CN117157388A - 卵巢体细胞样细胞的制造方法及将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
卵巢体细胞样细胞的制备方法包括:工序1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;工序2,将工序1后的细胞在包含BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的培养基中进行培养;和工序3,将工序2后的细胞在基础培养基中进行培养,获得卵巢体细胞样细胞。将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法包括使用所述卵巢体细胞样细胞的制备方法由灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞。
Description
技术领域
本发明涉及卵巢体细胞样细胞的制造方法以及将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法。
本申请基于在2021年3月31日在美国临时申请的美国专利第63/168263号说明书要求优先权,并将其内容援引于此。
背景技术
生殖细胞是起源于原始生殖细胞、分化为精子或卵子、并通过其融合形成新个体的细胞。另一方面,卵巢(其是进行卵子的生成、成熟及排卵的生殖器官)来源于原肠陷入后形成的中间中胚层(intermediate mesoderm),分化为一层体腔上皮后,其一部分增殖及增厚而形成生殖嵴(genital ridge)。而且,受精后经过规定的时间时,进一步受到性特异性的刺激,向构成卵巢的颗粒膜细胞或间质细胞进行分化。
据报道,小鼠的原始生殖细胞(PGCs)及由多能干细胞诱导的PGC样细胞(PGCLCs)通过与小鼠的胎仔性腺体细胞(fetal gonadal somatic cells)在试管内凝集培养,分化为能够供给后代的功能性精子或卵子(例如,参照专利文献1等)。但是,在该方法中,虽然通过体外培养使卵子成熟,但需要从生物体中采集培育卵子的卵巢体细胞(卵泡)。因此,难以适用于包括难以采集卵巢组织的人在内的各种动物。
另一方面,发明人等报道了将小鼠多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法(例如,参照非专利文献1)。
在利用专利文献1记载的方法的情况下,人或食蟹猴的PGCLCs即使与小鼠胎仔的卵巢体细胞持续数月地长期进行凝集培养,也不会像生物体的生殖细胞那样开始减数分裂。认为其主要原因是需要数月的生殖细胞的分化成熟与数天内进行的小鼠性腺体细胞的成熟不同步、分泌因子因种类而异等。
另外,即使尝试想要利用非专利文献1记载的方法而使用人等灵长类的多能干细胞获得卵巢体细胞样细胞,在小鼠和人等灵长类中,由于性腺体细胞成熟所需的时间、因子也不同,因此不能分化诱导成卵巢体细胞样细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2017/047799号
非专利文献
非专利文献1:Yoshino T et al.,“Generation of ovarian follicles frommouse pluripotent stem cells.”,Science,Vol.373,No.6552,p.eabe0237,2021.
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明是鉴于上述情况而完成的,提供一种由灵长类多能干细胞高效地得到任意发生阶段的卵巢体细胞样细胞的卵巢体细胞样细胞的制造方法、以及将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法。
用于解决技术问题的技术手段
发明人等为了达到上述目的而反复进行了深入研究,结果发现,通过在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的存在下培养灵长类多能干细胞而诱导为中胚层,然后通过在BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的存在下进行培养,从而诱导为表达OSR1、WT1的中间中胚层,进而,通过在基础培养基中继续培养,可以分化诱导为FOXL2阳性的卵巢体细胞样细胞,以至完成了本发明。
即,本发明包含以下的方式。
(1)一种卵巢体细胞样细胞的制造方法,其包括:
工序1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;
工序2,将工序1后的细胞在包含BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的培养基中进行培养;和,
工序3,将工序2后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
(2)根据(1)所述的制造方法,其中,进行3天以上所述工序1的培养。
(3)根据(1)或(2)所述的制造方法,其中,进行3天以上所述工序2的培养。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的制造方法,其中,进行1周以上所述工序3的培养。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养基还包含BMP4。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的制造方法,其中,
所述工序1包括:
工序1-1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;和,
工序1-2,将工序1-1后的细胞在包含GSK3抑制剂和激活素A的培养基中进行培养。
(7)根据(1)~(6)中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养为平面培养。
(8)根据(7)所述的制造方法,其中,在所述平面培养中,使用涂覆有细胞支架材料的容器。
(9)根据(7)或(8)所述的制造方法,其中,所述工序2的培养基还包含ROCK抑制剂。
(10)根据(1)~(9)中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养基还包含bFGF。
(11)根据(1)~(10)中任一项所述的制造方法,其中,所述工序2的培养基还包含Hedgehog信号活化剂。
(12)根据(1)~(11)中任一项所述的制造方法,其中,
所述工序3包括:
工序3-1,将工序2后的细胞在包含MEK抑制剂的培养基中进行培养;和,
工序3-2,将工序3-1后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
(13)根据(1)~(12)中任一项所述的制造方法,其中,所述卵巢体细胞样细胞是胚胎卵巢体细胞样细胞。
(14)根据(1)~(13)中任一项所述的制造方法,其中,所述灵长类多能干细胞来自食蟹猴或人。
(15)一种将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法,其中,
包括使用(1)~(14)中任一项所述的制备方法由灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞。
发明效果
根据本实施方式的制造方法和分化诱导方法,可以由灵长类多能干细胞高效地得到任意发生阶段的卵巢体细胞样细胞。
附图说明
图1是示出实施例1中导入到人iPS细胞株的各基因座中的构建体(construct)的结构的图。
图2是示出由小鼠ES细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞时的实验方案(protocol)的图。
图3A是示出实施例1的“1.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图3B是实施例1的“1.”中的胚状体的明视野像(左侧)和荧光像(中央及右侧)。
图3C是实施例1的“1.”中的OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图4A是示出实施例1的“2.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图4B是实施例1的“2.”中的OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图5A是示出实施例1的“3.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图5B是实施例1的“3.”中的胚状体的明视野像(左侧)和荧光像(中央及右侧)。
图5C是实施例1的“3.”中的OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图5D是示出将实施例1的“3.”中的步骤1的时间设为4天时,研究OSR1和NR5A1的表达的时间经过的结果的图。上段表示诱导天数,中段表示明视野像,下段表示OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图6A是示出实施例1的“4.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图6B是实施例1的“4.”中的胚状体的明视野像(上段)及荧光像(中段及下段)。
图6C是实施例1的“4.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图7A是示出实施例1的“5.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图7B是实施例1的“5.”中的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图7C是实施例1的“5.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图8A是实施例1的“6.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图8B是实施例1的“6.”中的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图8C是实施例1的“6.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图9A是实施例1的“7.”中的添加PD0325901(1.0μM)条件下的胚状体的明视野像(左侧)和荧光像(中央和右侧)。
图9B是实施例1的“7.”中的添加PD0325901(1.0μM)条件下的OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图9C是实施例1的“7.”中的未添加PD0325901条件下的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图9D是实施例1的“7.”中的未添加PD0325901条件下的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图10A是示出实施例1的“8.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图10B是实施例1的“8.”中的胚状体的明视野像(各条件的左侧的列)及荧光像(各条件的中央及右侧的列)。
图10C是实施例1的“8.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图11A是实施例1的“9.”中的KSR浓度5%条件下的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图11B是实施例1的“9.”中的KSR浓度5%条件下的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图11C是实施例1的“9.”中的KSR浓度7.5%条件下的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图11D是实施例1的“9.”中的KSR浓度7.5%条件下的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图12A是实施例1的“10.”中的诱导第15天的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图12B是实施例1的“10.”中的诱导第15天的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图12C是实施例1的“10.”中的诱导第23天的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图12D是实施例1的“10.”中的诱导第23天的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图13A是实施例1的“11.”中的诱导第15天的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图13B是实施例1的“11.”中的诱导第15天的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图13C是实施例1的“11.”中的诱导第23天的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图13D是实施例1的“11.”中的诱导第23天的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图14A是实施例1的“12.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图14B是实施例1的“12.”中的未添加Sonic Hedgehog(SHH)条件下的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图14C是实施例1的“12.”中的未添加SHH条件下的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图14D是实施例1的“12.”中的添加SHH条件下的胚状体的明视野像(左侧)及荧光像(中央及右侧)。
图14E是实施例1的“12.”中的添加SHH条件下的OSR1-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图15A是示出实施例1的“13.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图15B是示出实施例1的“13.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图16A是实施例1的“14.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图16B是示出实施例1的“14.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图17是示出实施例1的“15.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图18A是示出实施例1的“16.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图18B是观察实施例1的“16.”中细胞的经时变化的图像。
图18C是实施例1的“16.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图18D是表示实施例1的“16.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图18E是实施例1的“16.”中的胚状体的荧光免疫染色像。
图18F是实施例1的“16.”中的胚状体的荧光免疫染色像。
图18G是实施例1的“16.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图18H是示出实施例1的“16.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图19A是示出实施例1的“17.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图19B是实施例1的“17.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图20A是实施例1的“18.”中使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图20B是实施例1的“18.”中的胚状体的明视野像。
图20C是实施例1的“18.”中的胚状体的明视野像。
图20D是实施例1的“18.”中的OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图20E是实施例1的“18.”中的胚状体的荧光免疫染色像。
图20F是示出实施例1的“18.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图20G是示出根据实施例1的“18.”为止的结果而建立的使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图21是实施例1的“19.”中的PDGFRα及SF1的FACS图。
图22A是实施例1的“20.”中的胚状体的明视野像(左侧)和OSR1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图22B是实施例1的“20.”中的诱导第37天的胚状体的荧光免疫染色像。
图22C是实施例1的“20.”中的诱导第57天的胚状体的荧光免疫染色像。
图22D是实施例1的“20.”中的诱导第86天的胚状体的荧光免疫染色像。
图22E是实施例1的“20.”中的诱导第86天的胚状体的荧光免疫染色像。
图22F是实施例1的“20.”中的诱导第86天的胚状体的荧光免疫染色像。
图23A是实施例1的“21.”中的诱导第7~10天的FACS图。
图23B是实施例1的“21.”中的诱导第11~15天的FACS图。
图24A是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的TBXT基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构变化的图。
图24B是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的NR5A1基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构变化的图。
图24C是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的OSR1基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构变化的图。
图24D是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的FOXL2基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构的变化的图。
图24E是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的WT1基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构变化的图。
图24F是示出实施例2中导入到食蟹猴ES细胞的GATA4基因座中的构建体的结构以及导入后构建体的结构变化的图。
图25A是示出实施例2的“1.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图25B是实施例2的“1.”中的胚状体的明视野像(左侧、中央及右侧的左上)及荧光像(右侧的右上、左下及右下)。
图25C是实施例2的“1.”中的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图26A是示出实施例2的“2.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图26B是实施例2的“2.”中的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图27A是示出实施例2的“3.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图27B是实施例2的“3.”中的诱导第4天的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图27C是实施例2的“3.”中的诱导第6天的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图28A是示出实施例2的“4.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图28B是实施例2的“4.”中的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图29A是示出实施例2的“5.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图29B是实施例2的“5.”中的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图30A是示出实施例2的“6.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图30B是实施例2的“6.”中添加1天Y-27632的条件下的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图30C是实施例2的“6.”中添加2天Y-27632的条件下的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图31A是示出实施例2的“7.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。在图中,“MC”表示培养基更换。以后,以同样的含义使用。
图31B是实施例2的“7.”中的OSR1-tdTomato及TBXT-EGFP的FACS图。
图31C是示出实施例2的“7.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图32A是示出实施例2的“8.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图32B是实施例2的“8.”中的诱导第2~14天的FACS图。
图33A是示出实施例2的“9.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图33B是实施例2的“9.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图34A是示出实施例2的“10.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图34B是实施例2的“10.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图34C是实施例2的“10.”中的胚状体的明视野像。
图35A是示出实施例2的“11.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图35B是实施例2的“11.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图36A是示出实施例2的“12.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图36B是实施例2的“12.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图37A是示出实施例2的“13.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图37B是实施例2的“13.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图37C是示出实施例2的“13.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图38A是示出实施例2的“14.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图38B是实施例2的“14.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图39A是示出实施例2的“15.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图39B是实施例2的“15.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图39C是实施例2的“15.”中的胚状体的明视野像。
图40A是示出实施例2的“16.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图40B是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为2-2-12(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40C是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-2-11(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40D是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为4-2-10(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40E是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为2-3-11(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40F是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-3-10(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40G是实施例2的“16.”中步骤1、步骤2和步骤3的时间为4-3-9(天)的条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40H是实施例2的“16.”中在步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-3-10(天)的条件下追加培养1天的、诱导第17天的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图40I是示出实施例2的“16.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图40J是示出实施例2的“16.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图40K是示出实施例2的“16.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图40L是实施例2的“16.”中的诱导第17天的胚状体的荧光免疫染色像。
图41A是示出实施例2的“17.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图41B是实施例2的“17.”中的诱导第16及第28天的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图41C是示出实施例2的“17.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图42A是示出实施例2的“18.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图42B是实施例2的“18.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图43A是示出实施例2的“19.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图43B是实施例2的“19.”中的胚状体的明视野像。
图43C是实施例2的“19.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图44A是示出实施例2的“20.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图44B是实施例2的“20.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图45A是示出实施例2的“21.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图45B是实施例2的“21.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图46A是示出实施例2的“22.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图46B是实施例2的“22.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图47A是示出实施例2的“23.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图47B是实施例2的“23.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图48A是示出实施例2的“24.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图48B是实施例2的“24.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图49A是示出实施例2的“25.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图49B是实施例2的“25.”中的未添加SHH条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图49C是实施例2的“25.”中的添加SHH条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图50A是示出实施例2的“26.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图50B是实施例2的“26.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51A是示出实施例2的“27.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图51B是实施例2的“27.”中对照的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51C是实施例2的“27.”中的对照(CK-)及添加各细胞因子条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51D是实施例2的“27.”中的未添加BMP4及追加添加BMP4条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51E是实施例2的“27.”中的未添加SHH及追加添加SHH条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51F是实施例2的“27.”中的未添加PD0325901及追加添加PD0325901条件下的FOXL2-tdTomato及NR5A1-EGFP的FACS图。
图51G是实施例2的“27.”中的未添加维甲酸(RA)和追加添加RA条件下的FOXL2-tdTomato和NR5A1-EGFP的FACS图。
图52A是示出实施例2的“28.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图52B是实施例2的“28.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图52C是实施例2的“28.”中的RNAseq的结果的图。
图53A是示出实施例2的“29.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图53B是实施例2的“29.”中的PE-TexasRed以及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图54A是示出实施例2的“30.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图54B是实施例2的“30.”中的未添加PD0325901条件下的FACS图。
图54C是实施例2的“30.”中的添加PD0325901条件下的FACS图。
图54D是实施例2的“30.”中的细胞块的荧光像。
图55A是示出实施例2的“31.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图55B是实施例2的“31.”中的WT1-tdTomato及GATA4-mTagBFP2的FACS图。
图55C是实施例2的“31.”中的APC及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图56A是示出实施例2的“32.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图56B是实施例2的“32.”中的WT1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图57A是示出实施例2的“33.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图57B是实施例2的“33.”中的WT1-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图57C是示出实施例2的“33.”中各标记基因的基于定量PCR的测定结果的图表。
图58A是示出实施例2的“34.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图58B是实施例2的“34.”中的诱导第12~22天的FACS图。
图59A是示出实施例2的“35.”中使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
图59B是实施例2的“35.”中的FOXL2-tdTomato及NR5A1(SF1)-EGFP的FACS图。
图60A是示出根据实施例2的“35.”为止的结果而建立的使用食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图(上段)以及诱导第3~14天的FACS图(下段)。
图60B是示出由小鼠ES细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞时的实验方案的图(上段)以及诱导第2~6天的FACS图(下段)。
具体实施方式
<卵巢体细胞样细胞的制造方法>
本实施方式的卵巢体细胞样细胞的制造方法(以下有时简称为“本实施方式的制造方法”)包括以下工序。
工序1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;
工序2,将工序1后的细胞在包含BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的培养基中进行培养;以及
工序3,将工序2后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
根据本实施方式的制造方法,可以由灵长类多能干细胞高效地得到任意发生阶段的卵巢体细胞样细胞。即,本实施方式的制造方法也可以说是将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法。
以下,对构成本实施方式的制造方法的各工序进行详细说明。
[工序1]
在工序1中,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞。
在本说明书中,“多能干细胞”是指具有能够在保持未分化状态下增殖的“自我再生能力”和能够分化为所有三胚层系列的“分化多能性”的未分化细胞。作为多能干细胞,不限定于以下多能干细胞,例如可以举出人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、来源于原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(EG细胞)、在来自精巢组织的GS细胞的建立培养过程中分离的多能种系干细胞(mGS细胞)、从骨髓间叶系细胞分离的Muse细胞等。上述列举的多能干细胞可以分别通过公知的方法得到。
工序1中使用的多能干细胞来源于灵长类。“灵长类”是指属于灵长目的哺乳类动物,作为灵长类,例如可以举出:狐猴、懒猴、树鼩(tree shrews)等原猴亚目;和猴子(包括食蟹猴)、类人猿、人等类人猿亚目。其中,优选食蟹猴或人。
需要说明的是,本说明书中的“iPS细胞”是指如下细胞:通过向分化的体细胞中导入若干基因,能够重新编程(reprogramming)为各种组织、器官的细胞。在本实施方式的方法中,用于分化诱导原始生殖细胞的iPS细胞可以来自从适当的供体采集的体细胞的原代培养细胞,也可以来自确立细胞株。由于iPS细胞还能分化诱导成任何胚层系细胞,因此用于制备iPS细胞的体细胞原则上可以来自外胚层系和内胚层系的任意胚层系细胞。侵入性低且容易采集的皮肤、毛发、齿龈、血液等的细胞适合作为用于制备iPS细胞的体细胞。关于iPS细胞的制备方法,只要按照本领域公知的方法进行即可。具体而言,例如可以利用“Okita K.et al.,“Generation of germline-competent induced pluripotent stemcells.”,Nature,Vol.448,p313-317,2007.”(参考文献1)、“Hamanaka S.et al.,“Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells.”,PLoSOne,Vol.6,Issue7,e22008,2011.”(参考文献2)等公知文献中记载的制备方法。
另外,ES细胞可以通过公知的方法获得。例如可以通过如下方式来确立,即,从对象动物的受精卵的胚盘胞中采集内部细胞块,将该内部细胞块在来自成纤维细胞的饲养细胞上进行培养。另外,也可以使用通过培养初期胚胎而确立的ES细胞,所述初期胚胎通过将体细胞的核进行核移植而制作。
工序1中使用的培养基包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂作为必需添加剂。
GSK3抑制剂是对糖原合成酶3(GSK3)具有抑制活性的化合物。作为这种化合物,例如可列举出CHIR 99021(CAS编号:252917-06-9)、SB216763(CAS编号:280744-09-4)、SB415286(CAS编号:264218-23-7)、CHIR 98014(CAS编号:252935-94-7)、AZD1080(CAS编号:612487-72-6)、LY2090314(CAS编号:603288-22-8),其中,优选CHIR99021。
培养基中的GSK3抑制剂的浓度优选为5μM以上,更优选为10μM以上,进一步更优选为12μM以上,特别优选为14μM以上。通过使GSK3抑制剂的浓度为上述下限值以上,可以激活WNT信号,可以更有效地分化为中胚层。GSK3抑制剂的浓度的上限没有特别限定,例如可以是20μM。需要说明的是,单位“μM”表示1升增殖用培养基中的分子量(mol/L)的1/1000000的浓度,以后也表示同样的浓度。
ROCK抑制剂是对Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)具有抑制活性的化合物。作为这样的化合物,例如可以举出Y-27632(CAS编号:146986-50-7)、法舒地尔(Fasudil)(CAS编号:105628-07-7)、Y39983(CAS编号:203911-26-6)、Wf-536(CAS编号:539857-64-2)、SLx-2119(CAS编号:911417-87-3)、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱(Azabenzimidazole-aminofurazans)(CAS编号:850664-21-0)、DE-104、H-1152P(CAS编号:872543-07-6)、Rho激酶α抑制剂(ROKαinhibitor)、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷羧酰胺(4-(1-aminoalkyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexane-carboxamides)、Rho抑制素(Rhostatin)、BA-210、BA-207、Ki-23095、VAS-012等。其中,优选Y-27632。
培养基中的ROCK抑制剂的浓度通常可以设为1μM以上且20μM以下,优选为5μM以上且15μM以下,更优选为8μM以上且12μM以下。通过使ROCK抑制剂的浓度在上述范围内,可以更有效地抑制工序1中的细胞死亡。
在使用人多能干细胞的情况下,工序1中使用的培养基优选进一步包含BMP4(骨形成蛋白质4)。由此,可以促进GATA4的表达、更有效地分化为中胚层。
另一方面,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,工序1中使用的培养基优选不包含BMP4。由此,能够进一步提高NR5A1阳性细胞的诱导效率。
在工序1中使用的培养基包含BMP4的情况下,培养基中的BMP4的浓度可以设为0.1ng/mL以上,优选0.3ng/mL以上,更优选0.5ng/mL以上,进一步优选0.7ng/mL以上。另一方面,培养基中的BMP4的浓度可以设为10ng/mL以下,优选5ng/mL以下,更优选3ng/mL以下,进一步优选1.3ng/mL以下。通过使BMP4的浓度在上述范围内,可以促进GATA4的表达、更有效地分化为中胚层。
在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,工序1中使用的培养基优选进一步包含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子;也称为FGF2)。由此,能够更有效地分化为中胚层。
另一方面,在使用人多能干细胞的情况下,工序1中使用的培养基优选不包含bFGF。由此,能够进一步提高NR5A1阳性细胞的诱导效率。
在工序1中使用的培养基包含bFGF的情况下,培养基中的bFGF的浓度可以设为0.1ng/mL以上,优选0.5ng/mL以上,更优选1ng/mL以上,进一步优选3ng/mL以上。另一方面,培养基中的bFGF的浓度可以设为10ng/mL以下,优选9ng/mL以下,更优选8ng/mL以下,进一步优选7ng/mL以下。通过使bFGF的浓度在上述范围内,可以更有效地分化为中胚层。
工序1中使用的培养基可以包含EGF(表皮生长因子),也可以不包含EGF(表皮生长因子)。
作为在工序1中添加上述添加剂而使用的基础培养基,例如可列举出αMEM培养基、Neurobasal培养基、Neural Progenitor Basal培养基、NS-A培养基、BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、最小必需培养基(MEM)、Eagle MEM、Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)、Glasgow MEM(GMEM)、Improved MEM Zinc Option、IMDM、Medium199培养基、DMEM/F12培养基、StemPro-34SFM培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、HTF培养基、Fischer’s培养基、Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12、Advanced MEM、Advanced RPMI培养基、以及它们的混合培养基等,但不限定于这些培养基。其中,在使用来自食蟹猴的多能干细胞时,优选GMEM,另外,在使用来自人的多能干细胞时,优选Advanced DMEM或Advanced DMEM/F12,更优选Advanced DMEM/F12。
培养基可以是含血清培养基,也可以是无血清培养基。优选使用无血清培养基。无血清培养基(SFM)是指不含任何未处理或未纯化的血清的培养基,可以举出含有经纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(增殖因子等)的培养基。血清(例如,牛胎儿血清(FBS)、人血清等)的浓度可以设为0v/v%以上且20v/v%以下,优选为0v/v%以上且5v/v%以下,更优选为0v/v%以上且2v/v%以下,进一步优选为0v/v%(即,无血清)。SFM可以包含任意的血清替代物。作为血清替代物,例如可以举出白蛋白(例如富含脂质的白蛋白、重组白蛋白等白蛋白替代物;植物淀粉、葡聚糖及蛋白质水解物等)、转铁蛋白(或其他铁转运体)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油、以及它们的等同物等。另外,可以举出KnockOut(注册商标)Serum Replacement(KSR)、GlutaMax(注册商标)等。它们可以单独使用或者两种以上组合使用。
培养基可以包含其他公知的添加剂。添加剂没有特别限定,例如可以举出除上述以外的生长因子、多胺类、矿物质、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)及其盐(钠盐、钾盐等)、氨基酸(例如非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、类固醇、抗生素(例如链霉素、青霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)、营养添加物(例如B27 supplement、N2 supplement、StemPro-Nutrient Supplement等)。它们可以单独使用或者两种以上组合使用。可以在公知的浓度范围内包含各添加物。
作为在人多能干细胞中优选使用的基础培养基,例如可列举出包含KSR(优选浓度为6.0v/v%以上且9.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.01mM以上且0.5mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为50U/mL以上且150U/mL以下)、以及GlutaMax(注册商标)(优选浓度为0.5mM以上且5.0mM以下)的Advanced DMEM或Advanced DMEM/F12等。
作为在人多能干细胞中更优选使用的基础培养基,例如可列举出包含KSR(优选浓度为7.0v/v%以上且8.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为80U/mL以上且120U/mL以下)、以及GlutaMax(优选浓度为1.5mM以上且2.5mM以下)的Advanced DMEM/F12等。
作为在食蟹猴多能干细胞中优选使用的基础培养基,例如可列举出包含KSR(优选浓度为7.0v/v%以上且8.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、NEAA(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、丙酮酸盐(优选浓度为0.5mM以上且1.5mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为80U/mL以上且120U/mL以下)、以及L-谷氨酰胺(优选浓度为1.5mM以上且2.5mM以下)的GMEM等。
工序1的培养例如可以通过在公知的细胞非粘附性或低粘附性培养容器中接种灵长类多能干细胞并培养来进行。
培养条件不限定于以下条件,例如可以在1v/v%以上且10v/v%以下的二氧化碳和90v/v%以上且99v/v%以下的大气的气氛下进行。
培养温度为约30℃以上且40℃以下,优选为约37℃。
培养时间优选为2天以上,更优选为3天以上且5天以下。
在使用人多能干细胞的情况下,为了进一步促进向适当的卵巢体细胞的分化诱导,工序1的培养优选通过在公知的细胞粘附性培养容器中接种灵长类多能干细胞并平面培养来进行。
工序1中的平面培养优选使用涂覆有细胞支架材料的细胞粘附性培养容器。作为细胞支架材料,可以使用公知的细胞外基质(ECM),具体而言,可列举出:纤连蛋白、玻连蛋白;包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的Matrigel(注册商标)(BD生物科学公司制)等,但不限定于此。
在使用人多能干细胞的情况下,工序1优选包含以下的工序1-1和工序1-2。
工序1-1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;
工序1-2,将工序1-1后的细胞在包含GSK3抑制剂和激活素A的培养基中进行培养。
作为工序1-1和工序1-2中使用的GSK3抑制剂和ROCK抑制剂,可以使用上述例示的物质。另外,在工序1-1和工序1-2中,上述添加剂可以添加到上述例示的基础培养基中来使用。
工序1-2中使用的激活素A是指在发生过程中由多个细胞种产生的TGF-β家族的成员。通过添加激活素A,使通过后方化而分化成卵巢体细胞成为可能。
培养基中的激活素A的浓度可以设为1ng/mL以上且30ng/mL以下,优选3ng/mL以上且20ng/mL以下,更优选5ng/mL以上且15ng/mL以下,进一步优选8ng/mL以上且12ng/mL以下。通过使激活素A的浓度在上述范围内,使通过后方化而分化成卵巢体细胞成为可能。
工序1-1和工序1-2的培养条件不限定于以下条件,例如可以在1v/v%以上且10v/v%以下的二氧化碳和90v/v%以上且99v/v%以下的大气的气氛下进行。
培养温度为约30℃以上且40℃以下,优选为约37℃。
培养时间只要是使工序1-1和工序1-2的总培养时间成为上述工序1的培养时间的天数即可,工序1-1和工序1-2分别优选为1天以上,更优选为2天以上且3天以下。
通过使用免疫染色、FACS分析、定量PCR、RNAseq等公知的方法来分析OSR1、TBXT等标记基因的表达水平,从而可以确认工序1中所得到的细胞分化为中胚层。
[工序2]
在工序2中,将工序1后的细胞在包含BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的培养基中进行培养。
作为在工序2中使用的BMP4,可以使用与上述工序1中记载的BMP4相同的BMP4。
在工序2中,培养基中的BMP4的浓度可以设为0.1ng/mL以上,优选0.3ng/mL以上,更优选0.5ng/mL以上,进一步优选0.7ng/mL以上。另一方面,培养基中的BMP4的浓度可以设为10ng/mL以下,优选5ng/mL以下,更优选3ng/mL以下,进一步优选1.3ng/mL以下。通过使BMP4的浓度在上述范围内,可以促进GATA4的表达、更有效地分化为中间中胚层。
在工序2中,培养基中的维甲酸的浓度可以设为0.1μM以上且10μM以下,优选0.3μM以上且7μM以下,更优选0.5μM以上且5μM以下,进一步优选1μM以上且3μM以下。通过使维甲酸的浓度在上述范围内,可以更有效地分化为中间中胚层。
工序2中使用的MEK抑制剂是对有丝分裂原活化(mitogen-activated)细胞外信号相关激酶具有抑制活性的化合物。作为这样的化合物,例如可以举出PD0325901(CAS编号:391210-10-9)、曲美替尼(Trametinib,商品名“Mekinist”、CAS编号:871700-17-3)、司美替尼(Selumetinib,CAS编号:606143-52-6)、MEK 162(CAS编号:606143-89-9)、CH4987655(CAS编号:874101-00-5)等,但不限定于这些化合物。其中,优选PD0325901。
培养基中的MEK抑制剂的浓度优选为0.1μM以上且5μM以下,更优选为0.5μM以上且3μM以下,进一步优选为0.8μM以上且1.2μM以下。通过使MEK抑制剂的浓度在上述范围内,可以更有效地诱导NR5A1阳性细胞。
在使用人多能干细胞并且工序1中进行平面培养的情况下,工序2中使用的培养基优选进一步包含ROCK抑制剂。由此,在将工序1中得到的细胞作为单细胞(single cell)重新接种并在工序2中悬浮培养时,能够更有效地抑制细胞死亡。作为ROCK抑制剂,可以使用工序1中例示的ROCK抑制剂。
在工序2中使用的培养基包含ROCK抑制剂的情况下,通常可以设为1μM以上且20μM以下,优选5μM以上且15μM以下,更优选8μM以上且12μM以下。通过使ROCK抑制剂的浓度在上述范围内,可以更有效地抑制工序2中的细胞死亡。
在使用人多能干细胞的情况下,工序2中使用的培养基优选进一步包含Hedgehog信号活化剂。由此,能够更有效地诱导NR5A1阳性细胞。
另一方面,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,工序2中使用的培养基优选不包含Hedgehog信号活化剂。由此,能够更有效地分化为NR5A1阳性细胞。
作为在工序2中使用的Hedgehog信号活化剂,例如可以举出Sonic Hedgehog(SHH)、Smoothened Agonist(SAG;CAS编号:364590-63-6)等,但不限定于此。其中,优选SHH。
在工序2中使用的培养基包含Hedgehog信号活化剂的情况下,培养基中的Hedgehog信号活化剂的浓度可以设为1ng/mL以上,优选5ng/mL以上,更优选15ng/mL以上,进一步优选25ng/mL以上。另一方面,培养基中的Hedgehog信号活化剂的浓度可以设为50ng/mL以下,优选45ng/mL以下,更优选40ng/mL以下,进一步优选35ng/mL以下。通过使Hedgehog信号活化剂的浓度在上述范围内,可以更有效地诱导NR5A1阳性细胞。
工序2中使用的培养基可以包含EGF(表皮生长因子),也可以不包含EGF(表皮生长因子)。
在工序2中,可以将上述添加剂添加到基础培养基中使用。作为基础培养基,可以使用与工序1中例示的基础培养基相同的基础培养基。另外,作为添加到培养基中的其他添加剂,可以使用与工序1中例示的其他添加剂相同的添加剂。
工序1的培养例如可以通过在公知的细胞非粘附性或低粘附性培养容器中接种灵长类多能干细胞并培养来进行。
培养条件不限定于以下条件,例如可以在1v/v%以上且10v/v%以下的二氧化碳和90v/v%以上且99v/v%以下的大气气氛下进行。
培养温度为约30℃以上且40℃以下,优选为约37℃。
培养时间优选为2天以上,更优选为3天以上。
通过使用免疫染色、FACS分析、定量PCR、RNAseq等公知的方法来分析WT1、NR5A1等标记基因的表达水平,从而可以确认工序2中所得到的细胞分化为中间中胚层。
[工序3]
在工序3中,将工序2后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
作为工序3中使用的基础培养基,可以使用与工序1中例示的基础培养基相同的基础培养基。
在使用人多能干细胞的情况下,基础培养基优选不包含BMP4、FGF信号活化剂和MEK抑制剂等添加剂。需要说明的是,这里所说的FGF信号活化剂可以列举FGF家族蛋白等。例如,可以举出FGF9、bFGF、FGF4等,但不限定于此。
即,在使用人多能干细胞的情况下,作为工序3中优选使用的基础培养基,可列举出包含KSR(优选浓度为6.0v/v%以上且9.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.01mM以上且0.5mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为50U/mL以上且150U/mL以下)、以及GlutaMax(优选浓度为0.5mM以上且5.0mM以下)的Advanced DMEM或Advanced DMEM/F12等。
在使用人多能干细胞的情况下,作为工序3中更优选使用的基础培养基,例如可以举出包含KSR(优选浓度为7.0v/v%以上且8.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为80U/mL以上且120U/mL以下)、以及GlutaMax(优选浓度为1.5mM以上且2.5mM以下)的Advanced DMEM/F12等。
工序3的培养例如可以通过在公知的细胞非粘附性或低粘附性培养容器中接种灵长类多能干细胞并培养来进行。
培养条件不限定于以下条件,例如可以在1v/v%以上且10v/v%以下的二氧化碳和90v/v%以上且99v/v%以下的大气的气氛下进行。
培养温度为约30℃以上且40℃以下,优选为约37℃。
培养时间优选为1周以上。
另一方面,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,为了进一步提高NR5A1阳性细胞的诱导效率,优选在从工序3的诱导开始起优选1天以上、更优选约2天(例如48小时±12小时、优选48小时±6小时)使用进一步包含MEK抑制剂的培养基。
即,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,工序3优选包含以下的工序3-1和工序3-2。
工序3-1,将工序2后的细胞在包含MEK抑制剂的培养基中进行培养;
工序3-2,将工序3-1后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
作为MEK抑制剂,可以举出与上述工序2中例示的MEK抑制剂相同的抑制剂。可以将MEK抑制剂添加到上述工序1例示的基础培养基中使用。
在工序3-1中,培养基中的MEK抑制剂的浓度优选为0.1μM以上且5μM以下,更优选为0.5μM以上且3μM以下,进一步优选为0.8μM以上且1.2μM以下。通过使MEK抑制剂的浓度在上述范围内,可以进一步提高NR5A1阳性细胞的诱导效率。
工序3-1中使用的培养基优选为仅将MEK抑制剂添加到基础培养基中而不包含其他添加剂的培养基。即,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,作为工序3-1中优选使用的培养基,例如可列举出包含MEK抑制剂(优选浓度为0.8μM以上且1.2μM以下)、KSR(优选浓度为7.0v/v%以上且8.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、NEAA(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、丙酮酸盐(优选浓度为0.5mM以上且1.5mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为80U/mL以上且120U/mL以下)以及L-谷氨酰胺(优选浓度为1.5mM以上且2.5mM以下)的GMEM等。
另外,工序3-2中使用的培养基优选为不含其他添加剂的基础培养基。即,在使用食蟹猴多能干细胞的情况下,作为工序3-2中优选使用的基础培养基,例如可列举出包含KSR(优选浓度为7.0v/v%以上且8.0v/v%以下)、2-巯基乙醇(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、NEAA(优选浓度为0.05mM以上且0.15mM以下)、丙酮酸盐(优选浓度为0.5mM以上且1.5mM以下)、青霉素和链霉素(优选浓度为80U/mL以上且120U/mL以下)、L-谷氨酰胺(优选浓度为1.5mM以上且2.5mM以下)的GMEM等。
工序3-1和工序3-2的培养条件不限定于以下条件,例如可以在1v/v%以上且10v/v%以下的二氧化碳和90v/v%以上且99v/v%以下的大气的气氛下进行。
培养温度为约30℃以上且40℃以下,优选为约37℃。
培养时间只要是使工序3-1和工序3-2的总培养时间成为上述工序3的培养时间的天数即可,工序3-1优选为1天以上,更优选为约2天(例如48小时±12小时,优选48小时±6小时)。工序3-2的培养时间可以是工序3的培养时间内减去工序3-1的培养时间后的剩余时间。
通过使用免疫染色、FACS分析、定量PCR、RNAseq等公知的方法来分析FOXL2、FDGFRα等标记基因的表达水平,从而可以确认工序3中得到的细胞分化为卵巢体细胞样细胞。
通过本实施方式的制造方法得到的卵巢体细胞样细胞优选为与胎仔的卵巢体细胞具有同等特性的细胞、即胚胎卵巢体细胞样细胞,具有将来分化为形成卵泡的颗粒膜细胞、以及间质细胞等的特性。
另外,如后述的实施例所示,对于使用食蟹猴多能干细胞并利用本实施方式的制造方法得到的卵巢体细胞样细胞,由于具有颗粒膜细胞特性的细胞的比例多,因此也可以称为将食蟹猴多能干细胞分化诱导成颗粒膜细胞的方法。
利用本实施方式的制造方法得到的卵巢体细胞样细胞通过与灵长类的PGCs或由多能干细胞诱导的PGCLCs凝集并进行培养,能够构建再现了发育中的卵巢的球状体(Spheroid)。通过将其培养或移植到生物体中,从而有可能可以再现迄今为止在试管内无法再现的减数分裂的进行即生殖细胞的成熟、甚至卵泡的形成。即,有可能可以提供包括将通过上述制造方法得到的卵巢体细胞样细胞和灵长类PGCs或PGCLCs凝集共培养的、卵巢的再生方法、卵子的制作方法或不孕治疗方法。
[实施例]
以下,列举出实施例及比较例等对本发明进行更详细的说明,但本发明并不限定于这些实施例等。
<由人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的研究试验>
[材料]
1.人iPS细胞株
为了简便地观察在各发生阶段中具代表性的基因表达,对人iPS细胞株1390G3进行基因修饰,制作在OSR1基因的表达的同时发出红色荧光(tdTomato)、在NR5A1基因的表达的同时发出绿色荧光(EGFP)、在FOXL2基因的表达的同时发出红色荧光(tdTomato)的DNA序列(参照图1,需要说明的是,导入染色体后,用Cre使“PGKp-Neo(or Puro)-pA”的部分缺损。)。制作导入了OSR1和NR5A1两种DNA序列的iPS细胞株(以下有时简称为“OTNG”)、以及导入了NR5A1和FOXL2两种DNA序列的iPS细胞株(以下有时简称为“NGFT”)。在这次试验中,大部分实验中使用了OTNG株。需要说明的是,NR5A1和SF1是相同的基因。
2.培养基和药剂
培养基和药剂等的供给源和型号如下表所示。
[表1]
[表2]
[方法]
1.荧光免疫染色及基于荧光显微镜的观察
免疫染色中使用的抗体如下。
大鼠抗EGFP抗体(Nacalai Tesque公司生产,04404-84,稀释倍率250倍)
兔抗FOXL2抗体(Abcam公司生产,ab246511,稀释倍率200倍)
兔抗层粘连蛋白抗体(Abcam公司生产,ab11575,稀释倍率200倍)
另外,使用荧光显微镜(ZEISS共聚焦激光扫描,LSM780)观察各阶段的细胞。
2.FACS(荧光活化细胞分选(Fluorescence activated cell sorting)分析)
使用流式细胞仪(BD FACSAria III)分析各阶段的细胞。
3.定量PCR
对于以下的引物和条件,使用PCR装置(BIO-RAD CFX384 Real-Time System)确认各标记基因的相对表达量。需要说明的是,在表中,PPIA基因和RPLP0基因作为管家基因(house-keeping genes)使用。qPCR的差分是与“(PPIA+RPLP0)/2”所取的平均值之差。另外,使用ERCC基因作为样品之间的绝对对照(control)。
[表3]
[表4]
[表5]
[实施例1]
图2是示出由小鼠ES细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞时的实验方案的图。图2中,bFGF表示碱性成纤维细胞生长因子(FGF2),BMP4表示骨形成蛋白4,CHIR表示对WNT途径具有活化作用的GSK3抑制剂CHIR99021,EGF表示表皮生长因子,RA表示维甲酸,PD03表示对FGF途径具有抑制作用的MEK抑制剂PD0325901,SHH表示Sonic Hedgehog,FGF9表示成纤维细胞生长因子9。以后使用上述简称。
对于小鼠,首先通过将ES细胞(ESCs)在被覆有纤连蛋白的培养皿上培养42小时从而分化为EpiLCs(步骤0)。
然后,暂且剥离细胞,分散菌落,计数细胞数。如果将其每3万细胞在低粘附板上进行培养,则在悬浮的状态下细胞彼此粘附,形成细胞凝集块。此时,使用BMP4、激活WNT信号的小分子CHIR99021以及EGF,使之分化为中胚层~中间中胚层(步骤1)。
接着,更换为含有BMP4、RA、抑制FGF信号的小分子PD0325901、SHH和EGF的培养基,用2天时间从体腔上皮(gonadal coelomic epithelium)诱导至生殖嵴(genital ridge)(步骤2)。
然后,更换为含有BMP4和FGF9的培养基,观察到在1天~2天内区分为间质(stroma)和前颗粒膜(pregranulosa)的系列(步骤3)。
认为猴子的ES细胞、人的iPS细胞,与小鼠的ES细胞相比,在分化稍微进展的状态下,更接近EpiLC。因此,在本试验中的使用猴子、人的多能干细胞的研究中,省略步骤0,从步骤1开始。另外,与小鼠的EpiLC不同,已知人、猴子的多能干细胞在将菌落拆散至一个细胞水平时会导致细胞死亡,但作为ROCK抑制剂的小分子Y27632对其预防有效。因此,在步骤1中加入了Y27632进行研究。另外,作为培养板,使用96孔V-底(bottom)板,以每1孔成为1万细胞的方式接种细胞。
1.与小鼠同期进行试验
图3A是示出使用人iPS细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的实验方案的图。
在使用了人细胞的试验中,将基础培养基从GMEM(小鼠时使用)变更为含有7.5v/v%KnockOut(注册商标)Serum Replacement(KSR)的DMEM。另外,基础培养基中含有0.1mM2-巯基乙醇、100U/mL青霉素/链霉素和2mM GlutaMax(注册商标),但这些添加剂和浓度固定,在“2.”以后的试验中省略了记载。步骤1和步骤2与小鼠的实验方案同期进行,在步骤3的条件下继续培养。培养基基本上每2天或3天进行全量交换。在继代培养iPS细胞时,将3万细胞接种在低粘接板上,以凝集块的形式开始培养。
在步骤2结束时的第4天(d4)观察到OSR1的荧光报告物的表达(参照图3B),之后,即使在转移到步骤3后经过34天,OSR1仍继续出现,但未观察到NR5A1(参照图3B和图3C)。
2.步骤1的细胞数的优化
如果最初的细胞数过多,则信号可能不会渗透到里面,因此进行了减少每个细胞凝集块的细胞数的研究。在图4A中示出了详细的实验方案。
结果表明,在该分化法中未发现NR5A1的表达,OSR1的表达在细胞数为10000以下时一致上升,在30000时,OSR1和NR5A1都没有表达的细胞变多(参照图4B)。以后,使用人iPS细胞的情况下,从10000细胞开始。
3.步骤1的时间的优化1
如果步骤1的时间短,则预计会分化为靠近头部的组织,另一方面,如果步骤1的时间长,则预计会分化为靠近尾部的组织,因此将步骤1的时间设为2天、3天和4天(步骤1和步骤2的总时间为4天、5天和6天)进行了研究。在图5A中示出了详细的实验方案。
其结果,在将步骤1的时间设为3天时,在第17天观察到少量NR5A1阳性的细胞,在设为4天时,更多的细胞成为NR5A1阳性的细胞(参照图5B和图5C)。
另外,图5D是示出将步骤1的时间设为4天时研究OSR1及NR5A1的表达的时间经过的结果的图。
如图5D所示,在步骤3的第4天以后NR5A1开始表达,逐渐转移到NR5A1阳性细胞,不久OSR1阳性NR5A1阴性细胞减少。另外,对于OSR1和NR5A1均阳性的细胞,OSR1的表达也稍微降低。
4.步骤1的时间的优化2及步骤1中其他药剂的并用效果
接着,研究了如果进一步延长步骤1的时间会怎么样。在该实验中,将步骤1的时间设为3天、4天、5天和6天(步骤1和步骤2的总时间为5天、6天、7天和8天)进行了研究。此外,还合并评价了有可能能够抑制向靠近头部的组织分化的小分子Ly294002(phosphatidylinositol-3kinase;PI3K抑制剂,简写为图中的“Ly”)的效果。在图6A中示出了详细的实验方案。
在第18天进行评价时,发现:无论步骤1的时间是3天还是6天,都能得到同时表达OSR1和NR5A1的细胞(参照图6B)。然而,当进行FACS分析时,发现:对于OSR1和NR5A1均为阳性的细胞数,在步骤1的时间为4天的条件(C4R2F12)下最好(参照图6C)。另外,发现通过添加Ly294002得到的诱导效率未见增加,而是可采集的细胞数减少(参照图6C)。
根据这些结果,制定将步骤1的时间设为4天、且不添加Ly294002的实验方案。
5.步骤2的时间的优化
接着,将步骤1的时间固定为4天,将步骤2的时间设为2天、3天和4天(步骤1和步骤2的总时间为6天、7天和8天)进行了研究。在图7A中示出了详细的实验方案。
其结果,步骤2的时间为3天(R3)所得到的NR5A1阳性细胞的比例和实际数量均高于步骤2的时间为2天(R2)的情况(参照图7B和图7C)。另一方面,在步骤2的时间为4天(R4)的条件下,与步骤2的时间为3天相比,没有观察到太大的变化(参照图7C)。
根据该结果,以后将步骤2的时间设为3天。
6.步骤1中其他药剂的并用效果
将步骤2的时间设定为3天后,再次改变步骤1的CHIR99021的浓度,评价添加bFGF能否提高效率。在图8A中示出了详细的实验方案。
其结果,CHIR99021的浓度为15μM时的NR5A1阳性细胞的比例优于CHIR99021的浓度为10μM的情况,另外,没有bFGF时的分化诱导效率更好(参照图8B和图8C)。
7.步骤2中的RA浓度的优化
将步骤1的时间设为4天,将步骤2的时间设为3天,将步骤2的RA浓度设为0.3μM、1μM、3μM及10μM,将PD0325901设为1μM和0μM,除此以外,在目前为止同样的条件下实施了试验(参照图9A)。
在诱导第15天进行评价时,发现在不加入PD0325901时完全看不到NR5A1阳性细胞(参照图9A~图9D)。另一方面,关于RA浓度,发现在0.3μM或10μM时都能够高比率地被诱导,但NR5A1阳性细胞的比例和NR5A1阳性细胞的数量均是在小鼠的条件为相同程度的1μM以上且3μM以下时特别良好(参照图9A~图9D)。
8.步骤2中的KSR和PD0325901浓度的优化
接着,详细设定并比较了KSR和PD0325901的浓度。KSR设为7、8、9和10v/v%,PD0325901设为0.4、0.6、0.8和1.0μM进行培养,在第15天进行评价。图10A示出了详细的实验方案。
当KSR浓或PD0325901稀时,确认到未出现NR5A1阳性细胞(参照图10B)。从FACS分析中也确认到同样的结果(参照图10C)。
在KSR浓度为7v/v%、且PD0325901浓度为1.0μM的情况下,分化诱导效率最好。但是,为了从10000个细胞开始而获得1000个以上的更多的细胞,接下来尝试改变基础培养基。
9.基础培养基的研究1
将KSR浓度设为5.0和7.5v/v%,使用DMEM、Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12、Advanced MEM和Advanced RPMI五种类型的培养基。关于培养时间,将步骤1的时间设为4天、步骤2的时间设为3天,在诱导第23天进行评价。在本试验中,使用了与以往不同的iPS细胞株。具体而言,使用了FOXL2-tdTomato和NR5A1-EGFP的荧光报告细胞株(NGFT株),而不是OSR1-tdTomato和NR5A1-EGFP的荧光报告细胞株(OTNG株)。
结果发现,KSR浓度为7.5v/v%时分化诱导效率更优异,Advanced DMEM和Advanced DMEM/F12的分化诱导效率特别优异(参照图11A~图11D)。需要说明的是,在图11A中,KSR浓度5v/v%的DMEM由于细胞已经死亡,因此没有照片。
10.基础培养基的研究2
将KSR浓度固定在7.5v/v%并使用OTNG株,除此之外,在与上述“9.”相同的条件下进行了DMEM、Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12、Advanced MEM和Advanced RPMI五种类型的培养基的研究。在诱导第15天和第23天进行评价。
其结果,与DMEM相比,Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12和Advanced RPMI的分化诱导效率更好(参照图12A~12D)。另一方面,发现在Advanced MEM中虽然细胞数量增多,但难以变成NR5A1阳性(参照图12A~图12D)。在本试验中,Advanced DMEM的分化诱导效率比Advanced DMEM/F12更好,但随后的研究发现,Advanced DMEM/F12也为相同的分化诱导效率(未图示)。
11.基础培养基的研究3
除了在步骤3的最初的6天(即,从诱导第7天到第13天)添加SHH以外,在与上述“10.”相同的培养条件下,进行DMEM、Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12、Advanced MEM和Advanced RPMI五种类型的培养基的研究。在诱导第15天和第23天进行评价。
其结果,在Advanced RPMI中几乎没有见到NR5A1阳性细胞(参照图13A~图13D)。另一方面,与DMEM相比,在Advanced DMEM和Advanced DMEM/F12中所得到的NR5A1阳性细胞的数量更多。
由该结果可知,通过跨越步骤2的培养时间至步骤3的培养时间持续添加SHH,从而出现使分化诱导效率更优异的倾向。
12.步骤2中的SHH浓度的优化
接着,研究了步骤2中的SHH浓度的优化,并再次研究了步骤3初期的SHH给药的效果。步骤2中的SHH浓度设为0、30、50和100ng/mL四种,步骤3中的SHH浓度设为0和30ng/mL。步骤3中的SHH的添加时间固定为3天,在其他药剂的浓度不改变的情况下实施。使用的基础培养基是含有7.5v/v%KSR的DMEM。图14A示出了详细的实验方案。
其结果,步骤2中即使没有添加SHH,也确认到出现NR5A1阳性细胞,即使增加SHH浓度,细胞数量和分化诱导效率也没有观察到显著变化。另一方面,步骤3中添加了SHH时,诱导效率趋于更高,但没有观察到细胞数量的显著增加。
从这些结果来看,尽管SHH对于性腺体细胞的诱导不是必需的,但在步骤3初期而不是步骤2添加时获得的NR5A1阳性细胞的数量趋于增加,。
13.标记基因的研究
到上述“12.”为止的研究的结果,按照图15A所示的实验方案进行了分化诱导。然而,在步骤3的培养时,胚状体的大小随着时间的推移而减小,并且观察到许多死细胞。此外,在诱导第15、22和29天对NR5A1(SF1)阳性细胞进行qPCR的结果,确认到作为前方脏器的肾上腺细胞的标记基因的ACTH受体MC2R的表达,靠近头部(前方)的标记基因GATA3的表达高(参照图15B)。因此,显示具有肾上腺性质的可能性高。另一方面,未确认到颗粒膜细胞的标记基因FOXL2的表达(参照图15B)。
由以上结果,作为用于评价靠近尾部(后方)的标记基因,以已有的报告(参考文献3:Dolle P et al.,“Two gene members of the murine HOX-5complex show regionaland cell-type specific expression in developing limbs and gonads.”,The EMBOJournal,Vol.8,No.5,pp.1507-1515,1989.;参考文献4:Zubair M et al.,“Two-stepregulation of Ad4BP/SF-1gene transcription during fetal adrenal development:initiation by a Hox-Pbx1-Prep1 complex and maintenance via autoregulation byAd4BP/SF-1”,Mol Cell Biol.,Vol.26,No.11,pp.4111-4121,2006.)为基础,选择HOXD9和HOXD10作为卵巢体细胞的标记基因,选择HOXA7和HOXB9作为肾上腺细胞的标记基因,并随后进行评价。
14.步骤1中有无bFGF的研究和步骤2中RA浓度的优化
将步骤1中的bFGF浓度设为0和5ng/mL,将步骤2中的RA浓度设为0.1(100nM)、0.5(500nM)和1μM,除此以外,在与图15A所示的实验方案同样的条件下,在诱导第15天进行评价。
其结果,即使在步骤1中追加bFGF、降低步骤2中的RA浓度,也没有确认到后方化的标记基因的表达(参照图16A和图16B)。另外显示,由于胚状体的大小也随着时间的推移而减小,因此不适合作为促进后方化的培养条件的可能性高。
15.步骤1的时间的优化3
由于预想到若步骤1的时间短则分化为靠近头部的组织、另一方面若步骤1的时间长则分化为靠近尾部的组织,因此将步骤1的时间设置为4天和7天(使步骤1和步骤2的总时间为7天和10天),除此以外,在与图15A所示的实验方案相同的条件下实施试验。作为细胞株,使用了OTNG株。
其结果,确认到HOXB9的表达,其被认为在肾上腺(Adrenal)中表达,而不在卵巢体(Gonad)中表达(参照图17)。
此外,即使延长了步骤1的时间、或者如“14.”那样研究并用其他药剂,HOXB9的表达也不是阴性的。
16.步骤1的培养方法的优化1
在步骤1的培养中,假设由于早期制作胚状体而导致细胞因子信号的不均匀刺激。为了解决这个问题,代替在V底板中的悬浮培养,研究了平面培养,因为通过平面培养可更有效且均匀地为细胞群提供用于后方化的细胞因子。此外,对平板的涂覆剂和其他药剂的并用也进行了研究。图18A示出了详细的实验方案。作为细胞株,使用了OTNG株。
作为代表例,使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养,将在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件(图18A中的星标的条件)的胚状体的经时变化(诱导第3、9、11、13、17和19天的观察像)示于图18B。
如图18B所示,对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,胚状体的大小经时变大。另外,对于使用涂覆有玻连蛋白的平板以平面培养的方式进行、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,与使用了纤连蛋白的上述样品同样,胚状体的大小经时变大(未图示)。另一方面,对于在诱导第2天至第4天之间没有并用其他药剂、并且添加了bFGF以及添加了A830-01的样品,胚状体的状态差(死亡)。
另外,在诱导第15天,通过FACS分析和定量PCR测量标记基因的表达量。将结果示于图18C(FACS分析)和图18D(定量PCR)。在图18C和18D中,“以往”是指图15A的实验方案中的培养条件。“Fibronectin plate w/o drug”是指使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间不添加其他药剂的培养条件。“Fibronectin plate with Activin A”是指使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件。在图18D中,“P7”是指OSR1-(阴性)和SF1+(阳性)的细胞,“P11”是指OSR1+(阳性)和SF1+(阳性)的细胞。
如图18C所示,在使步骤1的培养为平面培养、在诱导第2天至第4天之间不添加其他药剂的培养条件下,OSR1+(阳性)和SF1+(阳性)的细胞的比例上升。此外,在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件下,OSR1-(阴性)和SF1+(阳性)的细胞的比例进一步上升。
如图18D所示,在使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件下,GATA3和HOXB9的表达降低。另外,对于使用涂覆有玻连蛋白的平板以平面培养的方式进行、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,定量PCR的结果与使用了纤连蛋白的上述样品相同(未图示)。
对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,在诱导第22天,使用FOXL2抗体进行免疫染色。将免疫染色像示于图18E(倍率:20倍)和图18F(倍率:63倍)。
如图18E和18F所示,胚状体的中央部由于没有用DAPI染色,因此死细胞聚集。在最外层,仅SF1(NR5A1)为阳性,FOXL2从其内侧表达。
进一步,对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,在诱导第27天,基于FACS分析和定量PCR对标记基因的表达量进行测定。将结果示于图18G(FACS分析)和图18H(定量PCR)。对于图18G和图18H,在图18G中,“P7”是OSR1-(阴性)和SF1+(阳性)的细胞,“P10”是OSR1+(阳性)和SF1+(弱阳性)的细胞。“P7”和“P10”在以后的图中也以相同的含义使用。在图18H中,作为对照,还确认了从生物体采集的卵巢体细胞的标记基因的表达。
如图18G和18H所示,对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、并且在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)的培养条件的样品,确认到与从生物体采集的卵巢体细胞大致同等的FOXL2表达。与“P10”相比,在“P7”中,FOXL2表达较少的是OSR1-(阴性)和SF1+(阳性)的细胞,其是图18E和图18F的免疫染色像中用于形成最外层的细胞,因此推测FOXL2阴性细胞较多。
17.再现性确认试验
在“16.”的培养条件下进行2次再现性确认试验。作为细胞株,使用OTNG株。在诱导第21或22天,通过定量PCR测定标记基因的表达量。将结果示于图19A。
如图19A所示,在2次再现性确认试验中,都确认了FOXL2的表达。另外,认为HOXB9的降低是后方化的指标。
另外,在再现性试验中,在诱导第4、10、16和21天进行FACS分析。将结果示于图19B。
如图19B所示,在诱导第4天,OSR1+(阳性)和SF1(NR5A1)-(阴性)的细胞较多,在诱导第10天,OSR1+(阳性)的细胞数降低,SF1(NR5A1)+(阳性)的细胞数开始上升。在诱导第16天,OSR1-(阴性)和SF1(NR5A1)+(阳性)的细胞数上升,在诱导第21天,OSR1-(阴性)或OSR1+(阳性)且SF1(NR5A1)+(阳性)的细胞数上升。
18.步骤1的培养方法的优化2及步骤3中其他药剂的并用效果
对于在步骤1中有无添加激活素A、以及使培养方法为使用涂覆有纤连蛋白的平板的平面培养或使用V-底板的悬浮培养、并且在步骤3中有无添加BMP4和FGF9进行了研究。将具体的实验方案示于图20A。作为细胞株,使用OTNG株。将在诱导第21天的各培养条件的胚状体的观察像示于图20B。
如图20B所示,对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)、且在步骤3中未添加BMP4和FGF9的培养条件的样品,胚状体大幅地生长。
对于使步骤1的培养为使用V-底板的悬浮培养、在诱导第2天至第4天之间添加激活素A(10ng/mL)、并且在步骤3中不添加BMP4和FGF9的培养条件的样品,也得到大的胚状体,因此在诱导第22天进行免疫染色。然而,未确认到FOXL2、SF1(NR5A1-EGFP)及OSR1(OSR-tdTomato)的表达(未图示)。
另一方面,对于使用涂覆有纤连蛋白的平板以平面培养的方式进行步骤1的培养、在诱导第2天至第4天之间添加了激活素A(10ng/mL)、且在步骤3中未添加BMP4和FGF9的培养条件的样品,在诱导第17天观察到卵巢体细胞样结构(Soma-like)、蘑菇样结构(Kinoko-like)及黑点结构(Black)的胚状体(参照图20C)。对于各结构的胚状体,在诱导第22天进行FACS分析。将结果示于图20D。
如图20D所示,在Soma-like和Kinoko-like的胚状体中,FACS图出现相同的倾向。
另外,将Kinoko-like的胚状体的诱导第17天的免疫染色的结果示于图20E。
如图20E所示,最外层仅SF1(NR5A1)为阳性,FOXL2从其内侧表达。这是与上述“16.”中的胚状体的免疫染色像同样的结果(参照图18E和图18F)。
此外,在诱导第22天,通过定量PCR测定标记基因的表达量。将结果示于图20F。
如图20F所示,在步骤1中的培养为利用V-底板的悬浮培养的样品中,几乎没有确认到FOXL2的表达。另外,GATA3的表达低,但HOXB9的表达高,结果并不能说是分化成了卵巢体细胞。
Kinoko-like的胚状体的P7和P10中FOXL2的表达方式分别与Soma-like胚状体的P7和P10中FOXL2的表达方式几乎相同。因此,推测Soma-like和Kinoko-like的胚状体具有卵巢体细胞的性质。
另一方面,在Black的胚状体中也确认到了FOXL2的表达,但HOXB9的表达方式与Soma-like及Kinoko-like的胚状体不同。
基于以上的结果,以后,以图20G所示的实验方案为基础,实施试验。
19.PDGFRα表达的确认
在卵巢体细胞中存在颗粒膜细胞和间质细胞,认为在颗粒膜细胞中FOXL2表达,在间质细胞中PDGFRα表达。因此,在由图20G所示的实验方案得到的细胞(作为细胞株,使用OTNG株)中,通过FACS确认了PDGFRα的表达的变化(图21和表6)。在图21和表6中,“P11”表示PDGFRα+(阳性)细胞。另外,FACS分析中使用的抗PDGFRα抗体是Biolgend公司生产的APCanti-human CD140a(PDGFRα)antibody(No.323512)。作为实验方案,制成单细胞(singlecell)后,使其与抗PDGFRα抗体反应(在冰上4℃下孵化30分钟),然后进行2次洗涤。
[表6]
Induction date | FACS date | P11 cell/agg |
0823 | D78 | 46.0%(6699) |
0830 | D68 | 33.4%(30295+α) |
0906 | D61 | 14.7%(10167) |
0913 | D54 | 15.5%(21926) |
1025 | D29 | 18.5%(3011) |
1101 | D23 | 6.5%(602) |
1108 | D15 | 7.9%(1485) |
1101 | D14 | 8.6%(149) |
如图21所示,在诱导30天前后,确认到PDGFRα表达的比例增加。
20.步骤3中长期培养的研究
使由图20G所示的实验方案得到的卵巢体细胞样细胞与PGCLCs共凝集培养,在研究是否能够得到成熟卵子之前,由于共凝集培养涉及很长时间,因此在长时间培养的情况下,研究了上述卵巢体细胞样细胞能否维持作为卵巢体细胞的性质。具体而言,在图20G所示的实验方案中,进行了维持步骤3的培养条件状态下的长期培养。作为细胞株,使用OTNG株。
将诱导第22天和第37天的胚状体的观察像(左侧)和FACS分析的结果(右侧)示于图22A。
如图22A所示,诱导第37天的胚状体与诱导第22天的胚状体相比,尺寸更大,另外,在OSR1+(阳性)细胞中,出现SF1-(阴性)细胞有增加的倾向。
另外,在诱导第37天、第57天和第86天进行免疫染色。将结果示于图22B(第37天)、图22C(第57天)和图22D~图22F(第86天)。
在诱导第37天,FOXL2的表达能够充分维持(参照图22B)。在诱导第57天,在中央部形成OSR1+(阳性)和FOXL2+(阳性)的细胞群,在中央部也充实了FOXL2+(阳性)的细胞(参照图22C)。在诱导第86天,SF1+(阳性)和FOXL2+(阳性)的分布一致(参照图22D),并且层粘连蛋白围绕着SF1+(阳性)而存在(参照图22E)。颗粒膜细胞以被层粘连蛋白包裹的方式形成岛状,因此在诱导第86天的时间点,确认为与生物体内的卵巢索类似的结构。
21.步骤3中的SF1(NR5A1)的表达及细胞状态的确认
由于细胞数少时胚状体不能很好地形成,因此在步骤2中活细胞可能变得相当少,因此进行了细胞状态的确认。具体而言,作为细胞株,使用OTNG株,以图20G所示的实验方案进行培养,在诱导第7、8、9、10、11、12、14以及15天进行FACS分析。在FACS分析中,通过DAPI进行死细胞的除去后,绘制OSR1+/-和SF1+/-(参照图23A和图23B)。
如图23A和图23B所示,在诱导第7天至第15天,出现P1中的活细胞群增加的倾向。另外,出现DAPI阳性细胞也逐渐减少的倾向。从诱导第12天开始,确认到SF1阳性细胞的增加。
<由食蟹猴ES细胞向卵巢体细胞样细胞分化诱导的研究试验>
[材料]
1.食蟹猴ES细胞株
为了维持食蟹猴雌性ES15XRi细胞株及其敲入报告株的品质,手工拾取仅形态良好的菌落,将其继代培养。或者,使用多能性标记物SSEA-4和TRA1-60以流式细胞仪将优质ES细胞浓缩并继代培养。其他继代培养的方法按照已有报道(参考文献5:Sakai Y et al.,“Induction of the germ cell fate from pluripotent stem cells in cynomolgusmonkeys.”,Biology of Reproduction,Vol.102,Issue 3,pp.620-638,2020.)进行。适当调整继代培养时的接种细胞数。
为了简便地观察各发生阶段中代表性的基因表达,对于食蟹猴雌性ES15XRi细胞株,使用Cas9核酸内切酶和基因靶向(gene targeting),删除TBXT、OSR1、NR5A1、FOXL2、WT1和GATA4的终止密码子,插入2A和EGFP(TBXT、NR5A1)、tdTomato(OSR1、FOXL2、WT1)及2A和mTagBFP2(GATA4),在其后方敲入夹在loxP之间的耐药盒(cassette)(参照图24A~图24F;需要说明的是,在图24A~图24F中,“PGK”表示PGK启动子)。然后,使用Cre除去耐药盒,制作以下5种双报告细胞株。
(1)TBXT-EGFP/OSR1-tdTomato(以下有时简称为“TGOT株”);
(2)NR5A1-EGFP/FOXL2-tdTomato(以下有时简称为“NGFT株”);
(3)NR5A1-EGFP的单一报告株(以下有时简称为“NG-Puro株”。需要说明的是,该株未进行利用Cre的耐药盒的除去。);
(4)WT1-tdTomato/GATA4-mTagBFP2/NR5A1-EGFP的三重报告株(以下有时简称为“WTGBNG株”);
(5)WT1-tdTomato/NR5A1-EGFP(以下有时简称为“WTNG株”)。
2.培养基及药剂
关于培养基和药剂等,使用上述表1和表2所记载的培养基和药剂。
[方法]
1.荧光免疫染色及基于荧光显微镜的观察
用于免疫染色的抗体如下。
(1次抗体:稀释倍率均为250倍)
abcam公司生产的兔抗FOXL2抗体(ab246511)
SICGEN公司生产的山羊抗tdTomato抗体(AB8181-200)
Nakarai Tesk公司生产的大鼠抗GFP抗体(04404-84)
(2次抗体:稀释倍率均为500倍)
ThermoFisher公司生产的Donkey anti rat Alexa Fluor 488(A21208)
ThermoFisher公司生产的Donkey anti goat Alexa Fluor 568(A11057)
ThermoFisher公司生产的Donkey anti rabbit Alexa Fluor 647plus(A32795)
另外,使用荧光显微镜(ZEISS共聚焦激光扫描,LSM780)观察各阶段的细胞。
2.FACS(Fluorescence activated cell sorting分析)
使用流式细胞仪(BD FACSAria III)分析各阶段的细胞。
3.定量PCR
对于以下的引物和条件,使用PCR装置(BIO-RAD CFX384 Real-Time System)确认各标记基因的相对表达量。表中的PAX3、OSR1、PAX2#3、EMX2#1、WT1#2及LHX9#2的引物仅用于图31C的实验,OSR1#10、CXCL12x4、BMP2及BMP4的引物仅用于图57C的实验。GAPDH基因及PPIA基因作为管家基因进行测量,用图表来表示将2者的Ct值的平均值作为对照值的相对值。虽然在图表中没有记载,但除了图31C的实验以外,作为对照,并用了ERCC-00096、ERCC-00009、ERCC-00022以及ERCC-00025。
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
4.RNA-seq
通过下一代测序仪(NGS)(Illumina公司制,NextSeq 550)确定全部转录物的碱基序列后,计算特定基因的表达量。
[实施例2]
1.步骤1中的ROCK抑制剂的研究
在诱导时,将ES细胞在作为饲养细胞的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上进行培养,然后用蛋白分解酶液(CTK:胶原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)和KSR)处理后,用TrypLEselect解离至单个细胞水平。接着,将每3万个细胞接种到低粘附96孔U底培养板(以下,如果没有特别说明,以同样的方法开始步骤1)。细胞株使用TGOT No.25株。研究了步骤1中有无ROCK抑制剂(Y-27632)。将详细的实验方案示于图25A。在图25A中,基础培养基GK7.5的组成为GMEM、7.5v/v%KSR、0.1mM 2-ME、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺。以步骤1的时间为2天、步骤2的时间为2天进行。在步骤2中,使用PD173074代替小鼠中使用的PD0325901。PD173074是FGF的抑制剂,而PD0325901是FGF信号传导途径的靠下游的MEK抑制剂。
与小鼠同样,在步骤1中不使用Y-27632进行诱导,但在诱导第2天细胞集块(胚状体)的形成效率也显著降低(参照图25B左侧照片)。因此,此后添加Y-27632进行实验。(参照图25B右侧照片)。需要说明的是,以下如果不特别说明,Y-27632在第1天除去。
如图25B右侧的荧光照片所示,确认在步骤1(d1和d2)中EGFP表达,在步骤2(d3和d4)中tdTomato表达,TBXT和OSR1表达。
图25C是FACS分析的结果,表明:与作为对照分析的Wild type相比,很显然这些基因也表达。
2.步骤1中的CHIR99021浓度和BMP4浓度的优化1
接着,将步骤1的时间固定为2天,进行TBXT和OSR1表达所需的CHIR99021(以下简称为“CHIR”)浓度和BMP4浓度的研究(参照图26A)。改变条件而使CHIR浓度为0、1、3、8、14和20μM并且使BMP4浓度为0、1、3和10ng/mL,在诱导第2天,通过FACS分析进行评价。细胞株使用TGOT No.25株。
其结果,在CHIR99021浓度为8μM以上的情况下,认为能够高效率地表达TBXT。(参照图26B)。
3.步骤1中的CHIR99021浓度和BMP4浓度的优化2
根据“2.”的结果,改变条件而使CHIR99021浓度为3、8及14μM并且使BMP4浓度为1、3及10ng/mL,以步骤1的时间为2天、以步骤2的时间为4天进行(参照图27A)。需要说明的是,在这以后的实验中,与小鼠同样地在步骤2中使用PD0325901。细胞株使用TGOT No.25株。
根据“2.”的结果,认为:在CHIR99021浓度为8μM以上的情况下,能够高效率地表达TBXT,但转移到步骤2时,认为通过使CHIR99021浓度为14μM以上,能够高效率地表达OSR1(参照图27B和图27C)。另外,通过使CHIR99021浓度为14μM以上、并且增加BMP的量,从而确认了OSR1的表达增强(参照图27B和图27C)。
4.步骤1中的CHIR99021浓度及BMP4浓度的优化3
根据“3.”的结果,为了研究最适合OSR1表达的CHIR的下限,将CHIR浓度固定为10μM,改变条件而使BMP4浓度为1、3和10ng/mL,以步骤1的时间为2天、步骤2的时间为4天进行(参照图28A)。作为阳性对照,还设置了BMP4浓度为1ng/mL、且CHIR浓度为14μM的条件。在诱导第2、4和6天进行FACS分析。细胞株使用TGOT No.25株。
不管BMP4浓度如何,在CHIR浓度10μM时确认了OSR1的表达(参照图28B)。另外,在CHIR浓度10μM时也被确认到由BMP4添加量引起的OSR1的表达上升(参照图28B)。
综上所述,认为最适合中间中胚层诱导的CHIR浓度为10μM以上。
5.在步骤1中添加bFGF及激活素A的研究1
在现有研究的中间中胚层诱导中,有通过添加bFGF、ActivinA来诱导中间中胚层的报道,在步骤1中进行了这些添加的研究。bFGF在整个步骤1的时间以50ng/mL进行添加,激活素A从诱导第1天开始以10ng/mL仅添加1天,以及在无添加的条件下进行实验。细胞株使用TGOT No.25株。将诱导第2天、第4天和第6天的FACS分析的结果示于图29B。
如图29B所示,bFGF和激活素A的添加均在使OSR1的表达亢进的方向上起作用,被认为对中间中胚层诱导有用。
6.步骤1中添加BMS493和Y-27632的研究
RA提供胚胎前方化的信息,承担胚胎前后方向的调节。因此,通过在进行胚胎的后方化的步骤1中以1μM使用RA的抑制剂BMS493来研究是否会发生变化(参照图30A)。需要说明的是,还研究了Y-27632仅1天或连续2天添加的情况。细胞株使用TGOT No.25株。CHIR也尝试了两个制造商(Tocris公司生产和BioVision公司生产)的产品。将诱导第2天、第4天和第6天的FACS分析的结果示于图30B和图30C。
如图30B和图30C所示,关于CHIR,因制造商的不同,在标记基因的表达上没有发现大的差异,因此决定一如既往地利用Tocris的产品。关于BMP493,观察到在步骤2中的OSR1表达的亢进。
7.步骤1中添加LDN的研究
由于已知BMP浓度规定了中胚层分级,因此通过在步骤1中使用作为BMP抑制剂的LDN193189来评价OSR1表达和FOXF1表达(参照图31A)。需要说明的是,FOXF1是侧板中胚层的标记物,用qPCR进行评价。BMP4浓度设为1ng/mL和0ng/mL,LDN193189浓度设为30nM、100nM和1000nM进行了研究。细胞株使用TGOT No.25株。
当增加LDN浓度时,确认在步骤1结束时刻(day2.2)的OSR1表达降低,即使转移到步骤2(day4及6),OSR1表达上升也变弱(参照图31B)。
如预期的那样,通过qPCR确认到作为侧板中胚层标记物的FOXF1的表达也由于没有BMP4和添加LDN而几乎消失(参照图31C)。另外,发现了在性腺中表达的HOXD9(参照图31C),认为胚胎的后方化程度良好。
从FACS的结果来看,BMP4浓度为0ng/mL以上时,几乎所有细胞都为OSR1阳性(参照图31B),但出乎意料地确认到了作为沿轴中胚层的标记物的PAX3表达(参照图31C)。
8.NR5A1阳性细胞的诱导
作为细胞株,使用TGOT No.25株和NGFT No.69株(NR5A1-EGFP/FOXL2-tdTomato的双报告株)进行了14天的诱导(参照图32A)。步骤1的时间为2天,步骤2的时间为2~8天,剩下的时间为步骤3。需要说明的是,TGOT No.25株将步骤2持续12天。将FACS分析的结果示于图32B。在图32B中,最上段表示TGOT No.25株中的每2天的流式细胞术结果。在图32B的FACS图中,横轴表示EGFP(TBXT或NR5A1(SF1)),纵轴表示tdTomato(OSR1或FOXL2)的表达。第2段以下是NGFT No.69株中的结果,第2段是NGFT No.69株,不转移到步骤3,进行了12天的步骤2。
如图32B所示,对于第2段的NGFT No.69株,在未转移到步骤3、且进行12天步骤2的条件下,未确认到NR5A1的表达。另一方面,在将步骤3设为10天的情况下,从诱导第10天左右,开始出现表达NR5A1的细胞(箭头),在第14天明显可见。当步骤2的时间为6天以上(步骤3为6天以下)时,NR5A1阳性细胞消失。
9.FOXL2阳性细胞的诱导
根据“8.”的结果无法确认FOXL2的表达,因此将诱导时间延长至22天(参照图33A)。步骤1的时间设为2天、步骤2的时间设为2~8天、剩下的时间设为步骤3。细胞株使用NGFT No.69株。
在步骤2的时间为2天的条件下,在第17天、第20天和第22天进行FACS分析,结果在第17天确认到明显表达了FOXL2的细胞,认为成功诱导了卵巢的体细胞(参照图33B)。
10.步骤1中的CHIR99021浓度和BMP4浓度的优化4
为了评价步骤1中的CHIR浓度和BMP4浓度对NR5A1和FOXL2表达的影响,将步骤1和步骤2的时间固定为2天,将CHIR浓度设为10、14和20μM,将BMP4浓度设为1、3和10ng/mL,培养进行至第17天(参照图34A)。细胞株使用NGFT No.69株。
在CHIR浓度为20μM的条件下,也出现许多NR5A1阳性细胞,另一方面,20μM为相当高的浓度,存在使胚状体变得非常小的倾向,因此也担心细胞毒性(参照图34B和图34C)。因此,之后决定研究CHIR浓度14μM的条件。另外,BMP4也过度增加时,确认到相同的倾向(参照图34B和图34C)。
11.步骤1中的BMP4浓度和LDN浓度的优化
由于已知OSR1和FOXF1的表达量根据BMP浓度而变动,因此研究了在步骤1中使用作为BMP抑制剂的LDN193189时哪个条件最有助于NR5A1阳性细胞的出现(参照图35A)。BMP浓度设为1ng/mL和0ng/mL,LDN193189浓度设为30、100和1000nM。细胞株使用了NGFT No.69株。
在诱导第14天、第17天和第21天进行FACS分析,关于NR5A1阳性细胞的比例,几乎没有确认到通过添加LDN带来的改善(参照图35B)。
12.步骤1中添加BMP4、LDN和BMS493的研究
研究了在步骤1中LDN和BMS493的添加是否有助于诱导NR5A1阳性细胞(参照图36A)。在步骤1的时间为2天或3天(步骤1的时间为3天时,仅LDN浓度30nM)、BMP4浓度1ng/mL及0ng/mL、添加(1μM)和不添加BMS493的6个条件下,步骤2固定为2天,在诱导第14天进行FACS分析(参照图36B)。细胞株使用NGFT No.69株。
如图36B所示,由于几乎没有诱导NR5A1阳性细胞,因此没有由特别添加LDN、BMS带来的优点。
13.步骤1中添加bFGF和激活素A的研究2
对于在步骤1中添加bFGF 50ng/mL和激活素A 10ng/mL(仅从day1开始)是否会改善NR5A1阳性细胞的诱导进行了研究(参照图37A)。步骤1和步骤2的时间均为2天,在诱导第14天和第21天进行FACS分析(参照图37B)。细胞株使用NGFT No.69株。
如图36B所示,未确认到通过添加bFGF和激活素A带来的NR5A1阳性细胞的诱导改善。
另外,分选在FACS分析中诱导第14天的NR5A1弱阳性及强阳性细胞,进行qPCR。确认作为性腺标记物的WT1、GATA4和NR5A1的表达,发现在小鼠卵巢中表达的HOXD9和HOXD10(参照图37C),因此是作为性腺体细胞的前体细胞而言不矛盾的观察结果。可知作为侧板中胚层的标记物的FOXF1和HAND1为阴性(参照图37C)。
14.步骤2中的BMP4浓度的优化、以及添加LDN和FGF9的研究
在现有的研究中,将FGF9和LDN用于中间中胚层诱导,将其作为参考,在步骤2中将BMP4浓度设为0、1和10ng/mL,通过LDN的添加(100nM)和FGF9的添加(100ng/mL),研究了NR5A1阳性细胞的诱导效率是否改善(参照图38A)。细胞株使用NGFT No.69株。以步骤1的时间为2天、以步骤2的时间为2天进行,在诱导第14天通过FACS分析进行评价(参照图38B)。
如图38B所示,任何条件都没有改善NR5A1阳性细胞的诱导效率。
15.步骤1中的细胞数及培养板的优化
接着,研究了通过改变细胞数和培养板(96well V-bottom)是否会使诱导效率发生改变(参照图39A)。同时还研究了接种的细胞数。步骤1和步骤2的时间一共为2天,步骤1在CHIR浓度14μM和BMP4浓度1ng/mL下进行。在诱导第14天和第21天进行FACS分析,在诱导第14天观察胚状体的情况。细胞株使用NGFT No.69株。需要说明的是,细胞数300难以培养。
在全体中几乎都没有进行诱导,没有确认到基于V底而带来的改善(参照图39B),从生存细胞数(P1栅极处的细胞数)和出现NR5A阳性细胞的观点来看,认为对U底而言细胞数3万是妥当的(参照图39B及图39C)。需要说明的是,在图39B中,P1栅极处的细胞数由“(总细胞数)×(P1的比例)”计算,例如对U底而言细胞数3万时的P1栅极处的细胞数由25195×0.727计算。
16.步骤1中bFGF浓度、BMP4浓度和培养时间、以及步骤1中的培养时间的优化
根据目前为止的结果,考虑可能在步骤1的时间为2天、步骤2的时间为2天时没有诱导效率进一步提高的前景。因此,将步骤1的时间设为2、3和4天,将BMP4浓度设为0、1、5和10ng/mL,将bFGF浓度设为0、5、10和20ng/mL,研究步骤2为2和3天的条件(参照图40A),在诱导第16天通过FACS分析进行评价(参照图40B~图40G)。在图40B中,B表示BMP4,F表示bFGF。细胞株使用NGFT No.69株。以后,由于条件复杂,将步骤1、步骤2及步骤3的时间按照2-2-10(天)来记载。需要说明的是,以后,如果没有特别说明,在步骤1的第1天以10μM添加Y-27632。
如图40B所示,在步骤1、步骤2及步骤3的时间为2-2-12(天)时,与以往相同,确认到NR5A阳性细胞。没有因添加bFGF带来的明显变化。
如图40C所示,在步骤1、步骤2及步骤3的时间为3-2-11(天)时,没有明显的变化。
如图40D所示,在步骤1、步骤2和步骤3的时间为4-2-10(天)时,通过使步骤1的时间为4天以上,从而确认到活细胞的减少。
如图40E所示,在步骤1、步骤2及步骤3的时间为2-3-11(天)时,没有确认到显著的变化。
如图40F所示,在步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-3-10(天)时,通过在步骤1中添加bFGF,确认到显著的NR5A1阳性细胞诱导效率改善。关于阳性细胞的数量和比例,BMP4浓度0ng/mL及bFGF浓度5ng/mL时最大。
如图40G所示,当步骤1、步骤2和步骤3的时间为4-3-9(天)时,通过使步骤1的时间为4天,确认到活细胞的减少。
根据这些结果,在96种尝试过的培养条件中,被认为非常有效的培养条件只有4种模式,步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-3-10(天)、不添加BMP4以及bFGF浓度5ng/mL被认为是最好的。
在步骤1、步骤2和步骤3的时间为3-3-10(天)、不添加BMP4以及bFGF浓度为5ng/mL的条件下,再追加1天步骤3(诱导第17天),通过FACS分析,分选NR5A1阴性(图40H的P10)、NR5A1阳性和FOXL2阴性(图40H的P8)、NR5A1阳性和FOXL2阳性(图40H的P9),进行qPCR。将结果示于图40I~图40K。在图40I~40K中,“NC”表示NR5A1阴性细胞,“SF1”表示NR5A1阳性和FOXL2阴性细胞,“FOXL2”表示NR5A1阳性和FOXL2阳性细胞。
如图40I~图40K所示,对于NR5A1阳性和FOXL2阳性细胞,确认到FOXF1阴性且WT1、GATA4、NR5A1和AMHR2阳性、作为性腺的细胞而言不矛盾的基因表达模式。对于FOXL2阳性细胞,确认到RSPO1、FOXL2、WNT6和KITL阳性、作为前颗粒膜细胞而言不矛盾的观察结果。对于NR5A1阳性细胞,确认到WNT5a阳性、PDGFRα以及TCF21的表达,是性腺的体细胞及其前体细胞,但目前无法判别是分化为间质细胞还是分化为颗粒膜细胞。
另外,在诱导第17天对BMP4浓度为0ng/mL及bFGF 10ng/mL条件下的胚状体进行免疫染色(参照图40L,标尺(Scale bar)在10倍时为50μm、在63倍时为10μm。)。
如图40L所示,确认FOXL2在tdTomato中被报告,确认在蛋白质水平上也表达了前颗粒膜细胞的标记物。此外,还发现性腺体细胞发生外周优势。
17.步骤1中激活素A的添加及步骤1的时间的研究
由于在步骤1中添加bFGF而不添加BMP4的条件最好,因此对在步骤1的第1天后追加激活素A是否会进一步改善体系进行了实验(参照图41A)。另外,对于步骤1的时间从2.5天到3.5天每隔半天研究条件。细胞株使用NGFT No.69株。在诱导第16天和第28天进行FACS分析。
如图41B所示,没有确认到由追加激活素A带来的改善,认为步骤1的时间为3天时特别良好。此外,在诱导第28天,发现FOXL2阳性集团与阴性集团明显分离。
分选该FOXL2阳性细胞,进行qPCR(参照图41C)。其结果发现,卵巢的体细胞具有性类固醇合成能力,而FOXL2阳性细胞则开始转录类固醇合成所需的基因组。
18.步骤2的时间的优化
接着,在步骤1中BMP4浓度为0ng/mL、bFGF浓度为5ng/mL以及步骤1的时间为3天、步骤2的时间为3、4、5及6天的条件下,诱导至第16天(参照图42A),通过FACS分析进行评价(参照图42B)。细胞株使用NGFT No.69株。
如图42B所示,虽然诱导效率不太好,但是没有出现由于步骤2的时间延长而带来的诱导效率的改善。
19.步骤2中的PD032901浓度的优化
PD032901是MEK抑制剂。因此,按照PD0325901浓度为3、1、0.3及0μM或者FGF9浓度为20ng/mL进行添加(参照图43A),在诱导第6天拍摄胚状体的观察像(参照图43B),在诱导第16天通过FACS分析(参照图43C)评价诱导效率。细胞株使用NGFT No.69株。
如图43B所示,对于步骤2结束时的大小,越减少PD0325901,越得到改善,并且在添加FGF9时也得到改善。
另外,如图43C所示,与以往同样,PD0325901浓度1μM被认为是最合适的。
20.步骤2中的BMP4浓度和SHH浓度的优化
接着,改变步骤2中的BMP4浓度和SHH浓度。改变条件而使BMP4浓度为0、1、5和10ng/mL并且使SHH浓度为0、30、60和100ng/mL(参照图44A)。细胞株使用NGFT No.69株。
在诱导第16天通过FACS分析对诱导效率进行评价时,BMP4浓度为1ng/mL及SHH浓度为100ng/mL时最好(参照图44B)。另外,SHH浓度依赖性地使FOXL2阳性及NR5A1阳性细胞数增加、胚状体也增大(参照图44B)。
21.步骤2中RA浓度及SHH浓度的优化
接着,进行步骤2中的RA浓度及SHH浓度的条件研究。另外,研究了SHH是否可以用小分子(small molecule)的SAG代替。改变条件而使RA浓度为0、0.3、1、3和10μM、使SHH浓度为30、100和200ng/mL、或者使SAG为100nM(参照图45A)。细胞数以23333个细胞/孔进行诱导。细胞株使用NGFT No.69株。
在诱导第16天通过FACS分析对诱导效率进行评价时,诱导效率低,但RA浓度为3μM以上时,NR5A1阳性细胞的诱导效率特别优异。另外,还提示了可以由SAG代替SHH的可能性。
根据以上结果表明,在本实验的时间点,在步骤2中RA浓度3μM、PD032901浓度1μM、BMP4浓度1ng/mL和EGF浓度50ng/mL最好。另外,即使SHH浓度为30ng/mL,有时也能够充分地进行诱导,但出现通过SHH的增量而改善诱导效率的倾向。
22.在明胶涂布皿中的去除MEF的研究
对于在饲养层(feeder)上的培养,为了尽量减少MEF的带入,尝试了将ES细胞接种到明胶涂布的皿中,30分钟后回收上清而开始诱导,从而减少MEF的带入。细胞株使用NGFTNo.69株。由常规诱导的物质和进行了明胶涂布皿处理的物质进行诱导至第16天(参照图46A),通过FACS分析进行评价(参照图46B)。
如图46B所示,未确认到由MEF去除带来的诱导效率的改善。
23.基于胶原蛋白酶type4进行MEF去除的研究
对于在饲养层上的培养,为了尽量减少MEF的带入,尝试了通过使用胶原蛋白酶type4回收ES细胞来减少MEF的带入。将常规的诱导和通过基于胶原蛋白酶type4的ES细胞回收来尝试MEF去除的诱导进行比较(参照图47A)。存在通过MEF去除而使胚状体变大的倾向,因此改变条件而使每1个孔的细胞数为3万、2万及1万进行了研究。细胞株使用NGFTNo.69株。
在诱导第16天通过FACS分析来评价诱导效率时,不进行MEF除去处理的诱导效率更好(参照图47B)。
24.步骤3中BMP4浓度及FGF9浓度的优化
作为步骤3的条件研究,研究了BMP4浓度和FGF9浓度。在BMP4浓度为0、1、20和50ng/mL、FGF9浓度为0、2、10和20ng/mL的条件下进行诱导(参照图48A),在第16天通过FACS分析进行评价(参照图48B)。细胞株使用NGFT No.69株。
如图48B所示,最诱导NR5A1阳性细胞的条件是BMP4浓度1ng/mL、FGF9浓度10ng/mL。
由于BMP4诱导性腺前体细胞中必需的GATA4,因此预期BMP4浓度50ng/mL能够更好地诱导,但结果完全相反。FGF9是睾丸化作用中有名的因子,增加其浓度很有效这一结果也是有趣的发现。
虽然诱导效率不是最好的,但得到的细胞数在迄今为止的实验中是最多的,认为原因之一是通过将细胞解离试剂从胰蛋白酶变更为Accumax、并增大反应体系从而使解离的效率得到改善。
25.4step诱导法的导入以及步骤3中BMP4、SHH和FGF9的必要性的验证
根据迄今为止的结果,由于认为SHH可能有助于诱导效率、BMP4有助于作为生殖嵴标记物的GATA4的表达,并且在肾脏区域的中间中胚层诱导中使用FGF9,因此在步骤2之后利用这些细胞因子,验证了其效果。细胞株使用NGFT No.69株。从诱导第6天起至认为NR5A1表达的诱导第10天左右为止(步骤3的时间),添加这些细胞因子,进一步在诱导第10天以后,验证BMP4浓度和FGF9的浓度(参照图49A)。
如果在诱导第16天通过FACS分析来评价诱导效率,则在研究期间不需要添加BMP4,反而不添加时诱导效率更好(参照图49B和图49C)。关于FGF9,添加2ng/mL时所诱导的细胞稍微增加,但没有显示出一定的倾向,效果稍不明显(参照图49B和图49C)。
关于SHH,除了添加SHH、BMP4浓度为1ng/mL、以及没有FGF9的条件以外,不添加时诱导效率更高,与迄今为止的验证相反,认为SHH可能起到抑制作用(参照图49B和图49C)。
26.步骤2中SHH的必要性和步骤4中FGF9的必要性的验证
由于已提示了SHH可能起到抑制作用,因此验证了步骤2中有无SHH以及替代小分子SAG的可能性。另外,在“25.”中,FGF9的效果不明显,因此验证了在步骤3中追加PD0325901时会发生什么情况。另外,为了确认BMP4在步骤3以后不是必须的,如图50A所示,针对如下共计20个条件进行了验证(参照图50A),即,在步骤2中为SHH浓度0和30ng/mL、或SAG浓度10、30和100ng/mL 5个条件,对于该5个条件,在步骤3以后为仅添加FGF9(浓度2ng/mL)、添加BMP4(浓度20ng/mL)及FGF9(浓度2ng/mL)、添加4天PD0325901(浓度1μM)之后不添加任何物质、以及添加4天PD0325901(浓度1μM)和BMP4(浓度20ng/mL)之后仅添加BMP4(浓度20ng/mL)。细胞株使用NGFT No.69株。
当在诱导第16天通过FACS分析来评价诱导效率时,发现在步骤2中不需要SHH,反而不添加SHH时诱导效率更好(参照图50B)。关于FGF9,也发现用PD0325901抑制FGF下游的MEK时诱导效率更好(参照图50B)。
27.步骤3中有用的因子的验证
除了PD0325901之外,还验证了步骤2的细胞因子中是否存在用于步骤3的有用因子。在步骤3中,除了EGF之外,还设置了RA(浓度3μM)、PD0325901(浓度1μM)、BMP4(浓度1ng/mL)及SHH(浓度30ng/mL)全部因子的添加或不添加的共计16种模式、以及作为对照而在步骤3以后什么都不加入和在步骤3中添加BMP4(浓度20ng/mL)和FGF9(浓度2ng/mL)。细胞株使用NGFT No.69株。将2种对照(即,在步骤3之后什么都不加入(CK-)和在步骤3之后添加BMP4(浓度20ng/mL)和FGF9(浓度2ng/mL))和其他条件下的诱导第16天的FACS图示于图51B。
如图51B所示,在步骤3以后任何细胞因子都不加入的模式下,诱导效率极高。
对于与步骤3以后无细胞因子(CK-)的对照相比而在步骤3中加入EGF(E)或1种其他细胞因子时会发生什么情况进行了验证(参照图51C)。
认为BMP4(B)的添加虽然使所诱导的细胞数较多,但诱导效率降低,效果不明显(参照图51C)。另外,与上次的结果相同,SHH(S)的添加起到不利的作用,PD0325901(P)的添加虽然细胞数降低,但诱导效率进一步提高,提示了有用的可能性(参照图51C)。维甲酸(R)3μM的添加显著降低了诱导效率(参照图51C)。
对追加各细胞因子的情况如何、其效果进行了详细验证(参照图51D~图51G)。
在各条件中追加BMP4的情况下,只要在将BMP4追加到EGF+RA时(ER+B),所诱导的细胞数降低(参照图51D)。添加少量的BMP4时,提示了所诱导的细胞数增加的可能性。
在上述“25.”中,由于添加了BMP4(浓度1ng/mL)直至诱导第16天,因此认为在诱导第10天以后不添加BMP4可能比较好。
在添加SHH的情况下,在所有条件下所诱导的细胞数量都减少,提示了SHH起到抑制作用(参照图51E)。
关于PD03的添加,认为:作为倾向而言并不固定,虽然由MEK的抑制而使所诱导的细胞数减少,但诱导效率本身存在改善的效力(参照图51F)。
RA的添加减少了一贯诱导的细胞数量。
根据以上结果,作为步骤3中的候补因子,考虑了PD0325901和BMP4(浓度1ng/mL)的利用。
28.用3step法诱导的SF1和FOXL2阳性细胞的基因表达
从“27.”的结果可知,即使在步骤3中不加入任何细胞因子,也能有效地诱导FOXL2阳性细胞。测量进行该诱导时RNAseq的数据。通过FACS分析对在诱导第16天强表达SF1的FOXL2阴性细胞(P7栅极,以下简称为“d16SF1+”)和FOXL2阳性细胞(P8栅极,以下简称为“d16FOXL2+”)进行分选(参照图52B),供于RNAseq(参照图52C)。在图52C的热图中,“色键(ColorKey)”的左侧(黑色)没有发现基因表达,右侧(白色)显示基因表达高。
所有细胞都强表达了生殖嵴的标记基因,SF1单独阳性细胞也确认到了颗粒膜细胞系列的标记物WNT6的表达(参照图52C)。
另外,在FOXL2阳性细胞中,间质细胞的标记物TCF21和MAFB降低(参照图52C)。由于确认到比较年幼的生殖嵴的体细胞的标记物SOX11和NR2F1的表达(参照图52C),也可以认为观察到正在从生殖嵴上皮向颗粒膜细胞分化的过程。
29.步骤3中PD0325901的添加时间的验证
由迄今为止的结果表明,通过添加PD0325901,所诱导的细胞数可能减少,但提示了诱导效率改善的可能性。
使用NG-Puro株作为细胞株对缩短PD0325901的时间会如何进行了验证。在步骤3中不添加PD03、添加48小时和添加96小时的条件下进行了验证(参照图53A)。
其结果表明,步骤3中的PD03的添加时间为48小时可能是最佳的(参见图53B)。
30.步骤3中PD0325901带来的影响的验证
为了验证在步骤3中添加PD03时对诱导有何影响,使用WTGBNG No.1株作为细胞株进行了验证。另外,为了确认诱导体系不需要SHH,除了在步骤3中添加或不添加PD0325901之外,还验证了在步骤2和步骤3中添加或不添加SHH的组合(参照图54A)。
将步骤3中不添加PD03的条件的FACS图示于图54B。在图54B中,左4列的FACS图的横轴为GATA4-mTagBFP2、纵轴为WT1-tdTomato,从左起依次为d8、d10、d12和d16。最右侧一列的横轴为SF1-EGFP、纵轴为APC,是对d16的FACS图的展开。最上面一行是步骤2中的SHH添加(+)和步骤3中的SHH添加(+),第2行是步骤2中的SHH添加(+)和步骤3中的SHH无添加(-),第3行是步骤2中的SHH无添加(-)和步骤3中的SHH添加(+),第4行是全部期间SHH无添加(-)。
其结果,即使不添加SHH,也诱导了SF1阳性细胞(参照图54B)。另外,在d8时间点,几乎所有的细胞都是WT1阳性,一部分细胞已经开始GATA4的表达(参照图54B),正在分化为生殖嵴上皮。
将步骤3中添加PD03的条件的FACS图示于图54C。图54C中的纵轴和横轴以及各行的条件与图54B相同。
在图54C中,与图54B的FACS图相比,在d10时间点,WT1低表达的细胞的比例整体减少,在d16中几乎所有的细胞都成为GATA4阳性。但是,被诱导的细胞数本身减少,特别是在不添加SHH的条件下,通过添加PD0325901,诱导效率最高。
因此认为,虽然SF1阳性细胞的产量可能减少,但不添加SHH且在步骤3中添加PD0325901时可能有助于诱导体系的稳定化。
另外,用显微镜观察在步骤2中不添加SHH和在步骤3中添加PD0325901时的细胞块的荧光(参照图54D)。如图54D所示,第8天(day8)在全体中观察到WT1的表达,确认到GATA4和SF1的表达从细胞块的外周部分开始,逐渐形成生殖嵴。这种情况与生殖嵴上皮增厚而逐渐形成生殖嵴的过程类似。
31.步骤3中RA浓度的优化
如果继续RA浓度3μM,则发现诱导效率急剧降低,因此对在步骤3中添加少量RA时会发生什么、相反在抑制RA信号时会发生什么进行了验证。细胞株使用WTGBNG No.1株。另外,RA的添加时间与PD03一共为48小时,浓度为3、1、0.1及0μM,或使用作为RA信号的反向拮抗剂(inverse antagonist)的BMS493(浓度1μM)(参照图55A)。在自诱导起第8、10、12、14和16天通过FACS分析进行评价(参照图55B和图55C)。
图55B的FACS图中,纵轴为WT1-tdTomato的基因表达,横轴为GATA4-mTagBFP2的基因表达,各行表示诱导天数。如图55B所示,在步骤3结束后,WT1几乎在所有细胞中都呈阳性,认为在任何条件下都有效地诱导了中间中胚层。当用BMS493抑制RA信号时,WT1的表达量略微降低。另外,在诱导第8天,部分细胞发现GATA4的表达,提示其正在逐渐分化为生殖嵴上皮。在RA添加条件下,WT1和GATA4的表达没有出现太显著的差异。
图55C的FACS图是以纵轴为APC、横轴为SF1-EGFP展开的图。在诱导第8天,SF1未表达,因此提供诱导第10、12、14和16天的数据。如图55C所示,在诱导第16天,未添加RA时最有效地诱导了SF1阳性细胞。另外,添加BMS493时,虽然SF1阳性细胞的诱导效率差,但出现SF1-EGFP表达量稍有增加的很有趣现象。也有报道称WT1对SF1表达起抑制作用,这提示可能已经看到了添加BMS493的影响。
32.更早期的WT1表达的确认
确认在步骤2结束后的阶段诱导了什么样的细胞。将详细的实验方案示于图56A。细胞株使用WTNG No.43株。在诱导第6、8、10和14天通过FACS分析进行评价(参照图56B)。
到目前为止,已经发现在步骤2结束时几乎所有的细胞都表达了OSR1(其为中间中胚层或侧板中胚层的标记物),如图56B所示,可知在诱导第6天已经出现了WT1阳性细胞。
33.WT1阳性细胞分化为生殖嵴的理由的考察
测定WT1阳性细胞中的基因表达。将详细的实验方案示于图57A。细胞株使用WTNGNo.43株。分别通过FACS分析对诱导第8天的WT1阳性细胞和诱导第10天的WT1单独阳性细胞以及WT1和SF1共阳性细胞进行分选(参照图57B),通过qPCR进行基因表达的确认(参照图57C)。
在图57C中,条形图从左侧开始依次为诱导第8天的WT1阳性细胞、诱导第10天的WT1单独阳性细胞、诱导第10天的WT1和SF1共阳性细胞。图表的纵轴表示相对于PPIA/GAPDH的dCT值。如图57C所示,在诱导第8天,OSR1表达已经显著降低,发现无论在哪个细胞的基因表达中都很好地表达了作为生殖嵴标记物的WT1和GATA4。另一方面,诱导第8-10天的WT1阳性且SF1阴性的细胞表达了BMP4,这促进了GATA4的表达(GATA4在BMP4的下游),提示其可能分化为生殖嵴。另外,在SF1阳性细胞中FOXF1的基因表达也降低,这也提示可能受到BMP4表达降低的影响。
34.间质细胞的检测
卵巢包含FOXL2阳性的颗粒膜细胞和PDGFRα阳性的间质细胞。在Yoshino等人的小鼠卵巢体细胞诱导法中,SF1阳性细胞分化成FOXL2阳性的颗粒膜细胞系和SF1及PDGFRα阳性的间质细胞。为了在猴子的诱导法中也验证这一点,从FOXL2开始表达的诱导第12天左右起定期进行FACS,进行SF1、PDGFRα、和FOXL2表达的监测。将详细的实验方案示于图58A。细胞株使用NGFT No.69株。将FACS图示于图58B。在图58B中,上段是以纵轴FOXL2-tdTomato、横轴SF1-EGFP对诱导第12、14、16、18以及22天的FACS图进行展开的图。左下是以纵轴PDGFRα-APC、横轴SF1-EGFP对诱导第12天和第14天的FACS图进行展开的图,右下是以纵轴PDGFRα-APC、横轴FOXL2-tdTomato对诱导第16、18及22天的SF1-EGFP阳性细胞的FACS图进行展开的图。
如图58B所示,在诱导第14天,SF1-EGFP相对低值的细胞的一部分表达了PDGFRα(箭头),从SF1的表达量来看,这些细胞是FOXL2阴性,因此认为它们是间质细胞。但是,除此之外的FACS图中明显的间质细胞样的信号很少,认为间质细胞的诱导需要进一步的条件研究。
35.步骤1和步骤2中EGF的必要性的验证
EGF在生殖嵴产生中的有用性不明确,不太清楚是如何起作用的功能。因此,以进一步简化诱导体系和降低成本为目标,在步骤1和步骤2中在不添加EGF的条件下进行诱导。将详细的实验方案示于图59A。细胞株使用NGFT No.69株。在诱导第16天进行FACS分析。
结果,EGF的效果仍然是不明确的,并且被认为不是诱导所必需的(参照图59B)。
36.总结
根据以上结果,建立了由食蟹猴ES细胞高效、呈再现性地诱导FOXL2阳性的颗粒膜细胞系列的细胞的方法(参照图60A)。另外,该诱导方法除了少量的bFGF和BMP4以外还使用比较便宜的小分子等制成简单的实验方案。
在诱导过程中,以模仿生物体和小鼠的诱导法的方式,由刚着床后的相当于外胚层的ES细胞,成功地诱导了TBXT的表达中发现的原肠陷入、作为中间中胚层分化的OSR1和WT1的表达、作为向生殖嵴上皮分化的GATA4和SF1的表达、以及作为向颗粒膜细胞系列分化的FOXL2的表达(参照图60B,引用非专利文献1,制作了实验方案图。)。另外,虽然是极少数,但后来也确认到如下细胞的出现,该细胞被认为是在性类固醇产生中起重要作用的间质细胞的前体细胞。在小鼠的诱导体系中,颗粒膜细胞系和间质细胞系得到相同程度的诱导,在猴子的体系中,可以考虑对FOXL2阳性的颗粒膜细胞系的细胞进行选择性诱导的实验方案。提高间质细胞的诱导效率的方法是今后的课题。
产业上的可利用性
根据本实施方式的制造方法及分化诱导方法,可以由灵长类多能干细胞高效地得到任意发生阶段的卵巢体细胞样细胞。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学;国立大学法人九州大学
<120> 卵巢体细胞样细胞的制造方法
<130> PC33985
<160> 146
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 1
cactcactct ccgcagtcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 2
gcgcctctcc cagaagtatt 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 3
atttataggc cagggcatgt gt 22
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<212> DNA
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<220>
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<400> 4
tgttagacaa gattcacccc cg 22
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<212> DNA
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cctctttctc agcagagctg ta 22
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aggtcatgaa ggacactctg c 21
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aaatgtcccc ggatctttcg at 22
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aaaacaaaaa gcagggagga cg 22
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tcccctcagt ttatgtcctc ct 22
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gagcaaacac acgtattggt cc 22
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gtgcagtcca tggctagacg 20
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<220>
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tggccccaca acacagattt 20
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ggatgccaag aagtttaagg aa 22
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gccagtgaaa ggaaacaaaa ct 22
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<212> DNA
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<400> 19
tttttccttt tgcaacgtgc ct 22
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<220>
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<400> 20
ggccactgga atcatttcta cc 22
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<212> DNA
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aacagaagct tcagggctca 20
<210> 22
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gtgcagtttg gtggtgcttt 20
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catcttctct tggagtgagg gag 23
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<400> 24
agcaatcctc aaactctcta gcc 23
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<212> DNA
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cagttcccat cataccagca tcc 23
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agacccagaa agagggaaca atg 23
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ttgatcattt ggtgtgttgg gc 22
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gaaactctgc attctcgctt cc 22
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actcgtttgt acccgttgat ga 22
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tccccacagg cacattaact 20
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<212> DNA
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<220>
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tctcacacat tcaccacacc a 21
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gcagggtaca ggacaacaca 20
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aggatgtgtt aatggggtga ct 22
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tctactggaa tgtccccttg c 21
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tactctctgc ttccgttcct c 21
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cggcaggtca aaatctggtt tc 22
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gggtttagga ctgctccttg tc 22
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gcagcacgaa cataatgacc c 21
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<212> DNA
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<220>
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cgattccttc ccacggtcaa 20
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<212> DNA
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tattaggatc cgctcggcca 20
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gatcccggaa gatacgctct aag 23
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cgcaggttga tgcttccaat aaa 23
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tggcaatggc ctctcacct 19
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gagagcgcgt aatcagtctg g 21
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<220>
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<220>
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gcggtgtttt ggttattagg gaaag 25
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ttgagcgtcc ttcctaccct 20
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ggagtactcg ttcccctgtt 20
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tggccgagtt caaccattca 20
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<220>
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gcgcccagta cagaatacac 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 58
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<212> DNA
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<220>
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cctcacccag gaagtctcat t 21
<210> 61
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
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cgctgcagtt gtttcccatt a 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
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gtggaggaga aaagaggcgt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 65
cacccccagc ttcataccaa 20
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
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<210> 67
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 67
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 68
gcgaacaaaa cgaaggcaat ac 22
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 69
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 70
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 71
actgtagagc atccatccat cc 22
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 72
ttcgtggact aaccacacac a 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 73
tcaccccttg gtctctttgc 20
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 74
actcgcgttc cagttcgc 18
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 75
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<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 76
atgctctaac cagccatctc a 21
<210> 77
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<220>
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<400> 77
ctctgccccc tgaaatgtgt 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 78
ggggctgggg tgattcttaa 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 79
acagatttgc agggcttttg g 21
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 80
ggcaactgtc tgaatagcat gttt 24
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 81
aatgatccgc cttgacaccc 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 82
tcaccttcct gcatctggtt c 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 83
gcctgccact tcaatgttca g 21
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 84
taggagaaag ggtacaggca gg 22
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 85
tcatgtagtt tgtataaaat gtgggaag 28
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 86
aaaacttgta aatagttggc cttacaaaa 29
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 87
tctggatgct gctaacccac 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 88
gtcacaatgg caaagagcct 20
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 89
ggcctctagg aggaaaccaa c 21
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 90
actaacctca cccaccatcc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 91
ggcatgcatc gaggaatcgt 20
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 92
tgcacagatg ccagtggtc 19
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 93
cgacctaggt ggtcttgtgg 20
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 94
ttggtccccc aaacaagtta ca 22
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 95
gattatagtg tccacttgcc acc 23
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 96
aagggtatat ctgtgcatcc atct 24
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 97
ctgatccctc aggtctgctg 20
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 98
acttcctggg caaactgttg a 21
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 99
ggttcagtaa cattaaggac catga 25
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 100
aaagaaaatg gacagagaaa tgcaa 25
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 101
agagtaaact gctctgttcc ca 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 102
tttgacaagc agactgacat cc 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 103
agccaaggaa tgtgtccaag ac 22
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 104
aattcaagaa ctaagcggga cc 22
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 105
agatgcaatt ttcctccatt cct 23
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 106
tgtatcagtt tgaacctaga agattga 27
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 107
gagatccttg cctggggaaa 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 108
tgtgacggat gagattccct 20
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 109
ccgaaacctt caagataaag gca 23
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 110
tttgagcgtg acacttctcc 20
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 111
ggatggggac ttgtgaattt ttc 23
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 112
ggtggaaagt gagcaacgg 19
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 113
gctggcctga gaaacacaat tt 22
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 114
acgtccctct tcacaaaaat agga 24
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 115
acaacgacga ggagattcgt 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 116
gcttgcagag tcattcacgg 20
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 117
gctttacggc tcaagaatgc c 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 118
tgctgtgcag tgaatgggag 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 119
acccaggagt gatcggagac 20
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 120
ggacagagga ctgaagctgt a 21
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 121
tcatacgcca gaggacagac 20
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 122
cacagtcatt cagaatcagc cac 23
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 123
caggctgagg gtagcaccta 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 124
gtcgggggtt gcatctctaa 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 125
cgtggtcaga gtagaacccc 20
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 126
tccacgacca catacaatga ttc 23
<210> 127
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 127
ggagccgggc gttatattg 19
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 128
aactccagtg ataaatgtcc gttac 25
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 129
gtggagccat atgaatgtca gtag 24
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 130
tgtggctaac attgaaaagc tgc 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 131
cccacttttc taacttttcg ccc 23
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 132
aaaagcaagt tgatgggtca gc 22
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 133
attccagtat ccccaaagcc tg 22
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 134
gatctcagcg acacccacat c 21
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 135
aacagggtgg tggacctcat 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 136
ttcctcttgt gctctcgctg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 137
acaggtcctg gcatcttgtc 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 138
ctcagtcttg gcagtgcaga 20
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 139
gatcccggaa gatacgctct aag 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 140
cgcaggttga tgcttccaat aaa 23
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 141
aattacagtt aggccgctga ca 22
<210> 142
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 142
ataagcgctg tcacggatgt at 22
<210> 143
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 143
atcacttctg gccgtcctta tg 22
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 144
ttccccaatg accttaactc cg 22
<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 145
ctacccagat aacatcgctc cc 22
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 146
tatcagtact tccaagcagc cc 22
Claims (15)
1.一种卵巢体细胞样细胞的制造方法,其包括:
工序1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;
工序2,将工序1后的细胞在包含BMP4、维甲酸和MEK抑制剂的培养基中进行培养;和,
工序3,将工序2后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
2.根据权利要求1所述的制造方法,其中,进行3天以上所述工序1的培养。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,进行3天以上所述工序2的培养。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其中,进行1周以上所述工序3的培养。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养基还包含BMP4。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的制造方法,其中,
所述工序1包括:
工序1-1,在包含GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养灵长类多能干细胞;和,
工序1-2,将工序1-1后的细胞在包含GSK3抑制剂和激活素A的培养基中进行培养。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养为平面培养。
8.根据权利要求7所述的制造方法,其中,在所述平面培养中,使用涂覆有细胞支架材料的容器。
9.根据权利要求7或8所述的制造方法,其中,所述工序2的培养基还包含ROCK抑制剂。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的制造方法,其中,所述工序1的培养基还包含bFGF。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的制造方法,其中,所述工序2的培养基还包含Hedgehog信号活化剂。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的制造方法,其中,
所述工序3包括:
工序3-1,将工序2后的细胞在包含MEK抑制剂的培养基中进行培养;和,
工序3-2,将工序3-1后的细胞在基础培养基中进行培养,得到卵巢体细胞样细胞。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的制造方法,其中,所述卵巢体细胞样细胞是胚胎卵巢体细胞样细胞。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的制造方法,其中,所述灵长类多能干细胞来自食蟹猴或人。
15.一种将灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞的方法,其中,
包括使用权利要求1-14中任一项所述的制备方法由灵长类多能干细胞分化诱导成卵巢体细胞样细胞。
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