行うことができる。該物質が核酸の場合、該核酸の細胞内への導入を促進するための核酸導入試薬をさらに添加することが好ましい。
　本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるILKの発現を上昇させる、及び／又はILKを活性化状態に変化させる処理が挙げられる。そのような処理としては、例えば、ILKをコードする核酸、ILKの恒常的活性化体（例、ILKのN末端にミリストイル化シグナル配列を付加するか、C末端にCaaXモチーフを付加することにより、膜局在性の恒常的活性化体とすることができる）をコードする核酸を多能性幹細胞に導入することが挙げられる。
　本発明のさらに別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるGSK3β活性、特にβ-カテニンをリン酸化する活性を阻害することが挙げられる。GSK3βは、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すので、GSK3βを阻害することにより、細胞内β-カテニンが蓄積し、結果としてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化される。
　GSK3β活性を阻害する方法としては、例えば、多能性幹細胞を低分子GSK3β阻害剤に接触させる方法や、β-カテニンの標的リン酸化部位をミミックしたペプチドを多能性幹細胞に接触させる方法等が挙げられるが、低分子GSK3β阻害剤を用いる方法が好ましい。
　本発明において、GSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、GSK-3β阻害剤として最初に見出された塩化リチウム (LiCl)、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）及び高い選択性を有するCHIR99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile) が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されている。GSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、GSK3β阻害剤を添加した培地中で多能性幹細胞を培養することにより行うことができる。培地に添加されるGSK3β阻害剤の濃度は薬剤の種類によって異なるが、例えば、CHIR99021の場合、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μM等であるがこれらに限定されない。好ましくは、5μM以上（例えば、5μM～50μM、好ましくは5μM～10μM）である。
　多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、2～5日間、好ましくは3～4日間行うことができる。
（ＩＩ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット
　本発明はまた、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する前記いずれかの物質を含有してなる、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための試薬を提供する。好ましい一実施態様において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する物質は、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドである。当該結合リガンドは、好ましくは、それがコーティングされた培養器の形態で提供される。従って、本発明はまた、当該培養器を構成として含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
　本発明のキットに含まれる結合リガンドがコーティングされた培養器として、例えば、結合リガンドがラミニン511もしくはその断片の場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100～1/2）、好ましくは、0.025～0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20～1/4）、より好ましくは、0.03～0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16～1/7）に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養器が挙げられる。培養器としては、多能性幹細胞の維持培養のための培養器として上記したものを、同様に用いることができる。
　本発明のキットは、培地や培地添加物、継代や分化誘導培養へ細胞を移すための細胞の培養器からの剥離・細胞間接着の解離のための試薬などをさらに含むことができる。
（ＩＩＩ）中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導法
　本発明はまた、上記本発明の製法（Ｉ）で作製した中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（ＩＩ）」ともいう）を提供する。本発明の製法（Ｉ）で作製された多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除されているので、効率よく中胚葉系又は内胚葉系の細胞へ分化誘導することができる。
　本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る中胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、中胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞、脂肪細胞などが挙げられる。ここで「血液細胞」とは、造血幹細胞から分化する血液中に含まれる任意の細胞を意味し、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、NK細胞、樹状細胞、T細胞、B細胞、並びにそれらの前駆細胞等が包含される。
　本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る内胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、内胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞、甲状腺細胞等の細胞又はそれらの前駆細胞などが挙げられる。
　中胚葉系及び内胚葉系は、中内胚葉細胞を共通の前駆体とする。従って、中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導工程の初期において、中内胚葉細胞への分化が誘導される。中内胚葉細胞への分化は、例えば、T、Foxa2、Gsc、Mixl1等の中内胚葉マーカーの発現を調べることにより確認することができる。
　多能性幹細胞から上記のいずれかの中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への分化誘導法は、それぞれ当該技術分野において周知であり、例えば、中辻及び末盛編、「実験医学別冊　ES・iPS細胞実験スタンダード」（羊土社発行、2014年）に種々の中胚葉系細胞又は内胚葉細胞への分化誘導法が記載されており、当業者であれば、これらの成書を参照することにより、多能性幹細胞を各種中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞へと分化誘導することができる。
　本発明の製法（Ｉ）により得られる多能性幹細胞は、特に血液細胞への分化効率に優れている。従って、好ましい一実施態様においては、本発明の製法（ＩＩ）において作製される中胚葉系細胞は、血液細胞である。多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化誘導法としては、例えば、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法が挙げられる (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。本法は必要なサイトカインが血管内皮増殖因子（VEGF）のみとシンプルであり、維持培養していた多能性幹細胞を基質から剥離してマイトマイシンC（MMC）処理したC3H 10T1/2細胞上へ播種すると、4日目には多能性幹細胞のフィーダー細胞への接着が認められ、14日目まで培養を続けると、多能性幹細胞からSac様の構造物が形成される。造血前駆細胞はこのSac用構造物の中に得られる。
　上記のようにして得られる造血前駆細胞は、自体公知の方法により各種血液細胞にさらに分化させることができる。例えば、巨核球前駆細胞、さらに血小板への分化誘導法については、WO 2018/038242に詳述されている。
（ＩＶ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法
　上述のように、多能性幹細胞において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することにより、中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、ITGB1の発現が亢進している。従って、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を指標として、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の程度を評価することができる。即ち、本発明はまた、多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう。）を提供する。
　本発明の評価方法に供される多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が不明なものである。ITGB1の発現量の測定は、例えば、被検多能性幹細胞を蛍光標識した抗ITGB1抗体に接触させ、ITGB1発現細胞を可視化した後、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いた画像解析により行うことができる。得られたITGB1発現量を、対照発現量（例えば、分化抵抗性が解除されていることが既知の相当数の多能性幹細胞クローンにおけるITGB1発現量から設定したカットオフ値）と比較し、対照発現量以上である場合に、被検多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性が解除されていると判定することができる。
　別の実施態様において、多能性幹細胞として、ITGB1遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（例、蛍光タンパク質遺伝子）を発現する細胞から誘導された多能性幹細胞を用い、該多能性幹細胞を、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度が未知の細胞接着用基質でコーティングした培養器内で維持培養し、上記の評価方法を実施することにより、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る、該細胞接着用基質の濃度を決定することができる。従って、本発明はまた、そのようにして決定された濃度で、該細胞接着用基質を多能性幹細胞に接触させることを含む、中内胚葉細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法を提供する。
　以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。
（材料及び方法）
１．多能性幹細胞株
　分化実験、イメージング、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、細胞内染色、細胞接着アッセイに用いたヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)は、京都大学iPS細胞研究所内で分与されたものである。また、実施例８で使用したヒトiPS細胞株692D2（Okita et al., Stem Cells, 31: 458-466 (2013)）は、京都大学iPS細胞研究所　沖田圭介博士より分与されたものであり、ヒトES細胞株KthES11Sは、京都大学ウイルス・再生医科学研究所　末盛博文博士より分与されたものである。
２．多能性幹細胞（PSCs）の維持培養
２－１．マウス胎児線維芽細胞（MEF）フィーダー上での維持培養
　マイトマイシンCにて処理を行ったMEFを播種した6cm dish上にて、既報に従ってPSCsの培養を行った (Takayama et al., Blood, 111(11): 5298-5306, 2008)。培地として、MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% KnockOut（商標）Serum Replacement (Gibco/ Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 5 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Wako, Osaka, Japan) を添加したDulbecco modified Eagle medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を使用した。
２－２．ラミニン上での維持培養
　既報に従って、各種ラミニンE8断片上にてフィーダーフリー条件下でPSCsを培養した(Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)。使用した組換えラミニンE8断片のうち、LM511 E8はiMatrix-511/iMatrix-511 silk (Nippi, Ibaraki, Japan) を、その他のラミニンE8（LM421/121）断片は 関口清俊博士 (大阪大学 蛋白質研究所) にご提供いただいた。それぞれのラミニン断片を、dish底面積に対して 0.5 μg/cm2となるように添加した。尚、ラミニンの希釈実験では、Laminin 511E8 0.5 μg/cm2条件を[x1]として、[x1/2]、[x1/4]、[x1/8]、[x1/16]の条件で、上記と同様にコーティングを行った。
　具体的には、組換えラミニンE8断片をPBS(-)に懸濁し、dish上へ添加、37℃にて1時間以上静置した。AK02N培地(Ajinomoto) を少量添加し馴化させ、ラミニン-PBS溶液を吸引除去した後、Y-27632を添加したAK02N培地へ置換した。これらのdishへPSCsを播種した。翌日以降も、細胞の様子を伺いながら適宜Y-27632を添加したAK02N培地で培地交換し、培養を継続した。
３．細胞分化実験
　PSCsから血球分化を行う方法としては、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法を用いた (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takaayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。PSCsは同数を2 wellに分けて培養しておき、1つのwellに対してPBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) で曝露した後、37℃で4分間静置し、細胞間接着が剥がれたことを確認の上でCell scraperでdishより細胞を剥離し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
　他方のwellをDispase I (Wako, Osaka, Japan) で曝露し、37℃で2分間静置した後、細胞をCell scraperで剥離し、培地で穏やかに懸濁した。マイトマイシンCにて処理後、ゼラチンコートを施した10cm dish上に播種し、37℃、5% CO2環境にて一晩静置したC3H10TR（Riken Bio-Resource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan）フィーダー細胞上に、PSCsを0.7-1x10^5の細胞数となるように播種し、分化誘導を開始した。Day0-7までは5% O2環境にて培養を行った。分化誘導開始時より造血細胞分化培地［IMDM media (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), insulin/ transferrin/selenite solution (Gibco/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), Ascorbic acid, 1-thioglycerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA -Aldrich), 20ng/ml recombinant human VEGF (VEGF-A165; Wako, Osaka, Japan)］にて3-4日に一度培地交換を行い、14日目にdish上の細胞を回収し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
　CHIR99021 (ADOOQ Bioscience, Irvine, CA, USA) 添加実験は，ラミニン511 E8断片（LM511）上で培養維持されている分化予定のPSCsに対して、分化誘導開始4日前、3日前、2日前又は1日前から分化誘導開始時までの間、それぞれにCHIR99021 6nMを添加した。CHIR99021を添加していない群には、同日にDMSOを同量添加した。
４．フローサイトメトリー（FCM）
　細胞は、Trypan Blueと血球計算板を用いて細胞数を計数した。各サンプルは3％ FBSを含むPBS (Staining Medium) に懸濁し、各種抗体を添加して氷上暗所で30分間静置した後、FACS Verse (BD bioscience) にて測定を行った。hPSCsの測定については，TRA-1-60陽性細胞を計測した。抗体として、Brilliant Violet 421（商標） anti-human CD34 antibody(561), Pacific Blue（商標） Anti-human CD326 antibody (BioLegend, San Diego, CA, USA), APC conjugated CD43 monoclonal antibody(eBio84-3C1)(eBioscience/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), PE mouse anti-human CD29 antibody (BD, Bedford, MA, USA), Propidium Iodide (Sigma), Alexa Fluor（登録商標） 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen (BD, Bedford, MA, USA)を用いた。
５．イメージング
　蛍光顕微鏡写真は、高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システム (Nikon A1R system) によって得た。簡潔にいうと、各種ラミニン断片でコーティングを施したμ-Dish 35 mm (ibidi, GmbH, Martinsried, Germany) へiPS細胞を播種し、4日間培養した。コロニー形成が見られたところで、4% PFAで15分間固定し、洗浄した後、3% FBS含有PBSにて希釈したBB515 Mouse Anti-human CD29 (BD bioscience, Bedford, MA, USA)を添加し、30分間静置した。十分に洗浄した後、観察を行った。画像はNIS-Elements software (Nikon) にて解析した。
６．ウェスタンブロッティング
　ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように行った (Eto et al., 2007; Nishikii et al., 2008, Nakamura et al., 2014)。 簡潔にいうと、Protease inhibitor cocktail（Roche、Basel、Switzerland）とphosphatase inhibitor cocktail (Nacalai tesque, Kyoto, Japan) を添加したTNE緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.8, 150mM NaCl, 1％ NP-40及び1mM EDTA）で、同数の細胞を処理した細胞溶解物の試料15μlを、4-15％Mini-PROTEAN（登録商標） TGX Precast Gels（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA）上で電気泳動し、分離した。次いで、polyvinylidene difluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire,UK）に転写した。ILK1 (4G9), phospho-GSK3β(Ser9)(D85E12), β-catenin (D10A8)(CST, Chicago, USA), β-actin (AC-74)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて一次抗体反応を行ない、anti-mouse IgG-HRP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 及びAnti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (CST, Chicago, USA) を2次抗体として用いてSuperSignal（商標） West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）にて可視化した。
７．細胞内染色（ICS）及びフローサイトメトリー（FCM）解析
　多能性マーカーであるSOX2とOCT3/4の検出のために、フローサイトメトリーによる細胞内染色を実施した。簡潔にいうと、Zombie（商標） Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, CA, USA) にて死細胞染色を実施し、洗浄した後、PerFix-ncキットReagent1にて室温で15分静置し、細胞を固定した。続いて、氷冷した100% メタノールで5分間固定、0.5% サポニンを用いて室温で10分間インキュベートし透過処理を行った。PBS（3% FBS含有）にて洗浄懸濁した後、V450 Mouse anti-Sox2及びAlexa Fluor（登録商標） 488 conjugated Mouse anti-OCT3/4 (BD biosciences, Bedford, MA, USA) を添加し、氷上で30分間インキュベーションした。余剰抗体を洗浄ののち、FACSVerse（商標） (BD Biosciences) にて解析を行った。
８．細胞接着アッセイ
　Stem Cell Reports, Vol. 11. Issue 1, 142-156, 2018を参照し、一部改変して行った。48 well plateに対して、各種ラミニンを0.5 μg/cm2となるようにコーティングし、37℃で1時間以上静置した後、Y-27632を添加したAK02N培地 (Ajinomoto, Japan) へ置換した。継代培養していたヒトiPS細胞に対して、PBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) に37℃で10分間曝露した。ピペッティングにてSingle cellとし、各Wellへ0.5x10^5ずつ播種し、37℃、5% CO2で1時間静置した。浮遊細胞をDMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて2回洗浄、除去した。4% PFA (Wako, Osaka, Japan) を添加し、15分間静置して固定し、100%エタノールを添加して5分間静置した。メタノールに0.4% Crystal Violetを添加したもので置換し、室温で5分間静置した。脱塩水にて3回洗浄し、上清を除去した。1% SDS 250 μlにて洗浄し、上清をNanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) にて、595 nm波長を用い、光学密度を測定した．
（結果）
参考例１　ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養したPSCsは造血細胞への分化抵抗性を示す
　MEF上で維持培養したPSCsを基質から剥離し、MMC処理したC3H10TR細胞上へ播種すると、4日目にはPSCsはフィーダー細胞への接着が認められ、さらに14日目まで培養を続けると、PSCsからSac様の構造物が形成された。造血前駆細胞はこのSac様構造物の中に得られた。一方、LM511で培養維持したPSCsを同様にC3H10TR細胞へ播種しても、該フィーダー細胞へはほとんど接着せず、14日目になってもSac様構造物はほとんど見られなかった。14日目に細胞を回収し、CD34+CD43+の造血前駆細胞を計数した結果、前記の観察を反映して、LM511で培養維持した多能性幹細胞からは、ほとんど造血前駆細胞が得られなかった（図１）。
実施例１　Wntシグナル作動薬はLM511上で培養維持したPSCsの造血細胞分化抵抗性を解除する
　本発明者らは以前、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すこと、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることを報告している（WO 2018/0378242）。そこで、造血前駆細胞を作ることができなかったLM511で培養維持した細胞に対して、 Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を刺激することによって、造血細胞への分化抵抗性が解除されるかを調べた。該シグナル伝達経路の中間メディエータであるGSK3βを、CHIR99021を用いて阻害することで、細胞内にβ-カテニンの蓄積を促した。GSK3β阻害剤で処理した細胞を用いて、PSC-sac法で分化誘導を行ったところ、LM511上で培養維持したPSCsによる造血細胞への分化誘導が改善され、造血前駆細胞数を増やすことができた（図２）。
　これらの結果より、ラミニンによる細胞の足場は、PSCs内部における造血系分化への経路を、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を介して調節していると考えられた。
実施例２　造血細胞分化誘導能を有するラミニン上で培養維持したPSCsはインテグリンβ1を高発現する
　LM511/LM421/LM121のそれぞれで培養維持されたPSCsにおけるインテグリンβ1（ITGB1）の発現レベルを調べた。ITGB1は、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質で、PSCsにおいては細胞の生存と維持に重要であることが報告されている。FCMおよび蛍光顕微鏡を用いた観察において、造血の特徴を持つLM421とLM121で培養維持したPSCsは、非造血の特徴を持つLM511と比較してITGB1の発現が高かった（図３）。
実施例３　造血細胞分化誘導能を有するラミニンはITGB1-β-カテニンシグナリングを活性化する
　いくつかのがんに関する報告では、ITGB1がILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していると考えられている。そこで、ラミニンとPSCsの関係においても同様の経路が働いているかを確認するため、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、MEFで維持したものはILK/pGSK3β/β-カテニンの量が最も多かった。また、LM421とLM121で培養維持したものは、LM511で培養維持したものよりもILK/pGSK3β/β-カテニンの量が多かった（図４）。これらの結果は、細胞表面のITGB1の量が増えることでITGB1以下のシグナルが強くなり、β-カテニンの細胞内蓄積量が増えて、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化されたことを示唆している。
実施例４　LM511濃度とITGB1発現の関係
　本発明者らは、PSCsの維持培養研究の過程で、LM421/LM121は、LM511に比べて細胞-基質間接着が弱い傾向があることに気づいていた。そこで、上記の結果がラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンの間の「接着の強さ」に依存したものなのかを確かめた。本実施例では、非造血性のラミニンであるLM511を段階希釈してコーティングしたプレートへPSCsを播種し、培養維持した。これは、LM511を希釈することで、ラミニンとしてのサブユニットを5-1-1のまま変えずに、接着の強さ（=インテグリン-ラミニン結合数）を調節したものである。その結果、FCMおよび蛍光顕微鏡による解析では、弱い細胞-基質間接着の条件ほどITGB1の発現が高く、ITGB1の発現量がラミニンサブユニットの種類ではなく、細胞-基質接着の量、つまり接着の強さに依存したものであることが示された（図５）。
実施例５　希釈したLM511上で培養維持したPSCsは効率よく造血前駆細胞に誘導される
　次に、段階希釈したLM511上で培養維持したPSCsをPSC-sac法で培養したところ、LM511の推奨濃度 (x1) で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数よりも、希釈したLM511で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数の方が多く、LM511（x1）で培養維持することで起きた血液細胞への分化抵抗性を解除することができた（図６）。また、ITGB1の発現量が高いPSCsの方が，血液細胞へ分化させた時の造血能が高かった（図６）。
　以上の結果をまとめると、細胞外基質と細胞の弱い接着は，ITGB1の発現を誘導し，十分な量のITGB1が発現すると下流のシグナルが変化し、β-カテニンが蓄積してWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化され、造血前駆細胞の分化が促進されると考えられる。
実施例６　GSK3β阻害剤による調節はPSCsの多能性維持を妨げる
　実施例１において、CHIR99021を添加することで、LM511で培養維持したPSCsの血液細胞への分化抵抗性を解除できたが、C3H10TRフィーダー細胞上へ播種して分化を開始する直前には、該PSCsではOCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞数は減少していた。これに対し、LM511を段階希釈する方法を用いた場合や、LM421/121などのその他のラミニンを用いて維持した場合は、OCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞の割合が高く、「多能性の維持」と「分化抵抗性の解除」を両立することができた（図７）。
実施例７　各種ラミニンの細胞－基質間接着強度
　造血性のLM421及びLM121と、非造血性のLM511とで、細胞-基質間接着強度を比較した。その結果、造血性のLM421やLM121は、非造血性のLM511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことが確認された（図８）。
実施例８　分化抵抗性を解除し得るラミニン511濃度は多能性幹細胞クローンごとに異なる
　ヒトiPS細胞株AK5（hPSC1）、ヒトiPS細胞株692D2（hPSC2）及びヒトES細胞株KthES11（hPSC3）について、実施例４及び５と同様にして、LM511濃度とITGB1発現の関係、並びにLM511濃度と造血前駆細胞への分化能の関係について調べた。その結果、hPSC1では、推奨濃度 (x1) のLM511で維持培養するよりも、希釈したLM511で維持培養する方が、ITGB1の発現量が高く、造血前駆細胞への分化効率が増すのに対し、hPSC2では、推奨濃度（x1）のLM511上で維持培養した場合でも十分なITGB1発現量を示し、造血前駆細胞への分化抵抗性は認められなかった。また、LM511を段階希釈してもITGB1発現量に大きな変化はなく、造血前駆細胞への分化効率は、推奨濃度か2倍濃度でむしろ高いことがわかった（図９Ａ及びＢ）。hPSC3はLM511の推奨濃度でほとんど造血前駆細胞へ分化せず、高い分化抵抗性を示したが、LM511を段階希釈して用いることにより、ある程度の造血前駆細胞への分化能が得られた（図９Ａ及びＢ）。PSCsのITGB1相対発現量と造血前駆細胞への分化効率との間には、正の相関が認められた（図９Ｃ）。
　以上の結果から、ITGB1の発現量を指標として多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価することができ、推奨濃度のLM511で分化抵抗性を有すると判定された多能性幹細胞に対しては、LM511を推奨濃度よりも低濃度に希釈して用いることで、当該分化抵抗性を解除することができることが示された。
　本発明によれば、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができ、中内胚葉系の細胞の製造において、きわめて有用である。
　本出願は、2018年10月31日付で日本国に出願された特願2018-205912を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。

Claims (15)

  1. 　多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すこと（但し、多能性幹細胞を、ラミニン421もしくはその断片及び／又はラミニン121もしくはその断片に接触させることを除く）を含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
  2. 　前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2～5日間接触させることである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　（１）請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び
    　（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程
    を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
  10. 　前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、請求項９に記載の方法。
  12. 　前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、請求項９に記載の方法。
  13. 　ラミニン511 E8断片換算で0.005～0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
  14. 　前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03～0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、請求項１３に記載のキット。
  15. 　多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
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