CN101952415B - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了用于形成胰腺内胚层、胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改良方法。本发明还提供了在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
技术领域
本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了用于形成胰腺内胚层、胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改良方法。本发明还提供了在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
在一个例子中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞，产生了类似β细胞的细胞。
在另一例子中，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGFβ超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的效果。他们观察到，TGFβ2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005Jun；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury+/HNF-3β+内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与 可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO 99/20741、WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出一种将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素即胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长素释放肽(ghrelin)的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过通向能表达内分泌激素的细胞的类似定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的各阶段，来模拟体内胰腺器官发生。
在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在这个情况中，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠和激活蛋白A的组合使人胚胎干细胞分化成内胚层。然后将细胞与TGFβ拮抗剂如Noggin并结合EGF或β细胞素(betacellulin)一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论认为，Pdx1的过量表达增强了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。”
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要，同时又保持分化成胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力的多能干细胞系的条件。我们采取了替代方法来改善使人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供分化多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，通过用任何一种如下方法处理多能干细胞，从多能干细胞分化得到表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：
a.将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，或
b.将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，或
c.将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在不存在血清的情况下进行培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血清一起培养，或
d.将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养，并将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养，或
e.将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养，然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体在含有血清的第一培养基中培养，然后将所述多能干细胞与激活素A一起在含有血清的第二培养基中培养，或
f.将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养，然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体在含有血清的第一培养基中培养，然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起在含有另一浓度的血清的第二培养基中培养，或
在一个实施例中，通过用任何一种如下方法处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，从表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化得到表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：
a.用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂的培养基并随后在将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂的培养基中进行培养，或
b.用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
c.用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除视黄酸并随后用至少一种成纤维细胞生长因子处理所述细胞。
在一个实施例中，通过用任何一种如下方法处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化得到表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：
a.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除所述含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中培养，或
b.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除所述含有毒蜥外泌肽4的培养基并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中培养，或
c.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，或
d.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，或
e.用可抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
f.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有约10mM至约20mM葡萄糖和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病的患者的方法，包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，
d.使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成β-细胞谱系的细胞，并且
e.将所述β-细胞谱系的细胞移植进所述患者中。
附图说明
图1的分图a示出了人胚胎干细胞系H9中在用100ng/ml激活素A处理两天、五天和八天后定形内胚层标志物CXCR4、GATA4、HNF-3β、Mixl1、Sox-17的表达。在mRNA水平上对定形内胚层标志物的表达进行测定并用未处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图b示出了用100ng/ml激活素A处理三天和五天后人胚胎干细胞系H9中前内胚层标志物Cerberus、Otx-1和Hex的表达。
图2示出了人胚胎干细胞系H9中在用100ng/ml激活素A处理五天后定形内胚层标志物的表达。通过免疫组织化学对定形内胚层标志物的表达进行检测。分图(a)示出了Sox-17的表达。分图(b)示出了HNF-3β的表达。分图(c)示出了Oct3/4的表达。
图3示出了人胚胎干细胞系H9中在分步式分化方案后定形内胚层标志物的表达。在mRNA水平上对定形内胚层标志物的表达进行测定并用未处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了GATA4的表达。分图(b)示出了Sox-17的表达。分图(c)示出了HNF-3β的表达。分图(d)示出了Mixl1的表达。标记‘AA’的数据点表示用激活素A处理一天 (1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记‘UT’的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的未处理过的对照。
图4示出了人胚胎干细胞系H9中在分步式分化方案后胚外内胚层标志物的表达。在mRNA水平上对胚外内胚层标志物的表达进行测定并用未处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了100ng/ml激活素A对AFP表达的影响。分图(b)示出了100ng/ml激活素A对Sox7表达的影响。标记‘AA’的数据点表示用激活素A处理一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记‘UT’的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的未处理过的对照。
图5示出了人胚胎干细胞系H9中在分步式分化方案后中胚层和外胚层标志物的表达。在mRNA水平上对中胚层和外胚层标志物的表达进行测定并用未处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了100ng/ml激活素A对Brachyury表达的影响。分图(b)示出了100ng/ml激活素A对Zic1表达的影响。标记‘AA’的数据点表示用激活素A处理一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记‘UT’的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的未处理过的对照。
图6示出了人胚胎干细胞系H9中在用100ng/ml激活素A处理一天、三天、五天和七天后定形内胚层标志物Brachyury(分图a)、CXCR4(分图b)、Mixl1(分图c)、Sox17(分图d)、HNF-3β(分图e)、Oct4(分图f)的表达。在mRNA水平上对定形内胚层标志物的表达进行测定并用未处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。
图7示出了在应用分化方案后人胚胎干细胞系H9中定形内胚层标志物的表达。通过免疫组织化学对定形内胚层标志物的表达进行检测。分图(a)和(b)示出了Sox-17的表达。分图(c)和(d)示出了HNF-3β的表达。分图(e)和(f)示出了GATA4的表达。分图(b)、(d)和(f)示出了用DAPI对细胞核的复染。标记为‘处理过的’列表示用激活素A处理(100ng/ml)五天。标记为‘未处理过的’列表示未处理过的对照。
图8示出了在应用第二分化方案后人胚胎干细胞系H9中胰腺内胚层标志物的表达。通过PCR对胰腺内胚层标志物的表达进行测定并用激活素A处 理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了Pdx1的表达。分图(b)示出了GLUT-2的表达。分图(c)示出了PTF1a的表达。
图9示出了在应用第二分化方案后人胚胎干细胞系H9中胰腺内胚层标志物的表达。通过免疫组织化学对胰腺内胚层标志物的表达进行检测。分图(a)示出了未处理过的对照中Pdx1的表达，而分图(b)示出了通过分步式分化方案处理过的培养物中Pdx1的表达。
图10示出了在应用第三分化方案后人胚胎干细胞系H9中胰腺内分泌标志物的表达。通过PCR对胰腺内分泌标志物的表达进行测定并用激活素A处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了NeuroD1的表达。分图(b)示出了Ngn3的表达。分图(c)示出了胰岛素的表达。分图(d)示出了Hes-1的表达，该表达水平相对于胰腺内胚层细胞进行了归一化。
图11示出了在应用分化方案后人胚胎干细胞系H9中胰腺内胚层标志物的表达。通过PCR对胰腺内胚层标志物的表达进行测定并用激活素A处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了Nkx2.2的表达。分图(b)示出了Pdx1的表达。
图12示出了培养物中每次传代(P0、P1和P2)时细胞中PDX-1的表达。通过PCR对PDX-1的表达进行测定并用激活素A处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。
图13示出了在应用第三分化方案后人胚胎干细胞系H9中肝细胞标志物的表达。通过PCR对肝细胞标志物的表达进行测定并用激活素A处理过的人胚胎干细胞中的表达水平进行归一化。分图(a)示出了AFP的表达。分图(b)示出了白蛋白的表达。
图14示出了人胚胎干细胞系H9中多潜能性标志物的表达。通过免疫组织化学对多潜能性标志物的表达进行测定。分图(a)示出了Oct-4的表达。分图(b)示出了碱性磷酸酶的表达。
图15示出了人胚胎细胞系H9的核型。该核型是在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上培养，传代数为P36时的细胞上测定。
图16描述了本发明的分化方案的概要，其中人胚胎干细胞在无饲养细胞系统中分化成定形内胚层。
图17描述了在不同浓度的MATRIGEL上培养并暴露于(0.5-2％)低血清和高激活素A(100ng/ml)5天的人胚胎干细胞系H9在传代44代时的FACS概况。定形内胚层标志物CXCR4(CD184)的表达在Y-轴上示出，而ES标志物CD9的表达在X-轴上示出。
图18示出了定形内胚层标志物的实时PCR结果，定形内胚层标志物来自在MATRIGEL的1∶10稀释物(■)、MATRIGEL的1∶20稀释物 或MATRIGEL的1∶30稀释物(□)上培养并暴露于实例14中公开的分化方案的传代44代的人胚胎干细胞系H9的培养物。诱导倍数是相对于在用小鼠胚胎成纤维细胞调理过的培养基中培养、传代44代时的人胚胎干细胞系H9的未分化细胞来计算。
图19示出了未分化的多能干细胞中以及使多能干细胞分化而获得的定形内胚层细胞中的全基因表达的散点图。示出的数据来自在小鼠胚胎成纤维细胞上培养传代44代时(右边的分图)和在MATRIGEL上培养传代83代时(左边分图)的人胚胎干细胞系H9细胞系的培养物。
图20示出了在第5天通过FACS测定的CXCR4表达，所述的CXCR4表达是关于在小鼠成纤维细胞饲养细胞上培养并暴露于实例4所公开的定形内胚层分化方案的人胚胎干细胞系H1(分图a)、人胚胎干细胞系H7(分图b)和人胚胎干细胞系H9(分图c)。
图21示出了在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系H7(分图a)和人胚胎干细胞系H9(分图b)的培养物中所标明的定形内胚层标志物表达的实时PCR结果。结果表示为高于未分化细胞的增加倍数。
图22示出了在第5天通过FACS测定的CXCR4表达，所述的表达是在MATRIGEL(1∶30稀释物)上培养并暴露于实例4所公开的定形内胚层分化方案的人胚胎干细胞系H1(分图a)、人胚胎干细胞系H7(分图b)和人胚胎干细胞系H9(分图c)。
图23示出了人胚胎干细胞系H7(分图a)和人胚胎干细胞系H9(分图b)以及人胚胎干细胞系H1(分图c)的培养物中所标明的定形内胚层标志物表达的实时PCR结果。结果表示为高于未分化细胞的增加倍数。细胞根据实例4中所公开的方法进行处理。
图24示出了在存在100ng/ml激活素A(分图a)或100ng/ml的激活素A+20ng/mlWnt-3a(分图b)的情况下传代46代时，人胚胎干细胞系H9的培养物的位相村度成像。将细胞处理五天。
图25示出了在根据实例4所公开的方法处理后，人胚胎干细胞系H7在传代44代时(分图a和b)和H9在传代46代时(分图c和d)的培养物中通过FACS测定的CXCR4表达。分图b和d示出了20ng/ml Wnt-3a对CXCR4表达的影响。分图a和c示出了不存在Wnt-3a时的CXCR4表达。结果是在处理后5天获得。
图26展示了人胚胎干细胞系H7(分图a)和H9(分图b)的培养物中，所标明基因的表达的实时PCR数据。培养物用实例4中所公开的分化方案进行了处理。还对Wnt激动剂Wnt-3a(20ng/ml)、Wnt-5a(20ng/ml)和Wnt-7a(20ng/ml)的效果进行测试，如分图中所表明的。将细胞处理5天。结果表示为高于未分化细胞的增加倍数。
图27示出了在处理后第5天通过FACS测定的，人胚胎干细胞系H9在传代46代时的培养物中的CXCR4表达。分图(a)示出了不存在Wnt-3a时的CXCR4表达。分图(b)示出了用10ng/ml Wnt-3a处理后的CXCR4表达。分图(c)示出了用20ng/ml Wnt-3a处理后的CXCR4表达，分图(d)示出了在用50ng/ml Wnt-3a处理后的CXCR4表达。
图28示出了在处理5天后，人胚胎干细胞系H9的培养物中所标明的定形内胚层标志物的表达。通过实时PCR进行测定，将结果表示为相对于未处理过的细胞的表达的增加倍数。分图(a)示出了10、20和50ng/ml Wnt-3a对所标明的定形内胚层标志物的表达的效果。分图(b)示出了在处理后第2天(2d)和第5天(5d)，1、5或10ng/ml Wnt-3a(x-轴标签：10、5、1)对goosecoid(■)和CXCR4(□)表达的效果。分图(c)示出了在第2天(■)或第5天(□)，1、5或10ng/ml Wnt-3a对细胞数目的影响。
图29示出了在用实例4中所公开的分化方案处理5天后，通过FACS测定的人胚胎干细胞系H9的培养物中CXCR4的表达。细胞在不存在Wnt-3a或GSK-3B抑制剂(分图a)、整个5天的周期中存在20ng/ml Wnt-3a(分图b)、整个5天的周期中存在1000nM GSK-3B抑制剂IX(分图c)、整个5天的周期中存在500nM GSK-3B抑制剂IX(分图d)、整个5天的周期中 存在100nMGSK-3B抑制剂IX(分图e)、整个5天的周期中存在10nM
GSK-3B抑制剂IX(分图f)、存在100nM GSK-3B抑制剂IX第1-2天(分图g)、存在10nMGSK-3B抑制剂IX第1-2天(分图h)时培养。
图30示出了通过实时PCR测定的定形内胚层标志物的基因表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。分图(a)示出了从人胚胎细胞系H9在传代48代时所获得的数据，该细胞系用根据实例4中所公开的定形内胚层方案进行处理，使用所标明浓度的Wnt-3a或GSK-3B抑制剂，处理所标明的次数。分图(b)示出了从人胚胎细胞系H9在传代46代时所获得的数据，该细胞系用根据实例4中所公开的定形内胚层方案进行处理，使用所标明浓度的Wnt-3a或GSK-3B抑制剂，处理所标明的次数。
图31示出通过FACS测定的、本发明所用的胚胎干细胞系的CXCR4表达。分图(a-d)示出了从人胚胎干细胞系H9传代49代时所获得的数据。分图(e-f)示出了从人胚胎干细胞系H1传代46代时所获得的数据。数据是在处理后5天获得。在如下条件下对细胞进行处理：分图(a)：10ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/ml Wnt-3a处理开始两天；分图(b)：100ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/ml Wnt-3a处理开始两天；分图(c)：100ng/ml激活素A处理整个五天加100nM GSK-3B抑制剂IX开始两天；分图(d)：10ng/ml激活素A处理整个五天加100nM GSK-3B IX抑制剂开始两天；分图(e)：100ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/mlWnt-3a处理开始两天；以及分图(f)：10ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/ml Wnt-3a处理开始两天。
图32示出了通过实时PCR测定的、用10、50或100ng/ml的激活素A加20ng/ml Wnt-3a处理过的人胚胎干细胞系H9在传代49代时的培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达，以及分图(b)：SOX-17和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。
图33示出了通过FACS测定的、人胚胎干细胞系H9在传代53代时的CXCR4表达。结果是在处理后5天获得。用如下条件对细胞进行处理：分图(a)：100ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/ml Wnt-3a处理开始两天且用25ng/ml BMP-4处理第3-5天；分图(b)：100ng/ml激活素A处理整个五 天加20ng/ml Wnt-3a处理开始两天；分图(c)：100ng/ml激活素A处理整个五天加100nM GSK-3B抑制剂IX处理开始两天；分图(d)：20ng/ml Wnt-3a+25ng/ml BMP-4处理整个五天；分图(e)：100ng/ml激活素A处理整个五天加20ng/ml Wnt-3a+100nm GSK-3B抑制剂IX处理开始两天，以及分图(f)：100ng/ml激活素A+25ng/ml BMP-4处理整个五天。对于全部分图，X-轴代表CD9的表达，而Y-轴代表CXCR4的表达(CD184)。
图34示出了通过实时PCR测定的、用10或100ng/ml的激活素A加20ng/ml的Wnt-3a或100NM GSK-3B抑制剂处理过的人胚胎干细胞系H1在传代46代时培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC和POU5F(Oct-4)的表达，以及分图(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。
图35示出了通过实时PCR测定的、用50或100ng/ml的激活素A加10或100nM GSK-3B抑制剂处理过的人胚胎干细胞系H9在传代49代时培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达，以及分图(b)：SOX-17和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。
图36示出了通过实时PCR测定的、用激活素A、Wnt-3a、GSK-3B抑制剂的组合处理五天的人胚胎干细胞系H9在传代53代时培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和SOX7的表达，以及分图(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。
图37示出了用实例22中列出的条件处理过的人胚胎干细胞系H9培养物中通过FACS测定的CXCR4的表达。
图38示出了在纤粘蛋白(分图a)或MATRIGELTM(分图b)上培养的人胚胎干细胞系H9培养物中通过FACS测定的定形内胚层标志物的表达。
图39示出了在纤粘蛋白(□)或生长因子减低的MATRIGEL的1∶10稀释物(■)上培养的人胚胎干细胞系H9培养物中通过实时PCR测定的定形内胚层标志物的表达。
图40示出了在存在低血清、100ng/ml的激活素A和20ng/ml的Wnt-3a的情况下，多种浓度的MATRIGEL对人胚胎干细胞分化成定形内胚层的影 响。细胞根据实例4中所公开的方法进行处理。所示的结果为通过实施PRC测定的所标明基因的表达水平。
图41示出了Wnt-3a在由在MATRIGEL上维持，但在小鼠胚胎成纤维细胞上分化的人胚胎干细胞形成定形内胚层中的作用。分图(a-d)示出了所标明基因的实时PCR数据。分图(e-g)示出了针对所标明条件的FACS数据。
图42示出了在涂覆有MATRIGELTM的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞在用Wnt抑制剂DKK-1处理后向定形内胚层的分化。所显示的结果为H9细胞中通过实时PCR测定的所标明基因的表达，该H9细胞根据实例4所公开的方法在存在20ng/ml的Wnt-3A加100ng/ml的DKK1(DE+DKK1)的情况下，或在缺少DKK1(DE)的情况下进行了处理。
图43示出了人胚胎干细胞系H9的培养物中定形内胚层标志物的免疫荧光染色，该细胞系H9是在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养并在无20ng/ml的Wnt-3a(分图a)，或在有20ng/ml的Wnt-3a(分图b)的低血清加100ng/ml的激活素-A中分化。Ecad＝E-钙粘蛋白，NCAM＝N-钙粘蛋白。
图44示出了人胚胎干细胞系SA002在传代38代时分化成定形内胚层。细胞用所标明的条件处理五天并通过实时PCR测定分图中所标明基因的基因表达。
图45示出了在用100ng/ml的激活素A(分图a)、100ng/ml激活素A+20ng/ml Wnt-3a(分图b)，或100ng/ml激活素A+100nM GSK-3B抑制剂IX(分图c)处理后，人胚胎干细胞系SA002在传代38代时通过FACS测定的CXCR4表达。将细胞处理五天。
图46示出了在涂覆有人血清的组织培养基质上在传代55代时的人胚胎干细胞系H1分化成定形内胚层。细胞用所标明的条件进行处理并通过实时PCR测定分图中所标明基因的基因表达。
图47示出了在涂覆有MATRIGELTM的组织培养基质上，人胚胎干细胞系H1的培养物在P54时分化成定形内胚层。按照为期五天的DE方案，对多种GSK-B抑制剂的效果进行测试。对100nM的如下GSK-3B抑制剂在处理的开始两天进行评价：GSK-3B VIII、IX、XI和XII。
图48示出了人胚胎干细胞系H9在传代49代时的培养物中AFP(分图a)、Pdx-1(分图b)、Cdx-2和Glut-2(分图c)和HNF-3β、HNF-6和生长抑素(分图d)的表达，该H9细胞系是在处理的开始两天存在20ng/ml的Wnt-3a的情况下，根据实例4中所公开的方法进行培养和处理。在所述的处理后，用2％FBS加1μM视黄酸、0.1至1μM的TTNPB(4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸；芳维甲酸)，或0.1-10μM的AM-580(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘)甲酰胺基]苯甲酸)另外处理三天。接着将细胞在2％FBS加20ng/ml的bFGF中另外处理三天。
图49示出了人胚胎干细胞系H1培养物中的分图a和b中所标明的定形内胚层标志物表达的实时PCR结果，该细胞系H1用激活素A和Wnt-1处理所标明的次数，采用所标明的浓度。
图50示出了胰腺内分泌细胞培养物中的胰岛素(分图a)和高血糖素(分图b)mRNA表达，该胰腺内分泌细胞培养物是在DMEM/F12或DMEM-低葡萄糖中处理胰腺内胚层细胞而形成。所显示的数据为从两个独立试验观察得到的结果。
图51示出了在DMDM-低葡萄糖(分图a)、DMEM/F12(分图b)中处理的细胞中通过免疫细胞化学测定的胰岛素表达。分图c示出了PDX-1和胰岛素的共染色。
图52示出了葡萄糖浓度对衍生自人胚胎干细胞系H9的胰腺内分泌细胞中基因表达的影响。在分图中标明了这些基因。
图53示出了从在2、10和20mM葡萄糖中形成的胰腺内分泌细胞释放的c-肽。细胞用IBMX或20mM葡萄糖进行刺激。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数的组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
干细胞按它们的发育潜力分成以下几类：(1)全能(totipotent)干细胞，意思是能够产生所有的胚胎和胚外细胞类型；(2)多能(pluripotent)干细胞，意思是能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能(multipotent)干细胞，意思是能够产生一部分细胞谱系，但都在特定的组织、器官或生理系统当中(例如，造血干细胞(HSC)能产生包括HSC(自我更新)、血细胞局限寡能祖细胞和所有属血液的正常组分的细胞类型和成分(例如血小板))；(4)寡能(oligopotent)干细胞，意思是能够产生比专能干细胞更局限的一部分细胞谱系；和(5)单能(unipotent)干细胞，意思是能够产生单一细胞谱系(例如精原干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞的谱系当中具有较为特化的(“定向的”)地位的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞的谱系将该细胞置于发育和分化的遗传安排(hereditary scheme)当中。谱系特征性标志指与目的谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向目的谱系的分化。
有不同的术语用来描述培养中的细胞。“维持”通常指将细胞在有利于细胞生长和/或分裂的条件下置于生长培养基中，这可能或可能不导致产生更大的细胞群体。“传代”指将细胞从一个培养容器移取并将它们在有利于细胞生长和/或分裂的条件下置于第二培养容器中的过程。
细胞的特定群体或者说细胞系，有时由它已被传代的次数来指称或表征。例如，已被传代十次的培养细胞群体可称为P10培养物。原代培养物，即从组织分离细胞后的第一培养物，称为P0。在第一亚培养后，将细胞描述为继代培养物(P1或传代1)。在第二亚培养后，细胞变成三代培养物(P2或传代2)，依此类推。本领域技术人员会理解，在传代期间可能有多次群体倍增；因此培养物的群体倍增数目大于传代数目。细胞在各次传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基质(substrate)、培养基、生长条件和各次传代之间的时间。
“β-细胞谱系”指对于转录因子PDX-1和至少一种以下转录因子具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3beta、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
本文所用的“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少以下标志物之一的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3beta、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mixlike同源盒蛋白、FGF4 CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少以下标志物之一的细胞：PDX-1、HNF-1beta、HNF-3β、PTF-1alpha、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”指表达至少以下标志物之一的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4或PTF-1 alpha。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞以及β-细胞谱系的细胞。
本文所用的“定形内胚层”指带有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物(derivative)的细胞。定形内胚层细胞表达以下标志物：CXCR4、HNF-3beta、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、c-Kit、CD99和Mixl1。
本文所用的“胚外内胚层”指表达至少一种以下标志物的细胞群体：SOX-7、AFP和SPARC。
本文所用的“标志物”是在目的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在这个情形中，差异表达意思是阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在目的细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将目的细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
本文所用的术语“中内胚层细胞”指表达至少以下标志物之一的细胞：CD48、eomesodermin(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3beta、GSC、FGF17、GATA-6。
本文所用的“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长素释放肽。
本文所用的“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
本文所用的“前原条细胞”指表达至少一种以下标志物的细胞：Nodal或FGF8。
本文所用的“原条细胞”指表达至少一种以下标志物的细胞：Brachyury、Mix-like同源盒蛋白或FGF4。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
增殖的多能干细胞系可以用标准G-显带技术进行核型分析并与所公开的相应灵长类物种的核型相比较。理想的是获得具有“正常核型”的细胞，“正常核型”的细胞意指该细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的为胚胎干细胞系H1、H7和H9 (WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v (BresaGen, Athens, GA)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
例如，Reubinof等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第1145-1147页)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)对一组11个不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养的能力进行了评价。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如，Stojkovic等人(Stem Cells 200523：306-314，2005)公开了一种衍生自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞系统。
在另一实例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞的来源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培育干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了一种用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的调理培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生 化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理”。
又如，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的调理培养基，所述干细胞衍生物已经过遗传修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种可供选择的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎儿血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的成分确定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，该培养基与被培养的干细胞基本上等渗。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，US6800480声称“在一个实施例中，提供了用于培养处于基本上未分化状态的衍生自灵长类的原始干细胞的细胞培养基，其包括可有效支持 衍生自灵长类的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素的基础培养基。该基础培养基与可有效支持衍生自灵长类的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质物质相混合。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962声称：“在一个方面，本发明提供了培养灵长类胚胎干细胞的方法。可在基本上无哺乳动物胎儿血清(优选还基本上无任何动物血清)的培养物中且在存在成纤维细胞生长因子的情况下培养所述干细胞，该成纤维细胞生长因子的供给来源不是仅为成纤维细胞饲养层。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变得非必需”。
在又一个实例中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，包含：a.基础培养基；b.bFGF，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.胰岛素，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.抗坏血酸，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGFβ)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是 (Becton Dickenson)。是得自Engelbreth-HolmSwarm肿瘤细胞的可溶性制品，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KODMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
多能干细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH编码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH编码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH编码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。能表达至少一种以下多能细胞特有标志物的细胞也适用于本发明：ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60、Tral-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX-17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix-like同源盒蛋白、FGF4 CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自Pdx1、HNF-1beta、PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。适用于本发明的是能表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系的特有标志物选自NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4和PTF-1 alpha。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞能表达Pdx1和至少一种以下转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3beta、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A的培养基中在血清不存在下进行培养，然后将所述细胞与激活蛋白A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活蛋白A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在NatureBiotechnology 23，1534-1541(2005)中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A的培养基中在血清不存在下进行培养，然后将所述细胞与激活蛋白A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A和Wnt配体的培养基中在血清不存在下进行培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活蛋白A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
在本发明的一个方面中，通过将多能干细胞接种到涂覆有细胞外基质的组织培养基质上，然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起在含有血清的第一培养基中培养一段时间，并然后将所述多能干细胞与激活素A一起在含有更高浓度血清的第二培养基中培养约另一段时间，所述多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
上面公开的第一培养基中的血清浓度可从约零至约0.5％，并且所述培养时间可从约一天至约三天。上面公开的第二培养基中的血清浓度可从约0.5％至约2％，并且所述培养时间可从约一天至约四天。
在本发明的一替代实施例中，通过将多能干细胞接种到涂覆有细胞外基质的组织培养基质上，然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起在含有血清的第一培养基中培养约一段时间，并然后将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起在含有更高浓度血清的第二培养基中培养另一段时间，所述多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
上面公开的第一培养基中的血清浓度可从约零至约0.5％，并且所述培养时间可从约一天至约三天。上面公开的第二培养基中的血清浓度可从约0.5％至约2％，并且所述培养时间可从约一天至约四天。
在一个实施例中，本发明提供了用于分化表达定形内胚层谱系特征性标志物的多能干细胞的方法，包括以下步骤：
a.将多能干细胞接种在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上，并且
b.将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养。
可在单种培养基中将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起进行培养。作为另一种选择，多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养可在不止一种培养基中独立进行或一起进行。在一个实施例中，在两种培养基中将所述培养基与激活素A和Wnt配体一起进行培养。
细胞外基质
在本发明的一个方面中，将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养和分化。细胞外基质可以是从小鼠肉瘤细胞提取的可溶性基底膜制剂(其可由BDBiosciences以商品名MATRIGEL销售)。作为另一种选择，细胞外基质可以是生长因子减低的MATRIGEL。作为另一种选择，细胞外基质可以是纤粘蛋白。在一个替代实施例中，将多能干细胞在涂覆有人血清的组织培养基质上培养和分化。
可在对组织培养基质进行涂覆前，将细胞外基质进行稀释。用于稀释细胞外基质以及用于涂覆组织培养基质的合适方法的例子可在如下文献中找到：Kleinman，H.K.，等人，Biochemistry 25：312(1986)和Hadley，M.A.，等人.，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。
在一个实施例中，细胞外基质是MATRIGEL。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶10稀释的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶15稀释的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶30稀释的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶60稀释的MATRIGEL涂覆。
在一个实施例中，细胞外基质是生长因子减低的MATRIGEL。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶10稀释的生长因子减低的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶15稀释的生长因子减低的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶30稀释的生长因子减低的MATRIGEL涂覆。在一个实施例中，组织培养基质用以1∶60稀释的生长因子减低的MATRIGEL涂覆。
使用单种培养基，多能干细胞在细胞外基质上分化成表达定形内胚层谱系特征性 标志物的细胞
当使用单种培养基时，其应该含有足够低浓度的某些因子以使得多能干细胞能向定形内胚层分化，例如胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开的)。这可通过降低血清的浓度来实现，或作为另一种选择，通过使用缺少胰岛素和IGF的化学成分确定的培养基来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(Exp Cell Res.1999Feb 25；247(1)：241-8.)中有所公开。
培养基的血清浓度可在约0％至约10％的范围内。在一个替代实施例中，该浓度可以在约0％至约5％的范围内。在一个替代实施例中，该浓度可以在约0％至约2％的范围内。在一个替代实施例中，该浓度可以为约2％。
与激活素A和Wnt配体一起培养的时间可以在约1天至约7天的范围内。在一个替代实施例中，该培养时间可以在约1天至约3天的范围内。在一个替代实施例中，该培养时间可以为约3天。
激活素A可以适于引起多能干细胞分化的任何浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可对Wnt配体的选择进行优化以提高分化方法的效率。Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体是Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体是Wnt-3a。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
所述的单种培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当将多能干细胞与GSK-3B抑制剂一起培养时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将多能干细胞与浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂一起培养。
所述的单种培养基还可以含有至少一种其他额外的因子，这些因子可增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的 成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体(mimetobody)、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、激活素、β细胞素、ITS、noggin、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCCNo：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)和原代的或转化的上皮细胞获得的调理培养基提供。
使用两种培养基，使多能干细胞在细胞外基质上分化成表达定形内胚层谱系特征 性标志物的细胞
多能干细胞向定形内胚层谱系细胞分化可通过将所述多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起用两种培养基培养来完成。因而，多能干细胞的分化可如下来完成：
a.将多能干细胞接种在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上，
b.将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起在第一培养基中培养，并且
c.将多能干细胞与激活素A在第二培养基中培养。
第一培养基可含有低浓度的血清，而第二培养基可含有浓度比第一培养基高的血清。
第二培养基可含有Wnt配体。
第一培养基：第一培养基应该含有足够低浓度的某些因子以使得多能干细胞能分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，例如胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开的)。这可通过降低血清的浓度来实现，或作为另一种选择，通过使用缺少胰岛素和IGF的化学成分确定的培养基来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(Exp CellRes.1999Feb25；247(1)：241-8.)中有所公开。
相对于第二培养基，在第一培养基中可存在较低浓度的血清。在第二培养基中增加血清浓度可增加细胞的存活率，或作为另一种选择，可增强细胞的增殖。第一培养基的血清浓度可以在约0％至约10％的范围内。作为另一种选择，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约2％的范围内。作为另一选择，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约1％的范围内。作为另一种选择，第一培养基的血清浓度可以为约0.5％。
当将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起用至少两种培养基培养时，在第一培养基中培养的时间可以在约1天至约3天的范围内。
激活素A可以适于引起多能干细胞分化的任何浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可对Wnt配体的选择进行优化以提高分化方法的效率。Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体是Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体是Wnt-3a。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
所述的第一培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂加入第一培养基中、加入第二培养基中，或加入第一和第二培养基两者中。
GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当将多能干细胞与GSK-3B抑制剂一起培养时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将多能干细胞与浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂一起培养。
所述的第一培养基还可以含有至少一种其他额外的因子，这些因子可增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、激活素、β细胞素、ITS、noggin、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCCNo：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
第二培养基：第二培养基应该含有某些因子，例如胰岛素和IGF(如在WO2006020919中所公开的)，所含的浓度足以促进所培养的细胞的存活。 这可以通过增加血清浓度，或作为另一种选择，通过使用化学成分确定的培养基(其中胰岛素和IGF的浓度相对于第一培养基有所增加)来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(ExpCell Res.1999Feb 25；247(1)：241-8.)中有所公开。
在具有较高浓度的血清的第二培养基中，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约10％的范围内。作为另一种选择，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约5％的范围内。作为另一种选择，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约2％的范围内。作为另一种选择，第二培养基的血清浓度可以为约2％。当将多能干细胞用第二培养基培养时，培养的时间可以在约1天至约4天的范围内。
与第一培养基类似，激活素A可以适于引起所述多能干细胞分化的任何浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体是Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体是Wnt-3a。
第二培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂加入第一培养基中、加入第二培养基中，或加入第一和第二培养基两者中。
GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当将多能干细胞与GSK-3B抑制剂一起培养时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将多能干细胞与浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂一起培养。
与第一培养基类似，第二培养基还可以含有至少一种其他额外的因子，这些因子可增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方 法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、激活素、β细胞素、ITS、noggin、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCCNo：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能干细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易地开发。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征不断地被鉴别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60、Tral-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成 纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
在本发明的一个方面，还通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。该周期可以是约一至约六天。
在本发明的一个替代方面，还通过用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，使该细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。该周期可以是约一至约三天。随后移除所述视黄酸并用至少一种成纤维细胞生长因子处理该细胞另一段时间。该周期可以是约一至约三天。
在一个实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
b.用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理约一天至约六天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理约六天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自FGF-2、FGF-4和FGF-10。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个替代实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
b.用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
c.移除该视黄酸并随后用至少一种成纤维细胞生长因子处理所述细胞。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸处理约一天至约三天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸处理约三天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种成纤维细胞生长因子处理约一天至约三天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种成纤维细胞生长因子处理约三天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自FGF-2、FGF-4和FGF-10。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸进行处理。作为另一种选择，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用FGF-2，或FGF-4，或FGF-10进行处理。在一个替代实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种如下因子进行处理：视黄酸、FGF-2、FGF-4或FGF-10。在一个替代实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸和至少一种如下成纤维细胞生长因子进行处理：FGF-2、FGF-4或FGF-10。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸和FGF-2进行处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸和FGF-4进行处理。在另外的实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸和FGF-10进行处理。
视黄酸可以约1nM至约1mM的浓度使用。在一个实施例中，视黄酸以1μM的浓度使用。
FGF-2可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-2以50ng/ml的浓度使用。
FGF-4可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-4以50ng/ml的浓度使用。
FGF-10可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-10以50ng/ml的浓度使用。
可以将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、激活素、β细胞素、ITS、noggin、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCCNo：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No： HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如H1xb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明公开的任何方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除该含有毒蜥外泌肽4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
在本发明的一个方面，通过用可抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。可抑制Notch信号传导途径的因子可以是Notch细胞外受体的拮抗剂。作为另一种选择，该因子可抑制Notch受体的生物学活性。作为另一种选择，该因子可抑制细胞内的Notch信号传导途径中的元素或为该元素的拮抗剂。
在一个实施例中，可抑制Notch信号传导途径的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，该γ-分泌酶抑制剂是1S-苄基-4R-[1-(1S-氨甲酰基-2-苯乙基氨甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
L-685,458可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约80μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约10μM的浓度使用。
在一个实施例中，本发明提供了使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
b.用可抑制Notch信号传导途径的因子处理该细胞。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，可抑制Notch信号传导途径的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，该γ-分泌酶抑制剂是1S-苄基-4R-[1-(1S-氨甲酰基-2-苯乙基氨甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用可抑制Notch信号传导途径的因子处理约一至约五天。作为另一个选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用可抑制Notch信号传导途径的因子处理约三至约五天。作为另一种选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用可抑制Notch信号传导途径的因子处理约五天。
在一个实施例中，可抑制Notch信号传导途径的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，该γ-分泌酶抑制剂是1S-苄基-4R-[1-(1S-氨甲酰基-2-苯乙基氨甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
L-685,458可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约 80μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458是以约10μM的浓度使用。
可以将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、激活素、β细胞素、ITS、noggin、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCCNo：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No： HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
在一个实施例中，本发明提供使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的一种改良方法，包括以下步骤：
a.培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
b.在含有浓度为约10mM至约20mM的葡萄糖的培养基中，用能使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的因子对所述细胞进行处理。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
任何能使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法均适用于改善本发明。
在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有浓度为约10mM的葡萄糖的培养基中进行处理。在一个替代实施例中，将细胞在含有浓度为约20mM的葡萄糖的培养基中进行处理。
将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约2至约30天。在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约2至约20天。在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约2至约10天。在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约10天。在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约4天。在一个实施例中，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞处理约2天。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-1的表达。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他β细胞谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子的表达，例如Pdx1(胰十二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA等等。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。作为另一种选择，可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进患者中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及将多能干细胞进行培养，使该 培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进该患者中。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可将这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、原来的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与其同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，将生长因子用于使所施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该细胞掺入三维的支持物中。在移植进患者前，可将该细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支持物，可在形成该支持物之前，将药剂与聚合物溶液进行混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂加入支持物中以改变药剂的释放速率。在一个替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、noggin、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人发展了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定作用(Centrifugational Cell Immobilization，CCI)。
本发明进一步通过如下实例举例说明，但不受限于如下实例。
实例
实例1
人胚胎干细胞培养物
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之， 将细胞在ES细胞培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上进行培养，该培养基由补充有20％knockout血清替代品、100nM MEM非必需氨基酸、0.5mM β巯基乙醇、具有4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理亚汇合的MEF细胞3小时以使细胞分裂停滞，然后用胰蛋白酶进行处理并以2×104/cm2接种于0.1％牛明胶涂覆的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将接种于MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在37℃的5％CO2气氛中，在调湿的组织培养箱内进行培养。当汇合时(接种后大约5-7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后用5ml吸管轻轻刮落。将细胞以900rpm离心5分钟，然后将沉淀物以细胞在新鲜培养基中为1∶3至1∶4的比率重新悬浮，并再次接种。
实例2
定形内胚层细胞的形成
对激活素A对定形内胚层的标志物的效果进行检验。将激活素A(100ng/ml)加入在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的人胚胎干细胞群体中。将细胞在存在激活蛋白A的情况下连续培养并在标明的时间进行采集。通过PCR(图1)、FACS(结果在表II中总结)和免疫组织化学(图2)对定形内胚层标志物的表达水平进行检验。
激活素A在H9系中引起CXCR4、GATA4、HNF-3β、Mixl1和Sox-17mRNA表达的时间依赖性增加(图1，分图a)。还观察到了前内胚层标志物Cerberus、Otx-1和Hex基因的显著上调(图1，分图b)。在用激活素A处理后通过FACS观察到CXCR4蛋白增加。在用激活素A处理后E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的表达没有改变(表IIA)。CXCR4阳性细胞对C-kit、EPCAM、CD99也是高度阳性的，而对CD9是阴性的。在所检验的全部三种hES细胞系中，这些标志物的表述模式是一致的(对H7是表IIB，对H1是表IIC)。对用激活素A处理五天的细胞进行免疫细胞化学分析表明，在处 理过的培养物中有30-40％的细胞对Sox17和HNF-3β是阳性的。同时，几乎100％的分化细胞仍然是Oct4阳性的(图2)。多潜能性的表面标志物表达的降低，结合定形内胚层标志物表达的增加，这些数据表明，激活素A可促进人胚胎干细胞向定形内胚层的分化。
实例3
胰腺内胚层细胞的形成
将已知可诱导人胚胎干细胞向胰腺内胚层分化的生长因子加入细胞培养物中。具体地讲，将已知可诱导胰腺内胚层形成的激活素A、bFGF和视黄酸加入培养物中。
在开始的一系列实验中，将激活素A加入在补充有0％至2％的血清和激活素A(100ng/ml)的DMEM/F12中的小鼠胚胎成纤维细胞上培养最多七天的人胚胎干细胞群体中。在图3中标明的时间点采集细胞并通过PCR测定所显示的基因的表达(图3、4和5)。在图3中，PCR分析表明，激活素处理过的细胞表达广谱的与内胚层发育相关的基因，包括GATA4(图3，分图a)、Sox-17(图3，分图b)、HNF-3β(图3，分图c)和Mixl-1(图3，分图d)。然而，没有观察到Pdx1基因的表达。在激活素A处理过的H7细胞中观察到相同的内胚层谱系标志物的表述模式(图6，分图a至f)。在该阶段，Oct4表达的没有显著降低。
激活素A引起了胚外内胚层标志物Sox7(图4，分图a)和AFP(图4，分图b)的时间依赖性降低。激活素A降低了Brachyury的表达(图5，分图a)，但对神经元标志物Zic1的表达没有影响(图5，分图b)。
总起来看，这些数据表明Sox-17、Mixl1、Gata4和HNF-3β表达增加以及前内胚层标志物Otx1、Cer1和Hex基因上调对应响应激活素A处理形成了定形内胚层。通过免疫细胞化学分析定形内胚层标志物表明，这些基因的蛋白质表达还反应了所观察到的mRNA表达的趋势。在未处理过的细胞中HNF-3β、Sox-17和GATA4的表达水平较低，大约为全部细胞的10至20％。用激活素A(100ng/ml)处理五天使HNF-3β、Sox-17和GATA4的表达增加至大约为全部细胞的50％至90％(图7)。
在第二系列实验中，根据实例1中所描述的方法将人胚胎干细胞培养物在未分化培养条件下维持2-3天。在细胞70-80％汇合后，将培养基换成 具有0至2％FBS的DMEM/F12(加入了100ng/ml的激活素A)并在存在激活素A的情况下培养三天、五天或七天。在该时间段后，将细胞随后用视黄酸和bFGF的组合进一步处理五至六天，如图8所示。采集培养物并收集mRNA的样品用于分析。还包括了对照培养物，该对照培养物由用激活素单独处理五天的细胞组成。
基因表达分析表明，单独的激活素A或视黄酸不会诱导Pdx1的表达。在存在激活素A的情况下用视黄酸联合FGF处理过的细胞培养物中观察到类似的结果(图8，分图a)。然而，在不存在激活素A的情况下用视黄酸和FGF处理细胞更进一步增加了Pdx1的表达(图8，分图a)。将细胞用激活素A处理三天，然后在不存在激活素A的情况下用1μM视黄酸和50ng/mlbFGF(也称为FGF-2)处理5天显示，Pdx1的表达水平比在单独用激活素A处理5天的样品中观察到的表达水平高大约3500倍(图8，分图a)。免疫细胞化学分析显示，全部细胞的5至20％表达Pdx1(图9)。
在不存在激活素A的情况下用1μM的视黄酸和bFGF处理还引起GLUT-2和PTF1a的表达增加(图8，分图c)，这在仅存在激活素A的情况下处理的细胞没有观察到。在用1μM视黄酸和50ng/ml bFGF处理过的细胞中观察到GLUT-2和PTF1a表达有最大增加。总起来看，这些数据表明，在已经形成定形内胚层后从细胞培养物移除激活素A进一步增强了胰内胚层的形成。
实例4
胰腺内分泌细胞的形成
根据实例1中所描述的方法将人胚胎干细胞培养物在未分化培养条件下维持3-4天。在细胞50-60％汇合后，将培养基换成含有100ng/ml激活素A但没有FBS的DMEM/F12，并将细胞在该培养基中培养一天。在培养一天后，移除该培养基并替换为具有100ng/ml激活素A的含0.5％FBS的培养基，并将细胞培养一天。在第二个为期一天的培养后，移除该培养基并替换为具有100ng/ml激活素A的含2％FBS的培养基，并将细胞培养一天。在该时间间隔后，然后按实例2中描述的将细胞用视黄酸和FGF的组合处理六天，然后移除该培养基并替换为包含具有2％FBS的DMEM/F12的培养基三天，该培养基含有10μM的γ-分泌酶抑制剂L-685,458。采集培养物并收 集mRNA的样品用于分析。还包括了对照培养物，该对照培养物由用激活素单独处理五天的细胞组成。
基因表达分析表明，单独的激活素A或与视黄酸和FGF联合不会诱导Ngn3或胰岛素的表达(图10，分图a，c)。在用L-685,458处理后，还观察到Hes-1表达的降低。在处理后第三天观察到最大的抑制(图10，分图d)。然而，用L-685,458处理细胞诱导Ngn3表达的水平达到比在单独用激活素A或用视黄酸与FGF联合处理过的样品中所观察到的表达水平要高大约50倍。在用γ-分泌酶抑制剂处理过的样品中观察到胰岛素表达有70倍增加。通过L-685,458处理，还进一步增加了NeuroD1的表达(图10，分图a)。总起来说，这些数据表明，通过在已经形成胰腺内胚层后从细胞培养物中移除视黄酸和FGF并加入γ-分泌酶抑制剂进一步增加了内分泌细胞的形成。
实例5
表达Nkx2.2的胰腺内分泌细胞的形成
将根据实例2所述的方法获得的定形内胚层细胞如下进行处理：将细胞在基础培养基中培养3至5天，该基础培养基包含具有2％FBS加50ng/ml激活素A、50ng/ml碱性FGF和1μM的视黄酸的DMEM/F12。将细胞继续在仅具有1μM视黄酸或还具有bFGF的基础培养基中继续另外培养3至5天。在该过程中在多个时间点采集RNA样品，以帮助评价细胞的定向分化。此外，在整个分化方案中有规律地移除培养基和因子并进行补充。加入激活素A显示，相对于不用激活素A处理的样品，Nkx2.2表达增加了约35倍。培养物用激活素A处理开始三天的样品保持Pdx1的表达水平类似于不含激活素A的样品(图11)。总起来说，这些数据表明，在用视黄酸和bFGF处理的开始三天加入激活素A进一步增强了胰腺内分泌标志物Nkx2.2的表达。
实例6
培养物中胰腺内胚层细胞的传代和扩增
该实例证明，本发明的人胚胎干细胞衍生的胰腺内胚层细胞可以在细胞培养物中维持并在在不会进一步分化的情况下传代。在存在100ng/ml激活素A的情况下在低血清DMEM/F12中分化胰腺内胚层细胞。该低血清 DMEM/F12在第1天含有0％(v/v)的胎牛血清(FBS)，在第二天含有0.5％(v/v)FBS，并且在其后的每一天都含有2％(v/v)FBS。在分化四天后，将细胞在含有2％(v/v)FBS、1μM视黄酸和50ng/ml bFGF的低血清DMEM/F12中再培养总共六天。在分化六天后，将细胞在存在50ng/ml FGF10的情况下，在含有2％(v/v)FBS的低血清DMEM/F12中的培养物中维持总共6天。在该为期六天的培养周期中，胰腺内胚层细胞传代两次并且在该为期6天的培养期间，细胞群体倍增时间为约36至48小时。在培养的第0、3和6天，将Q-PCR用于测量指示胰腺内胚层的标记基因的表达。图12显示，在它们衍生后的为期6天的培养周期中，在存在50ng/ml FGF10的情况下生长的细胞保持了胰腺内胚层标志物Pdx1的表达。
实例7
从人胚胎干细胞衍生肝细胞
根据实例1中所描述的方法将人胚胎干细胞培养物在未分化培养条件下维持2-3天。在细胞70-80％汇合后，将培养基换成具有2％FBS的DMEM/F12(含有100ng/ml的激活素A)，并在存在激活素A的情况下培养七天。在用激活素A处理7天后，将细胞用图13所示的条件处理五天。此后，采集细胞，并收集mRNA的样品用于分析。
对于在不存在激活素A的情况下培养的细胞，观察到甲胎蛋白(AFP)和白蛋白表达的增加(图13，分图a)。这通过视黄酸和FGF-4得以进一步增加(图13，分图b)。总起来看，这些数据表明，在如上所述进行处理后人胚胎干细胞的培养物能够表达肝细胞标志物。此外，人胚胎干细胞能够分化成表达肝细胞特征性标志物的细胞。
实例8
H9人胚胎干细胞系的表征
通过对由未分化的ES细胞表达的几种标志物的表达进行评价，实时监控H9细胞的质量(Carpenter等人，2001；Reubinoff等人，2000；Thomson等人，1998a)。H9细胞展示了阶段特异性胚胎抗原的逆反性表达(表III)。H9细胞对SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、AP和CD9抗原起着强的免疫反应性，这些抗原都是未分化的人胚胎干细胞的特征。
进行实时PCR来评估胚胎干细胞特征性基因(例如OCT3/4、SOX-2、UTF-1、REX-1、Cx43、Cx45、ABCG-2和TERT)的表达，确定该实例中生长的细胞看起来与先前描述的未分化胚胎干细胞类似(表III)。通过免疫染色来确认OCT3/4蛋白的表达和碱性磷酸酶活性(Chemicon)。大多数H9细胞对OCT3/4和AP是阳性的(图14)。总体上，这些结果证明，当与其他实验室的报道比较时该实例中所用的H9细胞在形态、抗原免疫染色或多潜能性标记物表达上没有显著差别。
实例9
荧光激活细胞分选(FACS)分析
通过与TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)一起孵育五分钟，从培养皿移出粘附的细胞。将脱离的细胞再悬浮于人胚胎干细胞培养基中并通过离心回收，随后将细胞在由PBS(Sigma，MO)中的2％BSA、0.05％叠氮化钠组成的染色缓冲液中进行洗涤和再悬浮。在适当时，用0.1％γ-球蛋白(Sigma)溶液对细胞进行Fc-受体封闭15分钟。将等分试样(大约105个细胞)与藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)缀合的单克隆抗体(每106个细胞5μl抗体)一起孵育，如表I中指出的那样，或与未缀合的一抗一起孵育。对照包括合适的同型匹配抗体、未染色的细胞和仅用缀合的二抗染色的细胞。所有的与抗体的孵育在4℃下进行30分钟，之后将细胞用染色缓冲液进行洗涤。将用未缀合的一抗染色的样品在4℃下与缀合的PE或-APC标记的二抗一起另外孵育30分钟。对于所用的二抗的列表，请参见表I。将洗涤过的细胞离心并将沉淀物再悬浮于染色缓冲液中，并用FACS Array(BDBiosciences)仪器，在至少10,000次事件时收集，来鉴别细胞表面分子。
实例10
免疫细胞化学分析
将接种于涂覆有0.1％Matrigel(BD)的培养皿上的细胞在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟。将固定过的细胞在室温下用PBS/0.1％BSA/10％正常鸡血清/0.5％Triton X-100封闭1小时，然后在4℃下与一抗在PBS/0.1％BSA/10％正常鸡血清中孵育过夜。表IB示出了一抗以及它们的使用稀释度的列表。在PBS/0.1％BSA中洗涤三次后，将在PBS中稀释度为1∶100的荧光二抗与细胞在室温下孵育1小时以使得能发生结合。对照样品 包括其中忽略了一抗或其中一抗替换为相同浓度的对应匹配阴性对照免疫球蛋白作为一抗的反应物。冲洗染色的样品；将一滴含有二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的 (Invitrogen，CA)加入各样品中以对细胞核进行复染以及用作抗褪色试剂。用NikonConfocal Eclipse C-1倒置显微镜(Nikon，Japan)和10-60倍物镜获取图像。
实例11
未分化的细胞的PCR分析
RNA提取、纯化和cDNA合成：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
实时PCR扩增和定量分析：除非另外说明，否则所有试剂均购自AppliedBiosystems。实时PCR反应用ABI 7900序列检测系统来进行。将 UNIVERSAL PCR MASTER (ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品进行两次以校正吸量误差。使用浓度为200nM的引物和FAM-标记的 探针。用先前由AppliedBiosystem开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源对照将每种靶基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列出如下：Oct3/4(Hs00742896)、SOX-2(Hs00602736)、UTF-1(Hs00747497)、Rex-1(Hs00399279)、连结素43(Hs00748445)、连结素45(Hs00271416)、ABCG2(Hs00184979)、Tert(Hs00162669)、HNF 3β(Hs00232764)、GATA-4(Hs00171403)、Mixl1(Hs00430824)、Sox7(Hs00846731)、AFP(Hs00173490)、Brachyury(Hs00610080)、GSC(Hs00418279_m1)、Pdx-1(Hs00426216)、PTF1a(Hs00603586)、Ngn3(Hs00360700)、NeuroD1(Hs00159598)、胰岛素(Hs00355773)和Glu2(Hs00165775)。Sox17引物用PRIMERS程序(ABI，CA)设计并且是如下序列：Sox17：TGGCGCAGCAGATACCA(SEQ ID NO：1)、AGCGCCTTCCACGACTTG(SEQ ID NO：2)和CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG(SEQ IDNO：3)。在50℃下2分钟，然后在95℃下10分钟的初始孵育后，将样品进 行40次分两个阶段的循环-在95℃进行15秒的变性步骤，然后在60℃下进行1分钟的退火/延伸步骤。用 7000序列检测系统软件进行数据分析。对于每种引物/探针组，测定Ct值，Ct值为荧光强度达到扩增指数区中间的特定值时的循环数。用比较Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到变化的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于基准样品表示的。
实例12
核型分析
通过标准的G显带核型分析来确定H9细胞的核型。对总共100份中期染色体涂片进行了评价(Applied Genetics Laboratories，Inc.)。在所分析的100个细胞中没有发现染色体畸变。细胞遗传学分析显示，该细胞具有正常数目的常染色体并且染色体众数为46。图15描述了从该人胚胎干细胞系H9获得的典型核型。
实例13
在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞培养物
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之，将细胞在ES细胞培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上进行培养，该培养基由补充有20％knockout血清替代品、100nM MEM非必需氨基酸、0.5mM β巯基乙醇、具有4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理亚汇合的MEF细胞3小时以使细胞分裂停滞，然后用胰蛋白酶进行处理并以2×104/cm2接种于0.1％牛明胶涂覆的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将接种于MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在37℃的5％CO2气氛中，在调湿的组织培养箱内进行培养。当汇合时(接种后大约5至7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5至10分钟， 然后用5ml吸管轻轻刮落。以900rpm将细胞离心5分钟，并将沉淀物再次悬浮并将细胞以1∶3至1∶4的比率再次接种在涂覆有生长因子减低的MATRIGELTM(BDBiosciences)的1∶30稀释物的培养皿上。随后将细胞在补充有8ng/ml bFGF和胶原酶的MEF调理过的培养基中培养，并在涂覆MATRIGEL有的培养皿上传代至少五代。将在MATRIGELTM上培养的细胞用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO)、分散酶(BD Biosciences)或Liberase酶(Roche，IN)进行常规的传代。
实例14
在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分 化
如先前在Nature Biotechnology 23，1534-1541(Dec 2005)中所描述的，进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之，将大约60至70％汇合的H9培养物暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM：/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。将H9细胞在涂覆有稀释度为1∶30至1∶10的生长因子减低的MATRIGEL的培养皿上进行培养或在稀释度为1∶30至1∶10的常规MATRIGEL上培养。将培养皿在室温下用MATRIGEL涂覆1小时。
在第5天，通过FACS对该培养物的CXCR4、E-钙粘蛋白、CD9和N-钙粘蛋白表达进行分析并通过实时PCR对该培养物的SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4进行分析。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条的标志物。图17示出了通过FACS测定的CXCR4表达。与较低浓度的MATRIGEL相比较，在涂覆有稀释度为1∶10的MATRIGEL的培养皿上培养的细胞表达的CXCR4有显著的增加。此外，与常规的MATRIGEL比较，生长因子减低的MATRIGEL在定形内胚层细胞的形成中没有如此有效。
图18示出了实时PCR结果，该结果证实，与在MATRIGEL的1∶30稀释物上培养的细胞相比，在涂覆有MATRIGEL的1∶10稀释物的平板上培养的细胞显示定形内胚层标志物得到显著上调。
实例15
在形成定形内胚层后人胚胎干细胞中基因表达改变的微阵列分析
用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从如下人胚胎干细胞培养物分离总RNA：在涂覆有MATRIGEL的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml的激活素A的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天的H9P83细胞；在MEFs上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基另外处理三天的H9P44细胞。每组的对照包括接种于涂覆有MATRIGEL的培养皿上并在用MEF调理过的培养基中培养的细胞或接种于MEFs上并在ES培养基中培养的细胞。
样品制备、杂交以及图像分析根据Affymetrix Human Genome U133Plus2.0Array进行。在归一化和对数转换后，用 软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。每种处理中以及不同处理之间的差异性用Pea rson相关系数进行比较。不同处理之间基因表达概况的方差以及系之间的相关系数在图19中示出。样品之间基因表达的显著差异用方差分析和F-检验进行评价，该F-检验采用小于或等于0.05的校正P-值(Benjamini-Hochberg校正)。在该分析中仅包括具有“存在应答(present call)”的基因。表IV列出了各种样品之间差别为至少5倍的差异表达的基因。列出了显著表达的基因的归一化强度值以及每种基因的平均值的标准偏差。
实例16
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
如先前在Nature Biotechnology 23，1534-1541(Dec 2005)中所描述的进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之，将接种于生长因子减低的MATRIGELTM(1∶30稀释物)上大约60％至70％汇合的H9、H7或H1细胞培养物暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN))的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。除否另外指明，否则在所有后面的实例中，该处理方法将被称为定形内胚层(DE)方案。
同时，也将在MEF饲养细胞上培养的H9、H7或H1细胞暴露于相同的上述DE方案。
在第5天，通过FACS对该培养物的CXCR4、E-钙粘蛋白、CD9、CD99和N-钙粘蛋白(CD56)表达进行分析并通过实时PCR对该培养物的SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4进行分析。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条的标志物。
FACS分析，H-系在小鼠饲养细胞上培养并暴露于DE方案导致DE标志物的稳健表达和CXCR4的稳健表达(图20)。在用DE方案处理后，E-钙粘蛋白的表达显著降低。最后，CXCR4+群体对CD117染色也是阳性的。图21显示，与未经处理过的H7细胞(图21，分图a)和H9细胞(图21，分图b)，定形内胚层标志物显著上调。
与在MEF饲养细胞上培养的H-系不同，在MATRIGELTM(1∶30稀释物)上培养并用定形内胚层方案处理的H-系没有显示定形内胚层标志物的稳健表达。具体地讲，通过FACS以及通过实时PCR分析，与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比，在MATRIGELTM上培养的细胞CXCR4的表达显著降低。定形内胚层标记物的表达遵循一般响应模式，H1大于H9，H9大于H7(图22和23)。根据图22，与H7和H9系相比，H1细胞显示了CXCR4表达的显著增加。注意到在所有情况下，与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比，在MATRIGELTM(1∶30稀释物)上培养的细胞CXCR4的表达较低。图23(分图a-c)示出了实时PCR结果，显示H7系(图23，分图a)和H9系(图23，分图b)中定形内胚层标志物的上调有适度增加。然而，与H7和H9系相比，H1(图23，分图c)系显示出更强劲的定形内胚层标志物上调。
实例17
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- Wnt配体的作用
将H7P44和H9P46胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶10稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A(R&D Systems， MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。在某些培养物中，在整个五天的处理中加入20ng/ml Wnt-3a(目录号1324-WN-002，R&D Systems，MN)、20ng/ml Wnt-5a(目录号654-WN-010，R&D Systems，MN)、25ng/ml Wnt-7a(目录号3008-WN-025，R&D Systems，MN)或25ng/ml Wnt-5b(目录号3006-WN-025，R&D Systems，MN)。图24示出了在存在高浓度(a)AA或(b)AA+20ng/ml Wnt-3a的情况下，H9P46定形内胚层培养物的位相村度成像。图25示出在MATRIGELTM(1∶30稀释物)上培养并暴露于DE方案+Wnt-3a(图25，分图b和d)以及DE方案-Wnt-3a(图25，分图a和c)的H7P44系和H9P46系在第5天通过FACS分析得到的CXCR4表达。与用低血清加高浓度AA处理的DE培养物相比，DE培养物中存在Wnt-3a导致CXCR4(CD184)的稳健表达。图26展示了用低血清+AA+/-Wnt配体处理过的a)H7和b)H9培养物的实时PCR数据。对于这两种H系，加入WNT-3a导致定形内胚层标志物显著上调。相比之下，Wnt 5a、Wnt-5b和Wnt-7a对定形内胚层标志物的表达具有极微的影响。
实例18
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- Wnt-3a的有效剂量
将H9P46胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶10稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A(AA)和10-50ng/ml的WNt-3a(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)和10-50ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培养基另外处理三天。对照培养物未用Wnt-3a进行处理。图27，分图a示出了在不存在Wnt-3a、存在b)10ng/ml Wnt-3a、c)20ng/ml Wnt-3a和d)50ng/mlWnt-3a的情况下在第5天通过FACS分析得到的CXCR4表达。在不存在Wnt-3a时，CXCR4的表达十分低。相比之下，加入10-50ng/ml的Wnt-3a显著增加了CXCR4阳性细胞的数目。此外，加入10ng/ml的Wnt-3a与加入50ng/ml的Wnt-3a一样有效。实时PCR结果(图28，分图a)也证实了该发现。
在独立的研究中，将H9p52细胞接种于1∶30低生长因子MATRIGELTM上。在DE方案开始的2天，使用了一系列Wnt-3a剂量：10ng/ml、5ng/ml和1ng/ml。图28的分图b示出了在5天的处理后DE标志物的PCR分析。实验完成时的细胞数目在图28的分图c中显示。这表明，当使用较高剂量的Wnt-3a时细胞可增殖。通过PCR分析，延长至用Wnt-3a处理5天(5D)对DE标志物几乎没有影响并且不会显著增加细胞数目(图28，分图c)。这些数目表明，用10ng/ml Wnt3a处理2天足以达到最佳的细胞扩增和定形内胚层分化。
实例19
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- GSK-3B抑制剂的效果
为了确定Wnt-3a是通过Wnt途径，将GSK-3抑制剂用于激活Wnt的下游靶标，例如β连环蛋白。将H9P46-P48胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶10稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng激活素-A(AA)和nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基培养基两天，然后用补充有2％FBS、100ng/ml激活素A(AA)和0-1000nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。对照培养物用低血清加高剂量激活素A+/-Wnt-3a进行处理。图29的分图a示出了在不存在Wnt-3a或GSK-3B抑制剂、b)+20ng/ml Wnt-3a、c)+1000nM GSK-3B抑制剂IX、d)+500nM GSK-3B抑制剂IX、e)+100nM GSK-3B抑制剂IX、f)+10nM GSK-3B抑制剂IX、g)+100nMGSK-3B抑制剂IX第1-2天、以及h)+10nM GSK-3B抑制剂IX第1-2天的情况下在第5天时通过FACS分析得到的CXCR4表达。
在不存在Wnt-3a或存在10nm GSK-3B抑制剂时CXCR4的表达十分低。相比之下，加入20ng/ml的Wnt-3a或100-1000nM GSK-3B抑制剂显著增加了CXCR4阳性细胞的数目。此外，加入100nM GSK-3B抑制剂第1-2天与加入100nM GSK-3B抑制剂整个五天的周期一样有效。图30示出了(分图a)H9P48细胞和(分图b)H9P46细胞的定形内胚层标志物的基因表达。
图16描述了本发明的分化方案的概要，其中胚胎干细胞在无饲养细胞系统中分化成定形内胚层。
实例20
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- 在存在GSK-3B抑制剂或Wnt-3a的情况下激活素A的有效剂量。
将H9P49和H1P46胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶10稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)和100nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)或20ng/ml Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。对照培养物用低血清加100ng/ml激活素A进行处理。图31示出了用如下条件处理过的H9P49和H1P46在第5天通过FACS获得的CXCR4的表达：a)：10ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天；b)：100ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天；c)：100ng/ml激活素A处理全部五天加100nM GSK-3B抑制剂IX处理开始两天；d)：10ng/ml激活素A处理全部五天加100nM GSK-3B抑制剂IX处理开始两天；e)：100ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天，以及f)：10ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天。图31的分图a-d是关于H9P49细胞而分图e-f是关于H1P46细胞。图32示出了用10、50或100ng/ml激活素A加20ng/ml Wnt-3a处理过的H9P49培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图a：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达，分图b：SOX-17和GATA4的表达。看起来，通过使用50ng/ml的AA+20ng/ml的Wnt-3A或100nM GSK-3B抑制剂IX可获得定形内胚层标志物的稳健表达。低剂量的激活素A导致形成胚外内胚层。
实例21
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- Wnt-3a和GSK-3B抑制剂的组合
将H9P53胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS、100ng/ml激活素A(AA)和100nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)+/-20ng/ml Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS、10-100ng/ml激活素-A(AA) 的DMEM/F12培养基另外处理三天。同时，将H9P53培养物用25ng/mlBMP-4(目录号314-BP-010，R&D Systems，MN)+/-20ng/ml Wnt-3A+/-100ng/ml激活素A进行处理。对照培养物用低血清加100ng/ml的激活素A进行处理。图33示出了用下列条件进行处理在第5天通过FACS获得的CXCR4表达：a)：100ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天且用25ng/ml BMP-4处理第3-5天；b)：100ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A处理开始两天；c)：100ng/ml激活素A处理全部五天加100nM GSK-3B抑制剂IX处理开始两天；d)：20ng/ml Wnt-3a+25ng/ml BMP-4处理全部五天；e)：100ng/ml激活素A处理全部五天加20ng/ml Wnt-3A+100nm GSK-3B抑制剂IX处理开始两天，以及f)：100ng/ml激活素A+25ng/ml BMP-4处理全部五天。图34示出了通过实时PCR测定的、用10或100ng/ml的激活素A加20ng/ml的Wnt-3a或100NMGSK-3B抑制剂处理过的人胚胎干细胞系H1在传代46代时培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC和POU5F(Oct-4)的表达，以及分图(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。图35示出了通过实时PCR测定的、用50或100ng/ml的激活素A加10或100nMGSK-3B抑制剂处理过的人胚胎干细胞系H9在传代49代时培养物的定形内胚层标志物的基因表达：分图(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达，以及分图(b)：SOX-17和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理过的细胞的增加倍数。图36示出了用激活素A、Wnt-3a、GSK-3抑制剂和BMP-4的组合处理过的H9P53培养物的定形内胚层标志物的基因表达：a)AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和SOX7的表达，以及b)SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。将BMP-4加入DE方案看起来诱导了中胚层标志物BRY的形成，并且与在存在激活素A的情况下单独加入各试剂相比，Wnt-3A和GSK-4B抑制剂的组合看起来没有导致定形内胚层标志物显著上调。
实例22
在MEFs上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化-Wnt-3a、激活素A、Wnt-5a、 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、IL-4和SDF-1在低血清中的组合
将H9P44细胞接种于先前用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)涂覆的6孔板上。将细胞在ES细胞培养基中培养直至70至80％汇合，该ES细胞培养基由补充有20％knockout血清替代品、100nM MEM非必需氨基酸、0.5mM β-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺(全部购自Invitrogen/GIBCO)和8ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(R&DSystems)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。
为了形成DE，将细胞在存在或不存在激活素A(100ng/ml)以及下面详细描述其他生长因子的情况下进行处理。将生长因子加入以分步方式浓度渐增的FBS中，如下面的方案中指出的那样：
第0天：DMEM/F12培养基中0％的FBS
第1天：DMEM/F12培养基中0.5％的FBS
第2天：DMEM/F12培养基中2％的FBS
第3天：采集细胞用于FACS分析和RT-PCR。
所有生长因子均购自R&D Systems，MN。下面示出了用于每个处理组的生长因子的详细描述和浓度。
1.对照-没有加入生长因子
2.激活素A(100ng/ml)
3.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt 5a(10ng/ml)
4.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)+BMP2(100ng/ml)
5.激活素A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
6.激活素A(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)
7.激活素A(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
8.激活素A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
9.IL-4(10ng/ml)
10.SDF1a(20ng/ml)
11.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)
12.BMP2(100ng/ml)+BMP-4(100ng.ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
13.激活素A(100ng/ml)+BMP-2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
14.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)
15.激活素A(100ng/ml)+(SDF1a(20ng/ml)
16.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt-5a(10ng/ml)+Wnt-7a(10ng/ml)
17.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
结果：
在DE方案处理的第3天采集细胞。为了进行分析，将处理过的细胞的等分试样用于RT-PCR的RNA制备，剩下的细胞用于FACS分析。CXCR4的频率(％)在图37中示出。上述生长因子的加入没有比用低血清中的100ng/mlAA处理增强CXCR4的表达。
对于RT-PCR分析，对细胞的所选定形内胚层标志物组的表达进行分析。将所示结果相对于在基础培养基中生长并且未用激活素A或任何其他生长因子处理过的细胞进行校准。与FACS数据一致，表V显示，将生长因子(例如Wnt-3a)加入用低血清中的高剂量活化素A处理过的培养物定形内胚层标志物没有显著的上调。这与显示在存在激活素A、WNT3A和低血清的无饲养细胞条件下培养的ES细胞中DE标志物显著增加的先前实例相反。
实例23
在涂覆有MATRIGEL或人纤粘蛋白的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形 内胚层的分化
使H9P55细胞在人纤粘蛋白或常规生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences)上生长和分化。将1ml含有1ug/ml的人纤粘蛋白(R&Dsystems，MN)的DMEM/F12培养基(Invitrogen/GIBCO)加入组织培养物处理过的6孔培养皿的每个孔中。或者，将常规生长因子MATRIGELTM在DMEM/F12培养基中以1∶10进行稀释并将1ml稀释过的MATRIGELTM加入组织培养物处理过的6孔培养皿的每个孔中。将细胞用胶原酶进行处理。在细胞达到80％汇合后，将它们进行如下处理：用含有10ng/ml小鼠重组Wnt3a(R&D)和100ng/ml激活素A(R&D)的0.5％FBS处理2天.随后用2％FBS加 100ng/ml激活素A处理3天。图38的分图a-b示出了分别在纤粘蛋白和MATRIGEL上培养的胚胎干细胞的CXCR4表达。实时PCR结果(图39)证实，在涂覆有纤粘蛋白和MATRIGELTM的板上定形内胚层形成相当。
实例24
在涂覆有各种浓度的MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层的分化
将大约60至70％汇合的H9培养物暴露于补充有0.5％FBS、20ng/mlWnt-3a和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS、20ng/ml Wnt-3a和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。将H9细胞在涂覆有稀释度为1∶60至1∶10的常规MATRIGEL的板上进行培养。将培养皿在室温下用MATRIGEL涂覆1小时。
实时PCR的结果在图40中示出。用低血清、激活素A和Wnt-3a处理人胚胎干细胞导致了CXCR4、GATA4、Goosecoid、HNF-3β和SOX-17基因的表达，表明细胞正向定形内胚层阶段分化。然而，看起来MATRIGELTM涂层存在Wnt-3a浓度没有在分化中起着重要的作用。
实例25
在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养并随后在MEFs上培养的人胚胎干细 胞向定形内胚层的分化-Wnt-3a的作用
将来自在MATRIGELTM上培养的人胚胎干细胞系H9的细胞接种于ES培养基中的MEF饲养细胞上。当细胞达到大约60至70％汇合时，将它们暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。另外的处理组包括20ng/ml的Wnt-3a处理全部五天+10-100ng/ml的激活素A。
在第3天和第5天，通过实时PCR对该培养物的SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β、GATA4、hTERT和Oct4进行分析。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条的标志物。hTERT和Oct-4分别为自我更新和多潜能性的标 志物。实时PCR结果在图41的分图a-d中示出。还在第3天和第5天进行FACS分析。分析了CXCR-4和CD9的表达水平并在图41的分图e中描述。
在不存在Wnt-3a时，在100ng/ml激活素A中培养的细胞的AFP表达水平与在未处理过的对照中所见的相似。然而，向在100ng/ml激活素A中培养的细胞加入Wnt-3a，AFP的表达增加，其随时间推移而增加。当使用较低浓度的激活素A时，无论存在Wnt3a与否，AFP表达都十分高(图41，分图a)。这表明，高浓度的激活素A是防止细胞向胚外组织分化所必须的。
在第3天，通过FACS分析，在用高浓度激活素A进行处理但没有用Wnt-3a处理过的样品中CXCR4阳性细胞范围为群体的32-42％，与之相比，在用高浓度激活素A和Wnt 3a处理过的样品中为群体的23-33％(图41，分图e)。到处理的第5天，28-32％的用高浓度激活素A进行处理但没有用Wnt-3a处理过的细胞表达CXCR4，与之相比，43-51％的用高浓度激活素A和Wnt3a处理过的细胞表达CXCR4(图41，分图f)。在用低浓度的激活素A处理过的细胞中，与Wnt-3a处理组相比(3至4％)未使用Wnt-3a的处理组中有更多的CXCR4阳性细胞(11至20％)(图41，分图g)。总体上，Wnt-3a看起来对在MEFs上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化没有起到显著作用。这表明，饲养层可能分泌足够的Wnt-3a或类似配体来增强激活素A所诱导的定形内胚层形成。
实例26
在用Wnt抑制剂DKK-1处理后在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚 胎干细胞向定形内胚层的分化
为了确定加入Wnt-3a是否引起分化的增加，将Wnt-3信号传导的抑制剂加入至该培养物中。将大约60至70％汇合的H9培养物暴露于补充有0.5％FBS、20ng/ml Wnt3a、100ng/ml Dikkopf-1(DKK-1)和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。将H9细胞在涂覆有稀释度为1∶30的MATRIGEL的板上培养。将培养皿在室温下涂覆MATRIGEL 1小时。
在第5天，通过实施PCR对培养物的SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β、GATA4、hTERT和Oct4进行分析。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而 GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条的标志物。hTERT和Oct-4分别为自我更新和多潜能性的标志物。结果在图42中示出。
在存在Wnt-3a的情况下，细胞可表达所有定形内胚层标志物CXCR4、GATA4、HNF-3β和SOX17。还检测到原条形成的标志物例如goosecoid的水平比在未处理过的对照中所检测到的要高。随着DKK1的加入，上述分化标志物的表达水平明显降低至与未处理过的细胞的水平相似。
实例27
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养并在低血清加激活素A和±Wnt-3a
中分化的H9胚胎干细胞的DE标志物的免疫荧光染色根据实例10针对SOX-17、HNF-3B、GATA-4、N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白对H9细胞的第5天DE培养物进行染色。用DAPI对所有的细胞核进行复染。与不存在Wnt-3a时分化的培养物相比，20ng/ml Wnt-3a导致对SOX-17、HNF-3β和GATA-4阳性的染色细胞核的数目显著较大。此外，加入Wnt-3a导致e-钙粘蛋白表达显著丧失并增强了N-钙粘蛋白的表达(图43，分图和图43，分图b)。
实例28
在MEFS或MATRIGEL上形成定形内胚层后人胚胎干细胞中基因表达改变的微阵列 分析
用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从如下胚胎干细胞培养物分离总RNA：A)在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的板上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml的激活素A的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天的H9P33细胞；B)在MEFs上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基另外处理三天的H9P44细胞，和C)在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的板上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A加20ng/ml Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天的H9P48细胞。每组对照包括接种于涂覆有MATRIGEL的培养皿上并在用MEF调理过的培养基 中培养的细胞或接种于MEFs上并在ES培养基中培养的细胞。所有的组均包括三份生物复制物并且每份生物复制物在两个独立的基因芯片上重复。
样品制备、杂交以及图像分析根据Affymetrix Human Genome U133Plus2.0Array进行。在归一化和对数转换后，用 软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。样品之间基因表达的显著差异用方差分析和F-检验进行评价，该F-检验采用小于或等于0.05的校正P-值(Benjamini-Hochberg校正)。在该分析中仅包括在至少一组中具有“存在应答”的基因。表VI列出了在A组、B组和C组之间显示至少5倍差异的基因的平均归一化的对数转化过的信号强度以及每种基因的校正P-值。
实例29
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的SA002ES系向定形内胚层的分化
将先前在涂覆有MATRIGEL(1∶30稀释物)的板上在补充有8ng/ml的MEF-CM中培养至少三代的SA002P38细胞(Cellartis，Sweden)暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)+/-20ng/ml的Wnt-3a或100nm GSK-3B IX抑制剂的DMEM/F12培养基两天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。实时PCR结果在图44的分图a和b中示出。与H1、H7和H9系类似，SA002系也需要加入Wnt-3A来稳健表达DE标志物。CXCR4的表达在图45中示出：a)AA处理；b)AA+Wnt-3a；c)AA+GSK-3B抑制剂。
实例30
在涂覆有人血清的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
使人胚胎干细胞系H1在第55代的培养物在涂覆有人血清(Sigma，#H1388，MO)的板上生长和分化。将0.5ml的人血清加入组织培养物处理过的6孔板的每个孔中，在室温下孵育1小时，并在抽吸后加入人胚胎干细胞。在细胞达到80％汇合后，将它们进行如下处理：用含有10ng/ml小鼠重组Wnt3a(R&D)或100nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)和100ng/ml激活素A(R&D)的0.5％FBS处理2天。随后用2％FBS加 100ng/ml激活素A处理3天。然后通过实时PCR对培养物进行分析(图46，分图a和b)。与仅用活化素A处理的细胞相比，用激活素A+GSK-3B抑制剂或Wnt-3A处理过的细胞观察到定形内胚层标志物的稳健表达。这些发现与我们对在包覆有MATRIGELTM或人纤粘蛋白的板上培养的人胚胎干细胞的发现类似。
实例31
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化- 对多种GSK-3B抑制剂的评价
对多种市售的GSK-3B抑制剂在从人胚胎干细胞形成DE中的效果进行了评价。对100nM的如下GSK-3B抑制剂进行了评价：GSK-3B抑制剂VIII(目录号361549，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂XI(目录号361553，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂XII(目录号361554，Calbiochem，CA)。将H1P54ES细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A(AA)+/-多种GSK-3B抑制剂的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。对照培养物用低血清加高剂量激活素AA进行处理。图47的分图a和b示出了在第5天定形内胚层标志物的基因表达。与GSK-3B抑制剂VIII和XII相比，GSK-3B抑制剂IX和XI在诱导DE形成中都有效。
实例32
由在无饲养细胞条件下培养的人胚胎干细胞形成胰腺内胚层-对视黄酸类似物的 评价
将H9P49胚胎干细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS，20ng/ml Wnt-3a(目录号1324-WN-002，R&D Systems，MN)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。在第5天，收集细胞用于通过FACS和实时PCR进行评价。如在前面的实例中所指出的那样，这些方案导致定形内胚层标志物(例如CXCR4和SOX-17)的稳健上调。将在第5天得到的定形内胚层细胞 暴露于如下培养基条件以诱导胰腺内胚层形成：在补充有2％FBS和1μM全反式视黄酸(RA)(目录号R2625，Sigma，MO)、或0.1-10μMAM-580(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘)甲酰胺基]苯甲酸，目录号A8843，Sigma，MO)、或0.1-1μM TTNPB(4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘)-1-丙烯基]苯甲酸；芳维甲酸，目录号T3757，Sigma，MO)的DMEM/F12中培养3天。AM-580和TTNPB为对视黄酸受体具有亲和力的视黄酸类似物。RA处理后，在补充有2％FBS和20-50ng/ml bFGF(目录号F0291，Sigma，MO)的DMEM/F12培养基中另外处理三天。采集培养物并收集mRNA的样品用于分析。
基因表达分析(图48，分图a-d)表明加入1μM RA，然后暴露于bFGF使胰腺内胚层标志物，例如PDX-1显著上调。此外，该方案导致前肠内胚层标志物例如CDX-2和AFP的稳健表达。以1μM的浓度，加入RA类似物导致相当的胰腺内胚层和前肠内胚层标志物。然而，与全反式视黄酸比较，加入1μM RA类似物导致AFP的表达更稳健。然而，加入10μM AM-580抑制了AFP和CDX-2的表达，而保持了PDX-1的表达。
实例34
Wnt-3a处理对人胚胎该细胞中细胞因子表达的影响
使用蛋白质阵列来分析Wnt-3a处理对细胞因子表达的影响。根据实例15中所描述的方法对人胚胎干细胞系H9的细胞进行培养。在传代第54代后，使细胞在0.5％FBS DMEM/F12中在存在100ng/ml激活素A+/-10ng/ml Wnt 3a的情况下分化2天。随后将细胞在100ng/ml激活素A和2％FBS DMEM/F12培养基中另外培养三天。在第5天结束时，通过FACS测定每个处理组的CXCR4表达。用激活素A处理过的细胞仅有1％的细胞表达CXCR4。用激活素A和Wnt3a处理过的细胞具有73％的细胞对CXCR4表达显阳性。
使用哺乳动物细胞溶解试剂盒(Sigma-Aldrich，MO)，从每个处理组制备细胞溶解物。从每个处理组收集调理过的培养基并浓缩。细胞因子阵列分析用RayBiotech，GA提供的细胞因子阵列板(Cytokine Array panel)(http://www.raybiotech.com/)来完成。表VII列出了数据归一化和本底扣 除后的细胞因子、生长因子和受体表达。对于每个阵列板，还包括了阳性和阴性对照。所示出的数据为每个细胞处理组的两个独立样品(1，2)。
在Wnt-3a处理细胞调理过的培养基中可见血管生成因子、IGFBP-1和EGF的明显上调。在Wnt-3a处理过的细胞溶解物中许多蛋白质得到上调，包括IGFBP-1、TGFbeta-1和TGFbeta-3。可将这些上调的蛋白质加回进分化培养基中以替代或增强Wnt-3a对定形内胚层形成的效果。
实例35
在涂覆有MATRIGEL的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化： Wnt1的作用
将H1P55ES细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿中培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素A+/-10-20ng/ml的WNT-1(PeproTech，NJ，目录号120-17)的DMEM/F12两天，随后用补充有2％FBS、100ng/ml激活素A(AA)和+/-10或20ng/ml的WNT-1的DMEM/F12培养基另外处理三天。测试了如下的WNT1+AA的组合：
a)0.5％FBS+DM-F12中的20ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DM-F12+100ng/ml AA处理第三天；b)0.5％FBS+DM-F12中的20ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DM-F12+100ng/ml AA处理第3-5天；c)0.5％FBS+DM-F12中的10ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DMF12+100ng/ml AA处理第三天；d)0.5％FBS+DM-F12中的10ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DM-F12+100ng/ml AA处理第3-5天；e)0.5％FBS+DM-F12中的20ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DM-F12+100ng/ml AA+20ng/ml WNT1处理第三天；f)0.5％FBS+DM-F12中的20ng/ml WNT1+100ng/ml AA处理第1-2天，随后用2％FBS+DM-F12+100ng/ml AA+20ng/mlWNT1处理第3-5天。图49的分图a和b示出了在用低血清、AA和Wnt-1处理H1细胞后定形内胚层标志物的实时PCR数据。在存在100ng/ml的AA的情况下加入20ng/ml的Wnt1导致定形内胚层标志物(Bry、CXCR4、GSC、SOX17、HNF-3B和GATA-4)显著上调。
实例36
葡萄糖对胰腺内分泌分化的影响
胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌细胞的效率取决于许多因素，包括例如基础培养基的选择，或葡萄糖的浓度。检验了葡萄糖浓度对衍生自胚胎干细胞的胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌细胞的影响。
通过改变基础培养基来变更葡萄糖浓度：在分化成胰岛素内胚层细胞前，根据实例1中描述的方法对未分化的人胚胎干细胞(H1和H9)的培养物进行培养。通过在不存在血清的情况下在含有100ng/ml的激活素A的RPMI中培养胚胎干细胞，使胚胎干细胞分化成胰内胚层细胞。此后，将细胞在含有100ng/ml的激活素A和0.2％FBS的RPMI中另外培养两天。在该处理后，将培养基替换为含有2％FBS、FGF10(50ng/ml)和KAAD-环巴胺(250nM)的RPMI。将细胞在该培养基中培养四天。此后，将培养基替换为补充有1x B27、含有全反式视黄酸(2μM)、FGF10(50ng/ml)和KAAD-环巴胺(0.25μM)的培养基四天以诱导胰腺内胚层细胞的形成。胰内胚层细胞的产率在用低葡萄糖DMEM或DMEM/F12培养基处理过的培养物中没有显著不同。
通过用毒蜥外泌肽4和HGFP处理细胞，胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌细胞。将Excendin 4(50ng/ml)和HGF(50ng/ml)加入低葡萄糖DMEM中十天或加入DMEM/F12培养基10天。两种培养基均补充有1x B27。采集培养物并收集mRNA的样品用于分析。将样品相对根据NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中所公开的方法获得的胰腺内胚层进行归一化。
通过实时PCR分析胰岛素的表达。如图50的分图a和b中所示，与在DMEM-低葡萄糖中处理过的细胞相比，在用DMEM/F12处理过的细胞中胰岛素和高血糖素基因表达强烈增加。还通过免疫组织化学对胰岛素表达进行了分析(图51)。与DMEM-低葡萄糖相比，在DMEM/F12培养基中处理导致胰岛素阳性细胞百分比较大(图51，分图a和b)。胰岛素阳性细胞也是PDX-1阳性(分图c)。
葡萄糖浓度的改变：在分化成胰岛素内胚层细胞前，根据实例1中描述的方法对未分化的人胚胎干细胞(H1和H9)的培养物进行培养。通过在不存在血清的情况下在含有100ng/ml的激活素A的RPMI中培养胚胎干细 胞，使胚胎干细胞分化成胰内胚层细胞。在这以后，将细胞在含有100ng/ml的激活素A和0.2％FBS的RPMI中另外培养两天。在该处理后，将培养基替换为含有2％FBS、FGF10(50ng/ml)和KAAD-环巴胺(250nM)的RPMI。将细胞在该培养基中培养四天。此后，将培养基替换为补充有1xB27、含有全反式视黄酸(2μM)、FGF10(50ng/ml)和KAAD-环巴胺(0.25μM)的CMRL四天以诱导胰腺内胚层细胞的形成。用5、10或20mM葡萄糖补充该培养基。衍生自用5、10或20mM葡萄糖处理过的H9胚胎干细胞的培养物中胰腺内胚层细胞的产率没有显著差别(图52，分图a)。
通过用补充有1x B27、毒蜥外泌肽4(50ng/ml)和HGF(50ng/ml)的CMRL处理细胞两天、四天或10天，胰腺内胚层在5、10或20mM葡萄糖中分化成胰腺内分泌细胞。采集培养物并收集mRNA的样品用于分析。将样品相对根据Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中所公开的方法获得的胰腺内胚层进行归一化。
图52的分图b-g示出了葡萄糖对衍生自人胚胎干细胞系H9中Ngn-3、NeuroD-1、Nkx2.2、Pax-4、胰岛素和高血糖素表达的影响。Ngn3是涉及决定胰腺内分泌命运的第一转录因子，而NeuroD1是Ngn3的直接靶标。葡萄糖刺激Ngn3mRNA水平和NeuroD1mRNA水平两者的剂量依赖性增加。另外两个关键性胰腺标志物Nkx2.2和Pax4也显示了类似的表达模式(图52，分图d和e)。在用10mM葡萄糖处理10天的细胞中观察到最佳的胰岛素和高血糖素的表达(图52，分图f和g)。
在衍生自人胚胎干细胞系H1的培养物中观察到Ngn-3、NeuroD-1、Nkx2.2、Pax-4的类似结果(表VIII)。然而，在用20mM葡萄糖处理10天的细胞中观察到最佳的胰岛素和突触素表达(表VIII)。
通过本发明方法形成的胰岛素表达细胞的C-肽释放：对衍生自在2、10或20mM葡萄糖中处理过的H1细胞的胰岛素阳性细胞中葡萄糖介导的c-肽释放进行监控。为了引起c-肽释放，首先将细胞与具有碳酸氢盐和HEPES的克-林二氏溶液(KRBH；129mM NaCl、4.8mMKCl、2.5mM CaCl2、1.2mMKH2PO4、1.2mM MgSO4、5mM NaHCO3、10mM HEPES、0.1％BSA)一起孵育1小时。然后弃去培养基并替换为含有2mM D-葡萄糖的克-林二氏溶液。用20mM葡萄糖或0.5mM IBMX刺激细胞1小时(全部购自Sigma)。通过将刺激上 清液中的C-肽浓度除以基础上清液中的C-肽浓度计算出每种培养物的刺激倍数。
BMX刺激的C-肽释放为1.2至3倍(图53)。20mM葡萄糖没有刺激C-肽释放。在于2、10和20mM葡萄糖中形成的胰岛素阳性细胞之间没有观察到C-肽分泌有显著差异。
总起来开看，我们的数据表明，葡萄糖可诱导内分泌标志物Ngn3和NeuroD1的剂量依赖性上调，说明葡萄糖可诱导人胚胎干细胞剂量依赖性地分化成胰腺内分泌细胞。胰岛素的表达也以剂量依赖性的方式受葡萄糖的调节。
将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由根据专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。
<110>Xu，Jean
<120>人胚胎干细胞的分化
<130>LFS5065USNP
<140>US 12/183,656
<141>2008-07-31
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>1
tggcgcagca gatacca 17
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<220>
<223>合成构建体
<400>3
ccagcatctt gctcaactcg gcg 23

Claims (28)

1.一种产生胰腺内分泌细胞的方法，包括在补充有浓度为10mM至20mM的葡萄糖的培养基中培养并用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和肝细胞生长因子（HGF）的组合处理人胰腺内胚层细胞而使分离的人胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人胰腺内胚层细胞是从人多能干细胞分化而来。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人胰腺内胚层细胞衍生自定形内胚层细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述人胰腺内分泌细胞衍生自人多能干细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中使所述人多能干细胞分化成人定形内胚层细胞，然后进一步分化成人胰腺内胚层细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖是以10mM的浓度使用。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖是以20mM的浓度使用。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合处理2天至30天。
9.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合培养2天至20天。
10.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合处理2天至10天。
11.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合处理10天。
12.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合处理4天。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽4和HGF的组合处理2天。
14.根据权利要求6所述的方法，其中将细胞用葡萄糖处理2天至30天。
15.根据权利要求7所述的方法，其中将细胞用葡萄糖处理2天至30天。
16.一种使人多能干细胞分化成人胰腺内分泌细胞的方法，包括如下步骤：
a.培养所述人多能干细胞，所述多能干细胞由人胚胎干细胞系H1、H7、H9和BG01v组成；
b.通过用激活素A处理所述人多能干细胞，使所述人多能干细胞分化成人定形内胚层细胞，
c.通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理所述定形内胚层细胞，使所述人定形内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞，并且
d.通过在补充有浓度为10mM至20mM的葡萄糖的培养基中培养并且用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和肝细胞生长因子（HGF）的组合处理人胰腺内胚层细胞而使所述人胰腺内胚层细胞分化成人胰腺内分泌细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述葡萄糖是以10mM的浓度使用。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述葡萄糖是以20mM的浓度使用。
19.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理2天至30天。
20.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理2天至20天。
21.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理2天至10天。
22.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理10天。
23.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理4天。
24.根据权利要求16所述的方法，其中将细胞用(i)γ分泌酶抑制剂、或(ii)毒蜥外泌肽 4和HGF的组合处理2天。
25.根据权利要求21所述的方法，其中将细胞用葡萄糖处理2天至30天。
26.根据权利要求22所述的方法，其中将细胞用葡萄糖处理2天至30天。
27.根据权利要求1-15任一项的方法获得的人胰腺内分泌细胞在制备用于治疗患有糖尿病的患者的药物的中用途。
28.根据权利要求16-26任一项的方法获得的人胰腺内分泌细胞在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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