CN102858958A - 诱导肝干细胞及其制造方法、以及该细胞的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明为在安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验,高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验，新药发现靶标筛选，动物模型制作，肝脏合成蛋白的生产及再生医疗中有用的下述诱导肝干细胞、其制造方法及该细胞的用途。一种诱导肝干细胞，其特征在于，至少具备下述（1）～（3）的特征，（1）表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的特定基因群中的至少15种基因，（2）具有肝细胞的性质，（3）能够增殖培养或继代培养3天以上。

Description

诱导肝干细胞及其制造方法、以及该细胞的用途
技术领域
本发明涉及在安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验，高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验，新药发现靶标筛选，动物模型制作，肝脏合成蛋白（hepatocyte-producedproteins）的生产及再生医疗中有用的诱导肝干细胞，特别涉及特征在于具有肝细胞的性质、以与胚胎干细胞同等的量表达胚胎干细胞的标志基因群且能够长期增殖继代培养的诱导肝干细胞、其制造方法及该细胞的用途。
背景技术
制药企业的新药研究开发均存在研究开发周期长且研究开发费用高的问题。并且，现状是虽然存在多个预期将来将成为新药的候补，但随着研究开发的进展而产生有效性、安全性的问题，其中的大半不得不放弃开发。
通常，开发新药需要长达9～17年的较长时间和数十亿元～数百亿元的巨额研究开发费用，因此可以说，若存在能够在临床前等早期阶段缩小候补化合物范围的新药发现工具，则能够减少其开发费用。
然而，在目前的非临床试验中，在药物的安全性、毒性等的评价中，必须使用动物进行试验，这也是开发费居高不下的原因之一。此外，由于人和动物的种间差异，有时药物在生物体内的动态是不同的，因而有时无法对安全性进行充分评价，进入临床试验阶段才获知候补化合物具有毒性而放弃开发。
因此，非常希望建立在研究开发的早期阶段对候补化合物在人活体内的动态等进行预测及评价的评价体系，目前已经开展了以构建使用人肝细胞的评价系统来代替具有“种间差异壁垒”的界线的动物实验为目标的研究。这样的评价系统由于能够在药物开发的早期阶段准确地筛出安全性高的候补药，因此在制药企业中存在较大需求。
目前的使用人培养细胞的非临床试验中，使用的是外国人的原代培养肝细胞或已有细胞株等。然而，原代培养肝细胞存在供体稀缺、批次差异非常大的问题。尤其是，日本人的原代培养肝细胞由于伦理问题及法律限制而非常难获得，无法实现稳定供给。
进而，肝脏中表达的药物代谢酶发挥着催化多种药物代谢的重要作用，但存在基因多态性且其表达量及活性也存在较大个体差异，因此使得上述非临床试验中的问题更加严峻。
此外，为了应对数量庞大的个体的差异，希望能够以囊括这些差异的来自多个供体的原代培养肝细胞作为代表细胞而重复用于各种试验。然而，即使在培养皿中培养原代培养肝细胞，也几乎无法进行增殖培养，因此还存在实际中无法对该肝细胞进行继代培养并反复用于各种试验的问题。
另一方面，现有细胞株大多是发生了核型异常的细胞，此外，也不存在囊括数量庞大的个体的差异的多个细胞株。进而，通过现有方法长期继代培养的现有细胞株由于未显示出与原代培养肝细胞同样的药物代谢酶活性、转运蛋白诱导能力，因此无法由其结果预测临床中对人的安全性、代谢等。
由上述诸多情况可知，虽然期待具有肝细胞的性质、能够长期继代培养的细胞，但尚未报道从囊括数量庞大的个体的差异的多个供体发现这样的细胞。
此外，设想存在肝脏的干细胞、即具有分化为肝细胞能力的肝干细胞。然而，还不存在发现如胚胎干细胞及诱导多能性干细胞那样表达自我复制基因、具有能够长期在生物体外继代培养的性质的肝干细胞的报道。
因此，在生物体外，理论上能够分化为所有组织的体细胞、生殖细胞的保持分化多能性且能够以未分化的状态几乎无限地自我复制的胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）（本说明书中以下记为“胚胎干细胞”。）是否不仅能够用于再生医疗而且可以用于新药发现领域还在研究之中。胚胎干细胞是指由属于动物的发生初期阶段的囊胚期的胚的一部分的内部细胞块制备的干细胞株，取英语的头一个字母时也被称为ES细胞。
为了建立胚胎干细胞，需要受精卵或由受精卵进一步发生至囊胚阶段的初期胚。在人的情况下，由于使用受精卵作为材料，认为存在使生命的萌芽消灭这一伦理问题。因此，存在着不允许制作和研究人胚胎干细胞的国家，此外，即使在认为具有治疗帕金森病等神经退行性疾病、脊髓损伤等目前无法根治的疾病的可能性而允许对其进行研究的国家，对人胚胎干细胞的操作也加以严格的限制。因此，胚胎干细胞的基础研究、应用研究中伦理问题是一个较大的障碍。
此外，实际中为了使用胚胎干细胞，需要使胚胎干细胞分化为某种特定细胞，积极地开发了分化为肝细胞、神经细胞、心肌细胞、胰岛β细胞等的方法。然而，这样分化为特定细胞较为困难，特别是难以诱导分化为肝细胞。目前尚未建立高效分化诱导为能够用于新药发现研究的高品质成熟肝干细胞的方法。目前报告的所有分化诱导法均需要3周左右的较长时间，花费了较高费用、劳力、时间而高度分化诱导的肝细胞样细胞几乎无法增殖。
最近报道了：通过导入OCT3/4基因（OCT3/4为基因名，有时也记作OCT3或4，在本说明书中以下记作POUF1基因。）、SOX2基因、KLF4基因及c-MYC基因（专利文献1）或在碱性成纤维细胞生长因子存在下导入POU5F1基因、SOX2基因及KLF4基因（非专利文献1），从而能够由人等的体细胞制作称为诱导多能性干细胞的与胚胎干细胞同样的未分化细胞（专利文献2）。已知的是，人的诱导多能性干细胞（induced Pluripotent StemCells；iPS细胞）（本说明书中，以下记为“诱导多能性干细胞”。）具有如下两个特征：（1）分化多能性：能够分化为形成个体的所有细胞的三胚层，（2）自我复制能力：在特定的条件下，能够维持其未分化性状态地在培养皿中无限地继代培养。并且，该人诱导多能性干细胞在形态、基因表达、细胞表面抗原、长期自我复制能力、畸胎瘤（良性肿瘤）形成能力方面与人胚胎干细胞非常类似(非专利文献2、非专利文献3)，进而，报道指出HLA的基因型与其来源细胞即体细胞完全相同（非专利文献3）。
通常认为，在该诱导多能性干细胞的制作中，仅仅向细胞中导入POU5F1基因、SOX2基因、KLF4基因、c-MYC基因这4个基因或POU5F1基因、SOX2基因、KLF4基因这3个基因，即可使已经分化的体细胞“初始化·复位”成未分化的多能性干细胞。然而，人细胞的情况下，用4个基因时仅能以0.1%-0.01％、用3个基因时仅能以0.01%-0.001％的效率由体细胞制作诱导多能性干细胞。因此，99.9%-99.999％的细胞无法通过基因导入而复位为诱导多能性干细胞。
进而，在胚胎干细胞中特异性表达的NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因等为对维持多能性干细胞的未分化性而言很重要的因子，可以认为其抑制了细胞的分化。因此，在已分化的细胞中，随着分化基因（分化细胞的性质）的表达，作为对维持未分化性而言很重要的因子的NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因的表达则消失。
也即，通常认为，使对维持未分化性而言很重要的因子NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因以及分化细胞的多种性质（多个分化基因的表达）一起进行表达的细胞是无法制作的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-283972
专利文献2：日本特开2008-307007
非专利文献
非专利文献1：Nakagawa M et al.,Nat Biotechnol.,2008,26,101-6
非专利文献2：Takahashi K,Yamanaka S et al.,Cell,2007,131,861-872
非专利文献3：Masaki H,Ishikawa T et al.,Stem Cell Res.,2008,1,105-115
因此，本发明人等对于能否制作使对维持未分化性而言很重要的基因和肝细胞的多种性质共存的细胞进行了深入研究，结果发现能够获得不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞，并且发现该诱导肝干细胞在安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验,高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验、新药发现靶标筛选、动物模型的制作、肝脏合成蛋白的生产、及再生医疗中有用，从而完成了本发明。
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的第1目的在于提供不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞。
本发明的第2目的在于提供不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞的制作方法。
本发明的第3目的在于提供使用本发明的诱导肝干细胞的安全性试验方法、毒性试验方法、代谢试验方法、药物相互作用试验方法、抗病毒活性试验方法、高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验方法、新药发现靶标筛选方法、动物模型制作方法、肝脏合成蛋白的生产方法、及再生医疗等方法。
用于解决问题的方案
即，本发明的第1发明为特征在于至少具备下述（1）～（3）的特征的诱导肝干细胞（权利要求1）。
（1）表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的下述表1的基因群中的至少15种基因。
[表1]
  基因符号   Genbank登录号
  ACVR2B   NM_001106
  CD24   L33930
CDH1 NM_004360
  CYP26A1   NM_057157
  DNMT3B   NM_175850
  DPPA4   NM_018189
  EDNRB   NM_003991
  FLT1   NM_002019
  GABRB3   NM_000814
  GATA6   NM_005257
  GDF3   NM_020634
  GRB7   NM_005310
  LIN28   NM_024674
  NANOG   NM_024865
  NODAL   NM_018055
  PODXL   NM_005397
  POU5F1   NM_002701
  SALL4   NM_020436
  SOX2   NM_003106
  TDGF1   NM_003212
  TERT   NM_198253
  ZFP42   NM_174900
  ZIC3   NM_003413
（2）具有肝细胞的性质。
（3）能够增殖培养或继代培养3天以上。
从维持诱导肝干细胞的性质或长期持续培养的观点出发，优选的是，与在胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比，本发明的诱导肝干细胞中表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达量为1/8～8倍（权利要求2），特别优选为1/4～4倍（权利要求3）。本发明的诱导肝干细胞优选表达作为前述（1）胚胎干细胞的标志基因的NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因及SALL4基因（权利要求4）。
优选表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的选自下述表2的基因群中的15种以上（权利要求5）。
[表2]
  基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号
  A2M   NM_000014   ERP27   NM_152321   NRCAM   NM_005010
  ACE2   NM_021804   EVA1   NM_144765   NTF3   NM_002527
  ACVRL1   NM_000020   F10   NM_000504   OLFML2A   NM_182487
  ADAMTS9   NM_182920   F2   NM_000506   PAG1   NM_018440
  AFAP1L2   NM_001001936   FABP1   NM_001443   PCSK6   NM_002570
  AFP   NM_001134   FGA   NM_021871   PDK4   NM_002612
  AGT   NM_000029   FGA   NM_000508   PDZK1   NM_002614
  AHSG   NM_001622   FGB   NM_005141   PLA2G12B   NM_032562
  AK027294   AK027294   FGG   NM_000509   PLG   NM_000301
  AK074614   AK074614   FLRT3   NM_198391   PRG4   NM_005807
  AK124281   AK124281   FMOD   NM_002023   PSMAL   NM_153696
  AK126405   AK126405   FOXA1   NM_004496   PTGDS   NM_000954
  ALB   NM_000477   FTCD   NM_206965   PTHR1   NM_000316
  ALDH1A1   NM_000689   GATA4   NM_002052   RASD1   NM_016084
  ANXA8   NM_001630   GATM   NM_001482   RBP4   NM_006744
  APCDD1   NM_153000   GDF10   NM_004962   RNF43   NM_017763
  APOA1   NM_000039   GJB1   NM_000166   RRAD   NM_004165
  APOA2   NM_001643   GLT1D1   NM_144669   S100A14   NM_020672
  APOA4   NM_000482   GPRC5C   NM_022036   SEPP1   NM_005410
  APOB   NM_000384   GSTA3   NM_000847   SERINC2   NM_178865
  AREG   NM_001657   GUCY1A3   NM_000856   SERPINA1   NM_001002236
  ART4   NM_021071   H19   NR_002196   SERPINA3   NM_001085
  ASGR2   NM_080912   HHEX   NM_002729   SERP1NA5   NM_000624
  ATAD4   NM_024320   HKDC1   NM_025130   SH3TC1   NM_018986
  BC018589   BC018589   HMGCS2   NM_005518   SLC13A5   NM_177550
  BMP2   NM_001200   HP   NM_005143   SLC40A1   NM_014585
  BX097190   BX097190   HPR   NM_020995   SLC5A9   NM_001011547
  C11orf9   NM_013279   HPX   NM_000613   SLCO2B1   NM__007256
  C13orf15   NM_014059   HSD17B2   NM_002153   SLPI   NM_003064
  C15orf27   NM_152335   HTRA3   NM_053044   SPARCL1   NM_004684
  C3   NM_000064   IGF2   NM_001007139   SPON1   NM_006108
  C5   NM_001735   IL32   NM_001012631   ST8SIA1   NM_003034
  CA414006   CA414006   INHBB   NM_002193   STARD10   NM_006645
  CD163   NM_004244   ISX   NM_001008494   STMN2   S82024
  CD1D   NM_001766   KCNJ16   NM_170741   TDO2   NM_005651
  CDX2   NM_001265   KYNU   NM_003937   TF   NM_001063
  CILP   NM_003613   LAMC2   NM_005562   TMC6   NM_007267
  CMKLR1   NM_004072   LGALS2   NM_006498   TMEM16D   NM_178826
  COL4A6   NM_033641   LHX2   NM_004789   TSPAN15   NM_012339
  COLEC11   NM_199235   LOC132205   AK091178   TTR   NM_000371
  CXCL14   NM_004887   LOC285733   AK091900   UBD   NM_006398
  CXCR4   NM_001008540   M27126   M27126   UGT2B11   NM_001073
  CXCR7   NM_020311   MAF   AF055376   UGT2B7   NM_001074
  DACH1   NM_080759   MFAP4   NM_002404   UNC93A   NM_018974
  DENND2A   NM_015689   MMP10   NM_002425   VCAM1   NM_001078
  DIO3   NM_001362   MTTP   NM_000253   VIL1   NM_007127
  DLK1   NM_003836   NGEF   NM_019850   VTN   NM_000638
  DUSP6   NM_001946   NGFR   NM_002507   WFDC1   NM_021197
此外，优选表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的AFP基因、TTR基因、TF基因、APOA2基因、APOA4基因、AHSG基因、FGA基因、AGT基因、FABP1基因、SERPINA1基因及RBP4基因（权利要求6）。
优选本发明的诱导肝干细胞进而表达中内胚层系干细胞及/或内胚层系干细胞特异性的选自SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因中的至少1种（权利要求7），优选的是，在受试物质作用下，抑制或诱导选自下述表3的基因群中的至少1种基因的表达，或者促进或抑制该基因的基因产物的活性（权利要求8）。
[表3]
  基因符号  Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号
  ABCB1   NM_000927   GSTA1   NM_145740   SLC22A6   NM_153277
  ABCB11   NM_003742   GSTA2   NM_000846   SLC22A7   NM_153320
  ABCB4   NM_018850   GSTA3   NM_000847   SLC22A8   NM_004254
  ABCC1   NM_019862   GSTA4   NM_001512   SLC22A9   NM_080866
  ABCC2   NM_000392   GSTA5   NM_153699   SLCO1A2   NM_005075
  ABCC3   NM_003786   GSTM1   NM_146421   SLCO1A2   NM_134431
  ACTB   NM_001101   GSTM2   NM_000848   SLCO1B1   NM_006446
  AHR   NM_001621   GSTM3   NM_000849   SLCO1B3   NM_019844
  ARNT   NM_001668   GSTM4   NM_147148   SLCO1C1   NM_017435
  BAAT   NM_001701   GSTM5   NM_000851   SLCO2A1   NM_005630
  COMT   NM_000754   GSTP1   NM_000852   SLCO2B1   NM_007256
  CYP1A1   NM_000499   GSTT1   NM_000853   SLCO3A1   XM_001132480
  CYP1A2   NM_000761   GSTT2   NM_000854   SLCO3A1   NM_013272
  CYP1B1   NM_000104   GSTZ1   NM_145870   SLCO4A1   NM_016354
  CYP2A13   NM_000766   NAT1   NM_000662   SLCO4C1   NM_180991
  CYP2A6   NM_000762   NAT2   NM_000015   SULT1A1   NM_177529
  CYP2A7   NM_000764   NR1H4   NM_005123   SULT1A2   NM_177528
  CYP2B6   NM_000767   NR1I2   NM_003889   SULT1A3   AK094769
  CYP2C18   NM_000772   NR1I3   NM_005122   SULT1A4   NM_001017389
  CYP2C19   NM_000769   PPARA   NM_005036   SULT1B1   D89479
  CYP2C8   NM_000770   PPARA   L02932   SULT1B1   NM_014465
  CYP2C9   NM_000771   PPARD   NM_006238   SULT1C2   NM_176825
  CYP2D6   NM_000106   PPARG   NM_138711   SULT1C4   NM_006588
  CYP2E1   NM_000773   RPL13   NM_033251   SULT1E1   NM_005420
  CYP2F1   NM_000774   RPS18   NM_022551   SULT2A1   NM_003167
  CYP2J2   NM_000775   RXRA   NM_002957   SULT2B1   NM_004605
  CYP3A4   NM_017460   RXRB   NM_021976   SULT4A1   NM_014351
  CYP3A5   NM_000777   RXRG   NM_006917   TPMT   NM_000367
  CYP3A5   AF355801   SLC10A1   NM_003049   UGT1A6   NM_001072
  CYP3A7   NM_000765   SLC10A2   NM_000452   UGT1A8   NM_019076
  CYP4A11   NM_000778   SLC16A1   NM_003051   UGT2A1   NM_006798
  CYP4B1   NM_000779   SLC17A1   NM_005074   UGT2B10   NM_001075
  CYP4F11   NM_021187   SLC22A1   NM_153187   UGT2B11   NM_001073
  CYP4F12   NM_023944   SLC22A10   NM_001039752   UGT2B15   NM_001076
  CYP4F2   NM_001082   SLC22A11   AK075127   UGT2B17   NM_001077
  CYP4F3   AB002454   SLC22A11   NM_018484   UGT2B28   NM_053039
  CYP4F8   NM_007253   SLC22A2   NM_003058   UGT2B4   NM_021139
  EEF1A1   NM_001402   SLC22A3   NM_021977   UGT2B7   NM_001074
  ENDOG   NM_004435   SLC22A4   NM_003059
  GAPDH   NM_002046   SLC22A5   NM_003060
进而，优选本发明的诱导肝干细胞能够增殖培养或继代培养1个月以上（权利要求9）。
本发明的第2发明为诱导肝干细胞的制造方法，其特征在于，所述诱导肝干细胞的制造方法包括将哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序，该工序为如下工序：使前述哺乳动物细胞处于存在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的基因产物且使得POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物的状态（权利要求10）。优选该工序为如下工序：使用前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因或它们的基因产物，且POU5F1基因或该基因的基因产物与SOX2基因或该基因的基因产物的使用比率大于1（权利要求11）。
优选前述的用于诱导诱导肝干细胞所必需的前述POU5F1基因、KLF4基因及S OX2基因的使用比率满足POU5F1基因＞KLF4基因＞SOX2基因的关系（权利要求12），特别优选为4：2：1（权利要求13）。
作为前述哺乳动物细胞，优选使用来源于成体的细胞、来源于新生仔的细胞、来源于新生仔皮肤的细胞、罹患癌症个体的细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞或由胚胎干细胞或诱导多能性干细胞分化的细胞（权利要求14），前述哺乳动物优选为人（权利要求15）。
进而，本发明的第3发明为使用本发明的诱导肝干细胞的试验方法（权利要求16），该试验方法包括安全性试验方法、毒性试验方法、代谢试验方法、药物相互作用试验方法、抗病毒活性试验方法、高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验方法（权利要求17）。本发明的第4发明为新药发现靶标筛选方法（权利要求18）、第5发明为动物模型制作方法（权利要求19）、第6发明为肝脏合成蛋白的生产方法（权利要求20）、第7发明为以哺乳动物对象的治疗方法（权利要求21）。
发明的效果
根据本发明，能够由人种、性别、年龄、遗传背景不同的供体制作人诱导肝干细胞，因此本发明在新药的临床试验前的安全性试验、毒性试验、代谢试验、药物相互作用试验等非临床试验中有用。此外，使用了人诱导肝干细胞的非临床试验还是有助于高效开发新药的新药发现工具。
具体实施方式
以下对本发明的诱导肝干细胞、其制造方法及该细胞的用途进行详细说明。
本发明的诱导肝干细胞为特征在于具备至少下述（1）～（3）的特征的诱导肝干细胞。
（1）表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的前述表1的基因群中的至少15种基因。
（2）具有肝细胞的性质。
（3）能够增殖培养或继代培养3天以上。
接下来，在本发明的诱导肝干细胞中，已知作为胚胎干细胞的标志基因的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达是用于限定：本发明的诱导肝干细胞为具有理论上无限地自我复制、事实上能够保持诱导肝干细胞的状态长期继代培养的性质的细胞。本发明的诱导肝干细胞必须表达选自前述表1的基因群中的至少15种基因。
本发明的诱导肝干细胞只要表达前述（1）胚胎干细胞的标志基因即可，没有特别限制，本发明的诱导肝干细胞所表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达量与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比，优选为1/16～16倍，更优选为1/8～8倍。特别地，从为了维持诱导肝干细胞的状态或长期继代培养的观点出发，优选本发明的诱导肝干细胞所表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达量与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比几乎相等，即在1/4～4倍以内；最优选在1/2～2倍以内。
本发明的诱导肝干细胞中，从维持未分化状态的观点出发，选自作为前述（1）胚胎干细胞的标志基因的前述表1的基因群中的至少15种基因在本发明的诱导肝干细胞中表达的基因的表达量和在胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比，优选在1/2～2倍的范围内表达，在该范围内表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的数优选增加至20、25种以上。
优选的是，本发明的诱导肝干细胞中，作为前述（1）胚胎干细胞的标志基因的前述表1的基因群中，以与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比5种以上基因的表达量为1/2～2倍、10种以上基因的表达量为1/4～4倍、20种以上基因的表达量为1/8～8倍的范围表达。
优选的是，本发明的诱导肝干细胞中，作为前述（1）胚胎干细胞的标志基因的前述表1的基因群中，包含NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因在内的5种基因以与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比为1/4～4倍的范围表达，更优选NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因及SALL4基因这5种基因以1/4～4倍的范围表达，特别地，进一步优选NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、TDGF1基因、DNMT3B基因、ZFP42基因、TERT基因、GDF3基因、SALL4基因、GABRB3基因这10种基因以1/4～4倍的范围表达。
作为前述比较对象的胚胎干细胞，可以使用hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）、hES_ES01（GSM194392）中任一者。这些基因的表达数据可以由数据库Gene Expression Omnibus〔GEO〕（“Gene Expression Omnibus〔GEO〕、[online]、[2010年1月28日检索]、网络＜http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/＞）获得。
本发明的诱导肝干细胞必须是前述（2）具有肝细胞的性质的。本发明的诱导肝干细胞的肝细胞性质，只要是肝细胞特异的性质即可，没有特别限制，主要可以列举出肝细胞特异性蛋白（基因产物）的产生等。具体而言，可以列举出：血清蛋白（AFP、TTR、TF、APOA2、APOA4、AHSG、FGA、AGT、FABP1、SERPINA1、RBP4等）的产生，糖类代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、及铁代谢的相关酶的产生，药物代谢酶及转运蛋白的产生等，但并非仅限于此。
本发明的诱导肝干细胞优选表达前述（2）肝细胞的性质的相关基因。这样的基因为肝细胞中特异性表达的基因，只要是与肝细胞的性质相关的基因即可，可以例示出例如肝细胞特异性蛋白的产生等的相关基因。具体而言，可以列举出：血清蛋白的产生，糖类代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、及铁代谢相关酶的产生，药物代谢酶及转运蛋白的产生等的相关基因，但并非仅限于此。特别是，作为药物代谢酶及转运蛋白的生产的相关基因，可以列举出例如前述表3的基因群等。这样的药物代谢酶及转运蛋白的生产的相关基因，在本发明的诱导肝干细胞所摄取的药物候补化合物等受试物质等的作用下，显示基因表达、诱导、抑制等。
作为本发明的诱导肝干细胞的一个形态，可以是表达选自作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因即肝相关基因的前述表2的基因群中的至少15种基因。这些基因为在人原代培养肝细胞中表达的肝细胞特异性基因。
与各基因符号相对应的gen bank登录号如前述表2所示。各基因信息可以由NCBI的主页（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）获得。
从能够获得强烈具有肝细胞特异性性质的细胞的观点出发，优选表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的前述表2的基因群中的50种以上基因，特别地，优选表达80种以上。优选的是，本发明的诱导肝干细胞表达前述表2的基因群中的AFP基因，特别优选表达AFP基因、TTR基因、TF基因、APOA2基因、APOA4基因、AHSG基因、FGA基因、AGT基因、FABP1基因、SERPINA1基因及RBP4基因。
已知的是，前述基因通常在肝细胞中大量表达，相对地，在包括胚胎干细胞在内的非肝细胞的细胞中，这些基因大多基本上不表达。
此外，在本发明的诱导肝干细胞的其它形态中，可以表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的以下列举的基因。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达GSTM3基因、SLC22A1基因、GSTA5基因、ALDH1A1基因、CYP27A1基因、CYP1B1基因、ALDH2基因、GSTA2基因、GSTA3基因、GSTA5基因、CYP4A2基因、UGT2B11基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出产生药物动力学相关蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在毒性试验方法中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达GSTM3基因、SLC22A1基因、GSTA5基因、ALDH1A1基因、CYP27A1基因、CYP1B1基因、ALDH2基因、GSTA2基因、GSTA3基因、GSTA5基因、CYP4A2基因、UGT2B11基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出产生药物代谢相关酶的相关蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在代谢试验方法中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达CD81基因、SCARB1基因、OCLN基因、CLDN1基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出产生HCV复制的相关蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在抗病毒活性试验方法中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达APOA1基因、APOA2基因、APOA4基因、APOB基因、FABP1基因、AGT基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出产生脂质代谢、血压的相关蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在高脂血症药、高血压治疗药等药物筛选试验中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达CCL2基因、CDKN1A基因、ICAM1基因、JUNB基因、RGS2基因、CCND1基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出产生转运蛋白及代谢型受体的相关蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在低分子化合物、抗体等药物的筛选试验中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达ALB基因、TTR基因、TF基因、RBP4基因、FGA基因、FGB基因、FGG基因、AHSG基因、AFP基因、FN1基因、SERPINA1基因、PLG基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出生产血清蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在动物模型制作方法中有用。
本发明的诱导肝干细胞中，还可以表达ALB基因、TTR基因、TF基因、RBP4基因、FGA基因、FGB基因、FGG基因、AHSG基因、AFP基因、FN1基因、SERPINA1基因、PLG基因等。在表达这样的基因的情况下，表现出生产血清蛋白这样的肝细胞性质，因此特别是在以非人动物为对象的治疗方法中有用。
本发明的诱导肝干细胞还可以具有中内胚层系干细胞及/或内胚层系干细胞的特异性性质，进而还可以表达选自在中内胚层系干细胞及/或内胚层系干细胞中表达的基因中的SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因中的至少1种。特别优选表达SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因及TCF2基因中的所有基因。
此外，本发明的诱导肝干细胞，还可以在受试物质作用下，抑制或诱导选自作为药物代谢酶及转运蛋白的产生的相关基因的前述表3的基因群中的至少1种的表达，或者促进或抑制该基因的基因产物的活性。这里，受试物质是指药物候补物质，当本发明的诱导肝干细胞摄取这样的受试物质时，本发明的诱导肝干细胞的药物代谢酶及转运蛋白的产生的相关基因的表达受到抑制或诱导，这些基因的基因产物的活性受到促进或抑制。这样的细胞在药物代谢试验等新药发现应用中有用。已知的是，包括转运蛋白基因、核受体基因在内的药物代谢基因的表达存在个体差异，本发明的诱导肝干细胞可以由各种各样的细胞诱导而得，因此能够获得囊括了这样的个体的差异的数量众多的诱导干细胞。因此，若能够在受试物质作用下在本发明的诱导肝干细胞中抑制·诱导前述表3记载的基因的表达及诱导、抑制基因产物的活性，则作为新药发现的开发工具是有用的。因此，本发明的诱导肝干细胞是在药物动力学试验、安全性试验、毒性试验、代谢试验、药物相互作用试验等中有用的细胞。
本发明的诱导肝干细胞显示出肝细胞的多种性质，因此在各种药物·化合物的代谢、作用机理的解析、肝脏的形成和功能控制的分子探索及解析等中非常有用。因此，可以用于安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验（特别是乙型和丙型肝炎），高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验，新药发现靶标的筛选（肝纤维化、肝硬化、脂肪肝、代谢综合征、造血等），肝脏合成蛋白的生产，动物模型制作，再生医疗等。
此外，本发明的诱导肝干细胞能够增殖培养或继代培养3天以上，是能够在1个月以上、半年或1年以上的较长时期内增殖的诱导肝干细胞，这意味着理论上能够无限地自我复制。
作为对本发明的诱导肝干细胞进行增殖培养或继代培养的培养基，只要是能够对胚胎干细胞、多能性干细胞等进行增殖培养或继代培养的培养基即可，没有特别限制，优选使用适于胚胎干细胞、多能性干细胞等的培养的培养基。作为这样的培养基，可以例示出例如：ES培养基〔40％Dulbecco’s modifiedEagle medium(DMEM)、40％的F12培养基（Sigma公司制）、2mM L-谷氨酰胺或GlutaMAX（Sigma公司制）、1％的非必需氨基酸（Sigma公司制）、0.1mM的β-巯基乙醇（Sigma公司制）、15～20％的Knockout血清替代物(Invitrogen公司制)、10μg/ml的庆大霉素（Invitrogen公司制）、4～10ng/ml的FGF2因子〕（以下称为ES培养基），在除去了0.1mM的β-巯基乙醇的ES培养基中培养小鼠胚胎成纤维细胞（以下MEF）24小时而得的上清、即驯化培养基中加入了0.1mM的β-巯基乙醇及10ng/ml的FGF2的培养基（以下称为MEF驯化ES培养基），iPS细胞用最适培养基（iPSellon公司制），饲养细胞用最适培养基（iPSellon公司制），StemPro〔注册商标〕hESC SFM（Invitrogen公司制），mTeSR1（STEMCELL Technologies/VERITAS制）、无动物蛋白的人ES/iPS细胞维持用无血清培养基TeSR2〔ST-05860〕（STEMCELL Technologies/VERITAS制）、灵长类ES/iPS细胞用培养基（ReproCELL）、ReproStem（ReproCELL）、ReproFF（ReproCELL）等，但并非仅限于这些培养基。在使用人细胞时，可以使用适于培养人胚胎干细胞的培养基。
就对本发明的诱导肝干细胞进行增殖培养或继代培养的方法而言，只要是本领域技术人员通常使用的培养胚胎干细胞、多能性干细胞等的方法即可，没有特别限制。具体而言，可以例示出例如如下的方法等，所述方法为：由细胞去除培养基，用PBS(-)洗涤，加入细胞剥离液，静置，然后去除细胞剥离液，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基，离心分离，进而去除上清后，加入1X抗生素-抗真菌剂、mTeSR及Y-27632，将细胞悬浮液接种至已接种了MEF的明胶包被或胶原包被中，从而进行继代培养。
进而，在对本发明的诱导肝干细胞进行自基因导入起1个月以上的长期培养时，为了避免其分化，可以在培养基中加入：抑制或中和TGF-β等的活性的各种抑制剂或抗体，HGF、FGF1～21等成纤维细胞生长因子、激活素等，作为成纤维细胞生长因子，特别优选使用属于酸性成纤维细胞生长因子的FGF1（也称为aFGF。以下记作FGF1。）、属于碱性成纤维细胞生长因子的FGF2（也称为bFGF。以下记作FGF2。）、FGF4、FGF7。作为这样的抗体，可以例示出例如抗这些生长因子的多克隆或单克隆中和抗体等。此外，还可以使用microRNA、siRNA、反义RNA抑制TGF-β等的基因的表达。还可以使用针对TGF-β等的低分子化合物抑制剂。例如，作为TGF-β信号抑制剂，可以列举出ALK抑制剂（A-83-01等）、TGF-βRI抑制剂、TGF-βRI激酶抑制剂等。予以说明，上述成纤维细胞生长因子可以根据所诱导的体细胞的种类而选择，可以使用来源于人、小鼠、牛、马、猪、斑马鱼等的成纤维细胞生长因子。
进而，还可以在培养基中添加作为Rho相关激酶(Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶)抑制剂的Y-27632(Calbiochem；水溶性)、Fasudil(HA1077：Calbiochem)等。
除此以外，还可以在培养基中添加FGF受体赖氨酸激酶、MEK（丝裂原活化蛋白激酶）/ERK（胞外信号调节激酶1和2）途径、及GSK(糖原合成酶激酶)3的3个低分子抑制剂〔SU5402、PD184352及CHIR99021〕、MEK/ERK途径及GSK3的2个低分子抑制剂〔PD0325901及CHIR99021〕、作为组蛋白甲基化酶G9a的抑制剂的低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、氮杂胞苷、曲古抑菌素A（TSA）、7-羟基黄铜、麦角酸乙酰胺、kenpaullone、TGFβ受体I激酶/激活素样激酶5（ALK5）抑制剂〔EMD616452〕、TGF-β受体1（TGFB R1）激酶抑制剂〔E-616452及E-616451〕、Src家族激酶抑制剂〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53抑制化合物、针对p53的siRNA、p53途径的抑制剂等。
此外，本发明的诱导肝干细胞可以通过公知的方法冻结及解冻。作为冻结方法可以例示出例如如下的方法等，所述方法为：由细胞去除培养基，用PBS(-)洗涤，加入细胞剥离液，静置，然后去除细胞剥离液，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基，离心分离，接下来去除上清，然后加入冻结用保存液，分注至冻存管中，在-80℃下冻结一晚，然后，在液氮中保管。此外，作为解冻方法，可以例示出：在37℃的恒温槽中解冻，悬浮在含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基中使用的方法等。
作为第2发明的、包括将哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序的诱导肝干细胞的制造方法中，作为对象的哺乳动物只要是哺乳动物即可，没有特别限制，可以列举出大鼠，小鼠，豚鼠，兔子，狗，猫，小型猪等猪，牛，马，食蟹猴等猴等灵长类，人等，优选大鼠，小鼠，豚鼠，狗，猫，小型猪，马，食蟹猴，人，特别优选使用的是人。
此外，作为前述哺乳动物细胞，只要是哺乳动物细胞则均可使用。例如，可以列举出脑、肝脏、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、结肠、胰脏、肾脏、肺等各脏器以及骨髓液、肌肉、脂肪组织、末梢血、皮肤、骨骼肌的细胞等，但并非仅限于此。其中，优选来源于内胚层性的肝脏、胃、十二指肠、小肠、大肠、结肠、胰脏、肺等的细胞，特别优选使用来源于胃、结肠的细胞。这些细胞由于易于在手术治疗癌时以医疗废弃物形式获得而优选。
此外，还能够使用来源于脐带组织（脐带、脐带血）、羊膜、胎盘、羊水的细胞等来源于生产时附带的组织、体液的细胞，特别是还可以使用来源于如新生仔的各组织这类刚出生的组织（新生仔的皮肤等）的细胞。此外，还能够利用动物胎仔细胞等。
此外，作为前述哺乳动物细胞，可以利用来源于成体的细胞、来源于新生仔的细胞、来源于新生仔皮肤的细胞、罹患癌症个体的细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、由胚胎干细胞或诱导多能性干细胞分化的细胞等。
罹患癌症个体的癌症种类没有特别限制，可以使用恶性肿瘤、实体癌、癌瘤、肉瘤、脑肿瘤、造血器官癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等中的任一种癌。可以列举出例如口腔癌、咽癌、上呼吸道癌、肺癌、肺细胞癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、骨肉瘤、血液癌等，但并非仅限于此。其中，优选使用来源于属于内胚层系的胃癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌个体的非癌组织或癌组织的细胞。
在本发明的制造方法中，作为前述哺乳动物细胞，可以使用由哺乳动物采集的细胞。由哺乳动物采集的细胞既可以立即使用，也可以通过公知方法保存、培养等后使用。在进行培养时，继代数没有特别限制，优选为由原代培养起至第4继代培养的细胞，特别优选由原代培养起至第2继代培养的细胞。这里，原代培养是指由哺乳动物采集细胞后立即进行的培养，对原代培养进行1次继代培养则为第2继代培养、再进行1次继代培养则为第3继代培养。
本发明的制造方法中的诱导为诱导肝干细胞的工序必需为如下工序，即，使前述哺乳动物细胞处于存在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的基因产物且使得POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物的状态的工序。予以说明，这里“处于。。。状态”的概念，不仅是指调节为该种状态的情况，还包括选择处于该种状态的细胞而进行制备的情况。
此外，在本发明的制造方法中，在由哺乳动物细胞诱导本发明的诱导肝干细胞时，需要这些基因的基因产物以特定的比率存在于细胞内。从而，哺乳动物细胞中内源性的前述（1）胚胎干细胞的标志基因表达，最终诱导出本发明的诱导肝干细胞。
在本发明的制造方法中，前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率优选满足POU5F1基因＞KLF4基因＞SOX2基因的关系，进而，从高效诱导诱导肝干细胞的观点出发，最优选将POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率调节为依次是4：2：1。
在本发明的制造方法中，只要使前述哺乳动物细胞处于存在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的基因产物且使得POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物的状态即可，其方法包括例如作为诱导多能性干细胞的诱导技术而公知的方法等，但并非仅限于此。
例如，可以例示出如下方法，即，将能够提高前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的表达强度的基因，导入前述哺乳动物细胞并使这些基因强烈表达，在细胞中生产基因产物；或者，将作为能够提高这样的基因的表达强度的基因的基因产物的蛋白、mRNA等，导入前述哺乳动物细胞中；等。根据需要，调节导入前述哺乳动物细胞内的载体量、导入的基因量、添加于培养基的基因产物量等，从而能够调节为POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物。
在本发明的制造方法中，作为能够提高前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的表达强度的基因，可以使用POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因本身。当前述哺乳动物细胞中的前述POU5F1基因、KLF4基因或SOX2基因的表达不充分时，可以在该细胞中导入所不足的基因或基因产物，当前述细胞中前述POU5F1基因、KLF4基因或SOX2基因表达时，也可以导入其以外的基因或其以外的基因的产物来代替前述POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因。作为上述其以外的基因，可以使用已知能够用于诱导诱导多能性干细胞的基因，例如NANOG基因、LIN28基因、TBX3基因、PRDM14基因、L-MYC基因、c-MYC基因、N-MYC基因、SALL1基因、SALL4基因、UTF1基因、ESRRB基因、NR5A2基因、REM2GTPase基因、TCL-1A基因、Yes相关蛋白(Yes-associatedprotein，YAP)基因、E-钙粘蛋白基因、p53显性阴性突变体基因、p53shRNA基因等。能够提高前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的表达强度的基因，可以单独使用或将两种以上组合使用。
此外，本发明优选的实施方式是：将前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因、与代替这些基因而使用的基因组合使用。
例如，若为已强烈表达POU5F1基因、KLF4基因、c-MYC基因或SOX2基因的细胞，则可以组合使用p53显性阴性突变体基因、p53shRNA基因等而不使用POU5F1基因、KLF4基因、c-MYC基因或SOX2基因，从而能够诱导本发明的诱导肝干细胞。
在前述哺乳动物细胞中导入作为前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因及代替这些基因而使用的基因的基因产物的蛋白、mRNA等的方法,可以列举出作为诱导多能性干细胞的诱导技术而公知的方法等，但并非仅限于此。例如，还可以在培养基中添加作为这些基因的基因产物的蛋白质、mRNA等。
在本发明的制造方法中，为了进一步提高诱导为诱导肝干细胞的效率，还可以在诱导本发明的诱导肝干细胞时所使用的培养基中，添加已知的用于诱导诱导多能性干细胞的化合物，例如FGF受体酪氨酸激酶、MEK（丝裂原活化蛋白激酶）/ERK（胞外信号调节激酶1和2）途径、GSK(糖原合成酶激酶)3的3个低分子抑制剂〔SU5402、PD184352及CHIR99021〕、MEK/ERK途径及GSK3的2个低分子抑制剂〔PD0325901及CHIR99021〕、作为组蛋白甲基化酶G9a的抑制剂的低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、氮杂胞苷、曲古抑菌素A（TSA）、7-羟基黄铜、麦角酸乙酰胺、kenpaullone、TGF β受体I激酶/激活素样激酶5（ALK5）抑制剂〔EMD 616452〕、TGF-β受体1（TGFBR1）激酶抑制剂〔E-616452及E-616451〕、Src家族激酶抑制剂〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53抑制化合物、针对p53的siRNA、p53途径的抑制剂等。
此外，为了提高诱导为诱导肝干细胞的效率，还可以使用microRNA。具体而言，可以使用本领域技术人员通常实施的方法，如使用表达载体将microRNA导入到前述哺乳动物细胞中，或者在培养基中添加microRNA等。
作为可以用于提高诱导为诱导肝干细胞的效率的microRNA，可以使用miR-154、miR-200、miR-368、miR-371、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-302等。在使用人的细胞时，可以使用人的microRNA。具体而言，可以列举出hsa-miR-372〔MI0000780〕、hsa-miR-373〔MI0000781〕、hsa-miR-302b〔MI0000772〕、hsa-miR-302c〔MI0000773〕、hsa-miR-302a〔MI0000738〕、hsa-miR-302d〔MI0000774〕、hsa-miR-367〔MI0000775〕、hsa-miR-520〔MI0003158〕等，但并非仅限于这些microRNA。还可以将这些microRNA中的1种或2种以上组合使用。
这些microRNA的信息可以由miRBase的主页（http：//www.mirbase.org/）获得。括号内为miRBase的登录号，hsa-表示人。
在将前述哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序中，还可以使用在培养本发明的诱导肝干细胞的培养基中添加的、抑制或中和TGF-β等的活性的各种抑制剂或抗体、FGF1～21等成纤维细胞生长因子等。作为成纤维细胞生长因子，特别优选使用FGF1、FGF2、FGF4、FGF7。作为TGF-β抑制剂，可以列举出例如作为TGF-β信号抑制剂的ALK抑制剂（A-83-01等）、TGF-βRI抑制剂、TGF-βRI激酶抑制剂等。
这些成分优选添加至将前述哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序中所使用的培养基中。
作为前述用于诱导诱导肝干细胞的工序，优选的例子为：使用前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因或它们的基因产物，且POU5F1基因或该基因的基因产物与SOX2基因或该基因的基因产物的使用比率大于1。用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因或它们的基因产物的使用比率优选满足POU5F1基因＞KLF4基因＞SOX2基因的关系，进而，从高效诱导为诱导肝干细胞的观点出发，最优选POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因或它们的基因产物的使用比率依次为4：2：1。与POU5F1（OCT3/4）基因、KLF4基因、及SOX2基因的各基因符号相应的gen bank登录号如表4所示。
[表4]
  基因符号   Genbank登录号
  KLF4   NM_004235
  POU5F1   NM_002701
  SOX2   NM_003106
在本发明的制造方法中，在使用前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因时，可以使用本领域技术人员通常实施的方法，如利用表达载体等将这些基因导入前述哺乳动物细胞中的方法等。在使用用于诱导诱导肝干细胞所必需的前述POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的蛋白、mRNA等基因产物时，可以使用本领域技术人员通常实施的方法，如将基因产物添加到诱导时所用的培养基中，等。
如上所述，在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因、它们的基因产物的基础上，为了进而提高诱导为上述本发明的诱导肝干细胞的效率，还可以使用前述的NANOG基因、LIN28基因、TBX3基因、PRDM14基因、L-MYC基因、c-MYC基因、N-MYC基因、SALL1基因、SALL4基因、UTF1基因、ESRRB基因、NR5A2基因、REM2 GTPase基因、TCL-1A基因、Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)基因、E-钙粘蛋白基因、p53显性阴性突变体基因、p53shRNA基因等基因或它们的基因产物、化合物、FGF1～21等成纤维细胞生长因子、ALK抑制剂（A-83-01等）、TGF-βRI抑制剂、TGF-βRI激酶抑制剂等。
作为为了由前述哺乳动物细胞制造诱导肝干细胞而将基因导入前述哺乳动物细胞的方法，只要为公知的方法即可，没有特别限制，可以使用病毒载体、质粒、人工染色体（HAC）、附加型载体（EBV）、微环载体、多顺反子表达载体、应用了Cre/loxP系统的载体、利用了噬菌体整合酶的载体、piggyback等转座子等载体，等。
作为能够用于将基因导入前述哺乳动物细胞的病毒载体，只要是公知的载体即可，可以使用任一种。例如，可以列举出慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、猴免疫缺陷病毒载体（DNAVC Corporation）、腺随伴病毒载体（DNAVCCorporation）、基因组中不残留外来基因的仙台病毒载体（DNAVC Corporation，株式会社医学生物学研究所）、仙台病毒迷你载体（DNAVC Corporation）、HVJ等，但并非仅限于此。逆转录病毒载体包括来源于莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体等。
作为病毒载体质粒，只要是公知的病毒载体质粒即可，可以使用任意一种。例如，作为逆转录病毒系统，优选pMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo（其中，pMXs-IB为搭载了杀稻瘟素耐性基因来代替pMXs-puro的嘌呤霉素耐性基因的载体）[Toshio Kitamura et.al.,”Retrovirus-me diated gene transferandexpression cloning：Powerful tools in functional genomics”,Experimental Hematology,2003,31(11)：1007-14]，除此以外，可以列举出MFG[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,6733-6737(1995)]、pBabePuro[Nucleic Acids Research,18,3587-3596(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[Journal ofVirology,72,8150-8157(1998)]等。此外，作为腺病毒系统，可以使用pAdex1[Nucleic Acids Res.,23,3816-3821(1995)]等。
作为前述将哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序中使用的培养基，只要是能够培养胚胎干细胞、多能性干细胞等的培养基即可，没有特别限制，可以使用适合于胚胎干细胞、多能性干细胞等的培养的培养基进行培养。作为这样的培养基，可以列举出作为培养本发明的诱导肝干细胞的培养基所列举的ES培养基、MEF驯化ES培养基、iPS细胞用最适培养基、饲养细胞用最适培养基、StemPro〔注册商标〕hESC SFM、mTeSR1、无动物蛋白的人ES/iPS细胞维持用无血清培养基TeSR2〔ST-05860〕、灵长类ES/iPS细胞用培养基、ReproStem、ReproFF等，但并非仅限于此。在使用人的细胞时，优选使用适合于培养人胚胎干细胞的培养基。
此外，在细胞来源不是成纤维细胞时，例如在使用来源于胃或结肠癌患者的细胞这类上皮系细胞时，优选在基因导入后与饲养细胞进行共培养。
第3发明是特征在于使用本发明的诱导肝干细胞的试验方法。本发明的试验方法优选为安全性试验方法、毒性试验方法、代谢试验方法、药物相互作用试验方法、抗病毒活性试验方法及高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物筛选试验方法。
使用本发明的诱导肝干细胞的药物相互作用试验方法，包括如下的试验方法等：例如，通过由人种、性别、年龄、遗传背景（多态性等）不同的供体制作人诱导肝干细胞，与药物候补化合物一起培养，使用DNA微阵列（KURABO INDUSTRIESLTD.制）、multifunctional gene expresser GenomeLabTM GeXP（Beckman Coulter,Inc.制）等调查这些细胞中的各种细胞色素P450(CYP)亚家族酶基因的表达，从而明确P450(CYP)亚家族酶与药物候补化合物的相互作用。此外，通过使用经细胞色素P450酶代谢后生成荧光产物的底物的方法，还能够调查P450(CYP)亚家族酶与药物候补化合物的相互作用。
细胞色素P450酶是对广泛的疏水性化学物质进行氧化代谢的重要催化剂，已知该酶的药物代谢与药物清除（drugclearance）、毒性、活化有关，因此有时对药物间的有害的相互作用也有影响。因此，在开发低分子治疗药等时，需要详细调查该酶与药物的相互作用。
作为使用本发明的诱导肝干细胞的抗病毒活性试验方法，可以列举出例如下述方法：在培养本发明的诱导肝干细胞的培养液中，添加甲、乙或丙型肝炎病毒，进行感染，添加抗病毒药的药物候补化合物，从而评价该化合物药效的试验方法等。
作为使用本发明的诱导肝干细胞的高脂血症药的筛选试验方法，可以列举出例如下述方法：在培养本发明的诱导肝干细胞的板中添加高脂血症药的候补化合物进行培养后，分析分泌至培养上清中的脂蛋白、脂质，从而评价所添加的高脂血症药的候补化合物的药效的试验方法等。
作为分泌至培养液上清中的脂蛋白及脂质的分析，可以列举出通过凝胶过滤HPLC法分析例如CM（乳糜微粒）、VLDL（超低密度脂蛋白）、LDL（低密度脂蛋白）、HDL（高密度脂蛋白）等蛋白以及FC（游离胆固醇）、PL（磷脂）、TC（总胆固醇）等脂质的试验方法（LipoSEARCH；Skylight Biotech,Inc.）等。
此外，还可以通过Usui S,Hara Y,Hosaki S,OkazakiM,“A new on-line dual enzymatic method for simultaneousquantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins byHPLC”,J.Lipid Res.,2002;43：805-14.及Mitsuyo Okazaki,Shinichi Usui,Masato Ishigami,Naohiko Sakai,TadashiNakamura,Yuji Matsuzawa,Shizuya Yamashita,“Identificationof Unique Lipoprotein Subclasses for Visceral Obesity byComponent Analysis of Cholesterol Profile in High-PerformanceLiquid Chromatography”,Arterioscler Thromb Vasc Biol.March2005中记载的方法进行测定。
第4发明是特征在于使用本发明的诱导肝干细胞的新药发现靶标筛选方法。
第5发明是特征在于使用本发明的诱导肝干细胞的动物模型制作方法。
第6发明是特征在于使用本发明的诱导肝干细胞的肝脏合成蛋白的生产方法。
本发明的诱导肝干细胞由于具有肝细胞的性质，因此可以产生各种肝细胞特异性蛋白。因此可以例示出如下的方法：对生产特定的肝细胞特异性蛋白的本发明的诱导肝干细胞进行培养，来生产肝细胞特异性蛋白，等。
第7发明是特征在于使用本发明的诱导肝干细胞的以哺乳动物为对象的治疗方法。
本发明的治疗方法为将由哺乳动物细胞诱导的本发明的诱导肝干细胞移植到哺乳动物的肝脏的治疗方法。例如，可以将由狗细胞诱导的本发明的诱导肝干细胞移植至狗的肝脏。
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不受这些实施例限定。
实施例1
1．泛嗜性逆转录病毒载体的制备
使用Fugene HD（罗氏公司制；Cat no.4709691），将POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs这3个基因的逆转录病毒载体质粒导入至作为泛嗜性逆转录病毒载体制备用包装细胞的Plat-GP细胞，制备逆转录病毒载体液。以依次为4：2：1的比率使用基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs。4：2：1的比率既可以是将基因导入至包装细胞时，此外，也可以是分别制作POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs这3个基因的逆转录病毒载体液并以4：2：1的比率混合。具体如下。
＜用于对来源于新生儿皮肤组织的细胞进行基因导入的逆转录病毒载体液的制备＞
基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs使用了addgene的载体(后述表5)。
各载体的量设为POU5F1-pMXs(addgene制)2μg、KLF4-pMXs(addgene制)1μg、SOX2-pMXs(addgene制)0.5μg、Venus-pCS2(Nagai T et al.A variant of yellow fluorescentprotein with fast and efficient maturation for cell-biologicalapplications.Nat Biotechnol 2002；20：87-90.?)0.5μg、VSV-G-pCMV(Cell Biolab制)2μg、FuGENE HD(罗氏制)18μl。
＜用于对来源于胃癌患者癌组织的细胞进行基因导入的逆转录病毒载体液的制备＞
基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs为构建的载体(表5)。
各载体的量设为POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs(Cell Biolab制)1.25μg、FuGENE HD 45μl。
＜用于对来源于胃癌患者非癌组织的细胞进行基因导入的逆转录病毒载体液的制备＞
基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs为构建的载体(表5)。
各载体的量设为POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μl。
＜用于对来源于成人皮肤组织的细胞进行基因导入的逆转录病毒载体液的制备＞
基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs为构建的载体(表5)。
各载体的量设为POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μl。
＜用于对来源于结肠癌患者的癌组织的细胞进行基因导入的逆转录病毒载体液的制备＞
基因POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXs为构建的载体(表5)。
各载体的量设为POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μl。
对导入了逆转录病毒载体质粒的Plat-GP细胞，进行48小时以上培养后，每24小时回收3次上清，用Steriflip-HV过滤器单元为0.45μm直径的过滤器（密理博公司制；Cat no.SE1M003M00）进行过滤。通过以上步骤制备3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）的泛嗜性逆转录病毒载体液。泛嗜性逆转录病毒载体能够对各种细胞进行基因导入，对人细胞也能以高效率进行基因导入。
[表5]
Addgene分让与构建的逆转录病毒载体质粒的细节
Figure BDA00002229175500341
实施例2
2．由来源于新生儿皮肤组织的细胞制作人诱导肝干细胞
由来源于属于刚出生后的组织的人新生儿皮肤组织的细胞（商品名：新生儿正常人皮肤成纤维细胞；原代培养；Lotno.7F 3956）制作人诱导肝干细胞。
将1根冻结保存的来源于人新生儿皮肤组织的细胞（原代培养；Lonza公司制；CC-2511；Lot no.7F3956）在37℃的恒温槽中解冻，悬浮在含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062）及10％FB S的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Cat no.11965-092)培养基中，获得10ml的细胞悬浮液。
接下来，将获得的细胞悬浮液在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离，除去上清后，悬浮在成纤维细胞培养基试剂盒-2（2%FBS）（以下也称为注册商标FGM-2BulletKit）（Lonza公司制；Cat no.CC-3132）12ml中，获得细胞悬浮液。在以20μg/cm2浓度的matrigel（BD公司制；Cat no.356230）包被底面30分钟以上的6孔塑料培养皿（Nunc公司制；Cat no.140675）上，各加入2ml所得的细胞悬浮液，进行细胞接种。
3天后除去培养基，每孔添加2ml的3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）逆转录病毒载体液，在37℃下进行24小时感染。除去病毒上清，各加入2mlFGM-2 BulletKit，在37℃下培养一天。然后，每2天更换MEF驯化ES培养基，自3基因导入起12、14、17天后用ES培养基进行培养基更换。使用的MEF驯化ES培养基及ES培养基的组成如下。
＜MEF驯化ES培养基>
MEF
丝裂霉素C处理初代小鼠胚胎成纤维细胞〔DS PharmaBiomedical制〕Cat no.R-PMEF-CF
驯化ES培养基
knockout D-MEM（Invitrogen公司制；Cat no.10829-018）500ml
20%knockout血清替代品（Invitrogen公司制；Cat no.10828-028）
50μg/ml庆大霉素（Invitrogen公司制；Cat no.15750-060）
1XMEM非必需氨基酸液（Invitrogen公司制；Catno.11140-050）
10ng/ml bFGF（PeproTech公司制；Cat no.100-18B）
0.1mM 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich公司制；Cat no.M7154）
＜ES培养基＞
knockout D-MEM（Invitrogen公司制；Cat no.10829-018）500ml
20%knockout血清替代品（Invitrogen公司制；Cat no.10828-028）
50μg/ml庆大霉素（Invitrogen公司制；Cat no.15750-060）
1XMEM非必需氨基酸液（Invitrogen公司制；Catno.11140-050）
10ng/ml bFGF（PeproTech公司制；Cat no.100-18B）
103U/ml 重组人LIF（和光纯药公司制；Catno.129-05601）
0.1mM 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich公司制；Cat no.M7154）
0.5μM ALK5抑制剂(A-83-01)（Sigma-Aldrich公司制；Catno.A5480）
0.5μM PD0325901（Axon Medchem公司制；Cat no.1408）
3μM CHIR99021（Axon Medchem公司制；Cat no.1386）
自基因导入起18天后，用无饲养细胞用人ES/iPS细胞用培养基mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制；Cat no.05850）每天进行培养基更换。自基因导入起30天后，将集落中的1个克隆(NFB1-3)，用镊子挑起并移至饲养细胞上。予以说明，饲养细胞为经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS PharmaBiomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF），在诱导肝干细胞的挑起前一天以5.0×104cell/cm2接种至明胶包被24孔板（Iwaki公司制；Cat no.11-020-012）。
下面示出来源于新生儿皮肤组织的人诱导肝干细胞的继代（p）和溶解于RNA回收用试剂盒的缓冲液(Buffer)的时间（天）。
＜来源于新生儿皮肤组织的人诱导肝干细胞＞
NFB13
52天：24孔(p1)→6孔(p2)
55天：6孔(p2)→10cm(p3)
61天：传代(p4)
62天：Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理(p5)
实施例3
3．由来源于胃癌患者癌组织的细胞制作人诱导肝干细胞
由人胃癌（晚期癌）患者的癌组织分离细胞。在获得的细胞中添加3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）逆转录病毒载体液而进行基因导入，从而制作人诱导肝干细胞。具体如下。
用Hank’s平衡盐液（不含酚红）（Invitrogen公司制；Catno.14175-095）洗涤手术时获得的胃癌（晚期癌：男性，67岁，日本人）新鲜组织的一部分，用剪刀细细地切成约1mm2。进而，用Hank’s平衡盐液（不含酚红）洗涤至上清达到透明，除去上清，向组织沉淀加入5ml 0.1%胶原酶（和光纯药公司制；Cat no.034-10533）/1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062），用振荡器在37℃下搅拌60分钟。
确认组织沉淀已被充分消化后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Catno.11965-092)培养基35ml，在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离。接下来，除去上清后加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Cat no.11965-092)培养基40ml，在1000rpm、4℃下再进行5分钟离心分离。接下来，除去上清后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基10ml，接种至60mm的胶原包被培养皿(Iwaki公司制；Cat no.11-018-004)中。
24小时后除去培养基，添加5ml的3基因的逆转录病毒载体液，在37℃进行1天的感染。除去病毒上清，将进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Catno.R-PMEF-CF）以5.0×104cell/cm2悬浮于含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062）及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基5ml后，接种于培养来源于胃癌患者的癌组织的基因导入细胞的60mm的胶原包被培养皿(Iwaki公司制；Cat no.11-018-004)中，进行共培养。
然后，每3天更换MEF驯化ES培养基，从自基因导入起15天后，用无饲养细胞用人ES/iPS细胞用培养基mTeSR 1(STEMCELL Technologies公司制、Cat no.05850）每天进行培养基更换。
在自3基因导入起25天后，将诱导肝干细胞集落中的1个克隆(GC1-2)，挑起至明胶包被24孔板中的经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞上。予以说明，饲养细胞为进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Catno.R-PMEF-CF），在诱导肝干细胞的挑起前一天，以5.0×104cell/cm2接种至明胶包被24孔板（Iwaki公司制、Catno.11-020-012）。
下面示出来源于胃癌患者的癌组织的人诱导肝干细胞的继代（p）和溶解于RNA回收用试剂盒的缓冲液(Buffer)的时间（天）。
＜来源于胃癌患者的癌组织的人诱导肝干细胞＞
GC1-2
37天：24孔(p1)→6孔(p2)
43天：6孔(p2)→10cm(p3)
56天：传代(p4)
57天：传代和保存(p5)
60天：Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理
实施例4
4．由来源于胃癌患者非癌组织的细胞制作人诱导肝干细胞
在来源于胃癌患者非癌组织的细胞中添加3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）逆转录病毒载体液，进行基因导入，从而制作人诱导肝干细胞。具体如下。
用Hank’s平衡盐液（不含酚红）（Invitrogen公司制；Catno.14175-095）洗涤手术时获得的胃癌（晚期癌：男性，67岁，日本人）患者的非癌新鲜组织的一部分，用剪刀细细地切成约1mm2。用Hank’s平衡盐液（不含酚红）洗涤至上清达到透明后，除去上清，向组织沉淀中加入5ml 0.01%胶原酶（和光纯药公司制；Cat no.034-10533）/1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062），用振荡器在37℃下搅拌60分钟。
确认组织沉淀已被充分消化后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Catno.11965-092)培养基35ml，在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离。接下来，除去上清后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基40ml，在1000rpm、4℃下再进行5分钟离心分离。进而，除去上清后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Cat no.11965-092)培养基10ml，接种至60mm的胶原包被培养皿(Iwaki公司制；Cat no.11-018-004)中。
约24小时后，除去培养基，添加5ml的3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）逆转录病毒载体，在37℃下进行约24小时的感染。除去病毒上清，将进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Catno.R-PMEF-CF）5.0×104cell/cm2悬浮于含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制、Cat no.15240-062）及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基5ml中后，接种于培养来源于胃癌患者非癌组织的进行了基因导入的细胞的60mm的胶原包被培养皿中，进行共培养。
然后，每3天更换MEF驯化ES培养基，自3基因导入起31天后，用mTeSR 1每天进行培养基更换。自基因导入起46天后，挑起集落中的1个克隆(NGC1-2)，在明胶包被24孔板中的进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞上进行继代培养。予以说明，饲养细胞是进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF），在诱导肝干细胞的挑起前一天，以5.0×104cell/cm2接种至明胶包被24孔板（Iwaki公司制；Cat no.11-020-012）。
下面示出来源于胃癌患者非癌组织的人诱导肝干细胞的继代（p）和溶解于RNA回收用试剂盒的缓冲液(Buffer)的时间（天）。
＜来源于胃癌患者非癌组织的人诱导肝干细胞＞
NGC1-2
52天：24孔(p1)→6孔(p2)
58天：6孔(p2)→10cm(p3)
65天：传代,stock and Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理(p4)
实施例5
5．由来源于结肠癌患者的癌组织的细胞制作人诱导肝干细 胞的制作
在来源于人结肠癌（S形结肠癌）患者的癌新鲜组织的细胞中，添加3基因（POU5F1、KLF4、SOX2的比率依次为4：2：1）逆转录病毒载体液，进行基因导入，从而制作人诱导肝干细胞。具体如下。
用Hank’s平衡盐液（不含酚红）（Invitrogen公司制；Catno.14175-095）洗涤手术时获得的结肠癌（S形结肠癌：男性，55岁，日本人）的一部分，用剪刀细细地切成约1mm2。用Hank’s平衡盐液（不含酚红）洗涤至上清达到透明。接下来，除去上清，向组织沉淀加入5ml 0.1%胶原酶（和光纯药公司制；Catno.034-10533）/1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Catno.15240-062），用振荡器在37℃下搅拌60分钟。
确认组织沉淀已被充分消化后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制、Catno.11965-092)培养基35ml，在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离。除去上清后，加入含有1X抗生素-抗真菌剂及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）培养基40ml，在1000rpm、4℃下再进行5分钟离心分离。除去上清后，加入含有11X抗生素-抗真菌剂及10％FB S的D-MEM（高葡萄糖）培养基10ml，接种至100mm的胶原包被培养皿(Iwaki公司制、Cat no.11-018-006)。
约24小时后除去培养基，添加10ml的3基因的逆转录病毒载体液，其后5小时后，添加5ml的Luc-IRES-GFP的逆转录病毒载体液，在37℃下进行约24小时的感染。除去病毒上清，将进行了丝裂霉素处理的MEF(DS Pharma Biomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF）以5.0×104cell/cm2悬浮于含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制、Cat no.15240-062）及10％FB S的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制、Cat no.11965-092)培养基10ml，然后接种至培养来源于结肠癌患者的癌组织的基因导入细胞的60mm的胶原包被培养皿中，进行共培养。
然后，每3天更换MEF驯化ES培养基，自基因导入22天后，用mTeSR 1每天进行培养基更换。自基因导入起31天后，挑起集落中的1个克隆(CC1-4)，在明胶包被24孔板中的进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF）上进行继代培养。予以说明，饲养细胞是进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS PharmaBiomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF），在诱导肝干细胞的挑起前一天，以5.0×104cell/cm2接种至明胶包被24孔板（Iwaki公司制；Cat no.11-020-012）。
下面示出来源于结肠癌患者癌组织的人诱导肝干细胞的继代（p）和溶解于RNA回收用试剂盒的缓冲液(Buffer)的时间（天）
＜来源于结肠癌患者癌组织的人诱导肝干细胞＞
CC1-4
40天：6孔(p2)→6孔(p2)
45天：6孔(p2)→10cm(p3)
51天：传代和保存(p4)
54天：传代和保存(p5)
59天：传代和保存(p5)
63天：Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理（p5）
实施例6
6．由来源于成人皮肤组织的细胞制作人诱导肝干细胞
由来源于成人皮肤组织的细胞（商品名：成人正常人皮肤成纤维细胞；原代培养；Lonza公司制；Lot no.76582）制作人诱导肝干细胞。
将1根冻结保存的成人正常人皮肤成纤维细胞（原代培养；Lonza公司制；Lot no.76582）在37℃的恒温槽中解冻，悬浮于含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062）及10％FBS的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Catno.11965-092)培养基，获得10ml的细胞悬浮液。接下来，在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离，除去上清后，悬浮于FGM-2 BulletKit 20ml。在以20μg/cm2浓度的matrigel（BD公司制）包被底面30分钟以上的100mm的培养皿(Nunc公司制；Cat no.172958)上，各加入该细胞悬浮液10ml，接种细胞。
约24小时后除去培养基，添加10ml的3基因的逆转录病毒载体液，在37℃下进行24小时感染。除去病毒上清，加入MEF驯化E S培养基10ml。然后，每3天更换MEF驯化ES培养基，自基因导入起18天后，用mTeSR 1(STEMCELL Technologies公司制）每天进行培养基更换。自基因导入起28天后，在6天内用MEF驯化E S培养基每天进行培养基更换。进而，自基因导入起34天后，用mTeSR 1每天进行培养基更换。自基因导入起39天后，将集落中的1克隆(AFB1-1)挑起至明胶包被24孔板中的进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF）。予以说明，饲养细胞是进行了丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（DS Pharma Biomedical公司制；Cat no.R-PMEF-CF），在诱导肝干细胞的挑起前一天，以5.0×104cell/cm2接种至明胶包被24孔板（Iwaki公司制；Catno.11-020-012）。
下面示出来源于成人皮肤组织的人诱导肝干细胞的继代（p）和溶解于RNA回收用试剂盒的缓冲液(Buffer)的时间（天）。
＜来源于成人皮肤组织的人诱导肝干细胞＞
AFB1-1
50天：24孔(p1)→6孔(p2)
54天：6孔(p2)→10cm(p3)
59天：传代(p4)
63天：传代(p5)
67天：传代、保存和Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理(p5)
上述实施例2～6中实施的继代培养如下。
由细胞除去培养基，用PBS(-)洗涤后，加入细胞剥离液。在37℃下静置5分钟后，除去细胞剥离液，加入含有1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062）及10％FBS(Invitrogen公司制；Cat no.26140-079)的D-MEM（高葡萄糖）(Invitrogen公司制；Cat no.11965-092)培养基20ml，在1000rpm、4℃下进行5分钟离心分离。接下来，除去上清后，加入1X抗生素-抗真菌剂（Invitrogen公司制；Cat no.15240-062）及mTeSR、10μM Y-27632，将细胞悬浮液接种至接种了1.0×106cells/培养皿的MEF的100mm明胶包被培养皿中。
继代培养时的细胞剥离液使用的是以下2种。
（1）0.25％胰蛋白酶-1mM EDTA溶液（Invitrogen公司制；Cat no.25200-056）
（2）10mg/ml胶原酶(Invitrogen公司制；Cat no.17104-019)10ml、
100mM氯化钙溶液1ml、
PBS 59ml、
2.5％胰蛋白酶溶液(Invitrogen公司制；Cat no.15090-046)10ml、
knockout血清替代品(Invitrogen公司制；Catno.10828-028)20ml
实施例7
7.人诱导多能性干细胞和人诱导肝干细胞的长期培养
对人诱导肝干细胞(AFB1-1、NGC1-2)进行长达半年以上的长期继代培养。培养基使用的是mTeSR1（STEMCELLTechnologies/VERITAS制）、添加bFGF的灵长类ES/iPS细胞用培养基（ReproCELL）、或添加bFGF的ReproStem（ReproCELL）等。使用MEF使用时，使用胶原或明胶包被的培养皿。不使用MEF时，使用的是matrigel包被培养皿。其结果是，0.05～0.5μM A-83-01（TGF-β信号抑制剂、TGF-βtype I受体ALK5激酶,type I激活素/nodal受体ALK4 andALK7抑制剂）的添加对人诱导肝干细胞的自我复制有用，增殖速度、形态均非常良好。
实施例8
8．利用微阵列对肝细胞标志基因和胚胎干细胞标志基因进行定量解析
利用安捷伦公司制Whole Human Genome寡DNA微阵列（4Ｘ44K），对全基因组的基因表达（mRNA转录组）进行解析。
＜试样＞
用AllPrep DNA/RNA Mini Kit(50)（Qiagen公司制；Catno.80204），由实施例2～6中事先通过Buffer RLT(RNA精制前的细胞溶解液)处理的溶液中提取实施例2～6的人诱导肝干细胞（NFB1-3,GC1-2,NGC1-2,AFB1-1,CC1-4）的总RNA和基因组DNA。
作为试样，使用的是人诱导肝干细胞（NFB1-3,GC1-2,NGC1-2,AFB1-1,CC1-4）的总RNA。
＜实验方法＞
（1）质量鉴定
使用RNA用LabChip(安捷伦公司制的注册商标)试剂盒，通过Agilent 2100 Bioanalyzer(安捷伦公司制)进行总RNA的品质鉴定，结果所有RNA样品的质量均良好。此外，通过NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies)进行了RNA浓度及RNA纯度的评价，确认所有样品中均存在cRNA合成所需要的总RNA量，纯度也高。
（2）cRNA的合成
按照安捷伦公司的说明书，使用Quick Amp Labeling kit（安捷伦公司制）由各样品的总RNA(500ng)合成了双链cRNA。由所制作的cDNA通过体外转录（in vitro transcription）合成了cRNA。此时，使其摄取用Cyanine染料标记的CTP（Cyanine 3-CTP），进行荧光标记。
（3）杂交
使用基因表达杂交试剂盒（Gene Expression HybridizationKit，安捷伦公司制），在杂交缓冲液中加入进行杂交的标记cRNA，在安捷伦制Whole Human Genome寡DNA微阵列（4X44K）上杂交17小时，洗涤后，通过安捷伦微阵列扫描器读取DNA微阵列的图像，使用特征提取软件（Feature ExtractionSoftware）(v.9.5.3.1)将各斑点的荧光信号数值化。
＜基因的定量解析结果＞
以整体的基因表达分布（各探针的荧光值分布）的中央值为0，来评价表达的有无。将显示大于0的表达值的探针作为检测到基因表达的探针，作为有基因表达，以表达探针的数进行表示。
予以说明，解析软件使用的是Gene Spring GX 10.0（AgilentTechnologies,Inc.），校正是以超过50%段值（50th percentile）进行的。所比较的人胚胎干细胞（hES ES01）的微阵列数据使用的是由GEO下载的数据。
1．肝细胞中特异性表达的基因
下述表6中，示出在本发明的人诱导肝干细胞中表达的肝细胞中特异性表达的基因。记载了肝细胞中特异性表达的安捷伦公司制Whole Human Genome寡DNA微阵列（4X44K）的156个表达探针（144基因）中、在人诱导肝干细胞所表达的表达探针数，在各表中记载了探针名（Probe name）、基因符号（GeneSymbol）、gen bank登录号（Genebank Accession No）。
[表6]
Figure BDA00002229175500471
下述表7示出在实施例3中诱导的来源于胃癌患者癌组织的人诱导肝干细胞（GC1-2）中表达的基因的表。
来源于胃癌患者癌组织的人诱导肝干细胞：GC1-2
在肝细胞中特异性表达的探针数为138。
[表7]
Figure BDA00002229175500491
下述表8示出在实施例6中诱导的来源于成人皮肤组织的人诱导肝干细胞（AFB1-1）中表达的基因。
来源于成人皮肤组织的人诱导肝干细胞：AFB1-1
在肝细胞中特异性表达的探针数为133。
[表8]
Figure BDA00002229175500511
下述表9示出在实施例4中诱导的来源于胃癌患者非癌组织的人诱导肝干细胞（NGC1-2）中表达的基因。
来源于胃癌患者非癌组织的人诱导肝干细胞：NGC1-2
在肝细胞中特异性表达的探针数为131。
[表9]
下述表10示出在实施例2中诱导的来源于新生儿皮肤组织的人诱导肝干细胞（NFB1-3）中表达的基因。
来源于新生儿皮肤组织的人诱导肝干细胞：NFB1-3
在肝细胞中特异性表达的探针数为96。
[表10]
  探针名   基因符号   Genbank登录号   探针名   基因符号   Genbank登录号
  A_23P116898   A2M   NM_000014   A_23_P69573   GUCY1A3   NM_000856
  A_23_P252981   ACE2   NM_021804   A_24_P52697   H19   NR_002196
  A_24_P945113   ACVRL1   NM_000020   A_23_P206760   HP   NM_005143
  A_32_P196263   ADAMTS9   NM_182920   A_23_P395438   HTRA3   NM_053044
  A_23_P406341   AFAP1L2   NM_001001936   A_23_P150609   IGF2   NM_001007139
  A_23_P58205   AFP   NM_001134   A_23_P15146   IL32   NM_001012631
  A_23_P155509   AHSG   NM_001622   A_23_P501193   KCNJ16   NM_170741
  A_23_P83098   ALDH1A1   NM_000689   A_23_P56898   KYNU   NM_003937
  A_32_P105549   ANXA8   NM_001630   A_23_P201636   LAMC2   NM_005562
  A_23_P337262   APCDD1   NM_153000   A_23_P120902   LGALS2   NM_006498
  A_23_P203191   APOA1   NM_000039   A_23_P32165   LHX2   NM_004789
  A_24_P302249   APOA2   NM_001643   A_24_P178834   LOC132205   AK091178
  A_23_P87036   APOA4   NM_000482   A_23_P164057   MFAP4   NM_002404
  A_23_P116902   ART4   NM_021071   A_23_P13094   MMP10   NM_002425
  A_23_P130113   ASGR2   NM_080912   A_23_P213171   NTTP   NM_000253
  A_24_P753592   BC018589   BC018589   A_23_P102364   NGEF   NM_019850
  A_23_P143331   BMP2   NM_001200   A_23_P389897   NGFR   NM_002507
  A_32_P42224   BX097190   BX097190   A_24_P252364   NRCAM   NM_005010
  A_23_P75790   C11orf9   NM_013279   A_23_P360797   NTF3   MM_002527
  A_23_P204937   C13orf15   NM_014059   A_24_P220485   OLFML2A   NM_182487
  A_24_P10137   C13orf15   NM_014059   A_32_P61684   PAG1   NM_018440
  A_32_P213103   CA414006   CA414006   A_23_P347070   PAG1   NM_018440
  A_23_P76654   CDX2   NM_001265   A_23_P52121   PDZK1   NM_002614
  A_23_P217379   COL4A6   NM_033641   A_23_P388150   PLA2G12B   NM_032562
  A_23_P120125   COLEC11   NM_199235   A_23_P146554   PTGDS   NM_000954
  A_23_P213745   CXCL14   NM_004887   A_23_P167030   PTHR1   NM_000316
  A_23_P102000   CXCR4   NM_001008540   A_23_P118392   RASD1   NM_016084
  A_23_P131676   CXCR7   NM_020311   A_23_P75283   RBP4   NM_006744
  A_23_P32577   DACH1   NM_080759   A_23_P3934   RNF43   NM_017763
  A_23_P257583   DENND2A   NM_015689   A_23_P88849   RRAD   NM_004165
  A_23_P105923   DIO3   NM_001362   A_23_P124619   S100A14   NM_020672
  A_24_P236251   DLK1   NM_003836   A_23_P121926   SEPP1   NM_005410
  A_23_P139704   DUSP6   NM_001946   A_24_P321766   SERPINA5   NM_000624
  A_23_P205177   F10   NM_000504   A_23_P205355   SERPINA5   NM_000624
  A_23_P94879   F2   NM_000506   A_23_P102391   SLC40A1   NM_014585
  A_23_P79562   FABP1   NM_001443   A_23_P91230   SLPI   NM_003064
  A_23_P136125   FGB   NM_005141   A_32_P133072   SPON1   NM_006108
  A_23_P148088   FGG   NM_000509   A_23_P354705   ST8SIA1   NM_003034
  A_23_P166109   FLRT3   NM_198391   A_23_P36345   STARD10   NM_006645
  A_23_P114883   FMOD   NM_002023   A_23_P399265   STMN2   S82024
  A_24_P347431   FOXA1   NM_004496   A_23_P212500   TF   NM_001063
  A_23_P384761   GATA4   NM_002052   A_23_P101013   TMC6   NM_007267
  A_23_P129064   GATM   NM_001482   A_23_P409093   TMEM16D   NM_178826
  A_23_P52227   GDF10   NM_004962   A_32_P7015   TSPAN15   NM_012339
  A_23_P250444   GJB1   NM_000166   A_23_P130333   TTR   NM_000371
  A_32_P19294   GLT1D1   NM_144669   A_23_P212968   UGT2B11   NM_001073
  A_32_P109029   GPRC5C   NM_022036   A_23_P16866   VIL1   NM_007127
  A_23_P253495   GSTA3   NM_000847   A_23_P78099   VTN   NM_000638
下述表11示出在实施例5中诱导的来源于结肠癌患者癌组织的人诱导肝干细胞（CC1-4）所表达的基因。
来源于结肠癌患者癌组织的人诱导肝干细胞：CC1-4
在肝细胞中特异性表达的探针数为92。
[表11]
  探针名   基因符号   Genbank登录号   探针名   基因符号   Genbank登录号
  A_ 23_P116898   A2M   NM_000014   A_24_P52697   H19   NR_002196
  A_23_P252981   ACE2   NM_021804   A_23_P47034   HHEX   NM_002729
  A_24_P945113   ACVRL1   NM_000020   A_23_P206760   HP   NM_005143
  A_32_P196263   ADAMTS9   NM_182920   A_23_P421493   HPR   NM_020995
  A_23_P406341   AFAP1L2   NM_001001936   A_23_P161998   HPX   NM_000613
  A_23_P58205   AFP   NM_001134   A_23_P395438   HTRA3   NM_053044
  A_23_P115261   AGT   NM_000029   A_23_P150609   IGF2   NM_001007139
  A_23_P155514   AHSG   NM_001622   A_23_P15146   IL32   NM_001012631
  A_23_P155509   AHSG   NM_001622   A_23_P153964   INHBB   NM_002193
  A_24_P766716   AK126405   AK126405   A_23_P501193   KCNJ16   NM_170741
  A_23_P257834   ALB   NM_000477   A_23_P56898   KYNU   NM_003937
  A_23_P83098   ALDH1A1   NM_000689   A_23_P201636   LAMC2   NM_005562
  A_32_P105549   ANXA8   NM_001630   A_23_P120902   LGALS2   NM_006498
  A_23_P337262   APCD01   NM_153000   A_24_P178834   LOC132205   AK091178
  A_23_P203191   APOA1   NM_000039   A_24_P845223   M27126   M27126
  A_24_P302249   APOA2   NM_001643   A_23_P164057   MFAP4   NM_002404
  A_23_P87036   APOA4   NM_000482   A_23_P213171   MTTP   NM_000253
  A_24_P753592   BC018589   BC018589   A_23_P102364   NGEF   NM_019850
  A_23_P143331   BMP2   NM_001200   A_23_P360797   NTF3   NM_002527
  A_23_P75790   C11orf9   NM_013279   A_24_P220485   OLFML2A   NM_182487
  A_23_P88678   C15orf27   NM_152335   A_23_P347070   PAG1   NM_018440
  A_23_P101407   C3   NM_000064   A_23_P52121   PDZK1   NM_002614
  A_23_P71855   C5   NM_001735   A_23_P146554   PTGDS   NM_000954
  A_23_P33723   CD163   NM_004244   A_23_P167030   PTHR1   NM_000316
  A_23_P217379   COL4A6   NM_033641   A_23_P118392   RASD1   NM_016084
  A_23_P120125   COLEC11   NM_199235   A_23_P75283   RBP4   NM_006744
  A_23_P213745   CXCL14   NM_004887   A_23_P3934   RNF43   NM_017763
  A_23_P102000   CXCR4   NM_001008540   A_23_P88849   RRAD   NM_004165
  A_23_P131676   CXCR7   NM_020311   A_23_P124619   S100A14   NM_020672
  A_23_P257583   DENND2A   NM_015689   A_23_P121926   SEPP1   NM_005410
  A_23_P105923   DIO3   NM_001362   A_24_P145629   SERINC2   NM_178865
  A_24_P236251   DLK1   NM_003836   A_23_P218111   SERPINA1   NM_001002236
  A_23_P139704   DUSP6   NM_001946   A_23_P205355   SERPINA5   NM_000624
  A_23_P205177   F10   NM_000504   A_23_P102391   SLC40A1   NM_014585
  A_23_P94879   F2   NM_000506   A_24_P242581   SLC5A9   NM_001011547
  A_23_P79562   FABP1   NM_001443   A_32_P133072   SPON1   NM_006108
  A_23_P166109   FLRT3   NM_198391   A_23_P36345   STARD10   NM_006645
  A_23_P114883   FMOD   NM_002023   A_23_P399265   STMN2   S82024
  A_23_P37127   FOXA1   NM_004496   A_23_P212500   TF   NM_001063
  A_24_P347431   FOXA1   NM_004496   A_23_P212508   TF   NM_001063
  A_23_P91552   FTCD   NM_206965   A_23_P101013   TMC6   NM_007267
  A_23_P384761   GATA4   NM_002052   A_23_P130333   TTR   NM_000371
  A_23_P129064   GATM   NM_001482   A_23_P214408   UNC93A   NM_018974
  A_32_P19294   GLT1D1   NM_144669   A_24_P103434   UNC93A   NM_018974
  A_32_P109029   GPRC5C   NM_022036   A_23_P16866   VIL1   NM_007127
  A_23_P69573   GUCY1A3   NM_000856   A_23_P78099   VTN   NM_000638
2．在人胚胎干细胞中特异性表达的基因
在人胚胎干细胞中特异性表达的、安捷伦公司制WholeHuman Genome寡DNA微阵列（4X44K）的表达探针数31（23个基因；表12）之中，31个探针数在实施例2～6的人诱导肝干细胞中与在人胚胎干细胞中几乎同等程度（1/4～4倍以内）地表达。记载了人胚胎干细胞和其基因的探针名（Probe name）、基因符号（GeneSymbol）、gen bank登录号（Genebank AccessionNo）。
[表12]
  探针名   基因符号  Genbank登录号
  A_24_P231132   ACVR2B   NM_001106
  A_23_P109950   ACVR2B   NM_001106
  A_32_P134209   ACVR2B   NM_001106
  A_23_P85250   CD24   L33930
  A_23_P206359   CDH1   NM_004360
  A_23_P138655   CYP26A1   NM_057157
  A_23_P28953   DNMT3B   NM_175850
  A_23_P380526   DPPA4   NM_018189
  A_23_P2831   EDNRB   NM_003991
  A_24_P42755   FLT1   NM_002019
  A_23_P14821   GABRB3   NM_000814
  A_23_P10966   GABRB3   NM_000814
  A_23_P304450   GATA6   NM_005257
  A_23_P72817   GDF3   NM_020634
  A_23_P163992   GRB7   NM_005310
  A_23_P74895   LIN28   NM_024674
  A_23_P204640   NANOG   NM_024865
  A_23_P127322   NODAL   NM_018055
  A_23_P215060   PODXL   NM_005397
  A_24_P144601   POU5F1   NM_002701
  A_23_P59138   POU5F1   NM_002701
  A_32_P132563   POU5F1   NM_002701
  A_24_P214841   POU5F1   NM_002701
  A_23_P109072   SALL4   NM_020436
  A_23_P401055   SOX2   NM_003106
  A_24_P379969   SOX2   NM_003106
  A_32_P135985   TDGF1   NM_003212
  A_23_P366376   TDGF1   NM_003212
  A_23_P110851   TERT   NM_198253
  A_23_P395582   ZFP42   NM_174900
  A_23_P327910   ZIC3   NM_003413
以上结果表明，通过实验验证了人诱导肝干细胞不仅表达作为肝细胞性质的肝细胞的标志基因，而且与人胚胎干细胞同等地表达胚胎干细胞特异性基因。
对微阵列的结果进一步进行解析，本发明的诱导肝干细胞具有中内胚层系干细胞及内胚层系干细胞特异性性质。具体而言，其表达在中内胚层系干细胞及内胚层系干细胞中特异性表达的基因中的SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因中的全部。实施例2～6的人诱导肝干细胞（NFB1-3、GC1-2、NGC1-2、AFB1-1、CC1-4）中，肝细胞特异性基因比较少且低表达的人诱导肝干细胞（NFB1-3、CC1-4）与其它人诱导肝干细胞（GC1-2、NGC1-2、AFB1-1）相比，更多地表达SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因。
如上所述，可以确认：由来源于胃癌患者的非癌组织制作的人诱导肝干细胞（NGC1-2）及由成人皮肤组织制作的人诱导肝干细胞(AFB1-1)表达作为肝细胞标志基因的α-甲胎蛋白（AFP）、甲状腺素运载蛋白（TTR）、白蛋白（ALB）及α1‐抗胰蛋白酶（AAT），与人胚胎干细胞同等地表达作为胚胎干细胞特异性基因的POU5F1基因、SOX2基因、NANOG基因、ZFP42基因。予以说明，有时AAT还记作SERPINA1，甲状腺素运载蛋白还记作前白蛋白，ZFP42还记作REX1。
实施例9
9．利用免疫荧光染色对肝细胞标记和胚胎干细胞标记进行 定量检测
将实施例4中诱导的由来源于胃癌患者的非癌组织制作的人诱导肝干细胞（NGC1-2）和实施例6中诱导的由来源于成人皮肤组织制作的人诱导肝干细胞(AFB1-1)接种至Lab-Tek（注册商标）Chamber Slide（注册商标）System（Nunc公司制、Cat no.177429）。第二天除去培养基，用PBS(-)洗涤2次后，加入10%福尔马林溶液，室温下静置15分钟。接下来，除去10%福尔马林溶液，用PBS(-)洗涤3次后，加入0.1%Triton-X100(ICN Biomedical公司制)，室温下静置15分钟。接下来，除去0.1%Triton-X100溶液，用PBS(-)洗涤3次后，加入封闭溶液（TBS系；pH7.2）（Nacalai Tesque公司制；Catno.05151-35），室温下静置一小时。与稀释50倍的一抗在4℃反应一晚或在室温下反应一小时。然后，用PBS(-)洗涤2次后，在室温下与稀释500倍的二抗反应30分钟。所使用的一抗及二抗如下。
＜一抗＞
山羊抗人NANOG抗体（R&D Systems公司制；Lotno.KKJ03）、小鼠抗人SSEA-4抗体(密理博公司制；Lotno.LV1488380)、小鼠抗人CD9抗体（R&D Systems公司制；Lot no.JOK04）、兔抗人α-1-甲胎蛋白抗体（Dako公司制；Lotno.A 0008）、小鼠抗人白蛋白抗体（Sigma-Aldrich公司制；Lot no.A6684）
＜二抗＞
驴抗山羊IgG抗体Alexa Fluor594标记（Invitrogen公司制；Cat no.A11058）、山羊抗小鼠IgG抗体Alexa Fluor488标记(Invitrogen公司制；Cat no.A11001)、山羊抗小鼠IgG抗体AlexaFluor594标记(Invitrogen公司制；Cat no.A11005)、驴抗兔IgG抗体Alexa Fluor488标记(Invitrogen公司制；Cat no.A21206)
染色后，用荧光显微镜观察，结果，由来源于胃癌患者的非癌组织制作的人诱导肝干细胞和由成人皮肤组织制作的人诱导肝干细胞均为产生作为肝细胞性质的α-甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）蛋白且表达胚胎干细胞特异性糖脂质NANOG、SSEA-4、CD9的细胞（未图示）。
实施例10
10．CD81基因、SCARB1基因、OCLN基因及CLDN1基因 的共表达
使用安捷伦公司制Whole Human Genome寡DNA微阵列（4X44K），解析丙型肝炎病毒（HCV）复制中的重要基因CD81基因、SCARB 1基因、OCLN基因及CLDN1基因。解析软件使用的是GeneSpring GX 10.0，校正以50th percentile来进行。实验方法与实施例8相同。
＜基因的定量解析结果＞
3种人胚胎干细胞、hES H9（GSM 194390）、hES BG03（GSM194391）和hES ES01（GSM194392）以及诱导多能性干细胞、iPS cells 201B7（GSM241846）的微阵列数据使用的是由GEO下载的数据。
可以确认并通过实验验证了：人诱导肝干细胞进行丙型肝炎病毒（HCV）复制中的重要基因CD81基因、SCARB1基因、OCLN基因及CLDN1基因的共表达。因此，暗示了使本发明的诱导肝干细胞感染丙型肝炎病毒并使其复制，同时添加抗病毒药的候补化合物，从而能够进行该化合物的药效评价试验。进而，暗示了其具有与人胚胎干细胞及人诱导多能性干细胞同样的用途。
在本发明的诱导肝干细胞的诱导中，必须使前述哺乳动物细胞处于存在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的基因产物且使得POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物的状态。在本发明中，优选POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率满足POU5F1基因＞KLF4基因＞SOX2基因的关系，进而，从高效诱导诱导肝干细胞的观点出发，最优选将POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率调节为依次为4：2：1。
此外，在本发明中，在胚胎干细胞中特异性表达的NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因等还发挥使各种生物体中的细胞在生物体外进行自我复制的“自我复制基因”功能。
本发明的诱导肝干细胞的诱导中的POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率为主宰分化的重要因素之一，在多能性干细胞的制作中，POU5F1基因、KLF4基因、及SOX2基因的基因产物的细胞内存在比率为1：1：1，判断为未分化细胞。
产业上的利用可能性
根据本发明，能够由人种、性别、年龄、遗传背景（多态性等）不同的供体制作人诱导肝干细胞，因此能够在临床试验中在评价对各种患者给予药物候补等的效果、安全性、毒性、药物相互作用之前，通过非临床试验对其进行评价、预测，从而本发明的人诱导肝干细胞能够作为开发新药的高效、有助于减轻患者负担的新药发现工具，因此在产业上极为有用。
本发明的诱导肝干细胞在肝脏形成和功能控制的分子探索及解析，例如，肝纤维化、肝硬化、脂肪肝、代谢综合征、造血等中的新药发现、以及各种药物和化合物的代谢、作用机理的解析、疫苗制作、生物反应器用途等中非常有用。

Claims (21)

1.一种诱导肝干细胞，其特征在于，其至少具备下述（1）～（3）的特征，
（1）表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的下述表1的基因群中的至少15种基因，
[表1]
  基因符号   Genbank登录号   ACVR2B   NM_001106   CD24   L33930 CDH1 NM_004360   CYP26A1   NM_057157   DNMT3B   NM_175850   DPPA4   NM_018189   EDNRB   NM_003991   FLT1   NM_002019   GABRB3   NM_000814   GATA6   NM_005257   GDF3   NM_020634   GRB7   NM_005310   LIN28   NM_024674   NANOG   NM_024865   NODAL   NM_018055 PODXL NM_005397   POU5F1   NM_002701   SALL4   NM_020436   SOX2   NM_003106   TDGF1   NM_003212   TERT   NM_198253   ZFP42   NM_174900   ZIC3   NM_003413
（2）具有肝细胞的性质，且
（3）能够增殖培养或继代培养3天以上。
2.根据权利要求1所述的诱导肝干细胞，在前述诱导肝干细胞中表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达量与在胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比为1/8~8倍。
3.根据权利要求2所述的诱导肝干细胞，在前述诱导肝干细胞中表达的前述（1）胚胎干细胞的标志基因的表达量与在胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比为1/4~4倍。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的诱导肝干细胞，其特征在于，其表达作为前述（1）胚胎干细胞的标志基因的NANOG基因、POU5F1基因、SOX2基因、ZFP42基因及SALL4基因。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的诱导肝干细胞，其表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的选自下述表2的基因群中的15种以上。
[表2]
  基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   A2M   NM_000014   ERP27   NM_152321   NRCAM   NM_005010   ACE2   NM_021804   EVA1   NM_144765   NTF3   NM_002527   ACVRL1   NM_000020   F10   NM_000504   OLFML2A   NN_182487   ADAMTS9   NM_182920   F2   NM_000506   PAG1   NM_018440   AFAP1L2   NM_001001936   FABP1   NM_001443   PCSK6   NM_002570   AFP   NM_001134   FGA   NM_021871   PDK4   NM_002612   AGT   NM_000029   FGA   NM_000508   PDZK1   NM_002614   AHSG   NM_001622   FGB   NM_005141   PLA2G12B   NM_032562   AK027294   AK027294   FGG   NM_000509   PLG   NM_000301   AK074614   AK074614   FLRT3   NM_198391   PRG4   NM_005807   AK124281   AK124281   FMOD   NM_002023   PSMAL   NM_153696   AK126405   AK126405   FOXA1   NM_004496   PTGDS   NM_000954   ALB   NM_000477   FTCD   NM_206965   PTHR1   NM_000316   ALDH1A1   NM_000689   GATA4   NM_002052   RASD1   NM_016084   ANXA8   NM_001630   GATM   NM_001482   RBP4   NM_006744   APCDD1   NM_153000   GDF10   NM_004962   RNF43   NM_017763   APOA1   NM_000039   GJB1   NM_000166   RRAD   NM_004165   APOA2   NM_001643   GLT1D1   NM_144669   S100A14   NM_020672   APOA4   NM_000482   GPRC5C   NM_022036   SEPP1   NM_005410   APOB   NM_000384   GSTA3   NM_000847   SERINC2   NM_178865   AREG   NM_001657   GUCY1A3   NM_000856   SERPINA1   NM_001002236   ART4   NM_021071   H19   NR_002196   SERPINA3   NM_001085   ASGR2   NM_080912   HHEX   NM_002729   SERPINA5   NM_000624   ATAD4   NM_024320   HKDC1   NM_025130   SH3TC1   NM_018986   BC018589   BC018589   HMGCS2   NM_005518   SLC13A5   NM_177550   BMP2   NM_001200   HP   NM_005143   SLC40A1   NM_014585   BX097190   BX097190   HPR   NM_020995   SLC5A9   NM_001011547   C11orf9   NM_023279   HPX   NM_000613   SLCO2B1   NM_007256   C13orf15   NM_014059   HSD17B2   NM_002153   SLPI   NM_003064   C15orf27   NM_152335   HTRA3   NM_053044   SPARCL1   NM_004684   C3   NM_000064   IGF2   NM_001007139   SPON1   NM_006108   C5   NM_001735   IL32   NM_101012631   ST8SIA1   NM_003034   CA414006   CA414006   INHBB   NM_002193   STARO10   NM_006645   CD163   NM_004244   ISX   NM_001008494   STMN2   S82024   GD1D   NM_001766   KCNJ16   NM_170741   TDO2   NM_005651   CDX2   NM_001265   KYNU   NM_003937   TF   NM_001063   CILP   NM_003613   LAMC2   NM_005562   TMC6   NM_007267   CMKLR1   NM_004072   LGALS2   NM_006498   TMEM16D   NM_178826   COL4A6   NM_033641   LHX2   NM_004789   TSPAN15   NM_012339   COLEC11   NM_199235   LOC132205   AK091178   TTR   NM_000371   CXCL14   NM_004887   LOC285733   AK091900   UBD   NM_006398   CXCR4   NM_001008540   M27126   M27126   UGT2B11   NM_001073   CXCR7   NM_020311   MAF   AF055376   UGT2B7   NM_001074   DACH1   NM_080759   MFAP4   NM_002404   UNC93A   NM_018974   DENND2A   NM_015689   MMP10   NM_002425   VCAM1   NM_001078   DIO3   NM_001362   MTTP   NM_000253   VIL1   NM_007127   DLK1   NM_003836   NGEF   NM_019850   VTN   NM_000638   DUSP6   NM_001946   NGFR   NM_002507   WFDC1   NM_021197
6.根据权利要求1～5中任一项所述的诱导肝干细胞，其表达作为前述（2）肝细胞的性质的相关基因的AFP基因、TTR基因、TF基因、APOA2基因、APOA4基因、AHSG基因、FGA基因、AGT基因、FABP1基因、SERPINA1基因及RBP4基因。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的诱导肝干细胞，其还选自中内胚层系干细胞及/或内胚层系干细胞特异性的表达SOX17基因、FOXA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因中的至少1种基因。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的诱导肝干细胞，进而，在受试物质作用下，抑制或诱导选自下述表3的基因群中的至少1种基因的表达，或者促进或抑制该基因的基因产物的活性。
[表3]
  基因符号  Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   基因符号   Genbank登录号   ABCB1   NM_000927   GSTA1   NM_145740   SLC22A6   NM_153277   ABCB11   NM_003742   GSTA2   NM_000846   SLC22A7   NM_153320   ABCB4   NM_018850   GSTA3   NM_000847   SLC22A8   NM_004254   ABCC1   NM_019862   GSTA4   NM_001512   SLC22A9   NM_080866   ABCC2   NM_000392   GSTA5   NM_153699   SLCO1A2   NM_005075   ABCC3   NM_003786   GSTM1   NM_146421   SLCO1A2   NM_134431   ACTB   NM_001101   GSTM2   NM_000848   SLCO1B1   NM_006446   AH1R   NM_001621   GSTM3   NM_000849   SLCO1B3   NM_019844   ARNT   NM_001668   GSTM4   NM_147148   SLCO1C1   NM_017435   BAAT   NM_001701   GSTM5   NM_000851   SLCO2A1   NM_005630   COMT   NM_000754   GSTP1   NM_000852   SLCO2B1   NM_007256   CYP1A1   NM_000499   GSTT1   NM_000853   SLCO3A1   XM_001132480   CYP1A2   NM_000761   GSTT2   NM_000854   SLCO3A1   NM_013272   CYP1B1   NM_000104   GSTZ1   NM_145870   SLCO4A1   NM_016354   CYP2A13   NM_000766   NAT1   NM_000662   SLCO4C1   NM_180991   CYP2A6   NM_000762   NAT2   NM_000015   SULT1A1   NM_177529   CYP2A7   NM_000764   NR1H4   NM_005123   SULT1A2   NM_177528   CYP2B6   NM_000767   NR1I2   NM_003889   SULT1A3   AK094769   CYP2C18   NM_000772   NR1I3   NM_005122   SULT1A4   NM_001017389   CYP2C19   NM_000769   PPARA   NM_005036   SULT1B1   D89479   CYP2C8   NM_000770   PPARA   L02932   SULT1B1   NM_014465   CYP2C9   NM_000771   PPARD   NM_006238   SULT1C2   NM_176825   CYP2D6   NM_000106   PPARG   NM_138711   SULT1C4   NM_006588   CYP2E1   NM_000773   RPL13   NM_033251   SULT1E1   NM_005420   CYP2F1   NM_000774   RPS18   NM_022551   SULT2A1   NM_003167   CYP2J2   NM_000775   RXRA   NM_002957   SULT2B1   NM_004605   CYP3A4   NM_017460   RXRB   NM_021976   SULT4A1   NM_014351   CYP3A5   NM_000777   RXRG   NM_006917   TPMT   NM_000367   CYP3A5   AF355801   SLC10A1   NM_003049   UGT1A6   NM_001072   CYP3A7   NM_000765   SLC10A2   NM_000452   UGT1A8   NM_019076   CYP4A11   NM_000778   SLC16A1   NM_003051   UGT2A1   NM_006798   CYP4B1   NM_000779   SLC17A1   NM_005074   UGT2B10   NM_001075   CYP4F11   NM_021187   SLC22A1   NM_153187   UGT2B11   NM_001073   CYP4F12   NM_023944   SLC22A10   NM_001039752   UGT2B15   NM_001076   CYP4F2   NM_001082   SLC22A11   AK075127   UGT2B17   NM_001077   CYP4F3   AB002454   SLC22A11   NM_018484   UGT2B28   NM_053039   CYP4F8   NM_007253   SLC22A2   NM_003058   UGT2B4   NM_021139   EEF1A1   NM_001402   SLC22A3   NM_021977   UGT2B7   NM_001074   ENDOG   NM_004435   SLC22A4   NM_003059   GAPDH   NM_002046   SLC22A5   NM_003060
9.根据权利要求1～8中任一项所述的诱导肝干细胞，其能够增殖培养或继代培养1个月以上。
10.根据权利要求1所述的诱导肝干细胞的制造方法，其特征在于，所述诱导肝干细胞的制造方法包括将哺乳动物细胞诱导为诱导肝干细胞的工序，该工序为如下工序：使前述哺乳动物细胞处于存在用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的基因产物且使得POU5F1基因的基因产物的细胞内存在比率大于SOX2基因的基因产物的状态。
11.根据权利要求10所述的诱导肝干细胞的制造方法，其特征在于，前述工序为如下工序：使用前述用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因或它们的基因产物，POU5F1基因或该基因的基因产物与SOX2基因或该基因的基因产物的使用比率大于1。
12.根据权利要求11所述的诱导肝干细胞的制造方法，前述的用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的使用比率满足POU5F1基因＞KLF4基因＞SOX2基因的关系。
13.根据权利要求12所述的诱导肝干细胞的制造方法，前述的用于诱导诱导肝干细胞所必需的POU5F1基因、KLF4基因及SOX2基因的使用比率为4：2：1。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的诱导肝干细胞的制造方法，前述哺乳动物细胞为来源于成体的细胞、来源于新生仔的细胞、来源于新生仔皮肤的细胞、罹患癌症个体的细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、或由胚胎干细胞或诱导多能性干细胞分化的细胞。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的诱导肝干细胞的制造方法，前述哺乳动物是人。
16.一种使用权利要求1所述的诱导肝干细胞的试验方法，其特征在于，该试验方法为选自安全性试验方法、毒性试验方法、代谢试验方法、药物相互作用试验方法、抗病毒活性试验方法、药物的筛选试验方法中的试验方法。
17.根据权利要求16所述的试验方法，前述药物的筛选试验方法为高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物或抗体药物的筛选试验方法。
18.一种新药发现靶标筛选方法，其特征在于，使用权利要求1所述的诱导肝干细胞。
19.一种动物模型制作方法，其特征在于，使用权利要求1所述的诱导肝干细胞。
20.一种肝脏合成蛋白的生产方法，其特征在于，使用权利要求1所述的诱导肝干细胞。
21.一种以哺乳动物对象的治疗方法，其特征在于，使用权利要求1所述的诱导肝干细胞。
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