WO2015180636A1 - 人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法。

Description

人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法 技术领域
本发明属于生物学和医学领域；更具体地，本发明涉及人肝细胞体外长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法。
背景技术
根据世界卫生组织统计，全球每年有上百万的人死于肝病。中国是一个肝病大国，仅乙型和丙型肝炎病毒带原者就有1.4亿，约占全球的28％；有29.7万肝癌患者，占全球的一半以上(55％)。因此在肝病研究、新药肝毒检测、生物人工肝及肝细胞移植等方面，需要大量的合格人肝细胞。但肝源缺乏是全球问题，而现有人肝细胞培养方法都存在常规培养维持其形态功能时间短，非常规培养操作繁杂、要求条件高、干扰因素多、培养时间不够长，并且都不能增殖传代等缺陷。因此亟待研究新的人肝细胞培养增殖传代方法。
人肝细胞在医药相关领域有极为广泛的应用。长期以来，国内外学者对肝细胞的培养方法作了大量研究，但在常规培养条件下，长时间培养肝细胞并保持其形态功能的方法，目前尚未见任何报道。尤其是让肝细胞在体外培养条件下增殖传代，更是难以突破。目前分离的人肝细胞在体外常规培养最长可达14天，其它方法如共生培养、悬浮培养、三明治培养、三维培养等最长可以培养肝细胞到3个月。但由于干扰因素多(如共生培养)、操作繁杂(三明治培养)、或者不能直接观察细胞的形态改变(悬浮培养和三维培养)等这样那样的缺陷而无法满足肝病研究的需要，因此仅部分用于检测新药物的肝毒性。然而，即使用于检测新药物的肝毒，由于存在上述各种缺陷，所得结果也仅有相对的意义和价值。更大的问题是，上述现有人肝细胞培养方法，都不能增殖传代。因此，现有方法及所培养肝细胞不仅不能作为肝病研究的合格细胞模型，更不可能为构建生物人工肝及肝细胞移植提供合格的肝细胞来源。
综上，本领域还有必要开发新型的人肝细胞长期维持和增殖传代培养的培养方法及专用培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法。
在本发明的第一方面，提供一种用于培养人肝细胞的培养基，所述的培养基包括：肝细胞基本培养基；以及
GSK3β抑制剂CHIR99021：0.5-10μM；
TGFβ抑制剂SB431542：0.5-10μM或/和
TGFβ抑制剂A83-01：0.5-10μM。
在一个优选例中，所述培养基中包括：
GSK3β抑制剂CHIR99021：1-4μM；
TGFβ抑制剂SB431542：1-8μM或/和
TGFβ抑制剂A83-01：1-8μM。
在另一优选例中，所述培养基中还包括选自下组的成分：
N-乙酰-半胱氨酸(NAC)：0.25-25mM；
制瘤素M(OSM)：l-100ng/ml；或/和
白血病抑制因子(LIF)：100-1000u/ml。
在另一优选例中，所述培养基中包括：
N-乙酰-半胱氨酸(NAC)：0.5-12.5mM；
制瘤素M(OSM)：5-80ng/ml；或/和
白血病抑制因子(LIF)：150-800u/ml。
在另一优选例中，所述培养基中还包括选自下组的成分：
Figure PCTCN2015079878-appb-000001
在另一优选例中，所述培养基中：
Figure PCTCN2015079878-appb-000002
Figure PCTCN2015079878-appb-000003
在另一优选例中，所述的肝细胞基本培养基是在基础细胞培养基中添加了2.5％N2、5％B27、1％非必须氨基酸、1％丙酮酸钠和青链霉素混合液(100X)；或者添加入：5％N2或10％B27、1％非必须氨基酸、1％丙酮酸钠和1％青链霉素(100X)等成分得到的培养基。或直接使用基础细胞培养基替代肝细胞基本培养基。所述基础细胞培养基为DMEM/F12、MEM、DMEM、RPMI1640、Neuronal basal或Fischers等，均为市场上可购得的商品。
在本发明的另一方面，提供一种用于培养人肝细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包括前面任一所述的培养基。
在本发明的另一方面，提供所述的培养基或所述的试剂盒的用途，用于维持和增殖传代培养人肝细胞。
在本发明的另一方面，提供一种维持和增殖传代培养肝细胞的方法，所述方法包括：应用前面任一所述的培养基培养肝细胞。较佳地，所述的培养肝细胞的方法包括：
(1)将培养板打底(较佳地，用基质胶、鼠尾胶、明胶、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白其中一种打底)1-24小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基(较佳地，为添加10％血清的肝细胞基本培养基)中混悬，铺板；37℃培养1-12小时；
(2)弃用(1)中的培养基，将肝细胞分别换入权利要求1-5任一所述的培养基中培养。
在另一优选例中，前面所述的培养基、试剂盒、用途或方法中，所述的人肝细胞包括但不限于：人原代肝细胞及其传代肝细胞，从干细胞分化所得的人肝细胞或成体细胞转化所得的人肝细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、人原代肝细胞在不同条件培养下，第1，14和20天拍摄的细胞形态图。
图2、肝细胞培养基Ⅰ-2.1培养14天的体外培养的细胞形态图。
图3、肝细胞培养基Ⅰ-3.4培养21天的体外培养的细胞形态图。
图4、肝细胞培养基Ⅰ-3.1培养35天的体外培养的细胞形态图。
图5、肝细胞培养基Ⅰ-3.2传代培养第二代，共培养56天的细胞形态图。
图6、肝细胞培养基Ⅰ-3.3传代培养第二代，共培养80天的细胞形态图。
图7、肝细胞培养基Ⅰ-2.2传代培养第三代，共培养110天的细胞形态图。
图8、肝细胞培养基Ⅰ-2.2传代培养的肝细胞形态图。
图9、肝细胞培养基Ⅰ-1.1/2与Ⅰ-2.1/2培养人原代肝细胞，在培养至第20天时获得的细胞形态图。其中，“2个核心因子”是指“CHIR99021+SB431542”或“CHIR99021+A83-01”。
图10、肝细胞培养基Ⅰ-2.2培养84天肝特异性标志物的免疫染色。
图11、肝细胞培养基Ⅰ-2.1培养77天肝系相关基因的表达。
图12、肝细胞培养基Ⅰ-3.1培养11周的P450酶诱导功能实验结果。
图13、肝细胞培养基Ⅰ-3.1培养11周的肝细胞糖原染色。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，揭示了一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养的培养基以及培养方法。所述方法克服了现有肝细胞培养方法的缺陷，可在常规条件下长期维持培养人肝细胞并使其增殖传代，且保持与新分离的人原代肝细胞基本一致的形态功能。所述方法培养条件简单，成本低廉且安全稳定。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”和“由……构成”。
培养基
本发明人提供了用于进行人肝细胞培养的培养基。所述的培养基包括：GSK3β抑制剂CHIR99021，TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01。上述组分以适合的比例添加到肝细胞基本培养基中，可为肝细胞提供适合的生长环境，促进肝细胞的生长和扩增，维持肝细胞在相当长的时间内(约15天内)保持稳定的形态功能。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基的组分的用量如表1所示。
表1
所述的GSK3β抑制剂CHIR99021具有如下式(I)所示的结构式：
Figure PCTCN2015079878-appb-000005
所述的TGFβ抑制剂SB431542具有如下式(II)所示的结构式：
Figure PCTCN2015079878-appb-000006
所述的TGFβ抑制剂A83-01具有如下式(III)所示的结构式：
Figure PCTCN2015079878-appb-000007
本发明还包括与上述化合物(I)、(II)或(III)等效的药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体。
所述化合物的类似物包括但不限于：所述化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“盐”包括但不限于：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸等。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐等。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中可转变成化合物(I)、(II)或(III)的一种化合物，或化合物(I)、(II)或(III)的一种化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的优选方式，所述的培养基中还包括选自表2的一种或多种组分：N-乙酰-半胱氨酸(NAC)，制瘤素M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)。所述组分以适合的比例添加到包含GSK3β抑制剂CHIR99021，TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01的肝细胞培养基中后，可为肝细胞的增殖提供良好的培养条件，可以进一步地延长肝细胞维持培养的时间，实现长期维持和增殖传代培养。维持和增殖传代培养的肝细胞可连续稳定培养4个月以上并保持和新鲜分离的肝细胞基本一致的形态功能。
表2
  含量 优选量
N-乙酰-半胱氨酸(NAC) 0.25-25mM 0.5-12.5mM
制瘤素M(OSM) l-100ng/ml 5-80ng/ml
白血病抑制因子(LIF) 100-1000u/ml 150-800u/ml
作为本发明的优选方式，所述的培养基中还包括选自表3的一种或多种组分：人表皮细胞生长因子，人成纤维细胞生长因子，人肝细胞生长因子，地塞米松，血小板衍生因子，三碘甲状腺原氨酸。所述成分以适合的比例添加到包含GSK3β抑制剂CHIR99021，TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01(较佳地还包含选自N-乙酰-半胱氨酸，制瘤素M，白血病抑制因子的成分)的肝细胞培养基中后，可以使得肝细胞在这些因子的作用下，进一步增强肝细胞的生长增殖及一些生物学行为和功能。表3所列的因子作为本领域已知因子，本身所具备的功能已为本领域技术人员所熟悉，因此这些因子处理肝细胞后所导致的生物学行为和功能也是本领域已知的。
表3
  含量 优选量
人表皮细胞生长因子 5-100ng/ml 5-50ng/ml
人成纤维细生长因子 5-100ng/ml 5-50ng/ml
人肝细胞生长因子 5-100ng/ml 5-50ng/ml
地塞米松 0.05-1μM 0.1-0.8μM
血小板衍生因子 1-100ng/ml 5-50ng/ml
三碘甲状腺原氨酸 1-100ng/ml 20-80ng/ml
表1、优选地还包括表2和/或表3的配方的成分按照表中所记载的终浓度被溶于肝细胞基本培养基中，从而为肝细胞提供适宜的长期维持和增殖传代的环境。
所述的肝细胞基本培养基是在基础细胞培养基中添加了：2.5％N2、5％B27、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和1％青链霉素混合液(100X)；或者添加入：5％N2或10％B27、1％非必须氨基酸、1％丙酮酸钠和1％青链霉素(100X)等成分得到的培养基。
所述基础细胞培养基为：DMEM/F12、MEM、DMEM、RPMI1640、Neuronal  basal或Fischers等，均为市场上可购得的商品。应理解，基础细胞培养基是本领域技术人员便于获得的已知培养基。
经本发明人优化后的上述培养基，含有足够且合理的维持肝细胞生长或促进肝细胞扩增的成份，有利于肝细胞的培养。
用于配制培养基的各组分均是本领域技术人员易于获得的，例如可通过商业途径购买，或可通过人工合成或重组表达获得。
培养方法
本发明还提供了一种培养肝细胞的方法，所述方法包括：利用前述的用于培养肝细胞的培养基培养肝细胞。
本发明中，所述的“人肝细胞”包括了任何来源的人肝细胞，包括但不限于人原代肝细胞及其传代肝细胞，从干细胞分化所得的人肝细胞或成体细胞转化所得的人肝细胞等等。如，可从手术切除的肝脏组织中用两步灌注法自行分离人原代肝细胞。
应用本发明提供的优选的培养基，本领域技术人员可以借鉴现有的肝细胞分离技术来获得所需的肝细胞。
作为本发明的优选方式，维持培养肝细胞的方法包括：(1)将培养板用基质胶、鼠尾胶、明胶、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白其中一种打底1-24小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基(较佳地，为添加10％血清的肝细胞基本培养基)中混悬，铺板；37℃培养1-12小时；(2)弃用(1)中的培养基，将肝细胞分别换入权利要求1-5任一所述的培养基中培养。
经过本发明的方法培养的肝细胞可在培养期中任意时间作传代培养(包括多次传代培养)。作为本发明的优选方式，传代培养步骤：用消化液，包括胰酶，EDTA，Acutase，TrypleE等将培养的肝细胞消化为单细胞，重悬后按1:2-1:4传代，参照步骤(1)和(2)培养传代肝细胞。传代培养获得的肝细胞可在培养期中任意时间再作传代培养。
经过本发明的方法培养的肝细胞可用于检测肝细胞的形态功能的任何实验。维持和增殖传代培养的肝细胞可连续稳定培养4个月以上并保持和新鲜分离的肝细胞基本一致的形态功能。
应用
用本发明的方法培养的人肝细胞，不但能够获得具有和原代肝细胞基本一致的形态功能，而且操作简单易行，成本低，安全稳定等优点所述肝细胞可用作肝病研究的最佳细胞模型，还可用于新药肝毒测试，生物人工肝脏及细胞移植治疗肝病等。应用前景广阔，具重大研究价值，重大社会效益和经济效益。
现有常规贴壁培养方法，所培养肝细胞从几个小时到几天，最多可达14天，就失去肝细胞的形态功能。现有非常规培养如共生培养、悬浮培养、三明治培养、三维培养，可培养维持肝细胞2-3个月，最长可以将时间延长到3个月。但由于干扰因素多(如共生培养)、操作尤其繁杂(三明治培养)、或者不能直接观察细胞的形态改变(悬浮培养和三维培养)等这样那样的缺陷而无法满足肝病研究的需要，因此仅部分用于检测新药物的肝毒性。然而，即使用于检测新药物的肝毒，由于存在上述各种缺陷，所得结果也仅有相对的意义和价值。上述现有肝细胞培养方法都不能使肝细胞体外增殖传代。而本发明的人肝细胞长期培养和增殖传代方法克服了前述现有肝细胞培养方法的全部缺陷。具有常规培养、操作简单、易于观察、成本较低、培养保持肝细胞的时间长(4个月以上)、能够增殖传代等创新特点。
本方法长期培养和增殖传代的肝细胞不仅可以为肝病研究、肝脏体内再生和体外重建、肝细胞去分化等研究提供足够合格的肝细胞模型；为药物筛选、药靶研究、药理分析及肝毒性评估等提供动物模型无法比拟的人肝细胞模型和实验平台。更为重要的是，足够数量的肝细胞可以为肝病患者的肝细胞移植和生物人工肝脏提供正常肝细胞来源，这将可能挽救大量的病患。
本发明的人肝细胞长期培养和增殖传代方法的主要优点在于：
1、操作条件属于常规贴壁培养，操作简单，易于观察肝细胞的形态功能改变。
2、无外源基因导入，不改变肝细胞的基因结构，无外源基因干扰和基因背景改变，遗传安全，实验结果可靠。
3、无其他干扰因素影响，能够忠实反映实验结果。
4、能够长时间(4个月以上)培养维持肝细胞的形态功能，可以满足肝病机理、药效药靶、药物毒理等相关基础实验研究要求，为其提供合格的肝细胞模型。
5、能够体外增殖传代，可以为需要较多肝细胞数量的研究提供同批次肝细胞， 提高实验对照可比性。而且可成为肝细胞移植、生物人工肝、新药肝毒检测等，提供合格的人肝细胞来源。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、配制人肝细胞培养基
1、肝细胞基本培养基按照常规方法制备，即：在DMEM/F12(基础细胞培养基)中加入表4的成分(百分数以v/v计)：
表4
N2 2.5％
B27 5％
非必须氨基酸(Non-AA) 1％
丙酮酸钠(Sodium pyruvate) 1％
青链霉素混合液(100x) 1％
2、在上述肝细胞基本培养基的基础上，分别再添加入终浓度如表5的成分，分别获得肝细胞培养基Ⅰ-1.1/2、Ⅰ-2.1/2和肝细胞培养基Ⅰ-3.1/2/3/4。
表5
Figure PCTCN2015079878-appb-000008
Figure PCTCN2015079878-appb-000009
实施例2、人肝细胞长期增殖传代维持培养
1、肝细胞培养基Ⅰ-1.1、肝细胞培养基Ⅰ-1.2培养人原代肝细胞
(1)原代肝细胞(为摘除的人体肝脏组织分离产品)购自Life technology公司。
(2)将培养板用基质胶(1：30)打底1小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基(添加10％血清的肝细胞基本培养基)中混悬，铺板，37℃培养1小时；
(3)弃用(2)培养液，将肝细胞分别换入肝细胞培养基Ⅰ-1.1、Ⅰ-1.2中培养。
利用肝细胞培养基Ⅰ-1.1、Ⅰ-1.2，培养1、14和20天的时候，拍摄细胞形态图(以未加入GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂培养的细胞作对照)，形态图如图1。
由图1可见，在肝细胞基本培养基的基础上添加GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂，可以在相对较长的时间内维持人肝细胞保持接近于新鲜分离的肝细胞的形态，至培养第14天(D14)还能维持形态。而未加入GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂的肝细胞，则无法较长时间维持。
2、肝细胞培养基Ⅰ-2.1/2、肝细胞培养基Ⅰ-3.1/2/3/4培养人原代肝细胞
(1)原代肝细胞购自Life technology公司。
(2)将培养板用基质胶(1：30)打底1小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基(添加10％的血清的细胞基本培养基)中混悬，铺板。37℃培养1小时；
(3)弃用(2)培养液，将肝细胞分别换入肝细胞培养基Ⅰ-2.1/2和肝细胞培养基Ⅰ-3.1/2/3/4中培养。
利用肝细胞培养基Ⅰ-2.1，培养14天的体外培养的细胞形态图如图2；
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.4，培养21天的体外培养的细胞形态图如图3；
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.1，培养35天的体外培养的细胞形态图如图4。
3.人原代肝细胞传代培养
传代培养步骤：用消化液(胰酶)将培养的肝细胞消化为单细胞，重悬后按1:2传代，按前述“2”中步骤(2)和(3)方法培养传代肝细胞。
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.2，培养至第14天后进行传代培养第二代，总共培养56天的体外培养的细胞形态图如图5；
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.3，培养至第21天后进行传代培养第二代，至第35天后进行第二次传代培养第三代，总共培养80天的体外培养的细胞形态图如图6；
利用肝细胞培养基Ⅰ-2.2，培养至第21天后进行第一次传代培养第二代，至第35天后进行第二次传代培养第三代，至第28天进行第三次传代培养第四代，总共培养110天的体外培养的细胞形态图如图7。
利用肝细胞培养基Ⅰ-2.2培养15天后的细胞用胰酶消化后按照1:3传代后以前述“2”中步骤(2)和(3)方法培养，获得的细胞形态图如图8。
综上可见，在肝细胞基本培养基的基础上添加GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂，同时再添加NAC，LIF或OSM，可以使得肝细胞更长期地保持接近于新鲜分离的肝细胞的形态功能，并可实现增殖传代培养。进一步添加EGF、bFGF、HGF、血小板衍生因子、三碘甲状腺原氨酸、地塞米松其中一种或多种，可在前述基础上，增强所培养肝细胞相关基因表达或增殖速度。
上述所获得的传代后的肝细胞继续进行传代培养，仍然获得较为理想的细胞形态。经鉴定，维持和增殖传代培养的肝细胞可连续稳定培养4个月以上并保持和新鲜分离的肝细胞基本一致的形态功能。
4.培养基Ⅰ-1.1/2与Ⅰ-2.1/2人原代肝细胞传代培养
培养基Ⅰ-1.1为肝细胞基本培养基添加GSK3β抑制剂CHIR99021及TGFβ抑制剂SB431542获得的培养基；培养基Ⅰ-1.2为肝细胞基本培养基添加GSK3β抑制剂CHIR99021及TGFβ抑制剂A83-01获得的培养基。而培养基Ⅰ-2.1/2是在肝细胞基本培养基中添加GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂的条件下，还添加了NAC和OSM。
分别以培养基Ⅰ-1.1/2与Ⅰ-2.1/2来培养人原代肝细胞，培养方法同前述“2”中步骤(2)和(3)。在培养至第20天时获得的细胞形态图如图9。
实施例3、肝细胞特性鉴定
(1)免疫染色
免疫染色方法为：
1.弃细胞培养液，PBS漂洗1次，
2.4％多聚甲醛固定10分钟后，PBS漂洗5分钟×3次，
3.10％羊血清封闭：室温，60分钟，
4.0.2％Triton：25-30min，
5.一抗(兔抗ALB抗体，鼠抗CYP3A抗体或兔抗Asgpr抗体)室温1小时或
4℃过夜，
6.PBS漂洗5分钟×3次，
7.二抗(Cy3标记的羊抗兔抗体，FITC标记的羊抗鼠或羊抗兔抗体)室温45-60min，
8.PBS洗净，5min×3次，
9.封片，荧光显微镜取照片。
利用肝细胞培养基Ⅰ-2.2，培养84天的体外培养的细胞，进行肝特异性标志物的免疫染色。结果如图10。
由结果可见，本发明的培养基培养的肝细胞长期维持培养后，肝特异性标志物明显，可见其仍然保留肝细胞的特性。
(2)基因表达鉴定
利用肝细胞培养基Ⅰ-2.1，培养77天的体外培养的细胞，PCR检测其肝系相关基因的表达。结果如图11。
由结果可见，长期培养的肝细胞(D56PHH)中ALB、HNF4a、AAT、TTR、UGT、CYP3A4、1A2、2B6等基因与新鲜分离的肝细胞(Fresh PHH)的基因表达水平几乎一致。
(3)P450酶诱导功能实验
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.1，培养人原代肝细胞77天(11周)后，人原代肝细胞的CYP 3A4的酶活性在利福平(Rifampicine)诱导下升高的情况。
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.1，培养人原代肝细胞77天后的肝原代细胞，利福平不同浓度(1uM、10uM、25uM)处理，以不加入利福平且其它条件相同的处理组作为对照。用PromegaP450-GloTMAssays试剂盒，按试剂盒说明检测体外培养77天的人肝原代细胞的CYP 3A4的酶活性。鉴定CYP 3A4的酶活性在利福平(Rifampicine)诱导下升高的情况。
结果如图12。可见培养后的人肝原代细胞在利福平诱导下CYP 3A4的酶活性显著升高。
(4)糖原染色
利用肝细胞培养基Ⅰ-3.1，培养人原代肝细胞77天(11周)后，进行糖原染色。用Schiff方法作肝糖原染色。具体方法为：
1.弃细胞培养液，PBS漂洗1次；
2.4％多聚甲醛固定10分钟后，PBS漂洗5分钟×3次；
3.加入PASI液10min，流水冲洗；
4.加入PASII液1-2min，流水冲洗；
5.显微镜取照片；
结果如图13。培养后的细胞肝糖原染色阳性，表明所述肝细胞保留了新鲜分离的人肝细胞基本相同的特性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 一种用于培养人肝细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：肝细胞基本培养基；以及
    GSK3β抑制剂CHIR99021：0.5-10μM；
    TGFβ抑制剂SB431542：0.5-10μM或/和TGFβ抑制剂A83-01：0.5-10μM。
  2. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括：
    GSK3β抑制剂CHIR99021：1-4μM；
    TGFβ抑制剂SB431542：1-8μM或/和TGFβ抑制剂A83-01：1-8μM。
  3. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括选自下组的成分：
    N-乙酰-半胱氨酸：0.25-25mM；
    制瘤素M：l-100ng/ml；或/和
    白血病抑制因子：100-1000u/ml。
  4. 如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括：
    N-乙酰-半胱氨酸：0.5-12.5mM；
    制瘤素M：5-80ng/ml；或/和
    白血病抑制因子：150-800u/ml。
  5. 如权利要求1或3所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括选自下组的成分：
    Figure PCTCN2015079878-appb-100001
  6. 一种用于培养人肝细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求1-5任一所述的培养基。
  7. 权利要求1-5所述的培养基或权利要求6所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于维持和增殖传代培养人肝细胞。
  8. 一种维持和增殖传代培养肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求1-5任一所述的培养基培养肝细胞；较佳地，所述的培养肝细胞的方法包括：
    (1)将培养板打底1-24小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基(较佳地为添加10％血清的肝细胞基本培养基)中混悬，铺板；37℃培养1-12小时；
    (2)弃用(1)中的培养基，将肝细胞分别换入权利要求1-5任一所述的培养基中培养。
  9. GSK3β抑制剂CHIR99021、TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01构成的组合物的用途，其特征在于，用于维持人肝细胞的形态功能和促进其增殖再生；用于维持和增殖培养人肝细胞。
  10. 如权利要求1-5所述的培养基、权利要求6所述的试剂盒、权利要求7或9所述的用途或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的人肝细胞包括：人原代肝细胞及其传代肝细胞，从干细胞分化所得的人肝细胞或成体细胞转化所得的人肝细胞。
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