KR20130012114A

KR20130012114A - 유도간 간세포 및 그 제조 방법, 그리고 그 세포의 응용

Info

Publication number: KR20130012114A
Application number: KR1020127022881A
Authority: KR
Inventors: 데츠야 이시카와; 게이타로 하기와라; 다카히로 오치야
Original assignee: 도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-02-03
Publication date: 2013-02-01
Also published as: CN102858958A; CA2794473A1; ES2667058T3; JP6023862B2; JP5812492B2; WO2011096223A1; JPWO2011096223A1; JP2016010406A; KR101646308B1; EP2532741A4; EP2532741B1; US20130023045A1; EP2532741A1

Abstract

본 발명은, 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험, 항바이러스 활성 시험, 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험, 창약 표적 스크리닝, 동물 모델 제작, 간세포 산생 단백질의 생산, 및 재생 의료에 유용한 하기의 유도간 간세포, 그 제조 방법 및 그 세포의 응용이다. 적어도 하기 (1) ~ (3) 의 요건을 구비하는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포 ; (1) 배성 간세포의 마커 유전자인 특정한 유전자군 중에서 선택된 적어도 15 종의 유전자를 발현하고 있다 (2) 간세포로서의 성질을 갖는다 (3) 3 일 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능하다.

Description

유도간 간세포 및 그 제조 방법, 그리고 그 세포의 응용{INDUCED HEPATIC STEM CELL AND PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF, AND APPLICATIONS OF THE CELL}

본 발명은, 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험, 항바이러스 활성 시험, 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험, 창약 표적 스크리닝, 동물 모델 제작, 간세포 산생 단백질의 생산, 및 재생 의료에 유용한 유도간 간세포 (肝細胞) 에 관한 것으로, 특히, 간세포로서의 성질을 갖고, 배성 간세포의 마커 유전자군을 배성 간세포와 동등한 양으로 발현시킴과 함께, 장기 증식 계대 배양이 가능하다는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포, 그 제조 방법, 및 그 세포의 응용에 관한 것이다.

제약 기업에 있어서의 신약의 연구 개발은 연구 개발 기간의 장기화에 더하여 연구 개발 비용의 고비용화의 문제도 떠안고 있다. 게다가, 장래 신약이 될 것으로 기대되는 후보는 많이 존재하지만, 연구 개발이 진행됨에 따라 유효성이나 안전성에 문제가 생겨, 그 대부분이 개발을 단념하지 않을 수 없다고 하는 상황에 있다.

일반적으로 신약 개발에는 9 ~ 17 년이나 되는 긴 세월과 수십억엔 ~ 수백억엔이나 되는 막대한 연구 개발비가 필요하기 때문에, 전 임상 등의 조기 단계에서 후보 화합물을 한정할 수 있는 창약 툴이 있으면, 그 개발비를 억제할 수 있다고 전해지고 있다.

그러나, 현재의 비임상 시험에 있어서는 약물의 안전성이나 독성 등의 평가에 있어서 동물을 사용한 시험을 실시할 필요가 있어, 이 점이 개발비를 상승시키는 하나의 요인으로 되고 있다. 또, 인간과 동물의 종차 (種差) 에 의해 약물의 생체 내 동태가 상이한 경우가 있어, 안전성에 대해 충분한 평가를 실시할 수 없으므로 임상 시험 단계에 들어가서 후보 화합물에 독성이 있는 것을 알게 되어 개발을 단념한다고 하는 경우도 있다.

그래서, 연구 개발의 조기 단계에 있어서 후보 화합물의 인간 생체 내에 있어서의 동태 등을 예측 및 평가하는 평가계의 확립이 강하게 요망되는 중에, 현재 「종차의 벽」의 한계를 갖는 동물 실험을 대신하는 인간 간세포를 사용한 평가 시스템의 구축을 목표로 해서 날마다 연구가 이루어지고 있다. 이와 같은 평가 시스템은 의약품 개발의 조기의 스테이지에서 안전성이 높은 후보약을 정확하게 한정할 수 있으므로, 특히 제약 기업에 큰 수요가 있다.

종래의 인간 배양 세포를 사용한 비임상 시험에서는 외국인의 초대 배양 간세포 또는 기존 세포주 등이 사용되고 있다. 그러나, 초대 배양 간세포에 대해서는 압도적으로 도너가 부족하고, 로트차가 매우 크다고 하는 문제가 있다. 특히, 일본인의 초대 배양 간세포는 윤리 문제 및 법규제 때문에 입수가 현저하게 곤란하여 안정적인 공급은 불가능하다.

또한, 간장 중에 발현되고 있는 약물 대사 효소는 많은 의약품의 대사를 촉매한다고 하는 중요한 역할을 하고 있지만, 유전자다형도 존재하여, 그 발현량 및 활성에는 큰 개인차가 존재하므로, 상기한 비임상 시험에 있어서의 과제는 심각하다.

또, 방대한 수의 개인차에 대응하기 위해서 그러한 차를 망라하는 복수의 도너 유래의 초대 배양 간세포를 대표 세포로 해서 각종 시험에 반복해서 사용하는 것이 가능한 것이 바람직하다. 그러나, 초대 배양 간세포를 배양 접시에서 배양해도 거의 증식 배양할 수 없으므로, 동일한 간세포를 계대 배양하여, 반복해서 다양한 시험에 사용하는 것은 사실상 불가능하다고 하는 문제도 있다.

한편, 기존 세포주의 상당수는 핵형 이상을 일으킨 세포이며, 또, 방대한 수의 개인차를 망라하는 다수의 세포주도 존재하지 않는다. 또한, 종래의 방법으로 장기 계대 배양된 기존 세포주는 초대 배양 간세포와 동일한 약물 대사 효소 활성이나 트랜스포터 유도능을 나타내지 않으므로, 이 결과로부터 임상에 있어서의 인간에서의 안전성, 대사 등을 예측하는 것은 불가능하다.

이와 같은 여러 사정으로부터 간세포의 성질을 갖고, 장기에 걸쳐 계대 배양 가능한 세포가 요망되고 있으나, 그러한 세포가 방대한 수의 개인차를 망라하는 복수의 도너로부터 발견되었다고 하는 보고는 아직 이루어져 있지 않다.

또, 간장의 간세포로서, 간세포로의 분화능을 갖는 간 간세포의 존재가 상정되어 있다. 그러나, 배성 간세포 및 유도 다능성 간세포와 같이 자기 복제 유전자를 발현하고, 장기에 걸쳐 생체 외에서 계대 배양 가능한 성질을 갖는 간 간세포가 발견되었다고 하는 보고도 아직 이루어져 있지 않다.

그래서, 생체 외에 있어서 이론상 모든 조직의 체세포, 생식 세포로 분화하는 분화 다능성을 유지하면서, 미분화인 상태로 거의 무한하게 자기 복제시킬 수 있는 배성 간세포 (Embryonic stem cells : ES 세포) (본 명세서에 있어서는, 이하 「배성 간세포」라고 기재한다) 가 재생 의료뿐만 아니라 창약의 분야에도 응용될 수 없는가 검토되고 있다. 배성 간세포란 동물의 발생 초기 단계인 배반포기의 배 (胚) 의 일부에 속하는 내부 세포 덩어리로 만들어지는 간세포주이며, 영어의 머리 글자를 취해 ES 세포라고도 불린다.

배성 간세포를 수립하려면, 수정란 또는 수정란보다 발생이 진행된 배반포까지의 단계의 초기배가 필요하다. 인간의 경우에는 수정란을 재료로서 사용하므로 생명의 맹아 (萌芽) 를 멸실해 버린다고 하는 것이 윤리적인 문제로서 인식되고 있다. 그 때문에, 인간 배성 간세포에 대해서는 그 제작을 포함하여 연구를 인정하지 않는 나라가 있으며, 또, 파킨슨병 등의 신경 변성 질환, 척수 손상 등 지금까지 근치 요법이 확립되어 있지 않은 질환을 치료할 수 있을 가능성을 인정하여 연구를 허용하고 있는 나라에 있어서도, 인간 배성 간세포의 취급에는 엄격한 제약이 가해지고 있다. 이와 같이, 배성 간세포의 기초 연구·응용 연구에서는 윤리적인 문제가 높은 장벽이 되고 있다.

또, 배성 간세포를 실제로 사용하려면, 배성 간세포를 어느 특정한 세포로 분화시킬 필요가 있어, 간세포나 신경세포, 심근세포, 췌장 베타세포 등으로 분화시키는 방법이 활발히 개발되고 있다. 그러나, 이와 같은 특정한 세포로의 분화는 어렵고, 특히 간세포로의 분화 유도는 곤란하다. 현시점에서는 창약 연구에 이용 가능한 고품질인 성숙간 간세포로의 고효율 분화 유도법은 확립되어 있지 않다. 지금까지 보고된 모든 분화 유도법은 3 주간 정도의 장기간을 필요로 하는 것이어서, 비싼 비용, 수고, 시간을 들여 고분화 유도시킨 간세포형 세포는 거의 증가시킬 수 없는 것이다.

최근, OCT3/4 유전자 (OCT3/4 는 유전자명으로 OCT3 또는 4 로 표기되는 경우도 있지만, 본 명세서에 있어서는, 이하 POU5F1 유전자라고 기재한다), SOX2 유전자, KLF4 유전자 및 c-MYC 유전자 (특허문헌 1) 의 도입, 혹은 염기성 선유아 세포 (fibroblast) 증식 인자 존재하에서의 POU5F1 유전자, SOX2 유전자 및 KLF4 유전자 (비특허문헌 1) 의 도입에 의해, 인간 등의 체세포로부터 유도 다능성 간세포라고 하는 배성 간세포와 동일한 미분화 세포를 제작할 수 있다는 보고가 이루어졌다 (특허문헌 2). 인간의 유도 다능성 간세포 (induced Pluripotent Stem Cells ; iPS 세포) (본 명세서에 있어서는, 이하 「유도 다능성 간세포」라고 기재한다) 는 (1) 몸을 구성하는 모든 세포로 될 수 있는 3 배엽으로의 분화 다능성과, (2) 특정 조건하에 있어서 그 미분화성을 유지한 채로 배양 접시 중에서 무한하게 계대 배양할 수 있는 자기 복제능이라고 하는 2 가지 특징을 갖는 것이 알려져 있다. 그리고, 이 인간 유도 다능성 간세포는 형태, 유전자 발현, 세포 표면 항원, 장기 자기 복제능, 테라토마 (양성 종양) 형성능에 있어서 인간 배성 간세포에 매우 유사하며 (비특허문헌 2, 비특허문헌 3), 또한, HLA 의 유전자형은 유래 세포인 체세포와 완전히 동일하다고 하는 보고가 이루어져 있다 (비특허문헌 3).

이 유도 다능성 간세포의 제작에서는 POU5F1 유전자, SOX2 유전자, KLF4 유전자, c-MYC 유전자의 4 개의 유전자, 또는 POU5F1 유전자, SOX2 유전자, KLF4 유전자의 3 개의 유전자를 세포에 도입하는 것만으로도 분화한 체세포를 미분화인 다능성 간세포에 「초기화·리프로그래밍」한다고 생각되고 있다. 그러나, 인간 세포에서는 4 개의 유전자에서 0.1 ％ - 0.01 ％, 3 개의 유전자에서 0.01 ％ - 0.001 ％ 의 효율로 체세포로부터 유도 다능성 간세포가 제작된다. 따라서, 99.9 ％ - 99.999 ％ 의 세포는 유전자 도입에 의해 유도 다능성 간세포에 리프로그래밍되지 않는다고 하는 것이 된다.

또한, 배성 간세포에 특징적으로 발현하는 NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자, SALL4 유전자, LIN28 유전자 및 TERT 유전자 등은 다능성 간세포의 미분화성 유지에 중요한 인자라고 생각되며, 세포의 분화를 억제하고 있다고 생각되고 있었다. 따라서, 분화한 세포에서는 분화 유전자 (분화 세포의 성질) 의 발현에 수반하여, 미분화성 유지에 중요한 인자라고 생각되고 있는 NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자, SALL4 유전자, LIN28 유전자 및 TERT 유전자의 발현은 소실된다.

요컨대, 미분화성 유지에 중요한 인자라고 생각되고 있는 NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자, SALL4 유전자, LIN28 유전자 및 TERT 유전자, 그리고 분화 세포의 다수의 성질 (다수의 분화 유전자의 발현) 이 함께 발현되는 세포는 제작 불가능하다고 생각되고 있었다.

일본 공개특허공보 2008-283972호 일본 공개특허공보 2008-307007호

Nakagawa M et al., Nat Biotechnol., 2008, 26,101-6 Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell, 2007, 131, 861-872 Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res., 2008, 1, 105-115 그래서 본 발명자들은 미분화성 유지에 중요한 유전자와 간세포의 다수의 성질이 공존하는 세포의 제작 가부에 대해 예의 연구한 결과, 배성 간세포에 특징적인 유전자를 발현시킴에도 불구하고, 간세포에 특징적인 유전자를 발현시키는 유도간 간세포가 얻어지는 것을 알아냄과 함께, 이 유도간 간세포가 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험, 항바이러스 활성 시험, 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험, 창약 표적 스크리닝, 동물 모델의 제작, 간세포 산생 단백질의 생산, 및 재생 의료에 유용한 것을 알아내어 본 발명을 완성했다.

따라서 본 발명의 제 1 목적은, 배성 간세포에 특징적인 유전자를 발현시킴에도 불구하고, 간세포에 특징적인 유전자를 발현시키는 유도간 간세포를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 제 2 목적은, 배성 간세포에 특징적인 유전자를 발현시킴에도 불구하고, 간세포에 특징적인 유전자를 발현시키는 유도간 간세포를 제작하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 제 3 목적은, 본 발명의 유도간 간세포를 사용한 안전성 시험 방법, 독성 시험 방법, 대사 시험 방법, 약물 상호작용 시험 방법, 항바이러스 활성 시험 방법, 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험 방법, 창약 표적 스크리닝 방법, 동물 모델 제작 방법, 간세포 산생 단백질의 생산 방법, 및 재생 의료 등의 방법을 제공하는 것에 있다.

즉, 본 발명의 제 1 발명은 적어도 하기 (1) ~ (3) 의 요건을 구비하는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포이다 (청구항 1).

(1) 배성 간세포의 마커 유전자인 하기 표 1 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 15 종의 유전자를 발현하고 있다.

(2) 간세포로서의 성질을 갖는다.

(3) 3 일 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능하다.

본 발명의 유도간 간세포에서 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현량이, 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 1/8 ~ 8 배인 것이, 유도간 간세포의 성질 유지 또는 장기 배양 계속의 관점에서 바람직하고 (청구항 2), 특히, 1/4 ~ 4 배인 것이 바람직하다 (청구항 3). 본 발명의 유도간 간세포는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자로서, NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자 및 SALL4 유전자가 발현되고 있는 것이 바람직하다 (청구항 4).

상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련되는 유전자로서 하기 표 2 의 유전자군 에서 선택되는 15 종 이상이 발현되고 있는 것이 바람직하다 (청구항 5).

또, 상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서, AFP 유전자, TTR 유전자, TF 유전자, APOA2 유전자, APOA4 유전자, AHSG 유전자, FGA 유전자, AGT 유전자, FABP1 유전자, SERPINA1 유전자 및 RBP4 유전자가 발현되고 있는 것이 바람직하다 (청구항 6).

본 발명의 유도간 간세포는 또한, 중내배엽계 간세포 및/또는 내배엽계 간세포에 특징적인 SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자, TCF2 유전자로부터 선택되는 적어도 1 종을 발현하고 있는 것이 바람직하고 (청구항 7), 피검 물질에 의해, 하기 표 3 의 유전자군 중에서 선택된 적어도 1 종의 유전자에 대해 그 발현이 억제 또는 유도되거나, 혹은 그 유전자의 유전자 산물의 활성이 촉진 또는 저해되는 것이 바람직하다 (청구항 8).

또한, 본 발명의 유도간 간세포는 1 개월 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능한 것이 바람직하다 (청구항 9).

본 발명의 제 2 발명은 포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 단계를 포함하는 유도간 간세포의 제조 방법으로서, 그 단계가, 상기 포유 동물의 세포를, SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록, 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 유전자 산물이 존재하는 상태로 두는 단계인 것을 특징으로 하는 유도간 간세포의 제조 방법이다 (청구항 10). 그 단계는, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 또는 이들 유전자 산물을 사용함과 함께, SOX2 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물에 대한 POU5F1 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물의 사용 비율이 1 보다 큰 단계인 것이 바람직하다 (청구항 11).

상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 상기 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 사용 비율이 POU5F1 유전자 〉KLF4 유전자 〉SOX2 유전자의 관계를 만족하는 것이 바람직하고 (청구항 12), 특히, 4 : 2 : 1 인 것이 바람직하다 (청구항 13).

상기 포유 동물의 세포로서, 성체 유래의 세포, 신생자 유래의 세포, 신생자 피부 유래의 세포, 발암 개체의 세포, 배성 간세포, 유도 다능성 간세포, 또는 배성 간세포 혹은 유도 다능성 간세포로부터 분화한 세포를 사용하는 것이 바람직하고 (청구항 14), 상기 포유 동물이 인간인 것이 바람직하다 (청구항 15).

또한, 본 발명의 제 3 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 시험 방법이며 (청구항 16), 이 시험 방법으로서는 안전성 시험 방법, 독성 시험 방법, 대사 시험 방법, 약물 상호작용 시험 방법, 항바이러스 활성 시험 방법, 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등에 대한 의약품의 스크리닝 시험 방법 (청구항 17) 이 있다. 본 발명의 제 4 발명은 창약 표적 스크리닝 방법 (청구항 18), 제 5 발명은 동물 모델 제작 방법 (청구항 19), 제 6 발명은 간세포 산생 단백질의 생산 방법 (청구항 20), 제 7 발명은 포유 동물을 대상으로 하는 치료 방법이다 (청구항 21).

본 발명에 의하면, 인종, 성, 연령, 유전적 배경이 상이한 도너로부터 인간 유도간 간세포를 제작하는 것이 가능하기 때문에, 본 발명은 신약의 임상 시험에 앞선 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험 등의 비임상 시험에 유효하다. 또, 인간 유도간 간세포를 사용한 비임상 시험은 신약 개발의 효율화에 기여하는 창약 툴이 된다.

이하, 본 발명의 유도간 간세포, 그 제조 방법, 및 그 세포의 응용에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명의 유도간 간세포는 적어도 하기 (1) ~ (3) 의 요건을 구비하는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포이다.

(1) 배성 간세포의 마커 유전자인 상기 표 1 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 15 종의 유전자를 발현하고 있다.

(2) 간세포로서의 성질을 갖는다.

(3) 3 일 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능하다.

다음으로, 본 발명의 유도간 간세포에 있어서, 배성 간세포의 마커 유전자로서 알려져 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현은, 본 발명의 유도간 간세포가 이론적으로는 무한하게 자기 복제하여 사실상 유도간 간세포인 채로 장기 계대 배양 가능한 성질을 갖는 세포인 것을 특정하는 것이다. 본 발명의 유도간 간세포에 있어서는, 상기 표 1 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 15 종의 유전자가 발현되고 있는 것이 필요하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는, 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자가 발현되고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 유도간 간세포가 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현량이 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 1/16 ~ 16 배인 것이 바람직하고, 1/8 ~ 8 배인 것이 보다 바람직하다. 특히, 본 발명의 유도간 간세포가 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현량이 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 거의 동등, 즉, 1/4 ~ 4 배 이내인 것이 유도간 간세포 상태를 유지하기 위해 또는 장기 계대 배양의 관점에서 바람직하고, 1/2 ~ 2 배 이내인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 미분화인 것을 유지하는 관점에서, 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자로서, 상기 표 1 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 15 종의 유전자가 본 발명의 유도간 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과, 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량을 비교하여 1/2 ~ 2 배의 범위에서 발현하고 있는 것이 바람직하고, 이 범위 내에서 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 수가 20, 25 이상으로 증가할수록 바람직하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는, 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자로서, 상기 표 1 의 유전자군 중 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 5 종 이상의 유전자의 발현량이 1/2 ~ 2 배, 10 종 이상의 유전자의 발현량이 1/4 ~ 4 배, 20 종 이상의 유전자의 발현량이 1/8 ~ 8 배의 범위에서 발현하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는, 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자로서, 상기 표 1 의 유전자군 중 NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자를 포함하는 5 종의 유전자가 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 1/4 ~ 4 배의 범위에서 발현하고 있는 것이 바람직하고, NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자 및 SALL4 유전자의 5 유전자가 1/4 ~ 4 배의 범위에서 발현하고 있는 것이 보다 바람직하며, 특히, NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, TDGF1 유전자, DNMT3B 유전자, ZFP42 유전자, TERT 유전자, GDF3 유전자, SALL4 유전자, GABRB3 유전자의 10 종류의 유전자가 1/4 ~ 4 배의 범위에서 발현하고 있는 것이 더욱 바람직하다.

상기한 비교 대상이 되는 배성 간세포로서는 hES_H9 (GSM194390), hES_BG03 (GSM194391), hES_ES01 (GSM194392) 중 어느 것이 사용된다. 이들 유전자 발현 데이터는 데이터베이스인 Gene Expression Omnibus [GEO] ("Gene Expression Omnibus [GEO], [online], [2010년 1월 28일 검색], 인터넷 <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/>) 로부터 취득할 수 있다.

본 발명의 유도간 간세포는 상기 (2) 간세포로서의 성질을 갖는 것이 필요하다. 본 발명의 유도간 간세포에 있어서의 간세포로서의 성질로는 간세포에 특징적인 성질이면 특별히 제한되지 않지만, 주로 간세포에 특징적인 단백질 (유전자 산물) 의 산생 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 혈청 단백질 (AFP, TTR, TF, APOA2, APOA4, AHSG, FGA, AGT, FABP1, SERPINA1, RBP4 등) 의 산생, 당류 대사, 아미노산 대사, 지질 대사, 및 철 대사 관련 효소의 산생, 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 산생 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명의 유도간 간세포는 상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자를 발현하고 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 유전자는 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 유전자이고, 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자이면 되며, 예를 들어, 간세포에 특징적인 단백질의 산생 등에 관련하는 유전자를 예시할 수 있다. 구체적으로는, 혈청 단백질의 산생, 당류 대사, 아미노산 대사, 지질 대사, 및 철 대사 관련 효소의 산생, 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 산생 등에 관련하는 유전자를 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다. 특히, 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 생산에 관련하는 유전자로서는, 예를 들어 상기 표 3 의 유전자군 등을 들 수 있다. 이와 같은 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 생산에 관련하는 유전자는 본 발명의 유도간 간세포가 취입한 의약품의 후보 화합물 등의 피검 물질 등에 의해 유전자 발현, 유도, 억제 등을 나타낸다.

본 발명의 유도간 간세포의 일 양태로서는 상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서, 간 관련 유전자인 상기 표 2 의 유전자군에서 선택된 적어도 15 종의 유전자를 발현하고 있어도 된다. 이들 유전자는 인간 초대 배양 간세포에서 발현하고 있는 간세포에 특징적인 유전자이다.

각 유전자기호에 대한 Genbank 접근 번호는 상기 표 2 와 같다. 각 유전자 정보에 대해서는 NCBI 의 홈페이지 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) 로부터 입수할 수 있다.

상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서는 간세포에 특징적인 성질을 강하게 갖는 세포가 얻어진다고 하는 관점에서, 상기 표 2 의 유전자군 중 50종 이상의 유전자가 발현되고 있는 것이 바람직하고, 특히, 80 종 이상이 발현되고 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 상기 표 2 의 유전자군 중에서도 AFP 유전자를 발현하고 있는 것이 바람직하고, 특히, AFP 유전자, TTR 유전자, TF 유전자, APOA2 유전자, APOA4 유전자, AHSG 유전자, FGA 유전자, AGT 유전자, FABP1 유전자, SERPINA1 유전자 및 RBP4 유전자가 발현되고 있는 것이 바람직하다.

상기 유전자는 일반적으로 간세포에서 많이 발현하고 있는 유전자이며, 반대로 배성 간세포도 포함한 간세포 이외의 세포에서는 이들 유전자의 상당수는 실질적으로 발현하고 있지 않은 것이 알려져 있다.

또, 본 발명의 유도간 간세포의 다른 양태에서는 상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서 이하에 드는 유전자를 발현하고 있어도 된다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 GSTM3 유전자, SLC22A1 유전자, GSTA5 유전자, ALDH1A1 유전자, CYP27A1 유전자, CYP1B1 유전자, ALDH2 유전자, GSTA2 유전자, GSTA3 유전자, GSTA5 유전자, CYP4A2 유전자, UGT2B11 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 약물 동태에 관한 단백질을 산생하는 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 독성 시험 방법에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 GSTM3 유전자, SLC22A1 유전자, GSTA5 유전자, ALDH1A1 유전자, CYP27A1 유전자, CYP1B1 유전자, ALDH2 유전자, GSTA2 유전자, GSTA3 유전자, GSTA5 유전자, CYP4A2 유전자, UGT2B11 유전자 등을 발현되고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 약물 대사 관련 효소에 관한 단백질을 산생하는 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 대사 시험 방법에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 CD81 유전자, SCARB1 유전자, OCLN 유전자, CLDN1 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, HCV 의 복제에 관한 단백질을 산생하는 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 항바이러스 활성 시험 방법에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 APOA1 유전자, APOA2 유전자, APOA4 유전자, APOB 유전자, FABP1 유전자, AGT 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 지질 대사, 혈압에 관한 단백질을 산생하는 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 고지혈증약, 고혈압 치료약 등의 의약품 스크리닝 시험에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 CCL2 유전자, CDKN1A 유전자, ICAM1 유전자, JUNB 유전자, RGS2 유전자, CCND1 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 트랜스포터 및 대사형 수용체 관련 단백질을 생산하는 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 저분자 화합물, 항체 등의 의약품의 스크리닝 시험에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 ALB 유전자, TTR 유전자, TF 유전자, RBP4 유전자, FGA 유전자, FGB 유전자, FGG 유전자, AHSG 유전자, AFP 유전자, FN1 유전자, SERPINA1 유전자, PLG 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 혈청 단백질의 생산과 같은 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 동물 모델 제작 방법에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포에 있어서는 ALB 유전자, TTR 유전자, TF 유전자, RBP4 유전자, FGA 유전자, FGB 유전자, FGG 유전자, AHSG 유전자, AFP 유전자, FN1 유전자, SERPINA1 유전자, PLG 유전자 등을 발현하고 있어도 된다. 이와 같은 유전자가 발현되고 있는 경우에는, 혈청 단백질의 생산과 같은 간세포의 성질을 나타내므로, 특히, 인간 이외의 동물을 대상으로 하는 치료 방법에 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포는 중내배엽계 간세포 및/또는 내배엽계 간세포에 특징적인 성질을 갖고 있어도 되고, 또한, 중내배엽계 간세포 및/또는 내배엽계 간세포에 발현하는 유전자인 SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자, TCF2 유전자로부터 선택되는 적어도 1 종을 발현하고 있어도 된다. 특히, SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자 및 TCF2 유전자 모두를 발현하고 있는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 유도간 간세포는, 피검 물질에 의해 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 산생에 관련하는 유전자인 상기 표 3 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 1 종에 대해 그 발현이 억제 또는 유도되거나, 혹은 그 유전자의 유전자 산물의 활성이 촉진 또는 저해되는 것이어도 된다. 여기서 피검 물질이란, 의약품의 후보 물질이며, 본 발명의 유도간 간세포가 이와 같은 피검 물질을 취입하면, 본 발명의 유도간 간세포의 약물 대사 효소 및 트랜스포터의 산생에 관련하는 유전자의 발현이 억제 또는 유도되어, 이들 유전자의 유전자 산물의 활성이 촉진 또는 저해된다. 이와 같은 세포는 약물 대사 시험 등의 창약 응용에 유용하다. 트랜스포터 유전자, 핵 리셉터 유전자를 함유하는 약물 대사 유전자의 발현에 대해서는 개인차가 있는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 유도간 간세포는 다종다양한 세포로부터 유도할 수 있으므로, 이와 같은 개인차를 망라한 다수의 유도간 세포를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 피검 물질에 의해, 본 발명의 유도간 간세포에 있어서 상기 표 3 에 기재된 유전자의 발현이 억제·유도 및 유전자 산물의 활성이 유도·저해되는 것이면 창약 개발 툴로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 유도간 간세포는 약물 동태 시험, 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험 등에 유용한 세포이다.

본 발명의 유도간 간세포는 다양한 간세포의 성질을 나타내므로, 각종 의약품·화합물의 대사, 작용 기구의 해석, 간장의 형성과 기능을 제어하는 분자의 탐색 및 해석 등에 매우 유용하다. 따라서, 안전성 시험, 독성 시험, 대사 시험, 약물 상호작용 시험, 항바이러스 활성 시험 (특히, B 형·C 형 간염), 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험, 창약 표적의 스크리닝 (간섬유화, 간경변, 지방간염, 메타볼릭신드롬, 조혈 등), 간세포 산생 단백질의 생산, 동물 모델 제작, 재생 의료 등에 사용할 수 있다.

또, 본 발명의 유도간 간세포는 3 일 이상 증식 배양 또는 계대 배양이 가능한데, 1 개월 이상, 반년 혹은 1 년 이상이라고 하는 장기에 걸쳐 증식 가능한 유도간 간세포이고, 이것은 이론적으로는 무한하게 자기 복제가 가능한 것을 의미한다.

본 발명의 유도간 간세포를 증식 배양 또는 계대 배양하는 배지로서는 배성 간세포, 다능성 간세포 등을 증식 배양 또는 계대 배양하는 것이 가능한 배지이면, 특별히 제한되지 않지만, 배성 간세포, 다능성 간세포 등의 배양에 적합한 배지가 바람직하게 사용된다. 이와 같은 배지로서는, 예를 들어 ES 배지 [40 ％ 둘베코 개변 이글 배지 (DMEM), 40 ％ 의 F12 배지 (시그마사 제조), 2 mM L-글루타민 또는 GlutaMAX (시그마사 제조), 1 ％ 의 non essential amino acid (시그마사 제조), 0.1 mM 의 β-메르캅토에탄올 (시그마사 제조), 15 ~ 20 ％ 의 Knockout Serum Replacement (인비트로젠사 제조), 10 ㎍/㎖ 의 겐타마이신 (인비트로젠사 제조), 4 ~ 10 ng/㎖ 의 FGF2 인자] (이하 ES 배지라고 한다), 0.1 mM 의 β-메르캅토에탄올을 제거한 ES 배지에서 마우스 배성 섬유아세포 (이하 MEF) 를 24 시간 배양한 상청 (上淸) 인 순화 배지에 0.1 mM 의 β-메르캅토에탄올 및 10 ng/㎖ 의 FGF2 를 첨가한 배지 (이하 MEF 순화 ES 배지), iPS 세포용 최적 배지 (iPSellon 사 제조), 피더 세포용 최적 배지 (iPSellon 사 제조), StemPro [등록상표] hESC SFM (인비트로젠사 제조), mTeSR1 (스템 셀 테크놀로지·베리타스사 제조), 애니멀 프로테인 프리의 인간 ES/iPS 세포 유지용 무혈청 배지 TeSR2 [ST-05860] (스템 셀 테크놀로지·베리타스사 제조), 영장류 ES/iPS 세포용 배지 (리프로셀사), ReproStem (리프로셀사), ReproFF (리프로셀사) 등을 예시할 수 있는데, 이들 배지에 제한되지 않는다. 인간의 세포를 사용하는 경우에는 인간 배성 간세포의 배양에 적합한 배지를 사용해도 된다.

본 발명의 유도간 간세포를 증식 배양 또는 계대 배양하는 수법에 대해서는 배성 간세포, 다능성 간세포 등의 배양에 있어서 당업자가 통상 사용하는 방법이면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포로부터 배지를 제거하고 PBS (-) 로 세정하고, 세포 박리액을 첨가하여 정치시킨 후, 세포 박리액을 제거하고, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 첨가하여 원심분리하고, 또한, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제, mTeSR 및 Y-27632 를 첨가하여 MEF 가 파종되어 있는 젤라틴 코트 또는 콜라겐 코트에 세포 현탁액을 파종함으로써 계대 배양하는 방법 등을 구체적으로 예시할 수 있다.

또한, 본 발명의 유도간 간세포에 있어서는, 유전자 도입으로부터 1 개월 이상 장기 배양했을 경우에도, 분화되지 않도록 TGF-beta 등의 활성을 저해 또는 중화 시키는 각종 저해제 또는 항체, HGF, FGF1 ~ 21 등의 선유아 세포 증식 인자, 액티빈 등을 배지에 첨가해도 되고, 선유아 세포 증식 인자로서는, 특히 산성 선유아 세포 증식 인자인 FGF1 (aFGF 라고도 한다. 이하 FGF1 이라고 기재한다), 염기성 선유아 세포 증식 인자인 FGF2 (bFGF 라고도 한다. 이하 FGF2 라고 기재한다), FGF4, FGF7 이 바람직하게 사용된다. 이와 같은 항체로서는, 예를 들어 이들 증식 인자에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 중화 항체 등을 예시할 수 있다. 또, microRNA, siRNA 나 안티센스 RNA 를 사용하여 TGF-beta 등의 유전자의 발현을 억제해도 된다. TGF-beta 등에 대한 저분자 화합물의 저해제를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, TGF-beta 시그널링의 저해제로서는 ALK 저해제 (A-83-01 등), TGF-beta RI 저해제, TGF-beta RI 키나아제 저해제 등을 들 수 있다. 또한, 상기한 선유아 세포 증식 인자는 유도되는 체세포의 종류에 따라 선택되며, 인간, 마우스, 소, 말, 돼지, 제브라피시 등을 유래로 하는 선유아 세포 증식 인자를 사용할 수 있다.

또한, Rho associatied kinase (Rho 관련 코일드코일 함유 단백질 키나아제) 의 저해제인 Y-27632 (Calbiochem ; water soluble), Fasudil (HA1077 : Calbiochem) 등을 배지 안에 첨가할 수도 있다.

그 외에도, FGF receptor tyrosine kinase, MEK (mitogen activated protein kinase)/ERK (extracellular signal regulated kinases 1 and 2) 경로, 및 GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 의 세 개의 저분자 저해제 [SU5402, PD184352 및 CHIR99021], MEK/ERK 경로 및 GSK3 의 두 개의 저분자 저해제 [PD0325901 및 CHIR99021], 히스톤메틸화 효소 G9a 의 저해제인 저분자 화합물 [BIX-01294 (BIX)], 아자시티딘, 트리코스타틴 A (TSA), 7-hydroxyflavone, lysergic acid ethylamide, kenpaullone, TGF β receptorI kinase/activin-like kinase 5 (ALK5) 의 저해제 [EMD 616452], TGF-βreceptor 1 (TGFBR1) kinase 의 저해제 [E-616452 및 E-616451], Src-family kinase 의 저해제 [EI-275], thiazovivin, PD0325901, CHIR99021, SU5402, PD184352, SB431542, 항TGF-β 중화 항체, A-83-01, Nr5a2, p53 저해 화합물, p53 에 대한 siRNA, p53 경로의 저해제 등을 배지에 첨가할 수도 있다.

또, 본 발명의 유도간 간세포는 공지된 방법에 의해 동결 및 해동하는 것이 가능하다. 동결 방법으로서는, 예를 들어 세포로부터 배지를 제거하고 PBS (-) 로 세정하고, 세포 박리액을 첨가하여 정치시킨 후, 세포 박리액을 제거하고, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 첨가하여 원심분리하고, 이어서, 상청을 제거한 후, 동결용 보존액을 첨가하여 세럼 튜브에 분주 (分注) 하여, -80 ℃ 에서 하룻밤 동결시킨 후, 액체 질소에서 보관하는 방법 등을 예시할 수 있다. 또, 해동 방법으로서는 37 ℃ 의 항온조 중에서 해동하여, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지에 현탁시켜서 사용하는 방법 등을 예시할 수 있다.

제 2 발명인 포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 공정을 포함하는 유도간 간세포의 제조 방법에 있어서, 대상이 되는 포유 동물로서는 포유 동물이면 특별히 제한되지 않고, 래트, 마우스, 마르모트, 토끼, 개, 고양이, 미니 돼지 등의 돼지, 소, 말, 게잡이 원숭이 등의 원숭이 등의 영장류, 인간 등을 들 수 있는데, 래트, 마우스, 마르모트, 개, 고양이, 미니 돼지, 말, 게잡이 원숭이, 인간이 바람직하고, 특히 인간이 바람직하게 사용된다.

또, 상기 포유 동물의 세포로서는 포유 동물의 세포이면 모두 사용 가능하다. 예를 들어, 뇌, 간장, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 췌장, 신장, 폐 등의 각 장기나, 골수액, 근육, 지방조직, 말초혈, 피부, 골격근의 세포 등을 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다. 그 중에서도, 내배엽성의 간장, 위, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 췌장, 폐 등 유래의 세포가 바람직하고, 특히, 위, 결장 유래의 세포가 바람직하게 사용된다. 이들 세포는 암치료의 수술시에 의료 폐기물로서 용이하게 입수하는 것이 가능한 점으로부터도 바람직하다.

또, 제대 조직 (제대, 제대혈), 양막, 태반, 양수 유래 세포 등의 출산시에 부수하는 조직, 체액 유래의 세포도 사용하는 것이 가능하고, 특히 신생자의 각 조직과 같은 출생 직후의 조직 (신생자의 피부 등) 유래의 세포를 사용해도 된다. 또, 동물의 태자 (胎仔) 의 세포 등도 이용 가능하다.

또, 상기 포유 동물의 세포로서 성체 유래의 세포, 신생자 유래의 세포, 신생자 피부 유래의 세포, 발암 개체의 세포, 배성 간세포, 유도 다능성 간세포, 배성 간세포 또는 유도 다능성 간세포로부터 분화한 세포 등을 사용할 수 있다.

발암 개체의 암의 종류는 특별히 제한되지 않고, 악성 종양, 고형암, 암종, 육종, 뇌종양, 조혈기암, 백혈병, 임파종, 다발성 골수종 등 어느 암도 사용 할 수 있다. 예를 들어, 구강암, 인두암, 상기도암, 폐암, 폐세포암, 식도암, 위암, 십이지장암, 췌암, 간암, 담암, 담관암, 대장암, 결장암, 직장암, 유방암, 갑상선암, 자궁체암, 자궁경암, 난소암, 정소암, 신장암, 방광암, 전립선암, 피부 암, 악성 흑색종, 뇌종양, 골육종, 혈액암 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다. 그 중에서도, 내배엽계인 위암, 유방암, 결장암, 대장암 개체의 비암조직 또는 암조직 유래의 세포가 바람직하게 사용된다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 포유 동물의 세포로서 포유 동물로부터 채취된 세포를 사용할 수도 있다. 포유 동물로부터 채취한 세포는 즉시 사용할 수도 있고, 공지된 방법으로 보존, 배양 등을 한 후에 사용할 수도 있다. 배양하는 경우에는 계대수는 특별히 제한되지 않지만, 초대 배양으로부터 제 4 계대 배양까지의 세포가 바람직하고, 초대 배양으로부터 제 2 계대 배양까지의 세포를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 초대 배양이란, 포유 동물로부터 세포가 채취된 직후의 배양을 의미하며, 초대 배양을 1 회 계대 배양하면 제 2 계대 배양, 또 1 회 계대 배양하면 제 3 계대 배양이 된다.

본 발명의 제조 방법에 있어서의 유도간 간세포에 유도하는 단계는, 상기 포유 동물의 세포를 SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록, 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 유전자 산물이 존재하는 상태로 두는 단계인 것이 필요하다. 또한, 여기서 「상태로 둔다」란, 그러한 상태가 되도록 조절하는 경우뿐만 아니라, 그러한 상태로 되어 있는 세포를 선택해서 조제하는 경우도 포함하는 개념이다.

또, 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 포유 동물의 세포로부터 본 발명의 유도간 간세포로의 유도시에 이들 유전자의 유전자 산물이 특정한 비율로 세포 내에 존재하는 것이 필요하다. 이로써, 포유 동물의 세포에 내재되는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자가 발현하여, 최종적으로 본 발명의 유도간 간세포가 유도된다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자에 관련된 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 POU5F1 유전자 〉KLF4 유전자 〉SOX2 유전자의 관계를 만족하는 것이 바람직하고, 또한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 순차적으로 4 : 2 : 1 이 되도록 조절하는 것이 유도간 간세포 로의 고효율 유도의 관점에서 가장 바람직하다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 상기 포유 동물의 세포를 SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록, 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 유전자 산물이 존재하는 상태로 둘 수 있으면 되고, 그 방법으로서는, 예를 들어 유도 다능성 간세포의 유도 기술로서 공지된 방법 등이 있는데, 이것에 제한되지 않는다.

예를 들어, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 발현 강도를 상승시킬 수 있는 유전자를 상기 포유 동물의 세포에 도입하여 이들 유전자를 강발현시켜 세포에 유전자 산물을 생산시키거나, 이와 같은 유전자의 발현 강도를 상승시킬 수 있는 유전자의 유전자 산물인 단백질이나 mRNA 등을 상기 포유 동물의 세포 중에 도입하는 등의 방법을 예시할 수 있다. 필요에 따라, 상기 포유 동물의 세포 내에 도입하는 벡터의 양, 도입하는 유전자의 양, 배지에 첨가하는 유전자 산물의 양 등을 조절함으로써, SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록 조절하는 것이 가능하다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 발현 강도를 상승시킬 수 있는 유전자로서는, POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 그 자체를 사용할 수 있다. 상기 포유 동물의 세포 중에 있어서의 상기 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 또는 SOX2 유전자의 발현이 불충분한 경우에는 그 세포 중에 부족한 유전자 또는 유전자 산물을 도입하고, 상기 세포 중의 상기 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 또는 SOX2 유전자가 발현하고 있는 경우에는 그 이외의 유전자 또는 그 유전자 산물을 상기 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 대신에 도입해도 된다. 상기 그 이외의 유전자로서는 유도 다능성 간세포를 유도하는 것으로 알려져 있는 유전자, 예를 들어, NANOG 유전자, LIN28 유전자, TBX3 유전자, PRDM14 유전자, L-MYC 유전자, c-MYC 유전자, N-MYC 유전자, SALL1 유전자, SALL4 유전자, UTF1 유전자, ESRRB 유전자, NR5A2 유전자, REM2 GTPase 유전자, TCL-1A 유전자, Yes-associated protein (YAP) 유전자, E-카드헤린 유전자, p53 도미넌트 네거티브 변이체 유전자, p53shRNA 유전자 등을 사용할 수 있다. 상기 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 발현 강도를 상승시킬 수 있는 유전자는 단독, 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

또, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자와, 이들 유전자 대신에 사용되는 유전자를 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 바람직한 실시양태이다.

예를 들어, 이미 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, c-MYC 유전자 또는 SOX2 유전자를 강하게 발현하고 있는 세포이면, POU5F1 유전자, KLF4 유전자, c-MYC 유전자 또는 SOX2 유전자를 사용하지 않고, p53 도미넌트 네거티브 변이체 유전자, p53shRNA 유전자 등을 조합하여 사용함으로써 본 발명의 유도간 간세포를 유도할 수도 있다.

상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 및 이들 유전자 대신에 사용되는 유전자의 유전자 산물인 단백질이나 mRNA 등을 상기 포유 동물의 세포 중에 도입하는 방법으로서는 유도 다능성 간세포의 유도 기술로서 공지된 방법 등을 들 수가 있지만, 이것에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들 유전자의 유전자 산물인 단백질이나 mRNA 등을 배지에 첨가해도 된다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 또한, 유도간 간세포로의 유도 효율을 높이기 위해서 유도 다능성 간세포를 유도하는 것으로 알려져 있는 화합물, 예를 들어, FGF receptor tyrosine kinase, MEK (mitogen activated protein kinase)/ERK (extracellular signal regulated kinases 1 and 2) 경로, GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 의 세 개의 저분자 저해제 [SU5402, PD184352 및 CHIR99021], MEK/ERK 경로 및 GSK3 의 두 개의 저분자 저해제 [PD0325901 및 CHIR99021], 히스톤메틸화 효소 G9a 의 저해제인 저분자 화합물 [BIX-01294 (BIX)], 아자시티딘, 트리코스타틴 A (TSA), 7-hydroxyflavone, lysergic acid ethylamide, kenpaullone, TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 (ALK5) 의 저해제 [EMD 616452], TGF-βreceptor 1 (TGFBR1) kinase 의 저해제 [E-616452 및 E-616451], Src-family kinase 의 저해제 [EI-275], thiazovivin, PD0325901, CHIR99021, SU5402, PD184352, SB431542, 항TGF-β 중화 항체, A-83-01, Nr5a2, p53 저해 화합물, p53 에 대한 siRNA, p53 경로의 저해제 등을 본 발명의 유도간 간세포를 유도할 때에 사용되는 배지 안에 첨가할 수 있다.

또, 유도간 간세포로의 유도 효율을 높이기 위해 또한, microRNA 를 사용하는 것도 가능하다. 구체적으로는, microRNA 를 상기 포유 동물의 세포에 발현 벡터를 사용하여 도입하거나, microRNA 를 배지에 첨가하거나 하는 등, 당업자가 통상 실시하는 방법을 사용할 수 있다.

유도간 간세포로의 유도 효율을 높이기 위해서 사용할 수 있는 microRNA 로서는 miR-154, miR-200, miR-368, miR-371, miR-291-3p, miR-294, miR-295, miR-302 등을 사용할 수 있다. 인간의 세포를 사용하는 경우에는 인간의 microRNA 를 사용해도 된다. 구체적으로는 hsa-miR-372 [MI0000780], hsa-miR-373 [MI0000781], hsa-miR-302b [MI0000772], hsa-miR-302c [MI0000773], hsa-miR-302a [MI0000738], hsa-miR-302d [MI0000774], hsa-miR-367 [MI0000775], hsa-miR-520 [MI0003158] 등을 들 수 있는데, 이들 microRNA 에 제한되지 않는다. 이들 microRNA 중에서 1 종, 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

이들 microRNA 의 정보에 대해서는 miRBase 의 홈페이지 (http://www.mirbase.org/) 로부터 입수하는 것이 가능하다. 괄호 내는 miRBase 의 액세션 번호이며, hsa- 는 인간을 나타낸다.

상기 포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 공정에 있어서는, 본 발명의 유도간 간세포를 배양하는 배지에 첨가되는 TGF-beta 등의 활성을 저해 또는 중화시키는 각각의 저해제 또는 항체, FGF1 ~ 21 등의 선유아 세포 증식 인자 등을 사용할 수도 있다. 선유아 세포 증식 인자로서는, 특히 FGF1, FGF2, FGF4, FGF7 이 바람직하게 사용된다. TGF-beta 의 저해제로서는, 예를 들어 TGF-beta 시그널링의 저해제로서는 ALK 저해제 (A-83-01 등), TGF-beta RI 저해제, TGF-beta RI 키나아제 저해제 등을 들 수 있다.

이들 성분은 상기 포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 공정에 있어서 사용되는 배지 중에 첨가하는 것이 바람직하다.

상기한 유도간 간세포에 유도하는 단계로서 바람직한 예로는, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 또는 이들 유전자 산물을 사용함과 함께, SOX2 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물에 대한 POU5F1 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물의 사용 비율이 1 보다 큰 것이 바람직하다. 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자 또는 이들 유전자 산물의 사용 비율이 POU5F1 유전자 〉 KLF4 유전자 〉SOX2 유전자의 관계를 만족하는 것이 바람직하고, 또한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자 또는 이들 유전자 산물의 사용 비율이 순차적으로 4 : 2 : 1 인 것이 유도간 간세포로의 고효율 유도의 관점에서 가장 바람직하다. POU5F1 (OCT3/4) 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 각 유전자기호에 대한 Genbank 접근 번호는 표 4 와 같다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자를 사용하는 경우에는 이들 유전자를 발현 벡터 등을 사용하여 상기 포유 동물의 세포 중에 도입하는 방법 등, 당업자가 통상 실시하는 방법을 사용할 수 있다. 유도간 간세포로의 유도에 필요한 상기 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 단백질이나 mRNA 등의 유전자 산물을 사용하는 경우에는 유도시에 사용하는 배지에 유전자 산물을 첨가하는 등, 당업자가 통상 실시하는 방법을 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자, 이들 유전자 산물에 더하여, 추가로, 상기한 본 발명의 유도간 간세포의 유도 효율을 올리기 위해서 상기한 NANOG 유전자, LIN28 유전자, TBX3 유전자, PRDM14 유전자, L-MYC 유전자, c-MYC 유전자, N-MYC 유전자, SALL1 유전자, SALL4 유전자, UTF1 유전자, ESRRB 유전자, NR5A2 유전자, REM2 GTPase 유전자, TCL-1A 유전자, Yes-associated protein (YAP) 유전자, E-카드헤린 유전자, p53 도미넌트 네거티브 변이체 유전자, p53shRNA 유전자 등의 유전자 또는 이들 유전자 산물, 화합물, FGF1 ~ 21 등의 선유아 세포 증식 인자, ALK 저해제 (A-83-01 등), TGF-beta RI 저해제, TGF-beta RI 키나아제 저해제 등을 사용할 수도 있다.

상기 포유 동물의 세포로부터 유도간 간세포를 제조하기 위해서, 상기 포유 동물의 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서는 공지된 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 바이러스 벡터, 플라스미드, 인공 염색체 (HAC), 에피솜 벡터 (EBV), 미니서클 벡터, 폴리시스트로닉 발현 벡터, Cre/loxP 시스템을 응용한 벡터, 파지인테그라아제를 사용한 벡터, 피기백 등의 트란스포존 등의 벡터 등을 사용할 수 있다.

상기 포유 동물의 세포에 유전자를 도입하기 위해서 사용 가능한 바이러스 벡터로서는 공지된 벡터이면 어느 것도 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 원숭이 면역 부전 바이러스 벡터 (디나벡 주식회사), 아데노 수반 바이러스 벡터 (디나벡 주식회사), 게놈에 외래 유전자가 잔존하지 않는 센다이 바이러스 벡터 (디나벡 주식회사, 주식회사 의학 생물학 연구소), 센다이 미니 벡터 (디나벡 주식회사), HVJ 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니마우스 백혈병 바이러스 유래 레트로바이러스 벡터 등이 있다.

바이러스 벡터 플라스미드로서는 공지된 바이러스 벡터 플라스미드이면 어느 것도 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 레트로바이러스계로서 pMXs, pMXs-IB, pMXs-puro, pMXs-neo (단, pMXs-IB 는 pMXs-puro 의 퓨로마이신 내성 유전자 대신에 블라스트사이딘 내성 유전자를 탑재한 벡터이다) [Toshio Kitamura et. al.," Retrovirus-mediated gene transfer andexpression cloning : Powerful tools in functional genomics" Experimental Hematology, 2003,31 (11) : 1007-14] 가 바람직하고, 그 밖에도, MFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737 (1995)], pBabePuro [Nucleic Acids Research, 18, 3587-3596 (1990)], LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG [Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)] 등을 들 수 있다. 또, 아데노바이러스계로서는 pAdex1 [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)] 등을 사용할 수 있다.

상기 포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 공정에 있어서 사용되는 배지로서는, 배성 간세포, 다능성 간세포 등을 배양 가능한 배지이면 특별히 제한되지 않지만, 배성 간세포, 다능성 간세포 등의 배양에 적합한 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 이와 같은 배지로서는 본 발명의 유도간 간세포를 배양하는 배지로서 예시한 ES 배지, MEF 순화 ES 배지, iPS 세포용 최적 배지, 피더 세포용 최적 배지, StemPro [등록상표] hESC SFM, mTeSR1, 애니멀 프로테인 프리의 인간 ES/iPS 세포 유지용 무혈청 배지 TeSR2 [ST-05860], 영장류 ES/iPS 세포용 배지, ReproStem, ReproFF 등을 들 수 있는데, 이들에 한정될 것은 없다. 인간의 세포를 사용하는 경우에는 인간 배성 간세포의 배양에 적절한 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

또, 유래 세포가 선유아 세포가 아닌 경우, 예를 들어, 위 또는 결장암 환자 유래의 세포와 같은 표피계 세포를 사용하는 경우에는 유전자 도입 후에 피더 세포와의 공배양을 실시하는 것이 바람직하다.

제 3 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 시험 방법이다. 본 발명의 시험 방법은 안전성 시험 방법, 독성 시험 방법, 대사 시험 방법, 약물 상호작용 시험 방법, 항바이러스 활성 시험 방법, 및 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 항체 의약 등의 의약품의 스크리닝 시험 방법으로서 바람직하다.

본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 약물 상호작용 시험 방법으로서는, 예를 들어 인종, 성, 연령, 유전적 배경 (다형 등) 이 상이한 도너로부터 인간 유도간 간세포를 제작하여 의약품의 후보 화합물과 함께 배양하고, 이들 세포에 있어서의 각종 시토크롬 P450 (CYP) 서브 패밀리 효소의 유전자의 발현을 DNA 마이크로 어레이 (쿠라보사 제조), 다기능 진 익스프레서 GenomeLabTM GeXP (벡크만쿨터사 제조) 등을 사용하여 조사함으로써, P450 (CYP) 서브 패밀리 효소와 의약품의 후보 화합물의 상호작용을 분명히 하는 시험 방법 등이 있다. 또, 시토크롬 P450 효소에 의해 대사된 후에 형광 산물을 생성하는 기질을 사용하는 방법에 의해서도 P450 (CYP) 서브 패밀리 효소와 의약품의 후보 화합물의 상호작용을 조사하는 것이 가능하다.

시토크롬 P450 효소는 광범위한 소수성의 화학 물질을 산화적으로 대사하는 중요한 촉매이며, 이 효소의 약물 대사는 약물 클리어런스, 독성, 활성화에 관련되므로, 약물 간의 유해한 상호작용에도 영향을 미치는 경우가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 저분자 치료약 등의 개발시에는 이 효소와 약물의 상호작용을 정밀 조사할 필요가 있다.

본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 항바이러스 활성 시험 방법으로서는, 예를 들어 본 발명의 유도간 간세포를 배양하고 있는 배양액에 간염 바이러스 A, B 또는 C 를 첨가하여 감염시키고, 항바이러스약의 의약품의 후보 화합물을 첨가함으로써 그 화합물의 약효를 평가하는 시험 방법 등을 들 수가 있다.

본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 고지혈증약의 스크리닝 시험 방법으로서는, 예를 들어 본 발명의 유도간 간세포를 배양한 플레이트에 고지혈증약의 후보 화합물을 첨가하여 배양한 후, 배양 상청에 분비되는 리포단백질이나 지질을 분석함으로써, 첨가한 고지혈증약의 후보 화합물의 약효를 평가하는 시험 방법 등을 들 수 있다.

배양액 상청에 분비되는 리포단백질 및 지질의 분석으로서는, 예를 들어 CM (카이로미크론), VLDL (초저비중 리포단백질), LDL (저비중 리포단백질), HDL (고비중 리포단백질) 등의 단백질이나, FC (프리 콜레스테롤), PL (인 지질), TC (총콜레스테롤) 등의 지질에 대해, 겔 여과 HPLC 법에 의해 분석하는 시험 방법 (LipoSEARCH ; 스카이라이트·바이오텍사) 등을 들 수 있다.

또, Usui S, Hara Y, Hosaki S, Okazaki M, "A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC", J. Lipid Res., 2002 ; 43 : 805-14. 및 Mitsuyo Okazaki, Shinichi Usui, Masato Ishigami, Naohiko Sakai, Tadashi Nakamura, Yuji Matsuzawa, Shizuya Yamashita, "Identification of Unique Lipoprotein Subclasses for Visceral Obesity by Component Analysis of Cholesterol Profile in High-Performance Liquid Chromatography", Arterioscler Thromb Vasc Biol. March 2005 에 기재되어 있는 방법에 의해서도 측정 가능하다.

제 4 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 창약 표적 스크리닝 방법이다.

제 5 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 동물 모델의 제작 방법이다.

제 6 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 간세포 산생 단백질의 생산 방법이다.

본 발명의 유도간 간세포는 간세포로서의 성질을 가지므로, 다양한 간세포에 특징적인 단백질을 산생할 수 있다. 그래서, 특정한 간세포에 특이적 단백질을 생산하는 본 발명의 유도간 간세포를 배양하여, 간세포에 특징적인 단백질을 생산하는 방법 등을 예시할 수 있다.

제 7 발명은 본 발명의 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 포유 동물을 대상으로 하는 치료 방법이다.

본 발명의 치료 방법에 있어서는 포유 동물의 세포로부터 유도한 본 발명의 유도간 간세포를 포유 동물의 간장에 이식하는 치료 방법이다. 예를 들어, 개의 세포로부터 유도한 본 발명의 유도간 간세포를 개의 간장에 이식할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

1. 판트로픽 레트로바이러스 벡터의 조제

POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 의 3 유전자의 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 Fugene HD (로슈사 제조 ; Cat no.4709691) 를 사용하여 판트로픽 레트로바이러스 벡터 조제용 패키징 세포인 Plat-GP 세포에 도입해서, 레트로바이러스 벡터액을 조제했다. 유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 순서대로 4 : 2 : 1 의 비율로 사용했다. 4 : 2 : 1 의 비율은 패키징 세포에 유전자를 도입할 때여도 되고, 또, 따로따로 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 의 3 유전자의 레트로바이러스 벡터액을 제작하여 4 : 2 : 1 의 비율로 혼합해도 된다. 자세한 것은 이하와 같다.

＜신생아 피부 조직 유래의 세포에 유전자 도입하는 레트로바이러스 벡터액의 조제＞

유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 addgene 의 벡터를 사용했다 (후기 표 5).

각 벡터의 양은 POU5F1-pMXs (addgene 제) 2 ㎍, KLF4-pMXs (addgene 제) 1 ㎍, SOX2-pMXs (addgene 제) 0.5 ㎍, Venus-pCS2 (Nagai T et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol 2002 ; 20 : 87-90.?) 0.5 ㎍, VSV-G-pCMV (Cell Biolab 제) 2 ㎍, FuGENE HD (롯슈제) 18 ㎕ 로 했다.

＜위암 환자 암조직 유래의 세포에 유전자 도입하는 레트로바이러스 벡터액의 조제＞

유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 구축한 벡터이다 (표 5).

각 벡터의 양은 POU5F1-pMXs 5 ㎍, KLF4-pMXs 2.5 ㎍, SOX2-pMXs 1.25 ㎍, Venus-pCS2 1.25 ㎍, VSV-G-pCMV 5 ㎍, GFP-pMXs (Cell Biolab 제) 1.25 ㎍, FuGENE HD 45 ㎕ 로 했다.

＜위암 환자 비암조직 유래의 세포에 유전자 도입하는 레트로바이러스 벡터액의 조제＞

유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 구축한 벡터이다 (표 5).

각 벡터의 양은 POU5F1-pMXs 5 ㎍, KLF4-pMXs 2.5 ㎍, SOX2-pMXs 1.25 ㎍, Venus-pCS2 1.25 ㎍, VSV-G-pCMV 5 ㎍, GFP-pMXs 1.25 ㎍, FuGENE HD 45 ㎕ 로 했다.

＜성인 피부 조직 유래의 세포에 유전자 도입하는 레트로바이러스 벡터액의 조제＞

유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 구축한 벡터이다 (표 5).

＜결장암 환자의 암조직 유래의 세포에 유전자 도입하는 레트로바이러스 벡터액의 조제＞

유전자 POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, SOX2-pMXs 는 구축한 벡터이다 (표 5).

레트로바이러스 벡터 플라스미드를 도입한 Plat-GP 세포를 48 시간 이상 배양한 후, 24 시간마다 3 회 상청을 회수하고, 스테리플립-HV 필터 유닛 : 0.45 ㎛ 직경의 필터 (밀리포어사 제조 ; Cat no.SE1M003M00) 로 여과를 실시했다. 이상의 순서에 의해 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 의 판트로픽 레트로바이러스 벡터액이 조제되었다. 판트로픽 레트로바이러스 벡터는 여러 세포에 유전자 도입하는 것이 가능한데, 인간 세포에도 높은 효율로 유전자 도입되었다.

실시예 2

2. 신생아 피부 조직 유래의 세포로부터 인간 유도간 간세포의 제작

출생 직후의 조직인 인간 신생아 피부 조직 유래의 세포 (상품명 : 신생아 정상 인간 피부 섬유아 세포 ; 초대 배양 ; Lot no.7F3956) 로부터 인간 유도간 간세포를 제작했다.

동결 보존된 인간 신생아 피부 조직 유래의 세포 (초대 배양 ; 론자사 제조 ; CC-2511 ; Lot no.7F3956) 1 개를 37 ℃ 의 항온조 중에서 해동하여, 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지에 현탁시켜 10 ㎖ 의 세포 현탁액을 얻었다.

이어서, 얻어진 세포 현탁액을 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리하고, 상청을 제거한 후, 선유아 세포 배지 키트-2 (2 ％ FBS) (이하, 등록상표 FGM-2 BulletKit 라고 한다) (론자사 제조 ; Cat no.CC-3132) 12 ㎖ 에 현탁하여 세포 현탁액을 얻었다. 20 ㎍/㎠ 의 농도의 마트리겔 (벡턴디킨슨사 제조 ; Cat no.356230) 로 저면이 30 분 이상 코팅된 6 웰 플라스틱 샬레 (눈크사 제조 ; Cat no.140675) 상에, 얻어진 세포 현탁액을 2 ㎖ 씩 첨가하여 세포를 파종했다.

3 일 후에 배지를 제거하고, 1 웰당 2 ㎖ 의 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여, 37 ℃ 에서 24 시간 감염시켰다. 바이러스 상청을 제거하고, FGM-2 BulletKit 를 2 ㎖ 씩 첨가하여 37 ℃ 에서 하루 배양했다. 그 후, 2 일마다 MEF 순화 ES 배지의 교환을 계속하고, 3 유전자 도입으로부터 12, 14, 17 일 후에 ES 배지로 배지 교환을 실시했다. 사용한 MEF 순화 ES 배지 및 ES 배지의 조성은 하기와 같다.

＜MEF 순화 ES 배지>

MEF

마이토마이신 C 처리 초대 마우스 배성 섬유아 세포 [DS 파머 바이오메디칼 사 제조] Cat no.R-PMEF-CF

순화 ES 배지

녹아웃 D-MEM (인비트로젠사 제조 ; Cat no.10829-018) 500 ㎖

20 ％ 녹아웃 혈청 리플레이스먼트 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.10828-028)

50 ㎍/㎖ 겐타마이신 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15750-060)

1X MEM 비필수 아미노산액 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11140-050)

10 ng/㎖ bFGF (프로텍사 제조 ; Cat no.100-18B)

0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (시그마 알드리치사 제조 ; Cat no.M7154)

＜ES 배지＞

녹아웃 D-MEM (인비트로젠사 제조 ; Cat no.10829-018) 500 ㎖

50 ㎍/㎖ 겐타마이신 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15750-060)

1X MEM 비필수 아미노산액 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11140-050)

10 ng/㎖ bFGF (프로텍사 제조 ; Cat no.100-18B)

103 U/㎖ 재조합 인간 LIF (와코우 순약사 제조 ; Cat no.129-05601)

0.5 μM ALK5 저해제 (A-83-01) (시그마 알드리치사 제조 ;Cat no.A5480)

0.5 μM PD0325901 (엑슨 메드켐사 제조 ;Cat no.1408)

3 μM CHIR99021 (엑슨 메드켐사 제조 ; Cat no.1386)

2 mM GlutaMAX 또는 2 mM L-글루타민

유전자 도입으로부터 18 일 후부터 피더 프리용 인간 ES/iPS 세포용 배지 mTeSR1 (스템 셀 테크놀로지사 제조 ; Cat no.05850) 로 매일 배지 교환을 실시했다. 유전자 도입으로부터 30 일 후에 콜로니를 1 클론 (NFB1-3) 핀셋으로 픽업하여, 피더 세포 상으로 옮겼다. 또한, 피더 세포는 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 이고, 유도간 간세포의 픽업 전날에 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 가 되도록 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 (이와키사 제조 ; Cat no.11-020-012) 에 파종했다.

하기에 신생아 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포의 계대 (p) 와 RNA 회수용 키트의 버퍼 (Buffer) 에 용해한 날 (day) 을 나타냈다.

＜신생아 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포＞

NFB1 -3

day 52 : 24 well (p1) → 6 well (p2)

day 55 : 6 well (p2) → 10 ㎝ (p3)

day 61 : passage (p4)

day 62 : Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해액) 처리 (p5)

실시예 3

3. 위암 환자의 암조직 유래의 세포로부터 인간 유도간 간세포의 제작

인간 위암 (진행 암) 환자의 암 조직으로부터 세포를 단리했다. 얻어진 세포에 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 유전자 도입함으로써, 인간 유도간 간세포를 제작했다. 자세한 것은 이하와 같다.

수술시에 얻어진 위암 (진행 암 : 남성, 67 세, 일본인) 신선 조직의 일부를 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.14175-095) 으로 세정하고, 전도를 사용하여 약 1 ㎟ 로 세단했다. 또한, 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) 으로 상청이 투명하게 될 때까지 세정하고, 상청을 제거하여, 조직 침전에 대해 5 ㎖ 0.1 ％ 콜라게나제 (와코우 순약사 제조 ; Cat no.034-10533)/1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 를 첨가하여 진탕기를 사용해서 37 ℃ 에서 60 분간 교반했다.

조직 침전이 충분히 소화된 것을 확인한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지를 35 ㎖ 첨가하여 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리했다. 이어서, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지를 40 ㎖ 첨가하여 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 재차 원심분리했다. 이어서, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 10 ㎖ 첨가하여 콜라겐 코트 디시 60 mm (이와키사 제조 ; Cat no.11-018-004) 에 파종했다.

24 시간 후에 배지를 제거하고, 5 ㎖ 의 3 유전자의 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 37 ℃ 에서 1 일간 감염시켰다. 바이러스 상청을 제거하고, 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 5.0×10⁴ cell/㎠ 를 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지 5 ㎖ 에 현탁한 후, 위암 환자의 암조직 유래의 유전자 도입 세포를 배양한 콜라겐 코트 디시 60 mm (이와키사 제조 ; Cat no.11-018-004) 에 파종하고, 공배양했다.

그 후, 3 일마다 MEF 순화 ES 배지의 교환을 계속하고, 유전자 도입으로부터 15 일 후부터 피더 프리용 인간 ES/iPS 세포용 배지 mTeSR1 (스템 셀 테크놀로지사 제조, Cat no.05850) 로 매일 배지 교환을 실시했다.

3 유전자 도입으로부터 25 일 후에 유도간 간세포의 콜로니를 1 클론 (GC1-2), 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 중의 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 상에 픽업했다. 또한, 피더 세포는 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 이고, 유도간 간세포의 픽업 전날에 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 가 되도록 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 (이와키사 제조, Cat no.11-020-012) 에 파종했다.

하기에 위암 환자의 암조직 유래 인간 유도간 간세포의 계대 (p) 와 RNA 회수용 키트의 버퍼 (Buffer) 에 용해한 날 (day) 을 나타냈다.

＜위암 환자의 암조직 유래 인간 유도간 간세포＞

GC1-2

day 37 : 24 well (p1) → 6 well (p2)

day 43 : 6 well (p2) → 10 ㎝ (p3)

day 56 : passage (p4)

day 57 : passage and stock (p5)

day 60 : Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해액) 처리

실시예 4

4. 위암 환자 비암조직 유래의 세포로부터 인간 유도간 간세포의 제작

위암 환자 비암조직 유래의 세포에 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 유전자를 도입함으로써, 인간 유도간 간세포를 제작했다. 자세한 것은 이하와 같다.

수술시에 얻어진 위암 (진행 암 : 남성, 67 세, 일본인) 환자의 비암 신선 조직의 일부를 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.14175-095) 으로 세정하고, 전도를 사용하여 약 1 ㎟ 로 세단했다. 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) 으로 상청이 투명하게 될 때까지 세정한 후, 상청을 제거하고, 조직 침전에 대해 5 ㎖ 0.1 ％ 콜라게나제 (와코우 순약사 제조 ; Cat no.034-10533)/1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 를 첨가하여 진탕기를 사용해서 37 ℃ 에서 60 분간 교반했다.

조직 침전이 충분히 소화된 것을 확인한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지를 35 ㎖ 첨가하여, 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리했다. 이어서, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 40 ㎖ 첨가하여, 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 재차 원심분리했다. 또한, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지를 10 ㎖ 첨가하여 콜라겐 코트 디시 60 mm (이와키사 제조 ; Cat no.11-018-004) 에 파종했다.

약 24 시간 후, 배지를 제거하고, 5 ㎖ 의 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 레트로바이러스 벡터를 첨가하여 37 ℃ 에서 약 24 시간 감염시켰다. 바이러스 상청을 제거하고, 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조；Cat no.R-PMEF-CF) 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 를 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조, Cat no.15240-062) 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지 5 ㎖ 에 현탁시킨 후, 위암 환자 비암조직 유래의 유전자 도입된 세포가 배양된 콜라겐 코트 디시 60 mm 에 파종하여 공배양했다.

그 이후, 3 일마다 MEF 순화 ES 배지의 교환을 계속하고, 3 유전자 도입으로부터 31 일 후, mTeSR1 로 매일 배지 교환을 실시했다. 유전자 도입으로부터 46 일 후에 콜로니의 1 클론 (NGC1-2) 을 픽업하여, 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 중의 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 상에 계대 배양했다. 또한, 피더 세포는 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 이고, 유도간 간세포의 픽업 전날에 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 가 되도록 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 (이와키사 제조 ; Cat no.11-020-012) 에 파종했다.

하기에 위암 환자 비암조직 유래의 인간 유도간 간세포의 계대 (p) 와 RNA 회수용 키트의 버퍼 (Buffer) 에 용해한 날 (day) 을 나타냈다.

＜위암 환자 비암조직 유래의 인간 유도간 간세포＞

NGC1 -2

day 52 : 24 well (p1) → 6 well (p2)

day 58 : 6 well (p2) → 10 ㎝ (p3)

day 65 : passage, stock and Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해액) 처리 (p4)

실시예 5

5. 결장암 환자의 암조직 유래의 세포로부터 인간 유도간 간세포의 제작

인간 결장암 (S 자 결장암) 환자의 암 신선 조직 유래의 세포에 3 유전자 (POU5F1, KLF4, SOX2 의 비율이 순서대로 4 : 2 : 1) 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 유전자 도입함으로써, 인간 유도간 간세포를 제작했다. 자세한 것은 이하와 같다.

수술시에 얻어진 결장암 (S 상 결장암 : 남성, 55 세, 일본인) 의 일부를 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.14175-095) 으로 세정하고, 전도를 사용하여 약 1 ㎟ 로 세단했다. 행크스 평형 염액 (페놀레드를 함유하지 않는다) 으로 상청이 투명하게 될 때까지 세정했다. 이어서, 상청을 제거하고, 조직 침전에 대해 5 ㎖ 0.01 ％ 콜라게나제 (와코우 순약사 제조 ; Cat no.034-10533)/1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 를 첨가하여 진탕기를 사용해서 37 ℃ 에서 60 분간 교반했다.

조직 침전이 충분히 소화된 것을 확인한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조, Cat no.11965-092) 배지를 35 ㎖ 첨가하여 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리했다. 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 40 ㎖ 첨가하여 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 재차 원심분리했다. 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) 배지를 10 ㎖ 첨가하고, 콜라겐 코트 디시 100 mm (이와키사 제조, Cat no.11-018-006) 에 파종했다.

약 24 시간 후에 배지를 제거하고, 10 ㎖ 의 3 유전자의 레트로바이러스 벡터액을 첨가하며, 그 5 시간 후, 5 ㎖ 의 Luc-IRES-GFP 의 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 37 ℃ 에서 약 24 시간 감염시켰다. 바이러스 상청을 제거하고, 마이토마이신 처리를 실시한 MEF (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 를 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조, Cat no.15240-062) 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조, Cat no.11965-092) 배지 10 ㎖ 에 현탁시킨 후, 결장암 환자의 암조직 유래의 유전자 도입 세포가 배양된 콜라겐 코트 디시 60 mm 에 파종하여 공배양했다.

그 후, 3 일마다 MEF 순화 ES 배지의 교환을 계속하고, 유전자 도입 22 일 후부터 mTeSR1 로 매일 배지 교환을 실시했다. 유전자 도입으로부터 31 일 후에 콜로니의 1 클론 (CC1-4) 을 픽업하여, 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 중의 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 에 계대 배양했다. 또한, 피더 세포는 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 이고, 유도간 간세포의 픽업 전날에 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 가 되도록 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 (이와키사 제조 ; Cat no.11-020-012) 에 파종했다.

하기에 결장암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포의 계대 (p) 와 RNA 회수용 키트의 버퍼 (Buffer) 에 용해한 날 (day) 을 나타냈다

＜결장암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포＞

CC1 -4

day 40 : 6 well (p2) → 6 well (p2)

day 45 : 6 well (p2) → 10 ㎝ (p3)

day 51 : passage and stock (p4)

day 54 : passage and stock (p5)

day 59 : passage and stock (p5)

day 63 : Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해액) 처리 (p5)

실시예 6

6. 성인 피부 조직 유래의 세포로부터 인간 유도간 간세포의 제작

성인 피부 조직 유래의 세포 (상품명 : 성인 정상 인간 피부 섬유아 세포 ; 초대 배양 ; 론자사 제조 ; Lot no.76582) 로부터 인간 유도간 간세포를 제작했다.

동결 보존된 성인 정상 인간 피부 섬유아 세포 (초대 배양 ; 론자사 제조 ; Lot no.76582) 1 개를 37 ℃ 의 항온조 중에서 해동하여, 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 및 FBS 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지에 현탁시켜, 10 ㎖ 의 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리하여 상청을 제거한 후, FGM-2 BulletKit 20 ㎖ 에 현탁시켰다. 20 ㎍/㎠ 의 농도의 마트리겔 (벡턴디킨슨사 제조) 로 저면을 30 분 이상 코팅한 디시 100 mm (눈크사 제조 ; Cat no.172958) 상에, 그 세포 현탁액을 10 ㎖ 씩 첨가하여 세포를 파종했다.

약 24 시간 후에 배지를 제거하고, 10 ㎖ 의 3 유전자의 레트로바이러스 벡터액을 첨가하여 37 ℃ 에서 24 시간 감염시켰다. 바이러스 상청을 제거하고, MEF 순화 ES 배지 10 ㎖ 를 첨가했다. 그 후, 3 일마다 MEF 순화 ES 배지의 교환을 계속하고, 유전자 도입 18 일 후부터 mTeSR1 (스템 셀 테크놀로지사 제조) 로 매일 배지 교환을 실시했다. 유전자 도입 28 일 후부터 6 일간, MEF 순화 ES 배지로 매일 배지 교환을 실시했다. 또한, 유전자 도입 34 일 후부터 mTeSR1 로 매일 배지 교환을 실시했다. 유전자 도입 39 일 후에 콜로니를 1 클론 (AFB1-1), 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 중의 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 에 픽업했다. 또한, 피더 세포는 마이토마이신 처리를 실시한 마우스 배성 섬유아 세포 (DS 파머 바이오메디칼사 제조 ; Cat no.R-PMEF-CF) 이고, 유도간 간세포의 픽업 전날에 5.0 × 10⁴ cell/㎠ 가 되도록 젤라틴 코트 24 웰 플레이트 (이와키사 제조 ; Cat no.11-020-012) 에 파종했다.

하기에 성인 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포의 계대 (p) 와 RNA 회수용 키트의 버퍼 (Buffer) 에 용해한 날 (day) 을 나타냈다.

＜성인 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포＞

AFB1 -1

day 50 : 24 well (p1) → 6 well (p2)

day 54 : 6 well (p2) → 10 ㎝ (p3)

day 59 : passage (p4)

day 63 : passage (p5)

day 67 : passage and stock and Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해 액) 처리 (p5)

상기한 실시예 2 ~ 6 에서 실시된 계대 배양은 이하와 같다.

세포로부터 배지를 제거하고 PBS (-) 로 세정한 후, 세포 박리액을 첨가했다. 37 ℃ 에서 5 분간 정치시킨 후, 세포 박리액을 제거하고, 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 및 FBS (인비트로젠사 제조 ; Cat no.26140-079) 를 10 ％ 함유하는 D-MEM (고글루코오스) (인비트로젠사 제조 ; Cat no.11965-092) 배지를 20 ㎖ 첨가하여 1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분간 원심분리했다. 이어서, 상청을 제거한 후, 1X 항생 물질-항진균제 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15240-062) 및 mTeSR, 10 μM Y-27632 를 첨가하여 MEF 1.0 × 106 cells/dish 가 파종되어 있는 젤라틴 코트 100 mm 에 세포 현탁액을 파종했다.

계대 배양시의 세포 박리액으로서는 이하의 2 종류를 사용한다.

(1) 0.25 ％ 트립신 - 1 mM EDTA 용액 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.25200-056)

(2) 10 mg/㎖ 콜라게네스 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.17104-019) 10 ㎖,

100 mM 염화칼슘 용액 1 ㎖,

PBS 59 ㎖,

2.5 ％ 트립신 용액 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.15090-046) 10 ㎖,

녹아웃 혈청 리플레이스먼트 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.10828-028) 20 ㎖

실시예 7

7. 인간 유도 다능성 간세포와 인간 유도간 간세포의 장기 배양

인간 유도간 간세포 (AFB1-1, NGC1-2) 를 반년 이상의 장기에 걸쳐 계대 배양을 실시했다. 배지는 mTeSR1 (스템 셀 테크놀로지·베리타스사 제조), bFGF 첨가 영장류 ES/iPS 세포용 배지 (리프로셀사), 또는 bFGF 첨가 ReproStem (리프로셀사) 등을 사용한다. MEF 사용시에는 콜라겐 또는 젤라틴 코트의 배양 접시를 사용한다. MEF 비사용시에는 마트리겔 코트한 배양 접시를 사용한다. 그 결과, 0.05 ~ 0.5 μM A-83-01 (TGF-β 시그널 저해제, TGF-β type I receptor ALK5 kinase, type I activin/nodal receptor ALK4 and ALK7 저해제) 의 첨가는 인간 유도간 간세포의 자기 복제에 유용하며, 증식 속도, 형태도 매우 양호했다.

실시예 8

8. 마이크로 어레이에 의한 간세포 마커 유전자와 배성 간세포 마커 유전자의 정량 해석

애질런트사 제조 Whole Human Genome 올리고 DNA 마이크로 어레이 (4 X 44K) 에 의해, 게놈 와이드인 유전자 발현 (mRNA 의 트랜스크립톰) 을 해석했다.

＜시료＞

실시예 2 ~ 6 의 인간 유도간 간세포 (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4) 의 total RNA 와 게놈 DNA 를, 실시예 2 ~ 6 에 있어서 사전에 Buffer RLT (RNA 정제 전의 세포의 용해액) 로 처리한 용액으로부터 AllPrep DNA/RNA Mini Kit (50) (퀴아젠사 제조 ; Cat no.80204) 를 사용하여 추출했다.

시료로서 인간 유도간 간세포 (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4) 의 total RNA 를 사용했다.

＜실험 방법＞

(1) 퀄리티 체크

RNA 용 LabChip (애질런트사 제조의 등록상표) 키트를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer (애질런트사 제조) 로 total RNA 의 품질 체크를 실시한 결과, 모든 RNA 샘플의 퀄리티는 양호했다. 또, NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies) 으로 RNA 농도 및 RNA 의 순도 평가를 실시한 결과, 어느 쪽의 샘플에 있어서도 cRNA 합성에 필요한 total RNA 량이 있는 것이 확인되어, 순도도 높은 것이 확인되었다.

(2) cRNA 의 합성

각 샘플의 total RNA (500 ng) 로부터 Quick Amp Labeling kit (애질런트사 제조) 를 사용하여 애질런트사의 프로토콜에 따라, 2 개 사슬 cRNA 를 합성했다. 제작한 cDNA 로부터 in vitro transcription 에 의해 cRNA 를 합성했다. 이때, Cyanine 색소로 표지된 CTP (Cyanine 3-CTP) 를 취입하여 형광 표지를 실시했다.

(3) 하이브리다이제이션

Gene Expression Hybridization Kit (애질런트사 제조) 를 사용하여 하이브리다이제이션 표지 cRNA 를 하이브리다이제이션 버퍼에 부가하여, 애질런트제 Whole Human Genome 올리고 DNA 마이크로 어레이 (4 X 44K) 상에서 17 시간 하이브리다이즈하고, 세정 후, 애질런트 마이크로 어레이 스캐너로 DNA 마이크로 어레이의 이미지를 판독하여, Feature Extraction Software (v.9.5.3.1) 를 사용해서 각 스포트의 형광 시그널을 수치화했다.

＜유전자의 정량 해석 결과＞

발현의 유무는 전체의 유전자 발현의 분포 (각 프로브의 형광치의 분포) 의 중앙치를 0 으로 해서 평가했다. 0 을 초과한 발현치를 나타낸 프로브를 유전자 발현을 검출한 프로브로 하고, 유전자 발현을 있음으로 해서 발현 프로브의 수로 나타냈다.

또한, 해석 소프트웨어로서는 GeneSpring GX 10.0 (애질런트·테크놀로지 주식회사) 을 사용하고, 노멀라이제이션은 50th percentile 로 실시했다. 비교한 인간 배성 간세포 (hES_ES01) 의 마이크로 어레이 데이터는 GEO 로부터 다운로드하여 사용했다.

1. 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 유전자

하기 표 6 에 본 발명의 인간 유도간 간세포에 있어서 발현하고 있는 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 유전자를 나타낸다. 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 애질런트사 제조 Whole Human Genome 올리고 DNA 마이크로 어레이 (4 X 44K) 의 발현 프로브 156 (144 유전자) 중, 인간 유도간 간세포가 발현하고 있던 발현 프로브수와 각각의 표에 프로브명 (Probe name), 유전자기호 (GeneSymbol), 유전자은행 접근번호 (Genebank Accession No) 를 기재했다.

하기 표 7 에 실시예 3 에서 유도한 위암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포 (GC1-2) 에서 발현하고 있는 유전자 표를 나타냈다.

위암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포 : GC1-2

간세포에서 특징적인 발현 프로브수는 138 이었다.

하기 표 8 에 실시예 6 에서 유도한 성인 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포 (AFB1-1) 에서 발현하고 있는 유전자를 나타냈다.

성인 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포 : AFB1-1

간세포에서 특징적인 발현 프로브수는 133 이었다.

하기 표 9 에 실시예 4 에서 유도한 위암 환자 비암조직 유래의 인간 유도간 간세포 (NGC1-2) 에서 발현하고 있는 유전자를 나타냈다.

위암 환자 비암조직 유래의 인간 유도간 간세포 : NGC1-2

간세포에서 특징적인 발현 프로브수는 131 이었다.

하기 표 10 에 실시예 2 에서 유도한 신생아 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포 (NFB1-3) 에서 발현하고 있는 유전자를 나타냈다.

신생아 피부 조직 유래의 인간 유도간 간세포 : NFB1-3

간세포에서 특징적인 발현 프로브수는 96 이었다.

하기 표 11 에 실시예 5 에서 유도한 결장암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포 (CC1-4) 가 발현하고 있는 유전자를 나타냈다.

결장암 환자 암조직 유래의 인간 유도간 간세포 : CC1-4

간세포에서 특징적인 발현 프로브수는 92 였다.

2. 인간 배성 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 유전자

인간 배성 간세포에서 특징적으로 발현하고 있는 애질런트사 제조 Whole Human Genome 올리고 DNA 마이크로 어레이 (4 X 44K) 의 발현 프로브수 31 (23 의 유전자 ; 표 12) 중, 31 의 프로브수가 실시예 2 ~ 6 의 인간 유도간 간세포에서 인간 배성 간세포와 거의 동일한 정도 (1/4 ~ 4 배 이내) 로 발현하고 있었다. 인간 배성 간세포와 그 유전자의 프로브명 (Probe name), 유전자기호 (GeneSymbol), 유전자은행 접근번호 (Genebank Accession No) 를 기재했다.

이상의 결과로부터, 인간 유도간 간세포는 간세포의 성질인 간세포의 마커 유전자가 발현하고 있을 뿐만 아니라, 배성 간세포에 특징적인 유전자가 인간 배성 간세포와 동등하게 발현하고 있는 것이 실험적으로 검증되었다.

마이크로 어레이의 결과를 더 해석하면, 본 발명의 유도간 간세포는 중내배엽계 간세포 및 내배엽계 간세포에 특징적인 성질을 갖고 있었다. 상세하게는, 중내배엽계 간세포 및 내배엽계 간세포에서 특징적으로 발현하는 유전자인 SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자, TCF2 유전자 모두를 발현하고 있었다. 실시예 2 ~ 6 의 인간 유도간 간세포 (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4) 중, 간세포에 특징적인 유전자가 비교적 적고, 저발현의 인간 유도간 간세포 (NFB1-3, CC1-4) 는, SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자, TCF2 유전자가 다른 인간 유도간 간세포 (GC1-2, NGC1-2, AFB1-1) 보다 고발현하고 있었다.

상기한 바와 같이, 위암 환자 유래 비암조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포 (NGC1-2), 및 성인 피부 조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포 (AFB1-1) 는 간세포의 마커 유전자인 알파-페토프로테인 (AFP), 트렌스티레틴 (TTR), 알부민 (ALB) 및 알파 1 - 앤트립신 (AAT) 을 발현하고, 배성 간세포에 특징적인 유전자인 POU5F1 유전자, SOX2 유전자, NANOG 유전자, ZFP42 유전자를 인간 배성 간세포와 동등하게 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, AAT 는 SERPINA1, 트렌스티레틴은 프레알부민, ZFP42 는 REX1 로도 표기되는 경우도 있다.

실시예 9

9. 면역 형광 염색에 의한 간세포 마커와 배성 간세포 마커의 정량 검출

실시예 4 에서 유도한 위암 환자 유래 비암조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포 (NGC1-2) 와, 실시예 6 에서 유도한 성인 피부 조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포 (AFB1-1) 를 Lab-Tek (등록상표) Chamber Slide (등록상표) System (Nunc 사 제조, Cat no.177429) 에 파종했다. 다음날, 배지를 제거하고, PBS (-) 로 2 회 세정한 후, 10 ％ 포르말린 용액을 첨가하여 실온에서 15 분 정치시켰다. 이어서, 10 ％ 포르말린 용액을 제거하고, PBS (-) 로 3 회 세정한 후, 0.1 ％ Triton-X100 (ICN Biomedical 사 제조) 을 첨가하여 실온에서 15 분 정치시켰다. 이어서, 0.1 ％ Triton-X100 용액을 제거하고 PBS (-) 로 3 회 세정한 후, 블로킹 용액 (TBS 계 ; pH7.2) (나카라이 테스크사 제조 ; Cat no.05151-35) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 정치시켰다. 50 배 희석한 1 차 항체를 4 ℃ 하룻밤 혹은 실온에서 1 시간 반응시켰다. 그 후, PBS (-) 로 2 회 세정한 후, 500 배 희석한 2 차 항체를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 사용한 1 차 항체 및 2 차 항체는 하기와 같다.

＜1 차 항체＞

염소 항 인간 NANOG 항체 (R＆D 시스템사 제조 ; Lot no.KKJ03), 마우스 항 인간 SSEA-4 항체 (밀리포어사 제조 ; Lot no.LV1488380), 마우스 항 인간 CD9 항체 (R＆D 시스템사 제조 ; Lot no.JOK04), 토끼 항 인간 α-1-Fetoprotein 항체 (다코사 제조 ; Lot no.A0008), 마우스 항 인간 Albumin 항체 (시그마 알드리치사 제조 ; Lot no.A6684)

＜2 차 항체＞

당나귀 항 염소 lgG 항체 Alexa Fluor594 표지 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.A11058), 염소 항 마우스 lgG 항체 Alexa Fluor488 표지 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.A11001), 염소 항 마우스 lgG 항체 Alexa Fluor594 표지 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.A11005), 당나귀 항 토끼 lgG 항체 Alexa Fluor488 표지 (인비트로젠사 제조 ; Cat no.A21206)

염색한 후, 형광 현미경으로 관찰한 결과, 위암 환자 유래 비암조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포와 성인 피부 조직으로부터 제작한 인간 유도간 간세포는, 간세포의 성질인 알파-페토프로테인 (AFP), 알부민 (ALB) 단백질을 산생하여, 배성 간세포에 특징적인 당지질, NANOG, SSEA-4, CD9 가 발현되는 세포였다 (도면 생략).

실시예 10

10. CD81 유전자, SCARB1 유전자, OCLN 유전자 및 CLDN1 유전자의 공발현

애질런트사 제조 Whole Human Genome 올리고 DNA 마이크로 어레이 (4 X 44K) 를 사용하여 C 형 간염 바이러스 (HCV) 의 복제에 중요한 유전자인 CD81 유전자, SCARB1 유전자, OCLN 유전자 및 CLDN1 유전자를 해석했다. 해석 소프트는 GeneSpring GX 10.0 을 사용하고, 노멀라이제이션은 50th percentile 로 실시했다. 실험 수법은 실시예 8 과 동일하다.

＜유전자의 정량 해석 결과＞

3 종류의 인간 배성 간세포, hES_H9 (GSM194390), hES_BG03 (GSM194391) 및 hES_ES01 (GSM194392) 과, 유도 다능성 간세포, iPS cells 201B7 (GSM241846) 의 마이크로 어레이 데이터는 GEO 로부터 다운로드하여 사용했다.

인간 유도간 간세포는 C 형 간염 바이러스 (HCV) 의 복제에 중요한 유전자인 CD81 유전자, SCARB1 유전자, OCLN 유전자 및 CLDN1 유전자가 공발현하고 있는 것이 확인되어, 실험적으로 검증되었다. 따라서, 본 발명의 유도간 간세포에 간염 바이러스 C 를 감염시켜, 복제시키면서, 항바이러스약의 후보 화합물을 첨가함으로써, 그 화합물의 약효를 평가하는 시험이 가능하다는 것이 시사되었다. 게다가 인간 배성 간세포, 및 인간 유도 다능성 간세포에 대해서도 동일한 용도가 시사되었다.

본 발명의 유도간 간세포의 유도에 있어서는, 상기 포유 동물의 세포를 SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록, 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 유전자 산물이 존재하는 상태로 둘 필요가 있다. 본 발명에 있어서는 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 POU5F1 유전자 〉KLF4 유전자 〉SOX2 유전자의 관계를 만족하는 것이 바람직하고, 또한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 순차적으로 4 : 2 : 1 인 것이 유도간 간세포로의 고효율 유도의 관점에서 가장 바람직하다.

또, 본 발명에 있어서는 추가로, 배성 간세포에 특징적으로 발현하는 NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자, SALL4 유전자, LIN28 유전자 및 TERT 유전자 등은 여러 생체 중의 세포를 생체 외에서 자기 복제시키는 「자기 복제 유전자」로서 기능한다.

본 발명의 유도간 간세포의 유도에 있어서의 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율은 분화를 결정 짓는 중요한 요인의 하나로 생각되며, 다능성 간세포의 제작에 있어서는 POU5F1 유전자, KLF4 유전자, 및 SOX2 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 1 : 1 : 1 이고, 미분화 세포인 것이 판명되었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 인종, 성, 연령, 유전적 배경 (다형 등) 이 상이한 도너로부터 인간 유도간 간세포를 제작하는 것이 가능해지므로, 임상 시험에 있어서 여러 환자에게 투여되는 의약품 후보 등의 효과, 안전성, 독성, 약물 상호작용의 평가에 앞서 비임상 시험에서 그 평가, 예측을 할 수 있으므로, 본 발명의 인간 유도간 간세포가 신약 개발의 효율화, 환자의 부담 경감에 기여하는 창약 툴이 되므로 산업상 매우 유용하다.

본 발명의 유도간 간세포는 간장의 형성과 기능을 제어하는 분자의 탐색 및 해석, 예를 들어, 간섬유화, 간경변, 지방간염, 메타볼릭신드롬, 조혈 등에 있어서의 창약, 그리고 각종 의약품·화합물의 대사, 작용 기구의 해석, 백신 제작, 바이오리엑터에 대한 응용 등에 매우 유용하다.

Claims

적어도 하기 (1) ~ (3) 의 요건을 구비하는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포 ;
(1) 배성 간세포의 마커 유전자인 하기 표 1 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 15 종의 유전자를 발현하고,
[표 1]

(2) 간세포로서의 성질을 갖고 있음과 함께,
(3) 3 일 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능하다.
제 1 항에 있어서,
상기 유도간 간세포에서 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현량이, 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 1/8 ~ 8 배인 유도간 간세포.
제 2 항에 있어서,
상기 유도간 간세포에서 발현하고 있는 상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자의 발현량이, 배성 간세포에서 발현하고 있는 유전자의 발현량과 비교하여 1/4 ~ 4 배인 유도간 간세포.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (1) 배성 간세포의 마커 유전자로서, NANOG 유전자, POU5F1 유전자, SOX2 유전자, ZFP42 유전자 및 SALL4 유전자가 발현되고 있는 것을 특징으로 하는 유도간 간세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서, 하기 표 2 의 유전자군 에서 선택되는 15 종 이상이 발현되고 있는 유도간 간세포.
[표 2]
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (2) 간세포로서의 성질에 관련하는 유전자로서, AFP 유전자, TTR 유전자, TF 유전자, APOA2 유전자, APOA4 유전자, AHSG 유전자, FGA 유전자, AGT 유전자, FABP1 유전자, SERPINA1 유전자 및 RBP4 유전자가 발현되고 있는 유도간 간세포.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로, 중내배엽계 간세포 및/또는 내배엽계 간세포에 특징적인 SOX17 유전자, FOXA2 유전자, GSC 유전자, EOMES 유전자, TCF2 유전자로부터 선택되는 적어도 1 종의 유전자를 발현하고 있는 유도간 간세포.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로, 피검 물질에 의해, 하기 표 3 의 유전자군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자에 대해, 그 발현이 억제 또는 유도되거나, 혹은 그 유전자의 유전자 산물의 활성이 촉진 또는 저해되는 유도간 간세포.
[표 3]
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
1 개월 이상 증식 배양 또는 계대 배양 가능한 유도간 간세포.
포유 동물의 세포를 유도간 간세포에 유도하는 단계를 포함하는 유도간 간세포의 제조 방법으로서, 그 단계가, 상기 포유 동물의 세포를 SOX2 유전자의 유전자 산물에 대해 POU5F1 유전자의 유전자 산물의 세포 내 존재 비율이 커지도록, 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 유전자 산물이 존재하는 상태로 두는 단계인 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 유도간 간세포의 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 단계가, 상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자 또는 이들 유전자 산물을 사용함과 함께, SOX2 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물에 대한 POU5F1 유전자 또는 그 유전자의 유전자 산물의 사용 비율이 1 보다 큰 단계인 것을 특징으로 하는 유도간 간세포의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 사용 비율이 POU5F1 유전자 〉KLF4 유전자 〉SOX2 유전자의 관계를 만족하는 유도간 간세포의 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
상기의 유도간 간세포로의 유도에 필요한 POU5F1 유전자, KLF4 유전자 및 SOX2 유전자의 사용 비율이 4 : 2 : 1 인 유도간 간세포의 제조 방법.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유 동물의 세포가 성체 유래의 세포, 신생자 유래의 세포, 신생자 피부 유래의 세포, 발암 개체의 세포, 배성 간세포, 유도 다능성 간세포, 또는 배성 간세포 혹은 유도 다능성 간세포로부터 분화한 세포인 유도간 간세포의 제조 방법.
제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유 동물이 인간인 유도간 간세포의 제조 방법.
제 1 항에 기재된 유도간 간세포를 사용하는 시험 방법으로서, 그 시험 방법이 안전성 시험 방법, 독성 시험 방법, 대사 시험 방법, 약물 상호작용 시험 방법, 항바이러스 활성 시험 방법, 의약품의 스크리닝 시험 방법 중에서 선택된 시험 방법인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 의약품의 스크리닝 시험 방법이 고지혈증약, 고혈압 치료약, 저분자 화합물 의약, 또는 항체 의약의 스크리닝 시험 방법인 시험 방법.
제 1 항에 기재된 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 창약 표적 스크리닝 방법.
제 1 항에 기재된 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
제 1 항에 기재된 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 간세포 산생 단백질의 생산 방법.
제 1 항에 기재된 유도간 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 포유 동물을 대상으로 하는 치료 방법.