JP6738572B2 - 肺胞上皮細胞の分化誘導法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法及び多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造するためのキット、並びにＩＩ型肺胞上皮細胞を培養する方法及びＩＩ型肺胞上皮細胞を培養するためのキットに関する。

肺は最も複雑な組織の一つであり、約４０の異なる細胞種から成ると考えられている。このうち肺胞は、ガスを溜める肺胞腔と、これを囲む肺胞上皮から成る。さらに、肺胞上皮は、Ｉ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞から成る。前者は、肺胞を取り囲む毛細血管内皮細胞と基底膜を介して血液空気関門を形成し、肺胞内ガスと血液ガスの交換を行う。後者は層板小体を多く含み、肺サーファクタントを開口分泌し、肺胞被覆層を形成していると言われている。
近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性を有する細胞がこれまでに報告されており、これらの細胞から肺胞上皮細胞の誘導方法（非特許文献１〜５）が報告され、誘導に必要な増殖因子等の報告もされている。しかしながら、ヒトの肺胞の細胞を再現性の高い方法で効率良く誘導できている例はない。
一方、本発明者等は、非特許文献６において、ヒト多能性幹細胞の３次元共培養がＩＩ型肺胞上皮細胞の分化誘導に有用であり、且つレポーターによりＩＩ型肺胞上皮細胞を単離できることを開示する。また、本発明者等は、特許文献１において、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造する方法を開示する。

国際公開第２０１４／１６８２６４号

Ｒｉｐｐｏｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００４年，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．４９−５６ Ｃｏｒａｕｘ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２００５年，Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．８７−９２ Ｍｏｒｒｉｓｅｙ ＥＥ ａｎｄ Ｈｏｇａｎ ＢＬＭ，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．，２０１０年，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．８−２３ Ｇｈａｅｄｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１３年，Ｖｏｌ．１２３，ｐｐ．４９５０−６２ Ｈｕａｎｇ ＳＸ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１４年，Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．８４−９１ Ｇｏｔｏｈ Ｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４年，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．３９４−４０３

本発明は、多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法及び多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造するためのキットを提供することを目的とする。また、本発明は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養する方法及びＩＩ型肺胞上皮細胞を培養するためのキットを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、各種増殖因子及び化合物を用いることによって、多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を分化誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法であって、次の（１）〜（５）の工程を含む、前記方法：
（１）多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（２）（１）の工程で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（３）（２）の工程で得られた細胞をＢＭＰ４、レチノイン酸及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（４）（３）の工程で得られた腹側前方前腸細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程；
（５）（４）の工程で得られた肺胞上皮前駆細胞をステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含む培地で３次元培養する工程。
（２）ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、ＢＭＰ阻害剤がＮｏｇｇｉｎであり、ＴＧＦβ阻害剤がＳＢ４３１５４２であり、ＮＯＴＣＨシグナル阻害剤がＤＡＰＴであり、ステロイド剤がデキサメタゾンであり、ｃＡＭＰ誘導体が８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）である、（１）記載の方法。
（３）工程（１）において、さらにＲＯＣＫ阻害剤及び／又はＨＤＡＣ阻害剤を培地に添加して多能性幹細胞を培養する、（１）又は（２）記載の方法。
（４）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２であり、且つ／又はＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、（３）記載の方法。
（５）工程（４）の後に、さらにＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を単離する工程を含む、（１）〜（４）のいずれか１記載の方法。
（６）工程（４）の後に、得られた肺胞上皮前駆細胞を凍結保存に供し、且つ工程（５）における肺胞上皮前駆細胞は、当該凍結保存した肺胞上皮前駆細胞を融解したものである、（１）〜（５）のいずれか１記載の方法。
（７）工程（５）において、さらにＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加して肺胞上皮前駆細胞を３次元培養する、（１）〜（６）のいずれか１記載の方法。
（８）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（７）記載の方法。
（９）工程（５）の後に、さらにＳＦＴＰＣ、ＥｐＣＡＭ又はＣＥＡＣＡＭ６から成る群より選択される１種以上のＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーが陽性であることを指標としてＩＩ型肺胞上皮細胞を単離する工程を含む、（１）〜（８）のいずれか１記載の方法。
（１０）さらに生細胞の酸性分画染色が陽性であることを指標としてＩＩ型肺胞上皮細胞を単離する、（９）記載の方法。
（１１）工程（５）の後に、得られたＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存に供する、（１）〜（１０）のいずれか１記載の方法。
（１２）アクチビンＡ、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ、ＮＯＴＣＨシグナル阻害剤、ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する、多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造するためのキット。
（１３）ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、ＢＭＰ阻害剤がＮｏｇｇｉｎであり、ＴＧＦβ阻害剤がＳＢ４３１５４２であり、ＮＯＴＣＨシグナル阻害剤がＤＡＰＴであり、ステロイド剤がデキサメタゾンであり、ｃＡＭＰ誘導体が８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸである、（１２）記載のキット。
（１４）ＲＯＣＫ阻害剤及び／又はＨＤＡＣ阻害剤をさらに含有する、（１２）又は（１３）記載のキット。
（１５）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２であり、且つ／又はＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、（１４）記載のキット。
（１６）ＩＩ型肺胞上皮細胞を、ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含む培地で３次元培養する工程を含む、ＩＩ型肺胞上皮細胞の培養方法。
（１７）ステロイド剤がデキサメタゾンであり、ｃＡＭＰ誘導体が８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸである、（１６）記載の方法。
（１８）さらにＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加してＩＩ型肺胞上皮細胞を３次元培養する、（１６）又は（１７）記載の方法。
（１９）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（１８）記載の方法。
（２０）さらにＷＮＴシグナル阻害剤及び／又はＩＧＦ２を培地に添加してＩＩ型肺胞上皮細胞を３次元培養する、（１６）〜（１９）のいずれか１記載の方法。
（２１）ＷＮＴシグナル阻害剤がＷＩＦ１である、（２０）記載の方法。
（２２）ＩＩ型肺胞上皮細胞が（１）〜（１１）のいずれか１記載の方法により製造されたＩＩ型肺胞上皮細胞である、（１６）〜（２１）のいずれか１記載の方法。
（２３）ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含有する、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養するためのキット。
（２４）ステロイド剤がデキサメタゾンであり、ｃＡＭＰ誘導体が８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸである、（２３）記載のキット。
（２５）ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含有する、（２３）又は（２４）記載のキット。
（２６）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（２５）記載のキット。
（２７）ＷＮＴシグナル阻害剤及び／又はＩＧＦ２をさらに含有する、（２３）〜（２６）のいずれか１記載のキット。
（２８）ＷＮＴシグナル阻害剤がＷＩＦ１である、（２７）記載のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−０４５２９８号の開示内容を包含する。

ヒト多能性幹細胞を用いて腹側前方前腸細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を誘導する方法を示す。 図１のＳｔｅｐ４用培地の組成を、ＮＫＸ２．１をマーカータンパク質とする肺胞上皮前駆細胞の誘導効率と単離の点から検討した結果を示す。 図２Ａ−Ｂの続きである。 Ｓｔｅｐ４用培地の組成について、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）のＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質であるＳＦＴＰＣの発現レベルの点から検討した結果を示す。 図２の（４）の条件での培養期間について、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）のＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質であるＳＦＴＰＣの発現レベルの点から検討した結果を示す。 ＳＦＴＰＣ（ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ）レポーターｉＰＳ細胞を用いて、Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）にＣＰＭ^＋細胞（肺胞上皮前駆細胞）と比較対照としてＣＰＭ⁻細胞とをそれぞれ単離し、ヒト胎児肺線維芽細胞と三次元共培養し、１４日間かけて肺胞上皮前駆細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞が誘導される経過をｗｈｏｌｅ ｗｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇした結果を示す。 Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）においてＣＰＭ^＋細胞から形成されたスフェロイドを強拡大で観察した写真である。 Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）においてフローサイトメトリーを行い、ＩＩ型肺胞上皮細胞を意味するＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ^＋細胞の比率が、ＣＰＭ^＋細胞由来のＥｐＣＡＭ^＋細胞のうち５０％に達したことを示す。 図１に示したＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導法（Ｎｅｗ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が、非特許文献６に記載の方法（Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に比べても、ＳＦＴＰＣ及びＳＦＴＰＢの発現レベルにおいても増加したことを示す。 Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）において、様々なＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質がＣＰＭ^＋細胞由来の三次元培養産物に発現することをＣＰＭ⁻細胞由来の三次元培養産物と比較して示す。 Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）におけるスフェロイドの蛍光二重免疫染色像を示す。 Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）におけるスフェロイドの透過型電子顕微鏡像を示す。 ヒト多能性幹細胞から誘導して作製したＩＩ型肺胞上皮細胞を三次元共培養系で長期間にわたり継代しながら培養する方法を示す。 ＩＩ型肺胞上皮細胞を三次元共培養系で継代しながら培養することにより、ＳＦＴＰＣを一定の陽性率で維持できたことを示す。 継代したＩＩ型肺胞上皮細胞（ＡＴ２−Ｐ３）によって形成されたスフェロイドが、ＡＴ２−Ｐ０のスフェロイドと同様にＤＣ−ＬＡＭＰ及びＳＦＴＰＣを発現したことを蛍光二重免疫染色像で示す。 ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞ではないヒトｉＰＳ細胞株（６０４Ａ１）を用いてＤａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）まで分化誘導し、ＡＴ２−Ｐ０の段階で抗ＥｐＣＡＭ抗体とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを用いてＩＩ型肺胞上皮細胞が単離できたことを示す。 図１５と同様にＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞ではないヒトｉＰＳ細胞株（６０４Ａ１）を用いてＤａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）まで分化誘導し、ＡＴ２−Ｐ０の段階で抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を用いてＩＩ型肺胞上皮細胞が単離できたことを示す。 ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞を用いてＡＴ２−Ｐ０を単離し、図１２に示したように継代を行なう際、Ｓｔｅｐ５用培地にＷＩＦ１（３００ｎｇ／ｍｌ）若しくはＩＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加すると、ＩＩ型肺胞上皮細胞が効率良く維持されたことを示す。 Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）のヒト肺胞上皮前駆細胞を凍結保存し、その細胞を用いて三次元共培養を行うことで、ＩＩ型肺胞上皮細胞を誘導する方法を示す。 図１８の結果、２０％程度の効率で凍結保存した肺胞上皮前駆細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞が分化できたことを示す。 ＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存し、その細胞を用いて三次元共培養を行うことで、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養する方法を示す。

＜多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法＞
本発明に係る多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法は、次の（１）〜（５）の工程を含む方法である；
（１）多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（２）（１）の工程で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（３）（２）の工程で得られた細胞をＢＭＰ４、レチノイン酸及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（４）（３）の工程で得られた腹側前方前腸細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程；
（５）（４）の工程で得られた肺胞上皮前駆細胞をステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含む培地で３次元培養する工程。
本発明において、腹側前方前腸細胞とは、発生学的に適切な刺激があれば甲状腺や肺への分化能を有するように運命づけられた細胞を意味し、ＮＫＸ２−１、ＧＡＴＡ６及び／又はＨＯＰＸを発現している細胞である。
本発明において、肺胞上皮前駆細胞とは、Ｉ型肺胞上皮細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞の前駆細胞を意味し、ＣＰＭ及び／又はＮＫＸ２−１を発現している細胞である。
本発明において、ＩＩ型肺胞上皮細胞とは、組織学的に肺サーファクタントを産生し、形態学的特徴である層板小体（ラメラ体）や多胞体を細胞内に有する上皮細胞を意味し、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＤ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＡＢＣＡ３、ＬＰＣＡＴ１等を発現している細胞である。
本発明に係る多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法における各工程を以下に説明する：
（１）アクチビンＡ及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程（Ｓｔｅｐ１）
多能性幹細胞を培養する工程において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の１つ以上の物質も含有し得る。より好ましくは、Ｂ２７及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地である。
本工程では、上記の基礎培地へアクチビンＡ及びＧＳＫ３β阻害剤を添加して多能性幹細胞を培養することによって行われる。本工程では、さらにＨＤＡＣ阻害剤を添加してもよい。
ここで、アクチビンＡは、２つのベータＡ鎖のホモダイマーであり、アクチビンＡのアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ネコのタンパク質で１００％の相同性があるため、特に種の限定はされない。本発明において好ましくは、Ｎ末端ペプチドが切断された活性型であり、ｉｎｈｉｂｉｎ ｂｅｔａ Ａ鎖（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２１８３）のＮ末端ペプチドが切断されたＧｌｙ３１１−Ｓｅｒ４２６断片がジスルフィド結合したホモダイマーである。このようなアクチビンＡは、例えば、Ｗａｋｏ社Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入可能である。
培地中におけるアクチビンＡの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、具体的には１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍ及び１ｍｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＧＳＫ３β阻害剤とは、ＧＳＫ−３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン ３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ_２）及び高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６−［２−［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
本発明で使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。本工程における、培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば１ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。本工程では、好ましくは、１μＭである。
ここで、ＨＤＡＣ阻害剤とは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の酵素活性を阻害又は失活させる物質として定義され、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤等、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））が挙げられる。
本発明で使用されるＨＤＡＣ阻害剤は、好ましくは、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）であり得る。培地中における酪酸ナトリウム（ＮａＢ）の濃度は、例えば１μＭ〜５ｍＭ、具体的には１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１２５〜２５０μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来又は人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程において、多能性幹細胞を解離させる工程を含んでも良い。細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）及びＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）等）又はコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ））を用いてヒト多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加することで行うことができる。
ここで、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、Ｙ−２７６３２であり得る。Ｙ−２７６３２の濃度は、例えば１００ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭである。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、又はそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、６日以上であり、特に好ましくは、６日である。また、ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、その添加する期間は１日又は２日であり、好ましくは２日である。さらに、ＨＤＡＣ阻害剤を添加する場合、本工程開始の翌日から添加して、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、又はそれ以上の日数、好ましくは、５日以上であり、特に好ましくは、５日間、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養する方法が例示される。
（２）ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程（Ｓｔｅｐ２）
本工程において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、３’−チオールグリセロール及びアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地及びＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を添加して前記工程（すなわち、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ＢＭＰ阻害剤とは、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ等のタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６−［４−（２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ−ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）及びＬＤＮ−１９３１８９（すなわち、４−（６−（４−（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ−１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社及びＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。
本発明で使用されるＢＭＰ阻害剤は、好ましくは、Ｎｏｇｇｉｎであり得る。培地中におけるＮｏｇｇｉｎの濃度は、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌ、具体的には１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Ｌｅｆｔｙ−１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２（４−（４−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−５−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ−８３−０１（ＷＯ ２００９１４６４０８）及びこれらの誘導体などが例示される。
本発明で使用されるＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、ＳＢ４３１５４２であり得る。培地中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、ＴＧＦβを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１μＭ〜５００μＭ、具体的には１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ及び５００μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培地（培養液）を上記培地（培養液）へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＳＯＸ１７及び／又はＦＯＸＡ２の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培地を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、又はそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、４日である。
（３）ＢＭＰ４、レチノイン酸及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程（Ｓｔｅｐ３）
本工程において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、３’−チオールグリセロール及びアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地及びＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＢＭＰ４、レチノイン酸及びＧＳＫ３β阻害剤を添加して前記工程（すなわち、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ＢＭＰ４とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００１２０２、ＮＭ＿１３０８５０又はＮＭ＿１３０８５１で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。
培養液中におけるＢＭＰ４の濃度は特に限定されないが、例えば１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌである。
ここで、レチノイン酸とは、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）が例示されるが、天然のレチノイン酸が有する機能を保持しながら人工的に修飾されたレチノイン酸であってもよく、例えば、４−［［（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ Ｄｅｖ．３２：１７−２６（１９９０））、４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）−１−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：５２６８−５２７２（１９８３））、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール若しくは、Ａｂｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：４９９０−４９９４（１９８１）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４：１８（１９８３）；Ｔａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：９１４−９１９（１９８０）に記載されている化合物が挙げられる。
培地中におけるレチノイン酸の濃度は、特に限定されないが、例えば１ｎＭ〜１μＭ、具体的には１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、５０ｎＭ〜１μＭである。
本工程におけるＧＳＫ３β阻害剤は、上述したＧＳＫ３β阻害剤を用いることができ、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。本工程における、培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば１ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。本工程では、好ましくは、１．５〜３．５μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来又は人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培地（培養液）を上記培地（培養液）へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ１７及び／又はＦＯＸＡ２の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培地を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、又はそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、４日以上であり、より好ましくは４日である。
（４）腹側前方前腸細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程（Ｓｔｅｐ４）
本工程において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７サプリメント、Ｌ−アスコルビン酸、モノチオグリセロール、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地及びＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル阻害剤を添加して前記工程（すなわち、ＢＭＰ４、レチノイン酸及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程）により得られた腹側前方前腸細胞を培養することによって行われる。
本工程におけるＧＳＫ３β阻害剤は、上述したＧＳＫ３β阻害剤を用いることができ、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。本工程における、培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば、１ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。本工程では、好ましくは、３μＭである。
ここで、ＦＧＦ１０とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００４４６５で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＦＧＦ１０は、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社又はＷａｋｏ社から入手可能である。
培地中におけるＦＧＦ１０の濃度は特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００２００９で示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＫＧＦは、例えば、Ｗａｋｏ社から入手することができる。
培地中におけるＫＧＦの濃度は特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＮＯＴＣＨシグナル阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナルを阻害する物質であり、例えばＤＡＰＴ（Ｎ−［２Ｓ−（３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ］−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ−ｇｌｙｃｉｎｅ）、ＤＢＺ（Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−Ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚ［ｂ，ｄ］ａｚｅｐｉｎ−７−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ］−３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ（Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（３Ｓ）−２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−５−ｐｈｅｎｙｌ−１Ｈ−１，４−ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ−３−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ］−３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＦＬＩ−０６（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ １，４，５，６，７，８−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−２，７，７−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−４−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｏｘｏ−３−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＬＹ４１１５７５（Ｎ２−［（２Ｓ）−２−（３，５−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈａｎｏｙｌ］−Ｎ１−［（７Ｓ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ−６，７−ｄｉｈｙｄｒｏ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｄ］ａｚｅｐｉｎ−７−ｙｌ］−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ）等が挙げられる。
本発明で使用されるＮＯＴＣＨシグナル阻害剤は、好ましくは、ＤＡＰＴであり得る。培地中におけるＤＡＰＴの濃度は、Ｎｏｔｃｈシグナルを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであり、好ましくは、２０μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来又は人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培地（培養液）を上記培地（培養液）へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＮＫＸ２−１、ＧＡＴＡ６及び／又はＨＯＰＸの陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培地を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により腹側前方前腸細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、又はそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、７日以上であり、より好ましくは７日である。
＜肺胞上皮前駆細胞を単離（選択）する工程＞
本発明において、工程（４）の後に、さらにＣＰＭ（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ）が陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を単離する工程を含むことができる。当該単離した肺胞上皮前駆細胞を工程（５）において使用することができる。単離した肺胞上皮前駆細胞は、肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団であればよく、好ましくは、肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団とは、肺胞上皮前駆細胞を５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上含有する細胞集団である。
肺胞上皮前駆細胞の単離は、ＣＰＭに特異的親和性を有する試薬を用いて行うことができる。ここで、特異的親和性を有する試薬とは、抗体、アプタマー、ペプチド又は特異的に認識する化合物等を用いることができ、好ましくは、抗体若しくはその断片である。
抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。抗体の断片としては、抗体の一部（例えばＦａｂ断片）又は合成抗体断片（例えば、一本鎖Ｆｖ断片「ＳｃＦｖ」）が例示される。
ＣＰＭを発現する細胞を認識又は分離することを目的として、当該親和性を有する試薬は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチン又はストレプトアビジン等の検出可能な物質又はプロテインＡ、プロテインＧ、ビーズ又は磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合又は接合されていてもよい。
当該親和性を有する試薬はまた、間接的に標識してもよい。例えば、抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。
肺胞上皮前駆細胞を単離（抽出）する方法には、当該親和性を有する試薬へ粒子を接合させ沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法（例えば、ＦＡＣＳ）、又は抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示される。
＜肺胞上皮前駆細胞を凍結保存に供する工程＞
さらに、工程（４）の後に、得られた肺胞上皮前駆細胞を凍結保存に供してもよい。凍結保存後、工程（５）を開始する際に、当該凍結保存した肺胞上皮前駆細胞を融解して使用することができる。
肺胞上皮前駆細胞の凍結保存は、例えば肺胞上皮前駆細胞を、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）：工程（４）に使用した培地＝１：４〜２０（好ましくは１：９）としたストック溶液に懸濁し、凍結用バイアルに注入後、速やかに細胞凍結容器に入れてディープフリーザーにて−２０〜−１５０℃（好ましくは−８０℃）で４〜４８時間（好ましくは２４時間）かけて緩徐に凍結した後、液体窒素タンクに保管することにより行うことができる。
また、凍結保存した細胞の融解は、例えば、事前に温めた工程（４）に使用した培地を速やかに添加して細胞を懸濁させ、３００〜１５００回転（好ましくは９００回転）で１〜１５分間（好ましくは５分間）遠心し、上清を吸引後、再度工程（４）に使用した培地で懸濁させることで行うことができる。
（５）肺胞上皮前駆細胞をステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含む培地で３次元培養する工程（Ｓｔｅｐ５）
本工程において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、ＩＴＳプレミックス、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、ＢＳＡ、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、ＩＴＳプレミックス、Ｂ２７サプリメント、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地である。
本工程では、上記の基礎培地へステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを添加して前記工程（ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程）により得られた肺胞上皮前駆細胞を培養することによって行われる。
ここで、ステロイド剤とは、ステロイド系抗炎症薬であり、グルココルチコイドあるいはその合成誘導体であり、例えば、ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、ベタメタゾンが例示される。
本発明で使用されるステロイド剤は、好ましくは、デキサメタゾンであり得る。培地中におけるデキサメタゾンの濃度は特に限定されないが、例えば１ｎＭ〜１μＭ、具体的には１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭであり、好ましくは、５０ｎＭである。
ここで、ｃＡＭＰ誘導体とは、ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰへ置換基が修飾された化合物であり、例えば、ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）、８−ｂｒｏｍｏ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、８−ｃｈｌｏｒｏ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ）、８−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）及びＤｉｂｕｔｙｒｙｌ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＢ−ｃＡＭＰ）が例示される。
本発明で使用されるｃＡＭＰ誘導体は、好ましくは、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり得る。培地中における８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの濃度は特に限定されないが、例えば１μＭ〜１ｍＭ、具体的には１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭであり、好ましくは、１００μＭである。
ここで、ホスホジエステラーゼ阻害剤とは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を阻害することにより、ｃＡＭＰあるいはｃＧＭＰの細胞内濃度を上昇させる化合物であり、例えば、１，３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、６，７−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、４−｛［３’，４’−（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌ］ａｍｉｎｏ｝−６−ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ及び３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）が例示される。
本発明で使用されるホスホジエステラーゼ阻害剤は、好ましくは、ＩＢＭＸであり得る。培地中におけるＩＢＭＸの濃度は特に限定されないが、例えば１μＭ〜１ｍＭ、具体的には１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭであり、好ましくは、１００μＭである。
本工程におけるＫＧＦは、上述したＫＧＦを用いることができる。培地中におけるＫＧＦの濃度は特に限定されないが、例えば１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌである。
本工程において、Ｙ−２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤をさらに培地に添加してもよい。培地中におけるＹ−２７６３２の濃度は、例えば１００ｎＭ〜５０μＭ、具体的には１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭである。
本工程において、肺胞上皮前駆細胞を成熟化させるために、肺胞上皮前駆細胞を３次元培養する。ここで、３次元培養とは、細胞を塊（スフェロイド）として浮遊状態で培養することを意味する。３次元培養では、例えば、ＢＤ社が提供するセルカルチャーインサートを使用して行うことができる。
３次元培養では、他の細胞種と共培養しても良く、この時用いる他の細胞種としては、ヒト肺線維芽細胞、及びヒト胎児肺線維芽細胞が例示され、このような細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及びＤＶ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社等から入手可能である。肺胞上皮前駆細胞と他の細胞種とは、例えば１：１０〜５００、好ましくは１：５０の比率で混合する。また、培地における細胞密度は、例えば０．５×１０^６個〜１ｘ１０^７個／ｍｌ、好ましくは２．５×１０^６個／ｍｌである。
３次元培養において、用いる培地は、上述の培地に細胞外基質を添加して用いてもよい。培地と細胞外基質との比率は、例えば１：０．２５〜１０、好ましくは１：１である。ここで、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体やペプチドハイドロゲル）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質又はこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＴＭ）等の細胞からの調製物であってもよい。人工物としては、ラミニンの断片やＣｏｒｎｉｎｇ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＴＭ）が例示される。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上又はそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、１４日以上であり、特に好ましくは、１４日である。
＜ＩＩ型肺胞上皮細胞を単離（選択）する工程＞
工程（５）の後に、さらにＳＦＴＰＣ（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）及びＣＥＡＣＡＭ６（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ６）から成る群より選択される１種以上のＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーが陽性であることを指標として、又は当該ＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーと生細胞の酸性分画（例えば、リソソーム）染色（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒによる染色）とが陽性であることを指標としてＩＩ型肺胞上皮細胞を単離する工程を含むことができる。
ＩＩ型肺胞上皮細胞の単離方法は、上述のＣＰＭが陽性であることを指標とした肺胞上皮前駆細胞の単離方法に準じて行うことができる。単離したＩＩ型肺胞上皮細胞は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を含有する細胞集団であればよく、好ましくは、ＩＩ型肺胞上皮細胞を含有する細胞集団とは、ＩＩ型肺胞上皮細胞を５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上含有する細胞集団である。
＜ＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存に供する工程＞
さらに、工程（５）の後に、得られたＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存に供し、保存することができる。
ＩＩ型肺胞上皮細胞の凍結保存は、例えばＩＩ型肺胞上皮細胞を、ＤＭＳＯ：工程（５）に使用した培地＝１：４〜２０（好ましくは１：９）としたストック溶液に懸濁し、凍結用バイアルに注入後、速やかに細胞凍結容器に入れてディープフリーザーにて−２０℃〜−１５０℃（好ましくは−８０℃）で４〜４８時間（好ましくは２４時間）かけて緩徐に凍結した後、液体窒素タンクに保管することにより行うことができる。
また、凍結保存した細胞の融解は、例えば、事前に温めた工程（５）に使用した培地を速やかに添加して細胞を懸濁させ、３００〜１５００回転（好ましくは９００回転）で１〜１５分間（好ましくは５分間）遠心し、上清を吸引後、再度工程（５）に使用した培地で懸濁させることで行うことができる。
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、且つ、増殖能をも併せ持つ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）等が含まれる。本発明では、胚の破壊を行わずに得られるという意味では、ｉＰＳ細胞又はＭｕｓｅ細胞を用いることが好ましい。
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウス等の哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サル等の霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））等の物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒト及びサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４−７８４８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５−１１４７；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５などに記載されている。
ＥＳ細胞作製のための培養液として、例えば０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ ＣａＣｌ_２及び２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ等の遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤ等の遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３−４５２）。
ヒトＥＳ細胞株（例えばＷＡ０１（Ｈ１）及びＷＡ０９（Ｈ９））は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できる等の性質を持つ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性を持つ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）等の物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；国際公開ＷＯ ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物若しくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３又はＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、ＭａｌｉＰ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤等］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７及びＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、Ｂｉｏ及びＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌ及びＧ９ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤等）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｌｃｉｕｍ ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤又はＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３及びＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５及びｍｉｒ−３０２等のｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２及びプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクション等の手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ ２０１０／００８０５４）等が例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用し得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等の制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子等の選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧ等のレポーター遺伝子配列等を含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子若しくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクション等の手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジン及びｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ Ｌ，（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．７：６１８−６３０）。
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノール等を適宜含むことができる。）又は市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］等が含まれる。
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上の後にｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノール等を適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上の後にＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７又はＷＯ２０１０／１３７７４６）、若しくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）及びマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：２３７−２４１又はＷＯ２０１０／０１３８４５）。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ^２あたり約５×１０^３〜約５×１０^６細胞の範囲である。
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞等の生殖系列細胞又は分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、及び成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞等が例示される。
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔ ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＥＳ）細胞である。ｎｔ ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞又は骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間又は１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５が陽性である。
＜多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造するためのキット＞
本発明は、多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造するためのキットを提供する。本キットには、上述した分化誘導に用いる増殖因子、化合物、培地、細胞外基質、解離溶液及び培養容器のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
＜ＩＩ型肺胞上皮細胞の培養方法＞
上述の本発明に係る多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法における工程（５）に準じて、本発明は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を、ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びＫＧＦを含む培地で３次元培養する工程を含む、ＩＩ型肺胞上皮細胞の培養方法に関する。Ｙ−２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤をさらに培地に添加してもよい。
また、ＷＮＴシグナル阻害剤及び／又はＩＧＦ２を培地に添加することにより、ＩＩ型肺胞上皮細胞を効率よく維持することができる。
ＷＮＴシグナル阻害剤とはＷＮＴシグナルを阻害する物質であり、ＷＩＦ１のような蛋白質性阻害剤や、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＲ１（４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１，３−ｄｉｏｘｏ−４，７−ｍｅｔｈａｎｏ−２Ｈ−ｉｓｏｉｎｄｏｌ−２−ｙｌ）−Ｎ−８−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ−Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＣＧ−００１（（６Ｓ，９ａＳ）−Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−６−［（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−８−（１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−４，７−ｄｉｏｘｏ−Ｎ−（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−２Ｈ−ｐｙｒａｚｉｎｏ［１，２−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−１（６Ｈ）−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）のような低分子化合物等が挙げられる。
ＷＩＦ１とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００７１９１で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＷＩＦ１は、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能である。
一方、ＩＧＦ２とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿０００６１２で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＩＧＦ２は、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社やＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能である。
本発明で使用されるＷＮＴシグナル阻害剤は、好ましくは、ＷＩＦ１であり得る。
培地中におけるＷＩＦ１の濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、３００ｎｇ／ｍｌである。
培地中におけるＩＧＦ２の濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、具体的には１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
ＩＩ型肺胞上皮細胞は、例えば、組織等から単離した初代培養細胞であってもよく、上述の本発明に係る多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を製造する方法により製造されたＩＩ型肺胞上皮細胞であってよい。
当該工程による継代を、例えば１４日間〜３５日間又はそれ以上の間隔、具体的には１４日間、１６日間、１８日間、２０日間、２１日間、２２日間、２４日間、２６日間、２８日間、３０日間、３２日間、３４日間、３５日間、あるいはそれ以上の間隔、好ましくは１４日間間隔で繰り返すことができる。
＜ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養するためのキット＞
本発明は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養するためのキットを提供する。本キットには、上述した培養に用いる増殖因子、化合物、培地、細胞外基質、解離溶液及び培養容器のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに培養の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
＜本発明において得られたＩＩ型肺胞上皮細胞の用途＞
本発明において得られたＩＩ型肺胞上皮細胞は、例えば特発性肺線維症、遺伝性間質性肺疾患、先天性肺胞蛋白症等の難治性呼吸器疾患の治療薬を開発する際の候補薬のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける大規模スクリーニングに使用することができる。
また、本発明で得られたＩＩ型肺胞上皮細胞は、製剤として肺胞の破壊される疾患患者に投与することができる。得られたＩＩ型肺胞上皮細胞をシート化して、患者の肺胞上皮に貼付してもよく、生理食塩水等に懸濁させ、患者の肺胞に直接移植することによって行われ得る。従って、本発明では、上記の方法で多能性幹細胞より得られたＩＩ型肺胞上皮細胞を含む肺胞疾患治療剤を提供する。
本発明において、肺胞疾患治療剤に含まれるＩＩ型肺胞上皮細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製してもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

ＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導方法
１．ＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導方法
図１は、ヒト多能性幹細胞を用いて腹側前方前腸細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を誘導する方法を示す。
１−１．Ｓｔｅｐ１−３でのヒト多能性幹細胞から腹側前方前腸細胞への分化誘導
非特許文献６に記載の方法に従い、ヒト多能性幹細胞から腹側前方前腸細胞への分化誘導を行った。
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７，６０４Ａ１）は、京都大学の山中教授より、ヒトＥＳ細胞（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより受領し、従来の方法で培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−８７２，２００７，Ｏｋｉｔａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．３１：４５８−４６６，２０１３，Ｇｏｔｏｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．３：３９４−４０３，２０１４）。
また、Ｍａｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４：１３６７，２０１３に記載された方法と同様の方法を用いてヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）のＳＦＴＰＣの開始コドンの下流にＥＧＦＰ配列をＫｎｏｃｋ−ｉｎさせたＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２０１Ｂ７（ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーターｉＰＳ細胞株Ｂ２−３）を作製した。
これらのヒト多能性幹細胞をＡｃｃｕｔａｓｅにより解離させ、マトリゲルコーティングした２４ウェルプレートに１ウェル当たり２．０ｘ１０^５個、又はマトリゲルコーティングした６ウェルプレートに１ウェル当たり９．６ｘ１０^５個を播種し、次の条件で培養することによって腹側前方前腸細胞を誘導した。
１−１−１．Ｓｔｅｐ１
播種した細胞（Ｄａｙ０）を１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び１０μＭ Ｙ−２７６３２を添加した基礎培地（２％ Ｂ２７（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｉｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ））中で培養した。翌日（Ｄａｙ１）、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び０．２５ｍＭ ＮａＢを含有する上記基礎培地へ培地を交換し、翌日（Ｄａｙ２）及び３日後（Ｄａｙ４）に同じ条件の培地へ培地を交換し、５日間培養した。
あるいは、播種した細胞（Ｄａｙ０）を１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び１０μＭ Ｙ−２７６３２を添加した上記基礎培地中で培養した。翌日（Ｄａｙ１）、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ Ｙ−２７６３２及び０．１２５ｍＭ又は０．２５ｍＭ ＮａＢを含有する上記基礎培地へ培地を交換し、翌日（Ｄａｙ２）、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、及び０．１２５ｍＭ又は０．２５ｍＭ ＮａＢを含有する上記基礎培地へ培地を交換し、３日後（Ｄａｙ４）に同じ条件の培地へ培地を交換した。
１−１−２．Ｓｔｅｐ２
Ｓｔｅｐ１で得られた細胞（Ｄａｙ６）を１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ ＳＢ−４３１５４２を添加した基礎培地（１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８％ ＳｔｅｍＳｕｒｅ^ＴＭ５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及び０．５％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｉｕｔｉｏｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で４日間培養した。この時、２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。
１−１−３．Ｓｔｅｐ３
Ｓｔｅｐ２で得られた細胞（Ｄａｙ１０）を２０ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ４（ＨｕｍａｎＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．）、０．０５μＭ、０．５μＭ又は１．０μＭ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）及び２．５μＭ又は３．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有する上記Ｓｔｅｐ２で使用した基本培地中で４日間培養した。この時、２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。
１−２．Ｓｔｅｐ４での二次元培養
第１−１節で分化誘導したＤａｙ１４（Ｓｔｅｐ３終了時点）の腹側前方前腸細胞に対して、Ｓｔｅｐ４用培地で７日間培養することで肺胞上皮前駆細胞が効率よく得られた。Ｓｔｅｐ４用培地の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．０５ｍｇ／ｍｌ、モノチオグリセロール（Ｗａｋｏ）０．４ｍＭ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５０Ｕ／ｍｌの基本培地に対して、ＣＨＩＲ９９０２１ ３μＭ、ＦＧＦ１０ １０ｎｇ／ｍｌ、ＫＧＦ（Ｐｒｏｓｐｅｃ）１０ｎｇ／ｍｌ及びＤＡＰＴ ２０μＭを添加したものであった。
１−３．ＦＡＣＳによる肺胞上皮前駆細胞の単離
第１−２節のＤａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）に、ＣＰＭに対する抗体を用いてｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）で肺胞上皮前駆細胞を単離した。肺胞上皮前駆細胞を剥離する１時間前に培地にＹ−２７６３２ １０μＭを添加した。その後、ＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）で培養プレートを洗浄後、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを加えて１２分間３７℃でインキュベートした。ＥＤＴＡ／ＰＢＳを除去後、アキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して２５分間３７℃でインキュベートした後、２％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を加えてピペッティング操作することで細胞を回収した。回収した細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーメッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に通した後、８００回転で５分間遠心後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、一次抗体としてマウス抗ヒトＣＰＭ抗体（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、１５分間４℃で反応させた。
一次抗体処理終了後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、二次抗体としてＡｌｅｘａ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、暗所で１５分間４℃で反応させた。二次抗体処理終了後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、最後にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅを添加した後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ若しくはＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳにより、ＣＰＭ陽性細胞及びＣＰＭ陰性細胞を単離し、ＣＰＭ陽性細胞を肺胞上皮前駆細胞として使用した。なお、アイソタイプコントロールとしてマウスＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した細胞をＦＡＣＳのゲーティングに用いた。
１−４．Ｓｔｅｐ５での三次元共培養
Ｓｔｅｐ４においてＦＡＣＳ若しくはＭＡＣＳで単離した肺胞上皮前駆細胞又は凍結保存した肺胞上皮前駆細胞とヒト胎児肺線維芽細胞（妊娠１７．５週、ＤＶ ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）とを２：１００の比率で混ぜ、２．５×１０^６個／ｍｌの細胞密度で、Ｙ−２７６３２を最終濃度１０μＭとなるように添加したＳｔｅｐ５用培地の細胞懸濁液とＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とを１：１で低温で混合し、速やかにセルカルチャーインサートの上層に加え、下層にはＳｔｅｐ５用培地を加えた。この時、上層に加える量は１２−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ用セルカルチャーインサートの場合は２００〜４００μｌが望ましく、２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ用セルカルチャーインサートの場合は１００μｌが望ましい。下層にはＳｔｅｐ５用の培地を、１２−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ用セルカルチャーインサートの場合は１ｍｌが望ましく、２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ用セルカルチャーインサートの場合は５００μｌが望ましい。
最初の２日間は、Ｓｔｅｐ５用培地にＹ−２７６３２を最終濃度１０μＭとなるように添加し、それ以降は１日おきに下層のみＳｔｅｐ５用培地を交換した。
なお、Ｓｔｅｐ５用培地の組成は、Ｈａｍｓ’Ｆ１２（Ｗａｋｏ）、０．２５％ ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍＭ、ＣａＣｌ_２（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）０．８ｍＭ、１×ＩＴＳｐｒｅｍｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、０．５×Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５０Ｕ／ｍｌの基本培地に対して、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｎＭ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇ）１００μＭ、ＩＢＭＸ（Ｗａｋｏ）１００μＭ及びＫＧＦ（Ｐｒｏｓｐｅｃ）１０ｎｇ／ｍｌを添加したものであった。
２．ＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導結果
図２は、図１のＳｔｅｐ４用培地の組成を、ＮＫＸ２．１をマーカータンパク質とする肺胞上皮前駆細胞の誘導効率と単離の点から検討した結果を示す。
図２Ａ〜Ｄは、以下を示す：
Ａ：検討を行った６つの条件。
Ｂ：腹側前方前腸細胞を各条件下に７日間培養後、Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）のＮＫＸ２．１^＋細胞の蛍光免疫染色像を示す。（４）の条件が最もＮＫＸ２．１の陽性率が高かった。
Ｃ：（４）の条件で培養したＤａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）の肺胞上皮前駆細胞に対して抗ＣＰＭ抗体を用いて行ったフローサイトメトリーの結果を示す。ヒトｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７，６０４Ａ１）及びヒトＥＳ細胞株（Ｈ９）でＣＰＭ^＋細胞が多く含まれたことを示す。
Ｄ：Ｃの各細胞株についてＣＰＭ^＋細胞及びＣＰＭ⁻細胞を単離してサイトスピンでスライドグラスに付着させて核染色と同時にＮＫＸ２．１を蛍光免疫染色した結果を示す。ＣＰＭ^＋細胞にほとんどのＮＫＸ２．１^＋細胞が含まれ、ＣＰＭ⁻細胞にはＮＫＸ２．１⁻細胞がほとんど含まれなかったことを示す。非特許文献６では、Ｄａｙ１４（Ｓｔｅｐ３終了時）の腹側前方前腸細胞について示していたが、同じことがＤａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）にも当てはまることを確認した。
図３は、Ｓｔｅｐ４用培地の組成について、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）のＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質であるＳＦＴＰＣの発現レベルの点から検討した結果を示す。図２で示した６条件の培地で腹側前方前腸細胞を７日間培養後、Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）でＣＰＭ^＋細胞を単離し、ヒト胎児肺線維芽細胞と１４日間、三次元共培養を行った後、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）でＳＦＴＰＣの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで評価した。６条件の中で、（４）の条件でＳＦＴＰＣの発現レベルが最も高かった。
図４は、図２の（４）の条件での培養期間について、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）のＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質であるＳＦＴＰＣの発現レベルの点から検討した結果を示す。Ｓｔｅｐ４の期間が７日間のとき、Ｄａｙ３５におけるＳＦＴＰＣ発現量が多い傾向にあったことを示す。
図５は、ＳＦＴＰＣ（ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ）レポーターｉＰＳ細胞を用いて、Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）にＣＰＭ^＋細胞（肺胞上皮前駆細胞）と比較対照としてＣＰＭ⁻細胞とをそれぞれ単離し、ヒト胎児肺線維芽細胞と三次元共培養し、１４日間かけて肺胞上皮前駆細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞が誘導される経過をｗｈｏｌｅ ｗｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇした結果を示す。ＣＰＭ^＋細胞もＣＰＭ⁻細胞も継時的にスフェロイドを形成し、増加して拡大するが、ＣＰＭ^＋細胞では１１日から１４日にかけてＳＦＴＰＣ−ＧＦＰが陽性となるのに対して、ＣＰＭ⁻細胞では陰性のままであったことを示す。
図６は、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）においてＣＰＭ^＋細胞から形成されたスフェロイドを強拡大で観察したものである。ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ^＋細胞が管腔状の構造を形成したことを示す。
図７は、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）においてフローサイトメトリーを行い、ＩＩ型肺胞上皮細胞を意味するＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ^＋細胞の比率が、ＣＰＭ^＋細胞由来のＥｐＣＡＭ^＋細胞のうち５０％に達したことを示す。その一方でＣＰＭ⁻細胞由来のＥｐＣＡＭ^＋細胞では、ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ^＋細胞は０％であった。ネガティブコントロールとしてはレポーター細胞を作る前の状態の２０１Ｂ７ヒトｉＰＳ細胞株を用いた。
図８は、図１に示したＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導法（Ｎｅｗ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が、非特許文献６に記載の方法（Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に比べても、ＳＦＴＰＣ及びＳＦＴＰＢの発現レベルにおいても増加したことを示す。ＣＰＭ^＋はＣＰＭ^＋細胞由来、ＣＰＭ⁻はＣＰＭ⁻細胞由来の三次元共培養産物の遺伝子発現を示す。
図９は、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）において、様々なＩＩ型肺胞上皮細胞のマーカータンパク質がＣＰＭ^＋細胞由来の三次元培養産物に発現することをＣＰＭ⁻細胞由来の三次元培養産物と比較して示す。肺サーファクタントタンパク質であるＳＦＴＰＡ及びＳＦＴＰＤ、ＩＩ型肺胞上皮細胞の形態学的特徴であるｌａｍｅｌｌａｒ ｂｏｄｙに局在するＤＣ−ＬＡＭＰ及びＡＢＣＡ３、サーファクタントに含まれる脂質を合成する酵素として知られるＬＰＣＡＴ１等のＩＩ型肺胞上皮細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現がＣＰＭ^＋細胞由来の三次元培養産物に多く認められたことを示す。
図１０は、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）におけるスフェロイドの蛍光二重免疫染色像を示す。ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＤの各種サーファクタントタンパク質が管腔を構成する細胞に発現したことを示す。ｌａｍｅｌｌａｒ ｂｏｄｙのマーカーであるＤＣ−ＬＡＭＰが管腔側に特に局在したことを示す。
図１１は、Ｄａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）におけるスフェロイドの透過型電子顕微鏡像を示す。ＩＩ型肺胞上皮細胞に特徴的な構造物であるｌａｍｅｌｌａｒ ｂｏｄｙが多数形成され（右の写真）、その前駆体であるｍｕｌｔｉ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ（左の写真）も認められた。

ＩＩ型肺胞上皮細胞の培養方法
１．ＩＩ型肺胞上皮細胞の三次元継代培養
図１２は、ヒト多能性幹細胞から誘導して作製したＩＩ型肺胞上皮細胞を三次元共培養系で長期間にわたり継代しながら培養する方法を示す。
実施例１におけるＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導のＤａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）に、三次元共培養した線維芽細胞とスフェロイドから成る細胞塊をセルカルチャーインサートから取り出した。取り出した細胞塊を、清潔なメスを用いて１ｍｍ片程度に細かく切り、ＰＢＳを添加して回収し、９００回転で５分間遠心して上清を除去した。沈殿物に０．１％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを添加し、適宜ピペッティングを繰り返しながら３７℃で１５分間インキュベートした。
次いで、２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを加えてトリプシンを中和し、４℃で９００回転、７分間遠心した。上清を吸引し、残った細胞ペレットに１％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、再度４℃で９００回転、５分間遠心した。細胞ペレットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、マウス抗ヒトＥｐ−ＣＡＭ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を加えて４℃で２０分間反応させた。
次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗マウス抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、４℃で２０分間反応させた。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄後、最後にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅを添加し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ若しくはＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳにより、ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰ陽性細胞を単離した。これをＩＩ型肺胞上皮細胞（ＡＴ２−Ｐ０）とした。
また、レポーター細胞を使わずにＩＩ型肺胞上皮細胞を単離する場合は、Ａｌｅｘａ６４７で標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、若しくはＩＩ型肺胞上皮細胞の既知の表面抗原（ＡＴ２−ａｎｔｉｇｅｎ）に対するラベル化抗体（ＰＥ標識抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体など）を用いて、ＦＡＣＳでＥｐＣＡＭ陽性ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性若しくはＡＴ２−ａｎｔｉｇｅｎ陽性細胞を単離した。
ＩＩ型肺胞上皮細胞を継代培養する場合、単離直後、或いは凍結保存操作を加えたＩＩ型肺胞上皮細胞とヒト胎児肺線維芽細胞とを１：５０の比率で混ぜ、２．５×１０^６個／ｍｌの細胞密度で、Ｙ−２７６３２を最終濃度１０μＭとなるように添加したＳｔｅｐ５用培地の細胞懸濁液とＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とを１：１で低温で混合し、速やかにセルカルチャーインサートの上層に加え、下層にはＳｔｅｐ５用培地を加えた。１２−ｗｅｌｌｐｌａｔｅ用セルカルチャーインサートの場合は、上層に加える量は２００〜４００μｌが望ましく、下層には１ｍｌが望ましい。
継代後、最初の２日間は、Ｓｔｅｐ５用培地にＹ−２７６３２を最終濃度１０μＭとなるように添加し、それ以降は１日おきに下層のみＳｔｅｐ５用培地を交換し、１４日間培養後、ＩＩ型肺胞上皮細胞を単離し、上記のヒト胎児肺線維芽細胞との三次元共培養を繰り返して培養を継続した。継代が１つ進む毎にＡＴ２−Ｐ１、ＡＴ２−Ｐ２、．．．と区別した。
なお、Ｓｔｅｐ５用培地に、ＷＩＦ１ ３００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＩＧＦ２ １００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することで、ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｗａｋｏ）、ＮＲＧ１ β ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＣＨＩＲ９９０２１ ３μＭ（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）を添加する場合に比べてＩＩ型肺胞上皮細胞がより効率よく維持された。
２．ＩＩ型肺胞上皮細胞の三次元継代培養結果
図１２に示すように、肺胞上皮前駆細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞に分化するＳｔｅｐ５のＩＩ型肺胞上皮細胞をＡＴ２−Ｐ０と定義し、単離して三次元共培養で継代することで、ＡＴ２−Ｐ１からＡＴ２−Ｐ５（Ｄａｙ１０５）まで培養できることを確認した。
図１３は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を三次元共培養系で継代しながら培養することにより、ＳＦＴＰＣを一定の陽性率で維持できたことを示す。
図１４は、継代したＩＩ型肺胞上皮細胞（ＡＴ２−Ｐ３）によって形成されたスフェロイドが、ＡＴ２−Ｐ０のスフェロイドと同様にＤＣ−ＬＡＭＰ及びＳＦＴＰＣを発現したことを蛍光二重免疫染色像で示す。
図１５は、ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞ではないヒトｉＰＳ細胞株（６０４Ａ１）を用いてＤａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）まで分化誘導し、ＡＴ２−Ｐ０の段階で抗ＥｐＣＡＭ抗体とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを用いてＩＩ型肺胞上皮細胞が単離できたことを示す。
図１５Ａ及びＢは以下を示す：
Ａ：抗ＥｐＣＡＭ抗体とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ ＤＮＤ２６を用いて二重染色を行なってから解析したフローサイトメトリーの結果を示す。
Ｂ：ＥｐＣＡＭ^＋ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ^＋細胞及びＥｐＣＡＭ^＋ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ⁻細胞を単離してサイトスピンでスライドグラスに付着させて核染色と同時にＳＦＴＰＣを蛍光免疫染色した結果を示す。ＥｐＣＡＭ^＋ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ^＋細胞にほとんどのＳＦＴＰＣ^＋細胞が含まれ、ＥｐＣＡＭ^＋ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ⁻細胞にはＳＦＴＰＣ^＋細胞がほとんど含まれなかったことを示す。
図１６は、図１５と同様にＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞ではないヒトｉＰＳ細胞株（６０４Ａ１）を用いてＤａｙ３５（Ｓｔｅｐ５終了時）まで分化誘導し、ＡＴ２−Ｐ０の段階で抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を用いてＩＩ型肺胞上皮細胞が単離できたことを示す。
図１６Ａ及びＢは以下を示す：
Ａ：抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を用いて一重染色を行なってから解析したフローサイトメトリーの結果を示す。
Ｂ：ＣＥＡＣＡＭ６^＋細胞及びＣＥＡＣＡＭ６⁻細胞を単離してサイトスピンでスライドグラスに付着させて核染色と同時にＳＦＴＰＣを蛍光免疫染色した結果を示す。図１５ほどではないが、ＳＦＴＰＣ^＋細胞のほとんどがＣＥＡＣＡＭ６^＋細胞に含まれ、ＣＥＡＣＡＭ６⁻細胞にはＳＦＴＰＣ^＋細胞がほとんど含まれなかったことを示す。
図１７は、ＳＦＴＰＣ−ＧＦＰレポーター細胞を用いてＡＴ２−Ｐ０を単離し、図１２に示したように継代を行なう際、Ｓｔｅｐ５用培地にＷＩＦ１（３００ｎｇ／ｍｌ）若しくはＩＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加すると、ＩＩ型肺胞上皮細胞が効率良く維持されたことを示す。Ｓｔｅｐ５用培地で維持する対照実験では、ＡＴ２−Ｐ１におけるＩＩ型肺胞上皮細胞の維持率が上皮細胞成分の４８．４％（共培養に用いた線維芽細胞を含めた全体の９．４％）に対して、各添加因子（ＷＩＦ ３００ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ２ １００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ＮＲＧ１ β ２０ｎｇ／ｍｌ、ＣＨＩＲ９９０２１ ３μＭ）を加えると、それぞれ上皮細胞成分の５４．４％、５８．０％、５．３％、２９．５％、２３．８％（全体の２０．２％、１６．６％、１．２％、１１．３％、０．５％）の維持率だった。

肺胞上皮前駆細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞のストック方法
１．肺胞上皮前駆細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞のストック方法
１−１．ＭＡＣＳによる肺胞上皮前駆細胞の単離・凍結保存
図１８は、Ｄａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）のヒト肺胞上皮前駆細胞を凍結保存し、その細胞を用いて三次元共培養を行うことで、ＩＩ型肺胞上皮細胞を誘導する方法を示す。
実施例１におけるＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導のＤａｙ２１（Ｓｔｅｐ４終了時）に、ＣＰＭに対する抗体を用いてｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）で肺胞上皮前駆細胞を単離して凍結保存した。上述の実施例１におけるＦＡＣＳによる肺胞上皮前駆細胞の単離と同じ方法で、マウス抗ヒトＣＰＭ抗体による一次抗体反応まで進めて１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。
その後、二次抗体としてｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ標識された抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、１５分間４℃で反応させた。２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、磁気分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたＭＡＣＳでＣＰＭ陽性細胞を単離し、純度を高めるため、ＭＡＣＳを２回繰り返した。
単離した肺胞上皮前駆細胞を凍結保存する際は、５．０×１０^５個の細胞をＤｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：Ｓｔｅｐ４用培地＝１：９としたストック溶液５００μｌに懸濁し、凍結用バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に注入後、速やかに細胞凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）に入れてディープフリーザーにて−８０℃で２４時間かけて緩徐に凍結した後、液体窒素タンクに保管した。
凍結保存した細胞を融解させる際は、事前に温めたＳｔｅｐ４用培地１０ｍｌを速やかに添加して細胞を懸濁させ、９００回転で５分間で遠心し、上清を吸引後、再度Ｓｔｅｐ４用培地で懸濁させた。
１−２．ＩＩ型肺胞上皮細胞の凍結保存
図２０は、ＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存し、その細胞を用いて三次元共培養を行うことで、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養する方法を示す。
実施例１におけるＩＩ型肺胞上皮細胞の誘導後、単離したＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存する場合、２．０×１０^５個の細胞をＤＭＳＯ：Ｓｔｅｐ５用培地＝１：９で混合したストック溶液２００μｌに懸濁し、凍結用バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に注入後、速やかに細胞凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）に入れてディープフリーザーにて−８０℃で２４時間かけて緩徐に凍結した後、液体窒素タンクに保管した。
凍結保存した細胞を融解させる際は、事前に温めたＳｔｅｐ５用培地１０ｍｌを速やかに添加して細胞を懸濁させ、９００回転、５分間で遠心し、上清を吸引後、再度Ｓｔｅｐ５用培地で懸濁させた。
２．肺胞上皮前駆細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞のストック結果
２−１．肺胞上皮前駆細胞のストック結果
図１９は、図１８の結果、２０％程度の効率で凍結保存した肺胞上皮前駆細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞が分化できたことを示す。
２−２．ＩＩ型肺胞上皮細胞のストック結果
図２０に示すように、ＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結保存し、その細胞を用いて三次元共培養を行うことで、ＳＦＴＰＣを一定の陽性率で維持しながら培養できた。

本発明によれば、多能性幹細胞からＩＩ型肺胞上皮細胞を効率良く製造し、またＩＩ型肺胞上皮細胞を維持することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (28)

1. 多能性幹細胞からII型肺胞上皮細胞を製造する方法であって、次の(1)〜(5)の工程を含む、前記方法：
   (1) 多能性幹細胞をアクチビンA及びGSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程；
   (2) (1)の工程で得られた細胞をBMP阻害剤及びTGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
   (3) (2)の工程で得られた細胞をBMP4、レチノイン酸及びGSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程；
   (4) (3)の工程で得られた腹側前方前腸細胞を、GSK3β阻害剤、FGF10、KGF及びNOTCHシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程；
   (5) (4)の工程で得られた肺胞上皮前駆細胞をステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含む培地で3次元培養する工程。
2. GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がNogginであり、TGFβ阻害剤がSB431542であり、NOTCHシグナル阻害剤がDAPTであり、ステロイド剤がデキサメタゾンであり、cAMP誘導体が8-Br-cAMPであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)である、請求項１記載の方法。
3. 工程(1)において、さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を培地に添加して多能性幹細胞を培養する、請求項１又は２記載の方法。
4. ROCK阻害剤がY-27632であり、且つ/又はHDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。
5. 工程(4)の後に、さらにCPMが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を単離する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 工程(4)の後に、得られた肺胞上皮前駆細胞を凍結保存に供し、且つ工程(5)における肺胞上皮前駆細胞は、当該凍結保存した肺胞上皮前駆細胞を融解したものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 工程(5)において、さらにROCK阻害剤を培地に添加して肺胞上皮前駆細胞を3次元培養する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. ROCK阻害剤がY-27632である、請求項７記載の方法。
9. 工程(5)の後に、さらにSFTPC、EpCAM及びCEACAM6から成る群より選択される1種以上のII型肺胞上皮細胞マーカーが陽性であることを指標としてII型肺胞上皮細胞を単離する工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. さらに生細胞の酸性分画染色が陽性であることを指標としてII型肺胞上皮細胞を単離する、請求項９記載の方法。
11. 工程(5)の後に、得られたII型肺胞上皮細胞を凍結保存に供する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. アクチビンA、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、BMP4、レチノイン酸、FGF10、KGF、NOTCHシグナル阻害剤、ステロイド剤、cAMP誘導体、及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により多能性幹細胞からII型肺胞上皮細胞を製造するためのキット。
13. GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がNogginであり、TGFβ阻害剤がSB431542であり、NOTCHシグナル阻害剤がDAPTであり、ステロイド剤がデキサメタゾンであり、cAMP誘導体が8-Br-cAMPであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項１２記載のキット。
14. ROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤をさらに含有する、請求項１２又は１３記載のキット。
15. ROCK阻害剤がY-27632であり、且つ/又はHDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項１４記載のキット。
16. II型肺胞上皮細胞をステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含む培地で3次元培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞の培養方法。
17. ステロイド剤がデキサメタゾンであり、cAMP誘導体が8-Br-cAMPであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項１６記載の方法。
18. さらにROCK阻害剤を培地に添加してII型肺胞上皮細胞を3次元培養する、請求項１６又は１７記載の方法。
19. ROCK阻害剤がY-27632である、請求項１８記載の方法。
20. さらにWNTシグナル阻害剤及び/又はIGF2を培地に添加してII型肺胞上皮細胞を3次元培養する、請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法。
21. WNTシグナル阻害剤がWIF1である、請求項２０記載の方法。
22. II型肺胞上皮細胞が請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により製造されたII型肺胞上皮細胞である、請求項１６〜２１のいずれか１項記載の方法。
23. ステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含有する、請求項１６〜２２のいずれか１項記載の方法によりII型肺胞上皮細胞を培養するためのキット。
24. ステロイド剤がデキサメタゾンであり、cAMP誘導体が8-Br-cAMPであり、且つホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項２３記載のキット。
25. ROCK阻害剤をさらに含有する、請求項２３又は２４記載のキット。
26. ROCK阻害剤がY-27632である、請求項２５記載のキット。
27. WNTシグナル阻害剤及び/又はIGF2をさらに含有する、請求項２３〜２６のいずれか１項記載のキット。
28. WNTシグナル阻害剤がWIF1である、請求項２７記載のキット。