KR101331510B1 - 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 인간 배아줄기세포용 배지에 있어서 포도당의 함량을 선택적으로 감소시킨 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포용 배지 조성물을 제공한다. 특히, 본원 발명은 저 농도의 포도당을 함유하는 것을 기본으로 하며 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포 또는 세포괴를 생산하기 위하여 각 단계별 분화과정을 유도할 수 있게 고안된 배지 조성물을 제공한다.

또한 본원 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포 또는 세포괴로의 분화 유도 방법, 그리고 이에 의해 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴에 관한 것이다.

본원 발명에 따르면, 포도당이 저 농도로 함유된 배지 조성물을 사용함으로써 세포가 배양 과정에서 고농도의 포도당 환경에 장기간 노출되면서 얻어지는 최종 단계의 인슐린 생산세포에서 나타날 수 있는 인슐린 내성(tolerance)을 감소시킬 수 있다. 이러한 배지를 사용한 분화 유도는 인간의 발생과정을 모방하면서 분화를 가속화시켜 분화 유도의 효율성을 도모하고 수율을 높이며 분화에 걸리는 시간을 최소화할 수 있다. 또한, 이렇게 얻어지는 인슐린 생산세포는 세포 대체 치료법의 수단은 물론, 약물의 스크리닝, 발생기전의 연구 등 다양한 영역에서 상업적으로 이용될 수 있다.

인슐린 생산세포, 인간 배아줄기세포, 인슐린 생합성, 췌장, 베타세포, 제1형 당뇨병, 글루코오스

Description

저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지 조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린 생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고 그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴{Media compostions containing low concentrations of glucose useful for human embryonic stem cells, differentiation method of human embryonic stem cells into insulin-producing cells or cell clusters using thereof, and insulin-producing cells or cell clusters differentiated thereby}

도 1은 7.8mM 포도당 배지에서 자라는 인간 배아 줄기세포의 군집(colony)의 현미경 사진이며;

도 2는 7.8mM 포도당 배지와 17.5mM 포도당 배지에서 자라는 인간 배아 줄기세포의 성장속도를 비교한 그래프이며;

도 3은 본원 발명에 의한 인간 배아 줄기세포의 인슐린 생산세포로의 분화과정 중 7.8mM 포도당 배지에서 생성되는 낭포형 배상체(cystic embryoid body)의 현미경 사진이며;

도 4는 포도당 농도를 17.5mM로 높인 고 포도당 배지를 사용하여, 도 3과 동일한 방법으로 분화를 유도였을 때 얻어지는 배상체(embryoid body)의 현미경 사진이며;

도 5는 본원 발명에서 사용된 베타셀룰린(betacellulin)에 의해 인슐린 생산세포의 전구체는 증식하면서, 네트워크를 이루고 있는 신경세포 전구체는 사멸하는 현미경 사진이며;

도 6은 본원 발명에서 사용된 베타셀룰린과 비교하여, FGF(fibroblast growth factor)-2에 의해 네트워크를 이루고 있는 신경세포 전구체가 왕성하게 성장하는 현미경 사진이며;

도 7은 본원 발명에 의한 인간 배아 줄기세포의 인슐린 생산세포로의 분화과정 중 7.8mM 포도당 배지에서 분화 유도된 세포의 단계별 분화 정도를 알아보기 위한 RT-PCR 산물의 겔 전기영동 사진이며 ;

도 8은 본원 발명에 의해 7.8mM 포도당 배지에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴에 대하여, 인슐린 생합성의 부산물인 C-펩타이드 발현을 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)으로 확인한 현미경 사진이며;

도 9는 본원 발명에 의해 7.8mM 포도당 배지에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴에 대하여, 인슐린 생산세포의 특징 중의 하나인 전사인자로서 Pdx-1의 발현을 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 확인한 현미경 사진이며;

도 10은 본원 발명에 의해 7.8mM 포도당 배지에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴에 대하여, C-펩타이드를 발현하는 세포의 비율을 측정하기 위하여, 유세포분석법(flow Cytometry, fluorescence-activated cell sorting; FACS)을 수행한 결과이며;

도 11은 포도당 농도를 17.5mM로 높인 고 포도당 배지를 사용하여, 도 10과 동일한 방법으로 분화를 유도였을 때 얻어지는 인슐린 생산세포괴에 대하여, C-펩타이드를 발현하는 세포의 비율을 측정하기 위하여, 유세포분석법(flow Cytometry)을 수행한 결과이며; 그리고

도 12는 본원 발명에 의해, 7.8mM 포도당 배지와 17.5mM 포도당 배지 각각에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴에 대하여, C-펩타이드의 함량을 측정하여 비교한 그래프이다.

<기술분야>

본원 발명은 인간 배아줄기세포용 배지에 있어서 포도당의 함량을 선택적으로 감소시킨 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포용 배지 조성물을 제공한다. 특히, 본원 발명은 저 농도의 포도당을 함유하는 것을 기본으로 하며 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포 또는 세포괴를 생산하기 위하여 각 단계별 분화과정을 유도할 수 있게 고안된 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본원 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포 또는 세포괴로의 분화 유도 방법, 그리고 이에 의해 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴에 관한 것이다.

<종래의 기술>

당뇨병(Diabetes Mellitus)은 각종 급-만성 합병증을 유발하여 환자 개인에 게는 여러 질병 및 장애를 초래하여, 조기 무능력과 조기 사망을 유발하는 질환으로, 사회적으로는 의료비 지출의 증가와 함께 노동력 상실에 따른 사회적 부담을 가중시키고 있다.

WHO가 1997년 World Health Report에서 추정한 바에 따르면, 당뇨병의 환자 수는 2025년에는 약 3억 명으로 급증할 것이며, 특히 아시아, 아프리카 등 개발도상국가에서 생활방식의 서구화에 따른 당뇨병 유행(diabetes epidemic)에 직면하게 될 것으로 보았고, 국내의 당뇨병 역학 연구에서도 30세 이상의 한국인의 당뇨병 유병률이 8-9%로 추정되는 등, 현대사회에서 급속히 증가하는 추세에 있는 것이 특징이다.

당뇨병의 치료는 주로 인슐린요법에 의존하고, 경구용 혈당강하제, 인슐린 분비촉진제, 인슐린 센서타이저 등을 사용하며, 식사요법과 운동요법을 병행하는 것을 원칙으로 하지만, 현대의학으로는 완치가 불가능하다고 판단되며, 궁극적인 완치법으로 생각해 볼 수 있는 것은 췌장소도세포의 이식(transplantation of pancreatic islets)으로 생각되지만, 이는 공여자의 절대적인 부족과 지속적인 면역 억제제(immunosuppressants)의 사용이 뒤따르는 문제점을 내포하고 있다.

배아 줄기세포에 대한 활발한 연구는 전분화능(pluripotency)에 기초하여 세포 대체요법(cell replacement therapy)의 다양한 문제점을 극복할 수 있는 세포의 공급원(source)으로 기대를 모으기 시작하였다. 특히, 이 세포로부터 췌장 베타세포의 기능을 갖는 인슐린생산세포로의 분화 연구는 Lumelsky 등(Science 292:1389, 2001)이 마우스 배아 줄기세포의 췌장 섬세포(islet cells)와 유사한 인슐린 분비 구조로의 분화를 보고하였고, Hori 등(PNAS 99:16105, 2002)은 앞서 발표된 방법에 PI-3 kinase 억제 인자를 도입하여 얻은 마우스 배아 줄기세포 유래의 인슐린 생산세포가 스트렙토조토신에 의해 유도된 마우스의 당뇨병 모델에서 고혈당상태를 조절하여 정상화한다는 결과를 발표하였다.

1998년, Thomson 등이 인간 포배로부터 인간 배아 줄기세포를 확립하면서, 이를 분화시켜 인간 인슐린 생산세포를 얻으려는 노력이 활발히 진행되어 왔으나, 인간 배아 줄기세포는 줄기세포 자체의 특성을 유지하고, 성체세포로 분화되는 데에 필요한 신호체계가 마우스 배아줄기세포와는 상당히 다르다는 것이 알려지게 되었다. 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린 생산세포를 얻고자 하는 시도로서, Assady 등(Diabetes 50:1691, 2001)은 이 세포의 자발적인 분화과정에서 면역세포화학염색법(immunocytochemistry) 및 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 통하여 인슐린 생산세포를 탐지하였다고 보고하였고, 이후 같은 그룹에 의하여 Lumelsky 등의 분화방법을 응용하여 인슐린 생산세포를 만들었다는 보고가 있었으나 (Stem Cells 22:265, 2004), 인슐린 생산량과 분비능에서의 한계는 여전하였다.

더욱이, 지금까지 여러 논문에서 면역세포화학염색법에 의해 관찰되었던 인슐린이 세포내에서 생합성된 것이라기보다는, 배양배지 내에 존재하는 인슐린이 세포로 흡수[uptake]되었다가, 고 포도당이외의 다른 자극에 의해 다시 배지로 유리[release]되는 것이며, 특히 이들은 세포사멸(apoptosis)의 과정을 겪고 있는 건강하지 못한 세포라는 주장이 제기되었다 (Sipione 등, Diabetologia 47:499, 2004; Hansson 등, Diabetes 53:2603, 2004; Rajagopal 등 Science 299:363, 2003). 이러한 주장이 많은 연구자들에 의해 받아들여지면서, 이전에 발표된 논문 또는 특허에서 제시된 인슐린 생산세포를 얻는 방법에 상당한 수정이 가해져야 하고, 새로운 분화방법과 확인과정을 모색하는 쪽으로 연구가 진행되고 있다. 특히, 이들 세포의 임상 적용을 위해서는, 정상의 기능을 갖는 순도 높은 인슐린 생산세포 혹은 세포괴(insulin-producing cells or cell clusters)를 제공할 수 있어야 하므로, 효율적인 분화방법에 대한 요구는 지속적으로 증가할 것이다. 이러한 최근의 문헌적 근거에 의하여, 제론사에서 보유한 특허기술(10-2004-7008713, PCT/US2002/039089)은 기술적으로 미약함이 있다. 즉, 이 기술을 통해 얻어진 최종산물에서 면역세포염색법으로 관찰되는 인슐린이 세포내에서 생합성 되었다는 근거가 제시되지 않았고, 그 인슐린이 세포 외부의 포도당 자극에 의해 세포 밖으로 유리되는지와 같은 기능성에 대한 입증자료가 포함되지 않았다. 또한, 분화에 영향을 미칠 가능성이 있는 수많은 분화인자를 칵테일 형태로 처리하여 분화를 유도하고 있을 뿐, 구체적인 분화인자의 영향성에 대한 분석이 미진하다.

한편, US7,029,915B2 등과 같이 인슐린 생산세포를 분화시키는 기술에 관련된 특허가 있기는 하지만, 이들은 대부분 성체 줄기세포를 이용하여 인슐린 생산세포로 분화시키는 연구들로서, 발생단계가 다른 배아 줄기세포를 이용하는 본원 발명의 내용과는 세포의 배양조건이나 분화를 유도하는 조건에서 큰 차이가 있다.

이에, 본원 발명에서는 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 각 분화 단계별로 분화인자와 농도와 사용 시기를 구체적으로 제시하여 효율성을 높였으며, 최 종산물의 기능성을 입증하였고, 특히 이 과정에서 많은 연구자들이 놓치고 있었던 인간 배아줄기세포의 배양 및 이로부터의 분화배지 중의 포도당 농도의 중요성을 제시하여 발명의 독창성을 확보하였다.

따라서, 본원 발명은 인간 배아 줄기세포의 배양 단계 및 그로부터 인슐린 생산세포 또는 세포괴로의 분화에 이르기까지의 과정을 보다 효율적으로 유도하기 위한 각 단계별 배지 조성물을 제공하는 데 있다.

본원 발명의 또 다른 목적은, 상기 배지 조성물을 이용하여 인간 배아 줄기세포의 배양단계는 물론 그로부터 인슐린 생산능력을 갖는 세포 또는 세포괴로의 분화를 유도하는 방법 및 이에 의해 유도된 인슐린 생산세포 또는 세포괴를 제공하는 데 있다.

본원 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명에서는 포도당의 함량을 선택적으로 감소시킨 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포용 배지 조성물을 제공한다. 상기 인간 배아줄기세포용 배지 조성물은 바람직하게는 5-10mM의 포도당을 함유하며, 더욱 바람직하게는 7-8mM의 포도당을 함유한다. 본원 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 인간 배아줄기세포용 배지 조성물은 5-10mM, 바람직하게는 7.8mM의 포도당을 함유한 DMEM/F12배지이다.

본원 발명에 따른 인간 배아줄기세포용 배지 조성물은 인간 배아줄기세포를 미분화 상태로 '배양'하거나 또는 이로부터 '분화를 유도'하는 데에 사용될 수 있 으며, 특히 인간 배아줄기세포로부터 췌장의 베타세포와 유사하거나 동일한 인슐린 생산세포로 분화를 유도하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 본원 발명은 포도당 함량만을 선택적으로 감소시킨 인간배아줄기세포용 기본 배지에 15%의 혈청 대체물 (Serum Replacement, Life Techology社 등)과 2ng/mL의 FGF-2를 더 포함한 인간 배아줄기세포의 배양에 효과적인 배지 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본원 발명은 DMEM과 F12 배지를 동일 비율로 첨가한 조성(DMEM/F12)에서 포도당의 함량만을 선택적으로 감소시킨 인간배아줄기세포용 기본배지에 15%의 혈청 대체물과 2ng/mL의 FGF-2를 더 포함한 인간 배아줄기세포의 배양에 효과적인 배지 조성물을 제공한다.

또한, 바람직한 일 실시예에서 본원 발명은 예컨대 포도당 함량만을 선택적으로 감소시킨 인간배아줄기세포용 기본배지에, 각 단계별로 액티빈 A (activin A), 베타셀룰린 (betacellulin) 및 니코틴아마이드 등의 분화인자를 첨가한 분화 유도 배지 조성물을 제공한다.

특히, 본원 발명에서는 인간 배아 줄기세포의 배양 단계로부터 인슐린 생산능력을 갖는 세포 또는 세포괴로의 최종 분화에 이르는 각 단계의 배지 조성물을 제공한다.

바람직한 일 실시예에 따르면, 본원 발명은 구체적으로는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지, Life Technologies 社)과 F12 (영양 혼합물 배지, Life Technologies 社)를 동일 비율로 첨가한 혼합 배지 조성(DMEM/F12)에 포도당의 양만을 선택적으로 감소시킨 조성물을 기본 배지로 하여, 인간 배아줄기세포의 배양에서부터 인슐 린 생산세포 또는 세포괴로의 분화에 이르는 각 단계별로 효과적인 인자를 첨가한 단계별 배지 조성물을 제공한다.

바람직한 일 실시예에서, 본원 발명의 배지 조성물에서 기본배지는 DMEM과 F12 배지를 동일 비율로 첨가한 조성(DMEM/F12)에서 포도당의 양을 선택적으로 감소시키는데, 포도당의 양을 선택적으로 감소시킨다함은, 5-10mM의 포도당을 함유한다는 것을 나타내고, 바람직하게는 7-8mM 의 포도당, 더욱 바람직하게는 7.8mM 농도의 포도당을 함유한다는 것을 나타낸다. 다만, 인슐린 생산세포를 세포괴로 만드는 최종 부유배양 단계에서 바람직한 저 농도의 포도당은 5 내지 7mM이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 5.5mM 이다.

본원 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 구체적으로 각 단계의 배지 조성물을 살펴보면, DMEM와 F12 배지를 동일 비율로 첨가한 조성(DMEM/F12)에 1mM L-글루타민(glutamine), 1% 불필수 아미노산(non-essential amino acid), 0.1mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol) 등을 첨가하고, 포도당의 양만을 선택적으로 감소시킨 조성물을 기본 배지로 하여 [예) DMEM/F12 + 5-10mM 포도당];

i) 15%의 혈청 대체물 (Serum Replacement, Life Techology사)과 2ng/mL의 FGF-2가 더 포함된 인간 배아줄기세포 배양 배지 [예) 기본배지+15%의 혈청 대체물+2ng/mL의 FGF-2];

ii) 상기 인간 배아줄기세포 배양 배지로부터 FGF-2를 배제시킨 것으로서 배상체 형성 분화 유도 배지 [예) 기본배지+15%의 혈청 대체물];

iii) 상기 배상체 형성 배지에, 고농도의 액티빈 A (activin A)를 더 포함하 여 내배엽 세포로의 분화를 촉진시키는 내배엽 분화 유도 배지 [예) 기본배지+15%의 혈청 대체물+액티빈 A 50-100ng/mL];

iv) 배상체 형성 배지에서 혈청 대체물을 제외하고, 0.5-2.0 mg/mL 인슐린 (insulin), 0.25-1.0 mg/mL 트랜스페린 (transferrin), 0.25-1.0 μg/mL 셀레늄화 나트륨 (sodium selenite) 등이 첨가되며 내배엽 세포로 초기 분화된 세포의 선별에 사용되는 무혈청 선별 배지 (serum-free selection media) [예) 기본배지+인슐린+트랜스페린+셀레늄];

v) 배상체 형성 배지에서 혈청 대체물을 제외하고 베타셀룰린 (betacellulin)을 도입한 인슐린 생산세포 전구체 증식/분화 유도 배지 [예) 기본배지+베타셀룰린 5-20ng/mL];

vi) 배상체 형성 배지에서 혈청 대체물을 제외하고 니코틴아마이드를 포함한 인슐린 생산세포 분화 유도 배지 [예) 기본배지+니코틴아마이드 10mM]; 그리고,

vii) 상기 인슐린 생산세포 유도 분화 배지에서 포도당의 농도를 더 낮추어 5-5.5mM의 포도당을 함유하도록 한 인슐린 생산세포괴 배양 배지[예) DMEM/F12 5-5.5mM 포도당+니코틴아마이드 10mM] 등이다.

상기 각 단계에서, 액티빈 A는 50-100ng/mL, 베타셀룰린은 5-20ng/mL, 니코틴아마이드는 10mM이다.

본원 발명에 따르면, 인간 배아줄기세포의 배양과정에 저 농도의 포도당을 함유한 배지를 사용하였을 때, 인간 배아 줄기세포는 몇 가지 중요한 특징을 보인 다. 우선, 고 농도의 포도당을 함유한 배지에서 배양하였을 때와 비교하여, 보다 빠르게 증식하는 특징이 관찰되는데, 이를 배증시간(population doubling time)으로 비교하면 약 1.45배 정도의 증식속도에 해당하였다 (도 2 참조). 또한, 이렇게 저 농도의 포도당 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포를 배상체 단계로 분화시킬 때, 고 농도의 포도당 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포에 비하여, 더 많은 낭포형 배상체(cystic EBs)를 형성함으로써 (도 3 참조), 분화가 더 빨리 진행되고 있음을 보여 주었다. 이는 저 농도의 포도당을 함유한 배지가 인간 배아줄기세포의 배양으로부터 배상체 형성의 초기 분화에 유익함을 입증하는 것이다.

본원 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 상기한 인간 배아줄기세포용 배지 조성물을 사용하여 인간 배아줄기세포를 미분화 상태로 배양하거나 또는 이로부터 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 특히, 본원 발명은 전술한 인간 배아줄기세포용 배지 조성물을 사용하여 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산세포 및 세포괴로 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

특히, 본원 발명은 다음의 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산능력을 갖는 세포 또는 세포괴로의 분화 유도 방법을 제공한다.

1) 인간 배아줄기세포 배양 배지(i)를 사용하여, 인간 배아 줄기세포를 배양하는 단계

2) 배상체 형성 분화 유도 배지(ii)를 사용하여 인간 배아 줄기세포가 배상 체 (embryoid body, EB)를 형성하도록 하는 단계

3) 고농도의 액티빈 A (activin A)를 포함한 내배엽 분화 유도 배지 (iii)를 이용하여 배상체 (embryoid body, EB)에서 내배엽 세포로 분화시키는 단계

4) 무혈청 선별 배지 (serum-free selection media)(iv)를 사용하여, 내배엽 세포 등으로 초기 분화된 세포만이 살아남도록 선별하는 단계

5) 베타셀룰린 (betacellulin)을 도입한 인슐린 생산세포 전구체 증식/분화 유도 배지(v)를 이용하여, 내배엽 세포로부터 인슐린 생산세포 전구체로 분화시키는 단계

6) 니코틴아마이드를 포함한 인슐린 생산세포 분화 유도 배지(vi)를 이용하여, 인슐린 생산세포 전구체에서 인슐린 생산세포로 분화시키는 단계, 및

7) 인슐린 생산세포 분화 유도 배지 중의 포도당 농도를 더욱 낮춘 (5-5.5mM) 인슐린 생산세포괴 배양 배지(vii) 중에서 부유 배양함으로써, 인슐린 생산세포로부터 인슐린 생산 세포괴를 형성시키는 단계.

바람직한 일 실시예에서, 본원 발명은 전술한 단계 1) 내지 단계 7)을 모두 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산능력을 갖는 세포 또는 세포괴로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본원 발명에서 사용된 액티빈 A와 베타셀룰린은 성체 줄기세포로 추정되는 췌장 세포를 베타세포의 기능을 갖는 세포로 분화시킬 수 있다고 보고되고 있는데, 본원 발명에서는 고농도의 액티빈 A와 베타셀룰린을 배상체 단계에서부터 단계적으로 사용하여, 배상체 세포를 내배엽 세포로 분화, 또 내배엽 세포를 인슐린 생산세포 전구체로 효과적으로 분화시킬 수 있었다. 특히 베타셀룰린은 전구체의 증식인자로 사용되어 신경세포로의 분화는 차단하면서 베타세포의 전구체로 추정되는 내피 세포 (epithelial cell)의 증식을 선택적으로 유도할 수 있음을 보여 주었다. 이는 지금까지 많은 문헌 (Li 등, Am J Physiol, 285:E577, 2003; Demeterco 등, J Clin Endocrinol Metab, 85:3892, 2000)과 특허(10-2004-7008713, PCT/US2002/039089) 등의 논문에서 내배엽 분화인자로서의 역할이 부각되었던 것과 달리, 본원 발명에서는 인슐린 생산세포의 전구세포의 선택적인 증식을 유도하는 기능이 강하게 관찰되었다. 특히, 액티빈 A와 베타셀룰린이 함께 작용하여 분화와 증식의 조화를 이루었을 것으로 추정된다. (도 5 및 6 참조)

본원 발명에 따른 분화 유도 방법은, 우선 인간 배아줄기세포의 배양 단계에서는 고유의 자기 복제능 (self-renewal)과 전분화능 (pluripotency)을 유지하면서 배양 세포의 성장속도를 증가시키고, 그 후 배상체를 형성하는 과정에서는 낭포형 배상체 (cystic embryoid body, cystic EB) 형성 비율을 상대적으로 높일 수 있다. 또한, 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산능력을 갖는 세포 또는 세포괴로 선택적으로 분화시킬 수 있으며, 결과적으로 분화 효율성을 월등히 높일 수 있다.

마지막으로, 본원 발명은 전술한 방법에 의하여 배양된 인간 배아줄기 세포 및 인간 배아줄기 세포로부터 분화된 내배엽 세포, 인슐린 생산세포의 전구체, 인슐린 생산 세포, 그리고 인슐린 생산 세포괴에 관한 것이다.

본원 발명은 상기의 분화 단계에서 얻어지는 저 포도당 배지에서 유도된 배상체, 여기에 액티빈 A를 도입하여 유도된 내배엽 세포, 베타셀룰린을 도입하여 유도된 인슐린 생산세포의 전구체세포 및 최종적으로 유도된 인슐린 생산세포 또는 세포괴를 제공한다.

저 농도 포도당을 함유하는 배양 배지 조성물에 인간 배아줄기세포를 적응시킨 뒤 미분화 표식인자로 사용되는 다양한 단백질의 발현을 조사하였는데, 이 세포로부터 형성된 배상체(embryoid body; EB) 단계에서 배아 삼배엽층(embryonic 3-germ layer)을 대표하는 단백질의 유전자 발현 여부를 유전자분석법 (RT-PCR)을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 본원 발명에서 사용된 저 포도당 배지에서도 인간 배아 줄기세포는 고유의 자기복제능 (self-renewal)과 전분화능 (pluripotency)을 가짐을 확인할 수 있었다. 또한, 저 포도당 배지에서 배양되는 세포들은 고 포도당 배지에서와 비교할 때, 그 성장속도가 더 빠르고 (배증시간[population doubling time]을 통하여 비교할 때, 약 1.45배의 증식속도를 보임), 배상체를 형성하는 과정에서 낭포형 배상체 (cystic EB)를 형성하는 비율이 상대적으로 높게 나타났다.

또한, 분화 중간체 및 최종 유도산물에 대하여 유전자분석법 (RT-PCR)을 통해서 혈당조절기능을 갖는 호르몬인 인슐린, 베타세포 특이적인 전사인자인 Pdx-1 및 베타세포 특이적인 당 전송체 (glucose transporter-2) 등의 췌장 베타세포의 분화 표식인자의 발현을 시험한 결과, 선택적인 분화가 유도되었음을 확인하였다.

또한, 면역세포화학염색법 (immunocytochemistry)을 통하여 최종 유도산물에 대해서, 인슐린 생산의 부산물 (by-product)인 C-펩타이드와 Pdx-1, 글루카곤 (glucagon), 소마토스타틴 (somatostatin) 등과 같은 췌장 섬 (pancreatic islet)에서 분비되는 내분비 호르몬 (hormone) 및 주요 전사인자의 발현을 시험한 결과, 많은 세포에서 C-펩타이드, Pdx-1의 강한 발현과, 일부 세포에서의 소마토스타틴 발현을 관찰하였으나, 글루카곤은 관찰되지 않았다.

여기에, 유세포분석법 (flow Cytometry)을 통하여 C-펩타이드에 대한 항체로 염색되는 세포의 비율을 시험한 결과, 약 57.9%에 달하는 것을 확인할 수 있었으며, 효소면역분석법을 통하여 인슐린 생산량을 비교한 결과 저 포도당 배지에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴는 고 포도당의 산물에 비해 약 6.4배의 C-펩타이드를 함유하고 있음을 알 수 있었다.

본원 발명에 따라 저 농도 포도당 배양 배지에 기초한 단계별 배지 조성물을 사용하거나 본원 발명에 따른 분화 방법을 사용하는 경우 인간 배아 줄기세포로부터 종전의 기술에 비하여 보다 높은 인슐린 생산능을 갖는 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 수 있다. 이러한 인슐린 생산세포는 췌장 베타세포를 대체할 수 있는 세포공급원으로서 당뇨병 치료의 새로운 기술로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 최종단계의 인슐린 생산세포 혹은 세포괴는 물론, 분화의 중간단계에서 얻어지는 내배엽 세포와 인슐린 생산세포의 전구체를 포함한 발생학적인 단계의 모든 세포는 약물의 안전성 및 유효성을 스크리닝하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본원 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본원 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본원 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 저 포도당 배지에서의 인간 배아 줄기세포의 배양

인간 배아 줄기세포주인 SNUhES3 (Oh 등, Stem Cells, 23:211, 2005)을, DMEM (둘베코 변형 이글 배지, Life Technologies 사)과 F12 (영양 혼합물 배지, Life Technologies 사)의 혼합 배지 조성(DMEM/F12)에서 포도당의 농도를 7.8mM로 조정하고, 15% 혈청대체물(Life Technologies 사), 2ng/mL FGF-2, 1mM L-glutamine, 1% non-essential amino acid, 0.1mM 2-mercaptoethanol 등을 첨가한 배지를 기본 배지로 사용하여 배양하였다. 지지세포(feeder cell)로는 STO (ATCC #1503)을 사용하였다.

도 1은 7.8mM 포도당 배지에서 자라는 인간 배아 줄기세포의 군집(colony)의 사진이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이들 세포가 배아줄기세포 고유의 형태를 유지하면서, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, alkaline phosphatase 등의 적절한 세포 표면 표식인자를 발현하고 있음을 면역세포화학염색법을 통하여 확인하였다.

도 2는 7.8mM 포도당 배지와 17.5mM 포도당 배지에서 자라는 인간 배아 줄기세포의 성장속도를 비교한 그래프이다. 저 농도에서의 배양은 다른 농도에서 보다 세포를 빠르게 증식시키는데, 이를 배증시간(population doubling time)으로부터 환산하면 약 1.45배의 증식속도에 해당하였다.

또한, 저 포도당 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포가 전분화능의 특성을 갖는지를 확인하기 위하여, 인간 배아줄기세포의 배양배지(i)에서 혈청대체물을 포함하고, FGF-2가 제외된 배지를 사용하여, 배상체를 형성하고, 이를 21일간 배양한 후, 자연적으로 분화되는 세포들 가운데, 배아 삼배엽성 표식인자 (embryonic 3-germ layer marker)를 발현되어 있는지를 유전자발현을 통하여 확인하였다. (Schuldiner et al., PNAS 97:11307, 2000; Reubinoff et al., Nature Biotechnol, 18:399, 2000; Bhattachary et al., Blood 103:2956, 2004)

도 3은 본원 발명에 의한 인간 배아 줄기세포의 인슐린 생산세포로의 분화과정 중 7.8mM 포도당 배지에서 생성되는 낭포형 배상체(cystic embryoid body)의 사진이며, 도 4는 포도당 농도를 17.5mM로 높인 고 포도당 배지를 사용하여, 도 3과 동일한 방법으로 분화를 유도였을 때 얻어지는 배상체(embryoid body)의 현미경 사진이다. 본원 발명의 저 포도당 배지를 사용한 경우는 다른 농도 군에 비하여 더 많은 낭포형 배상체 (cystic EBs)를 형성함으로써, 분화가 보다 진행되었음을 보여 주었다.

실시예 2: 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산세포 또는 세포괴로의 분화방법

실시예 1에서 제시된 바와 같이, 인간 배아줄기세포 배양 배지(i)를 사용하여 인간 배아줄기세포를 배양하고 (단계 1), 이로부터 배상체 형성 배지(ii)를 사용하여 부유배양을 통하여 배상체를 만든 후 (단계 2), 70ng/mL의 고농도의 액티빈 A (activin A)를 포함한 내배엽 유도 분화배지(iii)를 이용하여 배상체의 구성세포를 내배엽 세포로의 초기분화를 유도하였다 (단계 3). 이를 배양접시에 부착 (attach)시켜 평면배양 (monolayer culture)을 유도하고, 여기에 1.0mg/mL 인슐린 (insulin), 0.5 mg/mL 트랜스페린 (transferrin), 0.5 μg/mL 셀레늄화 나트륨 (sodium selenite)이 포함된 무혈청 선별 배지 (serum-free selection media)(iv)를 넣고 4일간 배양하여 내배엽 세포 등으로 초기 분화된 세포만이 살아남도록 한 다음 (단계 4), 베타셀룰린 (10ng/mL)이 포함된 인슐린 생산세포 전구체 증식/분화배지(v)를 이용하여, 내배엽 세포를 포함한 초기 분화 상태의 세포로부터 인슐린 생산세포 전구체 (progenitor) 세포의 증식과 분화를 동시에 유도하였다 (단계 5, 도 5 및 6). 이를 다시, 니코틴아마이드 (10mM)가 포함된 인슐린 생산세포 유도 분화 배지(vi)에서 약 2일간 평면배양을 계속하여, 인슐린 생산세포로 분화되도록 한 후 (단계 6), 이 배지의 조성 중 포도당 농도를 5mM로 조정한 인슐린 생산세포괴 배양 배지(vii)에서 부유배양 (suspension culture)을 5일간 계속하여, 덩어리 (cluster) 형태의 인슐린 생산세포 (insulin-producing cells), 즉 인슐린 생산세포괴(cell cluster)의 형성을 유도하였다 (단계 7).

실험예 1: 인슐린 생산세포에서의 표지인자 유전자 발현실험

본원 발명의 분화방법에 따라 분화가 유도된 실시예 2의 인슐린 생산세포가 췌장의 베타세포에 특징적인 유전자를 발현하는지를 mRNA 수준에서 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 실시하였다. Qiagen 사의 RNeasy kit을 이용하여 RNA를 분리하고, 이로부터 cDNA를 제조한 다음, 표 1에 제시된 각각의 프라이머(primers)와 Taq polymerase를 이용하여 PCR을 수행하였다. 전체반응은 35-40 사이클을 수행하였다. 그 결과, 인슐린, Pdx-1, 당전송체-2 (Glut-2, glucose transporter-2) 등과 같은 주요 유전자가 발현됨을 확인하였고, 분화가 진행됨에 따라 Oct-3/4와 같은 미분화상태의 표지인자는 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 도 7은 각 분화단계별 베타세포 관련인자의 발현을 나타내는 RT-PCR 산물의 전기영동 사진이다. (1: 인간배아줄기세포-배양 4일째, 2: 배상체-배양 4일째, 3: 액티빈 A 처리 없이 배양한 배상체-배양 11일째, 4: 액티빈 A 처리하여 배양한 배상체-배양 11일째, 5: 부착배양 후 선별과정-배양 4일째, 6: 전구체 세포의 농축-배양 4일째 7: 부유 배양-5mM의 포도당-배양 5일째)

name	프라이머 ( primer )
Insulin (179 bp)	forward	5'-TCA CAC CTG GTG GAA GCT C-3'
	backward	5'-ACA ATG CCA CGC TTC TGC-3'
Oct3/4 (219 bp)	forward	5'-GAG AAC AAT GAG AAC CTT CAG GAG A-3'
	backward	5'-TTC TGG CGC CGG TTA CAG AAC CA-3'
Pdx-1 (218 bp)	forward	5'-GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC ACG C-3'
	backward	5'-CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC GGT C-3'
Glut-2 (909 bp)	forward	5'-GCA GCT GCT CAA CTA ATC AC-3'
	backward	5'-TCA GCA GCA CAA GTC CCA CT-3'
β-actin (396 bp)	forward	5'-TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3'
	backward	5'-GCA CAG CTT CTC CTT AAT GTC ACG C-3'

실험예 2: 인슐린 생산세포의 면역세포화학염색법 (immunocytochemistry) 실험

본원 발명에서 얻어진 인슐린 생산세포가 정상적인 호르몬 또는 관련 전사인자를 생산하는지를 단백질 수준에서 살펴보기 위하여, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 실시예 2의 최종산물에 대하여 각 단백질에 특이적인 1차 항체를 처리하고 세척과정을 거친 후, 형광물질이 부착된 2차 항체를 처리하여 발현양상을 추적하였다. 그 결과, 최종 분화된 인슐린 생산세포는 인슐린 생합성의 부산물인 C-펩타이드를 생산하였고 (도 8), 췌장의 베타세포에 특이적인 전사인자인 Pdx-1을 핵 내에서 발현하는 것을 확인하였다 (도 9).

실험예 3: 유세포분석법 (Flow Cytometry)을 통한 인슐린 생산세포의 비율 분석

본원 발명에서 사용한 저 포도당 배지의 효과를 기존의 고 포도당 배지와 비교하기 위하여, 두 조건(실시예 2의 조건 vs 실시예 2의 조건과 동일하나 다만 모든 배지의 포도당의 농도를 17.5mM으로 조정한 조건)에서 분화된 최종 단계의 산물 가운데, C-펩타이드를 발현하는 인슐린 생산세포의 수를 비교하였다. 본 실험은 Becton-Dickinson사의 FACSCalibur를 사용하였고, CELLQuest software를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 실시예 2의 저 포도당 배지에서 분화 유도된 세포군에서는 C-펩타이드를 발현하는 비율이 약 57.9%이고 (도 10), 고 포도당(17.5mM) 배지에서 얻어지는 비율은 약 10.4% (도 11)로서, 저 포도당 배지에서 수율이 약 5.6배 더 높았다.

실험예 4: 인슐린 생산세포의 인슐린 생산량 비교 실험

실시예 2의 저 포도당 배지와 고 포도당(17.5mM) 배지의 각각에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴 내에서 생합성되는 인슐린의 양을 비교하기 위하여, 인슐린 생합성의 부산물인 C-펩타이드의 함량을 효소면역분석법 (ELISA)을 통하여 측정하였다. 그 결과, 저 포도당 배지에서 분화 유도된 인슐린 생산세포괴는 고 포도당의 산물에 비해 약 6.4배의 C-펩타이드를 함유하고 있음을 알 수 있었다. (도 12 참조. 598.30±61.88 및 93.22±7.53ng of C-peptide per milligram protein)

실험예 5: 인슐린 생산세포의 인슐린 생산능력 실험

본원 발명의 결과물인 인슐린 생산세포괴의 포도당 반응성 (glucose responsiveness)을 측정하기 위하여, 인슐린 생산세포괴를 다양한 농도의 포도당이 포함된 완충액에 넣고 세포외액의 포도당의 농도에 반응하여 완충액으로 유리 (release)되어 나오는 C-펩타이드의 양을 효소면역분석법 (ELISA)을 통하여 측정한 결과, 고 포도당 환경 (35mM)의 자극에 반응하여 분비되는 인슐린의 양이 저 포도당 환경 (5mM)과 비교하여 약 13.4% 증가함을 확인할 수 있었다. 또, 인슐린의 분비를 조절하는 것으로 알려져 있는 촉진제(agonist)인 IBMX를 처리하였을 때 인슐린 분비가 증가하고, 반대로 인슐린의 분비를 억제하는 길항제(antagonist)인 니페디핀 (Nifedipine)에 의해 인슐린 분비가 감소하는 경향을 확인함으로써, 얻어진 인슐린 생산세포가 촉진제와 길항제에 정상적으로 반응하는 특성을 갖추고 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 기술과 같이, 본원 발명에 따라 저 농도 포도당 배양 배지에 기초한 단계별 배지 조성물을 사용하거나 본원 발명에 따른 분화 방법을 사용하는 경우 인간 배아 줄기세포로부터 종전의 기술에 비하여 보다 높은 인슐린 생산능을 갖는 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 수 있다. 이러한 인슐린 생산세포는 췌장 베타세포를 대체할 수 있는 세포공급원으로서 당뇨병 치료의 새로운 기술로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 최종단계의 인슐린 생산세포 혹은 세포괴는 물론, 분화의 중간단계에서 얻어지는 내배엽 세포와 인슐린 생산세포의 전구체를 포함한 발생학적인 단계의 모든 세포는 약물의 안전성 및 유효성을 스크리닝하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> DONG-A PHARM.CO., LTD. MOON, SHIN YONG OH, SUN KYUNG <120> Media compostions containing low concentrations of glucose useful for human embryonic stem cells, differentiation method of human embryonic stem cells into insulin-producing cells or cell clusters using thereof, and insulin-producing cells or cell clusters differentiated thereby <130> 06p-207 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward primer <400> 1 tcacacctgg tggaagctc 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin backward primer <400> 2 acaatgccac gcttctgc 18 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct3/4 forward primer <400> 3 gagaacaatg agaaccttca ggaga 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct 3/4 backward primer <400> 4 ttctggcgcc ggttacagaa cca 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pdx-1 forward primer <400> 5 ggatgaagtc taccaaagct cacgc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pdx-1 backward primer <400> 6 ccagatcttg atgtgtctct cggtc 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-2 forward primer <400> 7 gcagctgctc aactaatcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-2 backward primer <400> 8 tcagcagcac aagtcccact 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 9 tggcaccaca ccttctacaa tgagc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin backward primer <400> 10 gcacagcttc tccttaatgt cacgc 25

Claims (28)

1. 삭제
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7. 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 15%의 혈청대체물(Serum Replacement) 및 2ng/mL의 FGF-2를 더 포함하며 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 배양하는데 사용됨을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포 배양 배지 조성물
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16. 제 7항에 따른 배지 조성물을 사용하여 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 배양하여 유지하는 방법
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22. 삭제
23. 1) 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 15%의 혈청대체물(Serum Replacement) 및 2ng/mL의 FGF-2를 함유하는 인간 배아줄기세포 배양 배지 조성물을 이용하여 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 배양하는 단계;

    2) 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 15%의 혈청대체물(Serum Replacement)을 함유하는 인간 배아줄기세포 분화 배지 조성물을 이용하여, 부유배양의 방법을 통해 상기 인간 배아줄기세포로부터 배상체를 형성하는 단계;

    3) 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 15%의 혈청대체물(Serum Replacement) 및 액티빈 A (activin A)를 50-100ng/mL를 함유하는 인간 배아줄기세포 분화 배지 조성물을 이용하여, 상기 배상체 세포로부터 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 단계;

    4) 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 0.5-2.0 mg/mL 인슐린 (insulin), 0.25-1.0 mg/mL 트랜스페린 (transferrin), 0.25-1.0 μg/mL 셀레늄화 나트륨 (sodium selenite)를 함유하는 무혈청 인간 배아줄기세포 분화 배지 조성물을 이용하여, 상기 내배엽 세포로 초기 분화된 세포를 선별하는 단계

    5) 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 5-20ng/mL의 베타셀룰린(betacellulin)를 함유하는 인간 배아줄기세포 분화 배지 조성물 및 5-10mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 10mM의 니코틴아마이드를 함유하는 인간 배아줄기세포 분화 배지 조성물을 이용하여, 상기 내배엽 세포로 초기 분화된 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 단계; 및

    6) 5-5.5mM로 함량이 선택적으로 감소된 포도당을 함유하고, 10mM의 니코틴아마이드를 함유하는 배지 조성물을 이용하여, 상기 인간 배아줄기세포에서 분화된 인슐린 생산세포로부터 인슐린 생산세포괴의 형성을 유도하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 능력을 갖는 세포 또는 세포괴로의 분화 유도 방법
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