TWI794821B - 用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的方法。本發明亦揭示該方法可被用於製備肺泡上皮三維細胞培養物。

Description

用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的方法
本發明是有關於一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞(primary human pulmonary alveolar epithelial cells, primary HPAEpiC)的方法，特別是一種能夠在體外使原代人類肺泡上皮細胞增生，同時能夠維持其細胞型態與生理功能的方法。
人類肺泡上皮(human pulmonary alveolar epithelium)主要是由肺泡第1型上皮細胞(alveolar type 1 epithelial cell, AT1 cell)與肺泡第2型上皮細胞(alveolar type 2 epithelial cell, AT2 cell)這兩種細胞以及其間所形成之緊密連接(tight junction)與黏附連接(adherens junction)所構成之組織，可提供重要的上皮屏障(epithelial barrier)功能。AT1細胞數量約佔肺總細胞的8%，其細胞型態大而扁平，覆蓋95%以上的肺泡表面積，形成肺泡的主要結構並負責肺泡內空氣與周邊微血管血液之間的氣體交換；AT2細胞數量約佔肺總細胞的16%，其細胞型態為立方型且體積較小，分散於AT1細胞之間而僅覆蓋5%的肺泡表面積，AT2細胞除了會合成並分泌表面活性劑蛋白(surfactant proteins)來維持肺泡結構的穩定性以外，它也是肺泡上皮中的幹細胞，當組織受到損傷時能夠自我更新並且分裂分化為新的AT1細胞來進行修復。
目前在肺泡上皮的相關研究(例如疾病的發展與治療以及藥物的篩選等)中，大多選用經永生化處理的(immortalized)人類肺腺癌細胞細胞株(human lung adenocarcinoma cells cell line) A549或NCI-H441或者人類經誘導之多功能幹細胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSC)所衍生的AT2細胞來作為體外( in vitro)肺泡上皮模型。然而，這些體外模型的生理功能與基因表現與實際的人體組織之間仍存在有差異，特別是hiPSC-衍生的AT2細胞因不存在AT1細胞，而缺乏完整的肺泡上皮功能。
在H.Y. Wang et al.(2018), BMC Cell Biol., 19(1):10中，H.Y. Wang等人將一永生化的豬氣管上皮細胞(swine tracheal epithelial cells, STECs)細胞株以及一經分離的原代STECs拿來進行氣液介面培養(air-liquid surface culture)以模擬人類肺泡環境，並比較兩種細胞的分化能力以及免疫功能。而結果顯示，相較於永生化STECs，原代STECs能夠形成較完整的緊密連接，而且其纖毛(cilia)結構的表現時間更長。由此可見，利用原代細胞(primary cells)來建立體外呼吸道的上皮模型上顯然更為理想。因此，為了能夠建立一更貼近真實人體的肺泡上皮生理狀態的體外模型，研究人員皆嘗試自健康的捐贈者組織或器官中分離出原代人類肺泡上皮細胞(primary human pulmonary alveolar epithelial cells, primary HPAEpiC)來進行培養。
在培養原代HPAEpiC的相關研究中發現，纖維母細胞(fibroblast)可提供一肺泡幹細胞區位(alveolar stem cell niche)來支持AT2細胞的生長，因此，原代HPAEpiC的體外培養通常會加入人類纖維母細胞來進行共培養(co-culture)。然而，此類共培養方法不僅步驟較為繁雜，亦可能在後續分析時造成干擾。
在K. Shiraishi et al.(2019), Biochem. Biophys. Res. Commun., 515(4):579-585中，K. Shiraishi等人將市售的原代HPAEpiC、添加有多種生長因子的市售之小呼吸道上皮生長培養基(small airway epithelial growth medium)以及基質膠(Matrigel)予以混合，待基質膠凝固以後，再加入添加有多種訊號配體(signal ligands)與抑制劑(inhibitors)的上皮細胞培養基來予以培養，結果顯示，此方法能夠在體外使AT2細胞擴增，並且形成類球體(spheroids)。接著，K. Shiraishi等人進一步利用磁珠標記細胞分選系統(magnetic-activated cell sorting system)來將AT2細胞所形成的類球體分離出，以避免存在於原代HPAEpiC細胞中的基底細胞(basal cells)等其他細胞產生干擾。然而，此一培養方法僅能培養出AT2細胞類球體的三維結構，而無法應用於氣液介面培養以模擬人類肺泡上皮環境。
發明概要
在本發明中，申請人意外地發現，使用特定的培養補充劑之組合[包括JAG-1胜肽(Jagged-1 peptide, JAG-1 peptide)、人類Noggin蛋白(human Noggin protein)、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7 (human fibroblast growth factor 7, hFgf7)、人類纖維母細胞生長因子10 (hFgf10)以及CHIR99021]以及Rho激酶抑制劑(Rho kinase inhibitor)來培養原代人類肺泡上皮細胞能夠有效地使原代人類肺泡上皮細胞增生(proliferate)，並且維持(maintain)其中肺泡第1型上皮細胞(alveolar type 1 epithelial cell, AT1)以及肺泡第2型上皮細胞(alveolar type 2 epithelial cell, AT2)的上皮細胞型態以及生理功能，避免其在培養過程中分化(differentiate)為纖維母細胞(fibroblast)。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞(primary human pulmonary alveolar epithelial cells, primary HPAEpiC)的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞培養於一第一培養基中，其中該第一培養基包含有一基礎培養基、一培養補充劑組成物，以及一Rho激酶抑制劑，其中該培養補充劑組成物包含有JAG-1胜肽、人類Noggin蛋白、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7、人類纖維母細胞生長因子10，以及CHIR99021；以及 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞培養於一第二培養基中，其中該第二培養基包含有該基礎培養基以及該培養補充劑組成物，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生。
在第二個方面，本發明提供一種用於製備肺泡上皮三維(3D)細胞培養物[3-dimensional (3D) cell culture of alveolar epithelium]的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養(submerged culturing)於一第一培養基中，其中該第一培養基包含有一基礎培養基、一培養補充劑組成物，以及一Rho激酶抑制劑，其中該培養補充劑組成物包含有JAG-1胜肽、人類Noggin蛋白、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7、人類纖維母細胞生長因子10，以及CHIR99021； 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養於一第二培養基中，其中該第二培養基包含有該基礎培養基以及該培養補充劑組成物，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生；以及 將該等經增生的原代人類肺泡上皮細胞氣液介面培養(air-liquid-interface culturing)於該第二培養基中，藉此形成一肺泡上皮3D細胞培養物。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞(primary human pulmonary alveolar epithelial cells, primary HPAEpiC)的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞培養於一第一培養基中，其中該第一培養基包含有一基礎培養基(basal medium)、一培養補充劑組成物(culture supplement composition)，以及一Rho激酶抑制劑(Rho kinase inhibitor)，其中該培養補充劑組成物包含有JAG-1胜肽(Jagged-1 peptide)、人類Noggin蛋白(human Noggin protein, hNoggin)、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7 (human fibroblast growth factor 7, hFgf7)、人類纖維母細胞生長因子10 (hFgf10)，以及CHIR99021；以及 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞培養於一第二培養基中，其中該第二培養基包含有該基礎培養基以及該培養補充劑組成物，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”以及“培養(cultivation)”可被交換地使用，並且意指在組織或人體的外部[例如在一無菌的細胞培養皿(cell culture dish)或培養瓶(flask)內]之細胞的維持(sustaining)、繁殖(propagating)和/或生長(growing)。此外，如此處所使用的術語“培養(cultivation)”，意指利用一培養基(culture medium)作為營養、激素和/或其他有助於繁殖和/或維持細胞之因子的來源。
如本文中所使用的，術語“原代細胞(primary cells)”意指直接自活組織(living tissue)[例如，活體組織切片(biopsy)]中分離出來並且被建立可在體外生長的細胞。
如本文中所使用的，術語“肺泡上皮細胞(pulmonary alveolar epithelial cells)”、“肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells, AECs)”、“肺上皮細胞(pulmonary epithelial cells)”以及“肺細胞(pneumocytes)”可被交換地使用，並且意指位於正常肺泡基底膜(basement membrane)上的上皮細胞(epithelial cells)，其包括肺泡第1型上皮細胞以及肺泡第2型上皮細胞。依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可以是自商業上購得，或是藉由熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而自人類活體組織被分離得到。
如本文中所使用的，術語“基礎培養基”意指任何提供用於在培養中的細胞之生長的鹽類、營養、胺基酸(amino acids)以及維生素(vitamins)之溶液的培養基。
依據本發明，熟習此技藝者可以視所使用的原代人類肺泡上皮細胞的狀態與生理活性並根據自身的專業素養來選擇一適當的基礎培養基來應用於本發明的培養方法。適用於本發明的基礎培養基包括，但不限於：杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)、Knockout-DMEM、最低必須培養基(Minimum Essential Medium, MEM)、α-MEM、基礎依格培養基(Basal Medium Eagle)、格拉斯哥最低必須培養基(Glasgow’s Minimal Essential Medium)、Advanced DMEM、DMEM/F-12 [營養混合物F-12 (Nutrient Mixture F-12)]、DMEM/F-10 [營養混合物F-10 (Nutrient Mixture F-10)]、依思柯夫氏改良的杜貝可氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, IMDM)、RPMI 1640培養基，以及它們的組合。
依據本發明，該基礎培養基亦可以是一商業上可購得的上皮細胞培養基(epithelial cell medium)，該上皮細胞培養基是被最佳化(optimized)以應用於促進上皮細胞的生長，包括，但不限於：上皮細胞基礎培養基(Epi Cell Basal Medium)(Cell Applications, Inc.)、氣管/支氣管上皮細胞生長培養基(Bronchia/Trachea Epithelial Cell Growth Medium)(Cell Applications, Inc.)、小呼吸道上皮生長培養基(small airway epithelial growth medium)(Lonza)、肺泡上皮細胞培養基(alveolar epithelial cell medium, AEpiCM)(ScienCell Research Laboratories, Inc.)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基是AEpiCM。
如此處所使用的，術語“增生(proliferate)”或“增生(proliferation)”意指在一細胞培養物中的細胞數量上的增加。
在本發明的一個較佳具體例中，該Rho激酶抑制劑是Y-27632。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，Rho激酶抑制劑可具有一範圍落在1至100 μM內的濃度。較佳地，Rho激酶抑制劑的濃度範圍落在1至50 μM內。在本發明的一個較佳具體例中，Rho激酶抑制劑的濃度為10 μM。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的JAG-1胜肽可具有一範圍落在1至50 μM內的濃度。較佳地，JAG-1胜肽的濃度範圍落在1至20 μM內。在本發明的一個較佳具體例中，JAG-1胜肽的濃度為1 μM。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的hNoggin可具有一範圍落在25至200 ng/mL內的濃度。較佳地，hNoggin的濃度範圍落在50至150 ng/mL內。在本發明的一個較佳具體例中，hNoggin的濃度為100 ng/mL。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的SB431542可具有一範圍落在2至20 μM內的濃度。較佳地，SB431542的濃度範圍落在3至15 μM內。在本發明的一個較佳具體例中，SB431542的濃度為10 μM。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的hFgf7可具有一範圍落在10至200 ng/mL內的濃度。較佳地，hFgf7的濃度範圍落在50至150 ng/mL內。在本發明的一個較佳具體例中，hFgf7的濃度為100 ng/mL。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的hFgf10可具有一範圍落在10至200 ng/mL內的濃度。較佳地，hFgf10的濃度範圍落在50至150 ng/mL內。在本發明的一個較佳具體例中，hFgf10的濃度為100 ng/mL。
依據本發明，以該第一培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的CHIR99021可具有一範圍落在1至10 μM內的濃度。較佳地，CHIR99021的濃度範圍落在1至5 μM內。在本發明的一個較佳具體例中，CHIR99021的濃度為3 μM。
依據本發明，以該第二培養基的總體積為基礎，該培養補充劑組成物中的JAG-1胜肽、hNoggin、SB431542、hFgf7、hFgf10以及CHIR99021的濃度是如上面該第一培養基所述者。
依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可被培養於該第一培養基中歷時至少24小時，較佳地，24至72小時。在本發明的一個較佳具體例中，該原代人類肺泡上皮細胞被培養於該第一培養基中歷時24小時。
依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可被培養於該第二培養基中歷時至少5天，較佳地，至少7天。在本發明的一個較佳具體例中，該原代人類肺泡上皮細胞被培養於該第二培養基中歷時至少14天。
依據本發明，該等原代人類肺泡上皮細胞的培養可以在一適合的培養基質(culturing substrate)的存在下被培養於該第一培養基中。在本發明的某些具體例中，該等原代人類肺泡上皮細胞的培養是在一細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的存在下被培養於該第一培養基中。
如此處所使用的，術語“細胞外基質(ECM)”意指存在於動物組織的體細胞之間且提供體細胞結構上的支撐以及存活所需的內部環境的物質，其通常由結締組織(connective tissue)所分泌，部分由基底膜所衍生，並包含有水、多醣(polysaccharides)[包括透明質酸(hyaluronan)]、彈性蛋白(elastin)以及醣蛋白(glycoproteins)[包括膠原蛋白(collagen)、巢蛋白(entactin)、纖維連接蛋白(fibronectin)以及層粘連蛋白(laminin)]等組份。
適用於本發明的ECM可以藉由培養一可生產ECM的細胞(ECM-producing cells)[例如，纖維母細胞(fibroblast)、軟骨細胞(chondrocytes)，或是它們的組合]而被獲得；或是可以使用商業上可購得的生物製劑，包括細胞外基質蛋白(Extracellular Matrix Proteins)[例如，第Ⅰ型膠原蛋白(Type I collagen)(Invitrogen)、第IV型膠原蛋白(Type IV collagen)(Sigma-Aldrich)、明膠(gelatin)(Sigma-Aldrich)、纖維連接蛋白(fibronectin)(Corning)]以及基底膜製劑(basement membrane preparations)[例如，基質膠(Matrigel)(BD Biosciences)、含有低濃度生長因子的基質膠(Matrigel Growth Factor Reduced)(Corning)、基底膜萃取物(Basement Membrane Extract)(Sigma-Aldrich)]，或合成材料[例如，ProNectin (Sigma-Aldrich)]。
較佳地，該ECM是選自於由下列所構成的群組：含有低濃度生長因子的基質膠(Matrigel Growth Factor Reduced, Matrigel GFR)、基質膠(Matrigel)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該ECM是Matrigel GFR。
在本發明的某些具體例中，ECM是被預塗覆(pre-coated)於用於培養原代人類肺泡上皮細胞的培養皿或盤的底部，繼而將該等原代人類肺泡上皮細胞懸浮於該第一培養基並添加至經預塗覆有ECM的培養皿或盤中來進行培養。
本發明亦提供一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的套組(kit)，其包含有該基礎培養基、該培養補充劑組成物，以及該Rho激酶抑制劑。在本發明的某些具體例中，該基礎培養基、該培養補充劑組成物，以及該Rho激酶抑制劑是被容納於分開的盒或容器中。在某些具體例中，該套組還進一步包含有一ECM。
另一方面，申請人經研究發現，本發明用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的方法在進一步結合浸沒培養(submerged culture)以及氣液介面培養(air-liquid interface culture)的條件下，能夠有效的使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生而形成一肺泡上皮三維(3D)細胞培養物[3-dimensional (3D) cell culture of alveolar epithelium]，並且該肺泡上皮3D細胞培養物被觀察到具有正常肺泡上皮(alveolar epithelium)的表徵與生理功能。
因此，本發明進一步提供一種用於製備肺泡上皮三維(3D)細胞培養物的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養(submerged culturing)於如上所述的第一培養基中； 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養於如上所述的第二培養基中，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生；以及 將該等經增生的原代人類肺泡上皮細胞氣液介面培養於如上所述的第二培養基中，藉此形成一肺泡上皮3D細胞培養物。
如本文中所使用的，術語“三維(3D)細胞培養[3-dimensional (3D) cell culture]”意指一人工創造的三維環境，其容許細胞在三維方向上生長[亦即，形成細胞多層(cell multilayers)、懸浮團粒(clusters in suspension)或是在一支架(scaffolds)(例如，ECM)上生長]並且與環境相互作用。
如本文中所使用的，術語“氣液介面培養”意指將細胞培養於一具孔洞的基質(porous substrate)上，以使該細胞的頂部(top side)與空氣接觸，而其底部(bottom side)與培養基接觸。舉例來說，可將細胞培養於一包含有一具濾膜的嵌入皿(filter insert)的開放培養容器中，並且該培養容器的底部添加有足量之培養基，以使得該培養基得以接觸位於該濾膜上的細胞底部，而不致包覆(encapsulate)或浸沒(submerge)該細胞。
該具孔洞的基質可以是由一選自於下列群組中的材料所製成：聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)、聚酯(polyester)、聚碳酸酯(polycarbonate)，以及它們的組合。適用於本發明的該具孔洞的基質可以是未塗覆或經預塗覆的。在本發明的一個較佳具體例中，該具孔洞的基質是一經預塗覆有ECM的具濾膜的嵌入皿。
依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可被浸沒培養於該第一培養基中歷時至少24小時，較佳地，24至72小時。在本發明的一個較佳具體例中，該原代人類肺泡上皮細胞被浸沒培養於該第一培養基中歷時24小時。
依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可被浸沒培養於該第二培養基中歷時至少10天，較佳地，10至24天。在本發明的一個較佳具體例中，該原代人類肺泡上皮細胞被浸沒培養於該第二培養基中歷時17天。
依據本發明，該原代人類肺泡上皮細胞可被氣液介面培養於該第二培養基中歷時至少7天，較佳地，7至14天。在本發明的一個較佳具體例中，該原代人類肺泡上皮細胞被氣液介面培養於該第二培養基中歷時14天。
經病毒感染相關測試結果顯示，依據本發明的方法所製備得到的肺泡上皮3D細胞培養物能夠被病毒蛋白誘導產生發炎反應，並且能夠被假病毒(pseudovirus)感染。因此，該肺泡上皮3D細胞培養物被預期可供作為一肺泡上皮的體外模型( in vitromodel of alveolar epithelium)使用。
因此，本發明亦提供一種用於在一肺泡上皮的體外模型中分析一待測物(test agent)對於肺泡組織之影響的方法，其包括： 藉由一如上所述的方法來製備得到一肺泡上皮3D細胞培養物； 對該肺泡上皮3D細胞培養物投予該待測物；以及 量測該待測物對於該肺泡上皮3D細胞培養物的影響。
依據本發明，該待測物可選自於由下列所構成之群組：奈米微粒(nanoparticles)、環境毒素(environmental toxins)或汙染物(pollutant)、香菸煙霧(tobacco smoke)、化妝品成分、化學試劑(chemical agent)、藥物、氣溶膠(aerosol)、放射線(radiation)、天然存在的物質或生物材料[例如，花粉(pollen)、核酸(nucleic acid)、胜肽(peptide)、病毒、細菌、真菌、單細胞生物、動物細胞等]，以及它們的組合。在某些具體例中，該待測物亦可以是一治療劑(therapeutic agent)的遞送載體(delivery vehicle)。
依據本發明，該方法可進一步包括在該待測物的投予之前，對肺泡上皮3D細胞培養物進行一疾病的誘發。
依據本發明，該疾病可選自於由下列所構成之群組：感染(例如，病毒感染、細菌感染、真菌感染等)、毒物作用、過敏反應、藥物的不良反應(adverse effects)或副作用(side effects)、癌症(cancer)、癌細胞轉移(metastasis)，以及它們的組合。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例1. 一般實驗材料： 基礎培養基(basal medium)：
若無特別說明，在下面實施例中用來培養原代人類肺泡上皮細胞(primary human pulmonary alveolar epithelial cell, primary HPAEpiC)的培養基是以補充有2%的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(ScienCell Research Laboratories, Inc., Cat. No. 0010)以及1%的盤尼西林-鏈黴素(penicillin-streptomycin)(ScienCell Research Laboratories, Inc., Cat. No. 0503)之肺泡上皮細胞培養基(alveolar epithelial cell medium, AEpiCM)(ScienCell Research Laboratories, Inc., Cat. No. 3201)作為基礎培養基。 2.  原代HPAEpiC細胞的來源以及初步擴增(amplification)：
在下面的實施例中所使用的原代HPAEpiC細胞是購自於美國的ScienCell Research Laboratories, Inc. (Cat. No. 3200)，並依據製造商的操作指南來進行初步擴增：首先，將分裝有原代HPAEpiC細胞的微量離心管從液態氮中取出並置於37℃水浴中予以解凍，接著將解凍的原代HPAEpiC細胞以一為1×10 4至1.5×10 4細胞/cm 2的密度接種至含有經添加有1%之上皮細胞生長補充劑(Epithelial Cell Growth Supplement, EpiCGS)(ScienCell Research Laboratories, Inc., Cat. No. 4152)之基礎培養基的T-25培養瓶(T-25 flask)[其瓶底預塗覆有2 μg/cm 2的聚-L-離胺酸(poly-L-lysine)]中，並於培養箱(37℃、5% CO 2)中靜置培養隔夜後，將各井中的液體置換成新鮮的培養基。 3.  培養補充劑(culture supplements)：
在下面的實施例中所使用的各個培養補充劑及其來源是如下面表1所示。 表1.   各個培養補充劑及其來源
培養補充劑 購買來源
JAG-1胜肽 [Jagged-1 (JAG-1) peptide] AnaSpec, Cat. No. AS-61298
重組人類Noggin蛋白(recombinant human Noggin protein, hNoggin) R&D Systems, Cat. No. 6057-NG
SB431542 [其是一種TGF-β第I型受體的抑制劑(inhibitor of TGF-β type I receptor)] Sigma Aldrich, Cat. No. S4317
重組人類纖維母細胞生長因子7 [recombinant human fibroblast growth factor 7 (hFgf7)] R&D Systems, Cat. No. 345-FG
重組人類纖維母細胞生長因子10 [recombinant human fibroblast growth factor 10 (hFgf10)] R&D Systems, Cat. No. 251-KG
CHIR99021 [其是一種GSK-3的抑制劑(inhibitor of GSK-3)] Sigma-Aldrich, Cat. No. SML1046
Rho激酶抑制劑Y-27632 [Rho kinase inhibitor (Rock inhibitor) Y-27632](下稱Rock抑制劑) Sigma-Aldrich, Cat. No. SCM075
一般實驗方法： 1.  統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。 2.  免疫螢光染色分析(immunofluorescence staining assay)：
移除各個細胞培養物中的培養基，並以杜貝可氏磷酸鹽緩衝生理鹽水(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS)來對所形成的單層細胞予以清洗2次，接著在室溫下加入適量的固定與通透化溶液(fixation and permeabilization solution)(Cytofix/Cytoperm™, BD Biosciences, Cat. No. 554722)來固定細胞並予以通透化歷時15分鐘。接著，移除液體並以DPBS予以清洗2次，繼而加入5% FBS (配於DPBS中)並於室溫下培育歷時30-60分鐘以阻斷非特異性結合。之後，令細胞在室溫下與適量之一次抗體(primary antibody)培育歷時90-120分鐘，繼而以DPBS予以清洗2次。若所使用的一次抗體不帶有螢光標籤(fluorescent label)，令該細胞進一步在室溫下與二次抗體(secondary antibody)培育歷時90-120分鐘。
接著，在以DPBS予以清洗2次後將經染色的單層細胞取出並在室溫下風乾歷時5分鐘，然後以含有細胞核染劑DAPI之抗螢光衰減的封片劑(VECTASHIELD ®Antifade Mounting Medium with DAPI, VECTASHIELD, H-1200)來予以封固。之後，以一共軛焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)(Leica Microsystems，型號SP8)來觀察細胞並進行拍照，以及使用一ImageXpress Micro 4高通量螢光影像擷取與分析系統多參數細胞影像分析儀(ImageXpress Micro 4 High-Content Imaging System)(Molecular Devices LLC.)來量化帶有螢光的細胞比率。針對不同蛋白質所使用的抗體分別被顯示於下面表2中。 表2.  用於免疫螢光染色分析的一次抗體與二次抗體
蛋白質 一次抗體 二次抗體
肺泡第1型細胞-特異性頂膜蛋白-56 (lung alveolar type 1 cell-specific apical membrane protein-56, HT1-56) 小鼠抗-HT1-56 IgG1抗體(mouse anti-HT1-56 IgG1 antibody)(Terrace Biotech, Cat. No. TB-29AHT1-56) (1：50) Alexa-Fluor ®555綴合的山羊-抗小鼠IgG1抗體(Alexa-Fluor ®555-conjugated goat-anti-mouse IgG1 antibody)(ThermoFisher Scientific, Cat. No. A-21127) (1：200)
肺泡第2型細胞-特異性頂膜蛋白-280 (HT2-280) 小鼠抗-HT2-280 IgM抗體(mouse anti-HT2-280 IgM antibody)(Terrace Biotech, Cat. No. TB-27AHT2-280) (1：50) Alexa-Fluor ®488綴合的山羊-抗小鼠IgM抗體(Alexa-Fluor ®488-conjugated goat-anti-mouse IgM antibody)(ThermoFisher Scientific, Cat. No. A-21042) (1：200)
Alexa-Fluor ®633綴合的山羊-抗小鼠IgM抗體(Alexa-Fluor ®633-conjugated goat-anti-mouse IgM antibody)(ThermoFisher Scientific, Invitrogen, Cat. No. A-21046) (1：200)
上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) PerCP/Cy5.5 ®-綴合的小鼠抗-EpCAM抗體(PerCP/Cy5.5 ®-conjugated mouse anti-EpCAM antibody)(BioLegend, Cat. No. 324214) (1：100) －
Alexa Fluor ®647-綴合的小鼠抗-EpCAM抗體(Alexa Fluor ®647-conjugated mouse anti-EpCAM antibody)(Cell Signaling, Cat. No. 5447) (1：400)
中間絲蛋白(vimentin) Alexa Fluor ®488-綴合的兔子抗-中間絲蛋白抗體(Alexa Fluor ®488-conjugated rabbit anti-Vimentin antibody)(Cell Signaling, Cat. No. 9854S) (1：400) －
緊密連接蛋白-1 (zonula occludens-1, ZO-1) Alexa Fluor ®488-綴合的小鼠抗-ZO-1 抗體(Alexa Fluor ®488-conjugated mouse anti-ZO-1 antibody)(ThermoFisher Scientific, Cat. No. 339188) (1:100) －
表面活性劑蛋白B (surfactant protein B, SPB) 小鼠抗-SPB IgG2抗體(mouse anti-SPB IgG2 antibody)(ThermoFisher Scientific, Invitrogen, Cat. No. MA1-204) (1：100) Alexa-Fluor ®488-綴合的山羊-抗小鼠IgG抗體(Alexa-Fluor ®488-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody)(Jackson Immunoresearch, Cat. No.115-545-062) (1：200)
表面活性劑蛋白C前體(pro-surfactant protein C, pro-SPC) 兔子抗-pro-SPC抗體(rabbit anti-pro-SPC antibody)(Sigma-Aldrich, AB3786) (1：200) Cy3-綴合的山羊-抗小鼠IgG抗體(Cy3-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody)(Sigma-Aldrich, Cat. No. AP132C) (1：200)
血管收縮素轉化酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 兔子抗-ACE2抗體(rabbit anti-ACE2 antibody)(abcam, Cat. No. ab87436) (1：100) Alexa-Fluor ®488-綴合的山羊-抗小鼠IgG抗體(同上述)(1：200)
跨膜絲氨酸蛋白酶2 (transmembrane protease serine 2, TMPRSS2) 小鼠抗-TMPRSS2抗體(mouse anti-TMPRSS2 antibody)(Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-515727) (1：100) Alexa-Fluor ®633-綴合的山羊-抗小鼠IgM抗體(Alexa-Fluor ®633-conjugated goat-anti-mouse IgM antibody)(ThermoFisher Scientific, Invitrogen, Cat. No. A-21046) (1：200)
實施例 1. 不同的培養補充劑對於培養原代 HPAEpiC 細胞的影響
在本實施例中，申請人透過對基礎培養基添加不同的培養補充劑來對原代HPAEpiC細胞進行繼代培養以及長時間的持續培養，俾以評估不同的培養補充劑對於原代HPAEpiC細胞型態的影響。另外，為供比較，市售之上皮細胞生長補充劑EpiCGS (同上述)亦被拿來進行相同的實驗。 A 、 以含有不同培養補充劑之培養基來對原代 HPAEpiC 細胞進行繼代培養： 實驗方法：
首先，將在上面“一般實驗材料”的第2項當中所得到的原代HPAEpiC細胞分為4組(亦即，實驗組B、BM、G以及GM)，並以一為1×10 5細胞/井的數量分別接種至含有添加有不同培養補充劑的培養基的6-井培養盤{其井底預塗覆有8.7 μg/cm 2之含有低濃度生長因子的基質膠[Corning ®Matrigel ®Growth Factor Reduced (GFR)，產品編號354230，Lot. No. 9133005]}中，其中各組所添加的培養補充劑是如下面表3所示，此即為第一代的HPAEpiC細胞(下稱P1細胞)。 表3.   各組培養基中添加的培養補充劑
培養補充劑 添加濃度 實驗組B 實驗組BM 實驗組G 實驗組GM
EpiCGS 1% － － ＋ ＋
JAG-1 1 μM － ＋ － ＋
hNoggin 100 ng/mL － ＋ － ＋
SB431542 10 μM － ＋ － ＋
hFgf7 100 ng/mL － ＋ － ＋
hFgf10 100 ng/mL － ＋ － ＋
CHIR99021 3 μM － ＋ － ＋
Y-27632* 10 μM － ＋ － ＋
*：Y-27632僅於開始培養後的第1天添加，後續更換培養基時則不再添加。
各組的P1細胞被置於培養箱(37℃、5% CO 2)中靜置培養，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基，待細胞密度達到約90%匯聚時，取部分的P1細胞進行繼代培養，而得到第二代的HPAEpiC細胞(下稱P2細胞)。接著，在P2細胞密度達到約90%匯聚時，將部分的P2細胞取出並進行繼代培養，而得到第三代的HPAEpiC細胞(下稱P3細胞)。在P1細胞開始培養之後的第2天，以及分別在P2與P3細胞開始培養之後的第6天，使用一光學顯微鏡(Nikon，型號TS100以及Eclipse Ti)並在一為100倍的放大倍率下來進行各組細胞型態的觀察以及拍照。
另外，分別在P1與P2細胞開始培養之後的第8天，依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來對實驗組BM以及實驗組GM的部分細胞進行肺泡第1型上皮細胞(alveolar type 1 epithelial cell, AT1)的細胞標記物(cell marker) HT1-56以及肺泡第2型上皮細胞(alveolar type 2 epithelial cell, AT2)的細胞標記物HT2-280的染色。 結果：
圖1顯示各組P1-P3細胞藉由光學顯微鏡所觀察到的細胞型態。從圖1可見，實驗組B的P1細胞在培養至第2天時幾乎已全部呈圓形且為懸浮狀態，這顯示實驗組B的細胞無法貼附於井底並正常地生長；而在培養至第5天時實驗組B的存活細胞數量極少而無法進行繼代培養(數據未顯示)。相較之下，實驗組BM、G以及GM皆能夠成功繼代培養至P3細胞，並且貼附狀態仍良好，不過實驗組G的P2至P3細胞的型態大多變化為細長紡錘型(spindle-shaped)，而被推測是已分化成纖維母細胞(fibroblast)，只有實驗組BM與GM的P3細胞的型態仍可維持鵝卵石型(cobblestone-shaped)的上皮細胞形態，其中又以實驗組GM的細胞數量較多。
圖2顯示實驗組BM的P1與P2細胞的免疫螢光染色分析結果。從圖2可見，實驗組BM的P1與P2細胞中皆包含有AT1細胞(呈紅色螢光)以及AT2細胞(呈綠色螢光)。而實驗組GM的P1與P2細胞亦被觀察到有類似的情形(數據未顯示)。
這個實驗結果顯示，實驗組BM以及GM所使用的培養補充劑JAG-1、hNoggin、SB431542、hFgf7、hFgf10、CHIR99021以及Rock抑制劑之組合不僅有助於原代HPAEpiC細胞的存活、擴增與繼代，並且能夠有效地維持其正常的細胞型態與生理功能(特別是AT1以及AT2細胞的增殖與分化)。相較之下，市售的上皮細胞生長補充劑僅有助於原代HPAEpiC細胞培養初期的貼附與存活，不僅無法用於原代HPAEpiC細胞的繼代培養，甚至可能導致原代HPAEpiC細胞的型態改變或分化。 B 、 以含有不同培養補充劑之培養基來對原代 HPAEpiC 細胞進行持續培養： 實驗方法：
將在上面第A項中實驗組G以及實驗組GM的P1細胞置於培養箱(37℃、5% CO 2)中持續進行培養，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基，並且在開始培養的第1天以及培養至第5天之時，將部分細胞拿來依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來進行上皮細胞標記物EpCAM以及纖維母細胞標記物Vimentin的染色，以及EpCAM +細胞以及Vimentin +細胞比率的量化。 結果：
圖3顯示實驗組G以及GM的P1細胞在培養第1天以及第5天之時的免疫螢光染色分析結果。從圖3可見，實驗組G中紅色螢光所示之EpCAM表現位準會隨著培養天數的增加而減少，相較之下，實驗組GM在整個培養期間皆維持明顯的高EpCAM表現位準。另外，實驗組G中綠色螢光所示之中間絲蛋白表現位準會隨著培養天數的增加而大幅提升，相較之下，實驗組GM在培養至第5天之時中間絲蛋白表現位準則是僅有微幅上升。
圖4顯示實驗組G以及GM的P1細胞在培養第1天以及第5天之時經免疫螢光染色分析之後量化的EpCAM +細胞比率(%)以及Vimentin +細胞比率(%)。由圖4上半部可見，實驗組G的EpCAM +細胞比率會隨著培養天數的增加而顯著減少，而實驗組GM在整個培養期間皆維持高的EpCAM +細胞比率。另一方面，由圖4下半部可見，實驗組G的Vimentin +細胞比率會隨著培養天數的增加而顯著上升，相較之下，實驗組GM的Vimentin +細胞比率則僅有微幅上升，並且顯著低於實驗組G所具者。
這個實驗結果顯示：在不進行繼代培養的情況下，在培養期間對基礎培養基添加培養補充劑JAG-1、hNoggin、SB431542、hFgf7、hFgf10、CHIR99021以及Rock抑制劑之組合的培養方法能有效地維持原代HPAEpiC細胞的上皮細胞表徵，而避免分化為纖維母細胞的情形。
基於上面的實驗結果，申請人選用實驗組GM的培養基(下稱培養基GM)作為代表來進行下面的實驗。 實施例 2. 肺泡上皮三維 (3D) 細胞培養物 [ 3-dimensional (3D) cell culture of alveolar epithelium ] 的製備 實驗方法： A 、 原代 HPAEpiC 細胞的 3D 細胞培養 (3D cell culture) ：
首先，將在上面“一般實驗材料”的第2項當中所得到的原代HPAEpiC細胞以一為1.5×10 5細胞/井的數量接種至含有0.3 mL培養基GM之24-井可滲透細胞培養嵌入皿(permeable transwell cell culture insert)(Falcon, Product No. 353095)(其底部預塗覆有8.7 μg/cm 2之Matrigel GFR)，將該嵌入皿置於含有0.7 mL培養基GM之24-井培養盤中，繼而於培養箱(37℃、5% CO 2)中進行浸沒培養(submerged culture)。在浸沒培養至第2天之時，置換為新鮮的培養基GM，後續大約每隔2-3天更換為新鮮的培養基GM，使細胞在該嵌入皿中形成一細胞單層(cell monolayer)。
在浸沒培養的第18天之時，移除該嵌入皿內的液體，並於培養箱(37℃、5% CO 2)中進行氣液介面培養(air-liquid interface culture)，大約每隔2-3天將各井內的培養基更換為新鮮的培養基GM，至於嵌入皿內則不添加培養基。上述氣液介面培養被進行總共歷時14天，而在氣液介面培養至第7天之時，已可觀察到細胞匯聚且排列緊密，並在細胞之間出現明顯連接型態，代表已成功製備得到一肺泡上皮3D細胞培養物。 B 、 免疫螢光染色分析：
在浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時，依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來對所得到的細胞培養物進行AT1與AT2細胞的細胞標記物(亦即，HT1-56以及HT2-280)的染色以及AT2細胞的表面活性劑蛋白(surfactant proteins) SPB與pro-SPC的染色。此外，在氣液介面培養的第15天之時，所得到的細胞培養物還有被進行HT2-280以及緊密連接蛋白-1 (ZO-1)的染色。 C 、 掃描式電子顯微術 (SEM) 分析 [scanning electron microscopy (SEM) analysis] ：
在浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時，將所得到的細胞培養物以DPBS予以清洗3次，繼而添加適量之2.5%戊二醛溶液(glutaraldehyde solution)(配於DPBS中)來予以固定歷時1小時。之後以DPBS予以清洗三次，繼而依序以濃度為35%、50%、75%、85%、95%、99.8% (v/v)的乙醇溶液來進行脫水處理，最後加入六甲基二矽氮烷(hexamethyldisilazane, HDMS)予以處理歷時5分鐘，繼而放置隔夜。之後，取出嵌入皿內的細胞薄膜，繼而依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來對該細胞薄膜進行鍍白金處理(platinum coating)，並且使用一高解析熱場發射掃描式電子顯微鏡(High Resolution Thermal Field Emission Scanning Electron Microscope, HR-FEG-SEM)(JEOL, JSM-7610F)並分別在2,500與5,000倍的放大倍率下進行觀察以及拍照。 結果： A 、 免疫螢光染色分析：
圖5顯示浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時所得到的細胞培養物的HT1-56與HT2-280以及SPB與pro-SPC免疫螢光染色分析結果。從圖5可見，浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時所得到的細胞培養物皆包含有AT1細胞(呈紅色螢光)以及AT2細胞(呈綠色螢光)，並且AT2細胞皆能正常表現表面活性劑蛋白SPB (呈綠色螢光)以及pro-SPC (呈紅色螢光)。
圖6顯示氣液介面培養的第15天之時所得到的細胞培養物的HT2-280與ZO-1免疫螢光染色分析結果。從圖6可見，該細胞培養物中的原代HPAEpiC細胞能正常表現ZO-1 (呈綠色螢光)，並且細胞之間已明顯形成緊密連接(tight junction)。 B 、 SEM 分析：
圖7顯示浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時所得到的細胞培養物的SEM分析結果。由圖7上半部可見，浸沒培養至第18天之時即可觀察到細胞之間的緊密連接(黃色箭頭處)，並且在AT2細胞表面上具有橢圓形的分泌孔(secretion pore)(白色箭頭處)。而在氣液介面培養的第8與第15天之時，分泌孔的數量增加，並且細胞型態與排列也變得更加緊密與立體。
由圖7下半部可見，在浸沒培養的第18天之時，即觀察到在細胞表面有短小突起物(short protrusion)的形成，而在氣液介面培養的第8與第15天之時，細胞表面突起物的數量增加且變得密集，長度也有明顯的增長(約達至0.4-1.0 μm的長度)，顯示該細胞培養物已形成更完整的肺泡微絨毛(microvilli)的結構。
這個實驗結果顯示：藉由本發明培養方法製備得到的肺泡上皮3D細胞培養物，不僅能維持AT1以及AT2細胞的正常生長以及生理功能，還具有正常人體肺泡上皮組織的表徵。 實施例 3. 使用本發明的肺泡上皮 3D 細胞培養物來評估抗 -ACE2 抗體的抗病毒效用
在本實施例中，申請人將本發明的肺泡上皮3D細胞培養物拿來進行冠狀病毒之嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染的相關測試，俾以評估該3D細胞培養物作為肺泡上皮之體外模型( in vitromodel of alveolar epithelium)的可行性。 實驗材料： 1. SARS-CoV-2 假病毒 (pseudovirus) ：
在本實施例中所使用的SARS-CoV-2假病毒是購自於中央研究院分子生物研究所RNA技術平台與基因操控核心設施(貨號nCoV-S-GFP)。它是一種SARS-CoV-2棘突蛋白假型慢病毒(SARS-CoV-2 spike pseudotyped lentivirus)，其病毒套膜(envelope)上具有經融合以增強的綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的SARS-CoV-2棘突蛋白。 實驗方法： A 、 免疫螢光染色分析：
依照上面實施例2的第A項當中所述的方法來製備得到一肺泡上皮3D細胞培養物。在氣液介面培養至第8天之時，依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來對所得到的肺泡上皮3D細胞培養物進行ACE2以及TMPRSS2 (這兩者皆是與SARS-CoV-2感染有關的蛋白)的染色。 B 、 SARS-CoV-2 假病毒的感染以及 SARS-CoV-2 假病毒誘發的發炎反應的評估：
首先，依照上面實施例2的第A項當中所述的方法來進行4組原代HPAEpiC細胞的3D細胞培養，分別為1個對照組以及3個實驗組。在浸沒培養的第18天之時，移除各組嵌入皿內的液體，並對實驗組1-3的嵌入皿內分別添加含有不同濃度的SARS-CoV-2假病毒的培養基GM而分別以一為1、10以及20的病毒感染倍數(multiplicity of infection, m.o.i.)來感染各組細胞培養物歷時24小時。至於對照組的細胞培養物則是被添加以不含有SARS-CoV-2假病毒的培養基GM，並繼而予以培育歷時24小時。之後，移除各組的培養基，並以DPBS來洗滌各組經SARS-CoV-2假病毒感染的細胞培養物。接著，將各組的嵌入皿置於含有培養基GM之24-井培養盤中，嵌入皿內則不添加培養基，繼而於培養箱(37℃、5% CO 2)中進行氣液介面培養歷時3天。
在氣液介面培養的第3天結束之時，依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來對所得到的肺泡上皮3D細胞培養物進行AT1與AT2細胞的細胞標記物(亦即，HT1-56以及HT2-280)的染色，繼而初步觀察各組是否有SARS-CoV-2假病毒的存在。接著，為了確認AT1與AT2細胞中是否皆有SARS-CoV-2假病毒的存在，進一步在較高的放大倍率下來觀察實驗組3。
此外，為了確認肺泡上皮3D細胞培養物在經SARS-CoV-2假病毒感染後是否產生發炎，在氣液介面培養的第3天結束之時，申請人進一步對實驗組3以及對照組分別添加100 μL的培養基GM並予以培育歷時15分鐘，之後分別取出100 μL的培養上清液，並使用一IL-8 ELISA套組(Invitrogen, Cat. No. 88-8086)來測定實驗組3培養上清液中的IL-8濃度。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 C 、 抗 -ACE2 抗體在抗 SARS-CoV-2 假病毒上的效用評估：
首先，依照上面實施例2的第A項當中所述的方法建立2組肺泡上皮3D細胞培養物，分別為1個病理對照組以及1個實驗組。在浸沒培養的第18天之時，先對實驗組的細胞培養物處理以抗-ACE2抗體(Abcam, Cat. No. ab87436)(配於基礎培養基中，濃度為20 μg/mL)歷時30分鐘。之後，移除各組的培養基，並以DPBS來洗滌各組的細胞培養物，接著，參考上面第B項當中所述的步驟來對各組的細胞培養物進行SARS-CoV-2假病毒的感染(感染倍數為20)以及氣液介面培養。
在氣液介面培養的第3天結束之時，依照上面“一般實驗方法”的第2項「免疫螢光染色分析」當中所述的方法來對各組的細胞培養物進行細胞核的染色以及進行SARS-CoV-2 +細胞比率的量化。
各組細胞培養物的相對感染效率(relative infection efficiency)(%)是藉由將各組量化得到的SARS-CoV-2 +細胞比率除以病理對照組所測得的SARS-CoV-2 +細胞比率來予以標準化而得到。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A 、 免疫螢光染色分析：
圖8顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物之與SARS-CoV-2有關的蛋白的免疫螢光染色分析結果。從圖8可見，本發明的肺泡上皮3D細胞培養物可正常表現與SARS-CoV-2感染有關的蛋白ACE2 (呈綠色螢光)以及TMPRSS2 (呈紅色螢光)。 B 、 發炎反應的評估：
圖9與圖10顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的免疫螢光染色分析結果。從圖9可見，實驗組1至3中則觀察到有SARS-CoV-2假病毒(呈綠色螢光)的存在，並且其數量是隨著所處理的病毒感染倍數增加而漸增，這顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物可正常被SARS-CoV-2假病毒感染。
圖10顯示實驗組3的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的HT1-56與HT2-280免疫螢光染色分析結果。由圖10可見，本發明的肺泡上皮3D細胞培養物中的AT1細胞(呈紅色螢光)以及AT2細胞(呈紫色螢光)中皆有偵測到SARS-CoV-2假病毒(呈綠色螢光)的存在。
圖11顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的培養上清液中所測得的IL-8濃度。從圖11可見，與對照組相較之下，實驗組3所測得的IL-8濃度有顯著的增加，這顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物確實會因SARS-CoV-2假病毒的感染而被誘發發炎反應。 C、   抗-ACE2抗體在抗SARS-CoV-2假病毒上的效用評估：
圖12顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染之後的免疫螢光染色分析結果。從圖12可見，相較於病理對照組，經抗-ACE2抗體預處理的實驗組中所測得的SARS-CoV-2假病毒(呈綠色螢光)顯著地較少。
圖13顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染之後所測得的相對感染效率。由圖13可見，相較於病理對照組，SARS-CoV-2假病毒對於經抗-ACE2抗體預處理的相對感染效率顯著地降低了許多，這顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物確實能作為一肺泡上皮的體外模型而被應用於評估藥物的抗病毒效用。
上面的實驗結果顯示：本發明的肺泡上皮3D細胞培養物能夠正常表現SARS-CoV-2感染途徑中所涉及的相關蛋白，具有被SARS-CoV-2感染的能力，因而能夠作為一肺泡上皮的體外模型而被應用於SARS-CoV-2感染相關實驗以及抗-SARS-CoV-2感染的藥物之篩選。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示各組細胞在使用含有不同的培養補充劑之培養基來進行繼代培養所得到的P1-P3細胞，其中實驗組B表示使用不含有任何培養補充劑的培養基來予以培養的細胞，實驗組BM表示使用含有7種培養補充劑之組合的培養基來予以培養的細胞，實驗組G表示使用含有市售之上皮細胞生長補充劑的培養基來予以培養的細胞，以及實驗組GM表示使用含有7種培養補充劑之組合以及市售之上皮細胞生長補充劑的培養基來予以培養的細胞； 圖2顯示實驗組BM的P1至P2細胞藉由免疫螢光染色分析所得到的結果，其中AT1細胞是呈紅色螢光，AT2細胞是呈綠色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖3顯示實驗組G以及GM的P1細胞在培養第1天以及第5天之時藉由免疫螢光染色分析所得到的結果，其中EpCAM +細胞是呈紅色螢光，Vimentin +細胞是呈綠色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖4顯示實驗組G以及GM的P1細胞在培養第1天以及第5天之時經免疫螢光染色分析之後量化的EpCAM +細胞以及Vimentin +細胞比率(%)，其中“*”表示當與實驗組G作比較， p＜0.05，以及“***”表示當與實驗組G作比較， p＜0.001； 圖5分別顯示浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時所得到的細胞培養物的HT1-56與HT2-280以及SPB與pro-SPC免疫螢光染色分析結果，其中AT1細胞是呈紅色螢光，AT2細胞是呈綠色螢光，SPB是呈綠色螢光，pro-SPC是呈紅色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖6顯示氣液介面培養的第15天之時所得到的細胞培養物的HT2-280與ZO-1免疫螢光染色分析結果，其中ZO-1是呈綠色螢光，HT2-280是呈紅色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖7顯示浸沒培養的第18天以及氣液介面培養的第8與第15天之時所得到的細胞培養物藉由一高解析熱場發射掃描式電子顯微鏡(High Resolution Thermal Field Emission Scanning Electron Microscope, HR-FEG-SEM)來進行拍照所得到的SEM影像； 圖8顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物的ACE2與TMPRSS2免疫螢光染色分析結果，其中ACE2是呈綠色螢光，TMPRSS2是呈紅色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖9顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的HT1-56與HT2-280免疫螢光染色分析結果，其中對照組表示未被SARS-CoV-2假病毒感染的肺泡上皮3D細胞培養物，實驗組1至3分別表示以不同病毒感染倍數(m.o.i)而被SARS-CoV-2假病毒感染的肺泡上皮3D細胞培養物；並且AT1細胞是呈紅色螢光，AT2細胞是呈紫色螢光，SARS-CoV-2假病毒是呈綠色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖10顯示實驗組3的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的HT1-56與HT2-280免疫螢光染色分析結果，其中AT1細胞是呈紅色螢光，AT2細胞是呈紫色螢光，SARS-CoV-2假病毒是呈綠色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光； 圖11顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染後第3天的培養上清液中所測得的IL-8濃度，其中對照組表示未經SARS-CoV-2假病毒感染的肺泡上皮3D細胞培養物，實驗組3表示以一為20的m.o.i而被SARS-CoV-2假病毒感染的肺泡上皮3D細胞培養物，以及“**”表示當與對照組作比較， p＜0.01； 圖12顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染之後藉由免疫螢光染色分析所得到的結果，其中病理對照組表示未經抗-ACE2抗體預處理的肺泡上皮3D細胞培養物，實驗組表示經抗-ACE2抗體預處理的肺泡上皮3D細胞培養物；並且SARS-CoV-2假病毒是呈綠色螢光，以及細胞核是呈藍色螢光；以及 圖13顯示本發明的肺泡上皮3D細胞培養物在被SARS-CoV-2假病毒感染之後所測得的相對感染效率(%)，其中病理對照組表示未經抗-ACE2抗體預處理的肺泡上皮3D細胞培養物，實驗組表示經抗-ACE2抗體預處理的肺泡上皮3D細胞培養物，以及“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05。

Claims (6)

  1. 一種用於在體外培養原代人類肺泡上皮細胞的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞培養於一第一培養基中，其中該第一培養基包含有一基礎培養基、一培養補充劑組成物，以及一Rho激酶抑制劑，其中該培養補充劑組成物包含有JAG-1胜肽、人類Noggin蛋白、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7、人類纖維母細胞生長因子10，以及CHIR99021；以及 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞培養於一第二培養基中，其中該第二培養基包含有該基礎培養基以及該培養補充劑組成物，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生。
  2. 如請求項1的方法，其中該等原代人類肺泡上皮細胞的培養是在一細胞外基質的存在下被培養於該第一培養基中。
  3. 如請求項2的方法，其中該細胞外基質是選自於由下列所構成的群組：第Ⅰ型膠原蛋白、第IV型膠原蛋白、明膠、纖維連接蛋白、基質膠、含有低濃度生長因子的基質膠、基底膜萃取物，以及它們的組合。
  4. 一種用於製備肺泡上皮三維(3D)細胞培養物的方法，其包括： 將原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養於一第一培養基中，其中該第一培養基包含有一基礎培養基、一培養補充劑組成物，以及一Rho激酶抑制劑，其中該培養補充劑組成物包含有JAG-1胜肽、人類Noggin蛋白、SB431542、人類纖維母細胞生長因子7、人類纖維母細胞生長因子10，以及CHIR99021； 將該等經培養的原代人類肺泡上皮細胞浸沒培養於一第二培養基中，其中該第二培養基包含有該基礎培養基以及該培養補充劑組成物，而使得該等原代人類肺泡上皮細胞增生；以及 將該等經增生的原代人類肺泡上皮細胞氣液介面培養於該第二培養基中，藉此形成一肺泡上皮3D細胞培養物。
  5. 如請求項4的方法，其中該等原代人類肺泡上皮細胞的培養是在一細胞外基質的存在下被培養於該第一培養基中。
  6. 如請求項5的方法，其中該細胞外基質是選自於由下列所構成的群組：第Ⅰ型膠原蛋白、第IV型膠原蛋白、明膠、纖維連接蛋白、基質膠、含有低濃度生長因子的基質膠、基底膜萃取物，以及它們的組合。
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