CN108884441B - 集落形成培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于产生间充质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括在含氧量正常的条件下在包含LiCl和FGF2但不包含PDGF的间充质集落形成培养基(M‑CFM)中培养原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间，和贴壁培养所述间充质集落以产生所述MSC，其中相对于不在所述M‑CFM中产生的MSC，所述MSC具有卓越的T细胞免疫抑制特性。本发明还涉及通过所述方法产生的MSC，通过所述方法产生的MSC的群体，包含通过所述方法产生的MSC的治疗性组合物，M‑CFM和浓缩形式的M‑CFM，以及所述MSC或群体在治疗疾病中的方法和用途。

Description

集落形成培养基及其用途
技术领域
本发明涉及一种将人多能干细胞(PSC)分化成间充质干细胞(MSC)的方法，并涉及对这样的分化有用的组合物。本发明还涉及通过所述方法分化的MSC，通过所述方法分化的MSC的群体，并涉及所述MSC或MSC的群体的方法和用途。
背景技术
多能干细胞(PSC)，特别是人PSC，其包括胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)，提供了体外研究人类发育和开发新的基于细胞的治疗产品的机会。使用PSC作为起始材料用于制造治疗性产品具有几个优点，包括作为PSC在体外无限地复制的能力的结果的从单个细胞库产生几乎无限数量的细胞，以及分化成任何细胞类型的潜能。
大多数方案分化在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或
Figure BDA0001800287180000011
(一种从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制剂)上生长的人PSC。已经描述了用于人PSC衍生和维持的化学上确定的、无异种物的培养基和基质。在US 2014/0273211 A1中还描述了用于从人PSC衍生造血祖细胞的化学上确定的、无异种物的定向分化方案。
特别地，US 2014/0273211 A1描述了用于分化人多能干细胞的方法，其包括：(a)提供人多能干细胞；(b)在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的细胞培养基中，在含氧量低的条件下，培养人多能干细胞约2天的时间以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群。US 2014/0273211 A1还描述了用于分化人多能干细胞的无异种物的培养基，其包含补充有以下物质的IF9S培养基：约50ng/mL至约250ng/mL BMP4；约10ng/mL至约15ng/mL激活素A；约10ng/mL至约50ng/mL FGF2；和约1mM至约2mM的LiCl。
然而，US 2014/0273211 A1并未提及关于任何改进的间充质集落形成培养基(M-CFM)。
间充质干细胞(MSC)具有显著的作为细胞疗法的前景，并且目前处于用于治疗多种疾病的临床试验中，包括移植物抗宿主病。诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的MSC与直接来源的MSC(即衍生自组织，诸如骨髓、脐带血、脂肪组织)相比具有独特的优势，因为iPSC的体外扩增可以提供几乎无限量的MSC供给。
然而，尽管它们有前景，但在体外产生MSC仍然存在挑战，例如将生产从实验室规模扩大到良好生产规范(GMP)规模，这对于任何生物产品来说，既不容易也不一定可预测，如会在本领域中理解的。
结果就是，需要用于将包括iPSC在内的PSC分化为MSC的改进的和可扩展的方法。
本说明书中提及的任何出版物均通过引用的方式并入本文。然而，如果本文引用了任何出版物，则这样的引用并不构成承认该出版物构成澳大利亚或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。
发明内容
本发明的发明人已经鉴定用于将PSC分化成MSC的分化培养基的特定组合物，其中与在不存在本文所公开的分化培养基的情况下分化形成的MSC相比，这样的MSC具有卓越的免疫抑制特性，此外，所述方法可适用于GMP规模，即足以为治疗性使用提供MSC的规模。
在第一方面，本发明提供了一种MSC，其表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但是不表达miR-127-3p或miR-299-5p。
在一个实施方案中，所述MSC具有CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表型。
在第二方面，本发明提供了一种用于产生MSC的方法，所述方法包括：
(a)在含氧量正常的条件下，在包含LiCl和FGF2但不包含PDGF的M-CFM中培养原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间；和
(b)贴壁培养(a)的间充质集落以产生所述MSC，
其中，相对于不在所述M-CFM中产生的MSC，(b)的MSC具有卓越的T细胞免疫抑制特性。
在一个实施方案中，所述原始中胚层细胞是具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的原始中胚层细胞。在一个实施方案中，所述具有MCA潜能的原始中胚层细胞具有EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+表型。
在一个实施方案中，所述足以产生间充质集落的时间为约8天至约14天。在一个实施方案中，所述足以产生间充质集落的时间为约12天。
在一个实施方案中，所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于通过一种方法产生的MSC确定的，所述方法包括：
(a’)在含氧量正常的条件下，在包含FGF2和任选的PDGF但不包含LiCl的培养基中培养原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间；和
(b’)贴壁培养(a’)的间充质集落以产生MSC。
在一个实施方案中，所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于在含氧量低的条件下在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的分化培养基中持续约2天由从PSC分化的原始中胚层细胞产生的MSC确定的。
在第三方面，本发明提供了通过第二方面的方法产生的MSC。
在第四方面，本发明提供了MSC的群体，其包含第一方面或第三方面的MSC。
在第五方面，本发明提供了一种治疗性组合物，其包含第一方面或第三方面的MSC，或第四方面的MSC的群体。
在第六方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含含有第一方面或第三方面的MSC、第四方面的MSC的群体或第五方面的治疗性组合物的容器。
在第七方面，本发明提供了一种间充质集落形成培养基(M-CFM)，其包含约1mMLiCl，和约5ng/mL至约100ng/mL FGF2，或约10ng/mL至约50ng/mL FGF2，约10ng/mL FGF2，或约20ng/mL FGF2，但不包含PDGF。
在第八方面，本发明提供了一种组合物，其包含LiCl和FGF2但不包含PDGF，当与包含水的液体混合时其产生M-CFM，所述M-CFM包含约1mM LiCl，和约5ng/mL至约100ng/mLFGF2，或约10ng/mL至约50ng/mL FGF2，约10ng/mL FGF2，或约20ng/mL FGF2，但不包含PDGF。
在第九方面，本发明提供了第一方面或第三方面的MSC或第四方面的MSC的群体在制备用于治疗或预防诸如以下的病症的药物中的用途：骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全症、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、移植物抗宿主病(GvHD)、骨髓增生异常综合征；1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗塞、心肌缺血、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、烧伤、大疱性表皮松解、红斑狼疮、类风湿性关节炎、角结膜干燥症(Sjogren’sdisease)、系统性硬化症、支气管肺发育不良、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、ALS、阿尔茨海默症、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘病、多系统萎缩、多发性硬化、帕金森氏病、视网膜色素变性、Romberg氏病、脊髓损伤、中风、肌肉萎缩症、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位症和骨髓或实体器官移植的并发症。
在第十方面、本发明提供了用于治疗或预防诸如以下的病症的方法：骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全症、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、GvHD、骨髓增生异常综合征；1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗塞、心肌缺血、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、烧伤、大疱性表皮松解、红斑狼疮、类风湿性关节炎、角结膜干燥症、系统性硬化症、支气管肺发育不良、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、ALS、阿尔茨海默症、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘病、多系统萎缩、多发性硬化、帕金森氏病、视网膜色素变性、Romberg氏病、脊髓损伤、中风、肌肉萎缩症、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位症和骨髓或实体器官移植的并发症，所述方法包括向受试者施用第一或第三方面的MSC、第四方面的MSC的群体或第五方面的治疗性组合物。
还公开了一种将多能干细胞(PSC)分化成间充质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
(a)在含氧量低的条件下在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的分化培养基中培养PSC约2天以形成原始中胚层细胞；
(b)用包含LiCl和FGF2但是不包含PDGF的间充质集落形成培养基(M-CFM)替代(a)的分化培养基；
(c)在含氧量正常的条件下在(b)的M-CFM中培养(b)的原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间；和
(d)贴壁培养(c)的间充质集落以产生所述MSC，
其中所述MSC相对于不在所述M-CFM中产生的MSC具有卓越的T细胞免疫抑制特性。
在一个实施方案中，上述方法进一步包括：
(e)扩增(d)的MSC。
在一个实施方案中，原始中胚层细胞是具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的原始中胚层细胞。在一个实施方案中，具有MCA潜能的原始中胚层细胞是具有MCA潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞。
在一个实施方案中，足以形成间充质集落的时间为约8天至约14天。在一个实施方案中，足以形成间充质集落的时间为约12天。
在一个实施方案中，所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于从在包含FGF2和任选的PDGF但是不包含LiCl的培养基中培养的原始中胚层细胞产生的MSC确定的。
在一个实施方案中，所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于在含氧量低的条件下在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的分化培养基中持续约2天由从PSC分化的原始中胚层细胞产生的MSC确定的。
附图说明
以下仅通过实施例和参考附图描述本发明的实施方案，其中
图1是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，所述多肽作为同二聚体(homodimer)是人激活素A的一个实例。
图2是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，所述多肽作为同二聚体是人BMP4的一个实例。SEQ ID NO:2对应于全长BMP4前体的氨基酸序列的氨基酸303至408。
图3是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，所述多肽是人I型胶原蛋白α1链的一个实例。人I型胶原蛋白(胶原蛋白I)是三螺旋三聚体，其在一个实例中具有两条由SEQID NO：3表示的α1链和一条α2链。SEQ ID NO:3对应于全长I型胶原蛋白α1链前体的氨基酸162至1218。
图4是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，所述多肽是人IV型胶原蛋白α1链的一个实例。人IV型胶原蛋白(胶原蛋白IV)是三螺旋异三聚体，其在一个实例中包含由SEQID NO:4表示的一条α1链。SEQ ID NO:4对应于全长IV型胶原蛋白α1链前体的氨基酸173至1669。
图5是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，所述多肽是人FGF2的一个实例。
图6是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，所述多肽作为二聚体是人纤连蛋白的一个实例。SEQ ID NO:6对应于全长纤连蛋白前体的氨基酸32至2446。
图7是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，所述多肽作为同二聚体是人PDGF的一个实例(PDGF-BB)。SEQ ID NO:7对应于全长PDGF亚基B前体的氨基酸82至190。
图8是表示多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)，所述多肽作为六聚体是人生腱蛋白C的一个实例。SEQ ID NO:8对应于全长生腱蛋白C前体的氨基酸23至2201。
图9的图表示本公开的MSC和通过除了本发明方法以外的方法获得的71个其他MSC样品的miRNA表达的主成分分析。AD,脂肪(■)；BM,骨髓(◆)；iPSC_MSC,本公开的MSC(▲)；iPSC,分化成本公开的MSC之前的iPSC(+)。
图10是实施例6的研究的示意图。
图11是实施例6的研究的组织学的示意图。
图12包括实施例6的心脏中MSC移入的荧光显微照片(人细胞核染色)。人细胞核染色在中间LV(冷冻切片)中在所有水平下进行。在第28天没有细胞移入的现象。人线粒体染色在基底LV(石蜡切片)进行。在第28天没有细胞移入的现象。
图13显示了功能评估(TTE)并包含在基线和1个月时间点处实施例6的运载体、BMMSC和PSC-MSC接受者的心脏的M模式图像的短轴。该图像显示与运载体和BM MSC接受者相比，PSC-MSC接受者中的降低的心室扩张和增加的心室收缩性。
图14显示了功能评估(TTE)并包含显示实施例6的梗塞心脏的缩短分数(FS)的个体评估的直线图和显示其的组评估的柱状图。在运载体组中，基线FS在注射有运载体的1只大鼠中是较高的，但是总的来说，除了1只大鼠之外，与第0天相比，在第28天的FS没有变化或变化很小(平均增加1.39％)。在BM MSC组中，与第0天相比，3/3只大鼠在第28天FS恶化(平均降低2.3％)。在PSC-MSC组中，与第0天相比，4/4只大鼠在第28天FS增加(平均增加5.48％)。
图15包含显微照片，其显示了在实施例6的梗塞心脏中使用天狼星红染色的疤痕大小。该图片显示，与运载体和BM-MSC处理的组比较，在PSC-MSC处理的组中使用天狼星红染色的明显减小的疤痕大小。
图16包含荧光显微照片，其评估实施例6的心脏中的血管发生(vWF染色)。该图像显示，组间的血管大小和数量没有差异。
图17是类似于实施例6的研究的示意图。
图18是与GvHD有关的实施例7的小鼠的第+19天的百分比体重变化的散布图。
图19是显示实施例7的小鼠中的GvHD疾病严重性的线图。
图20是显示实施例7的小鼠的GvHD存活率的Kaplan-Meier图。
具体实施方案
本发明的发明人已经限定了改善的化学上明确的、无异种物的分化方案，其包括尤其是，改善的化学上明确的、无异种物的间充质集落形成方案。令人意外地，当与现有的分化和间充质集落形成方案相比时，所述改善的方案提供了具有卓越的免疫抑制特性的MSC。
在开发所述改善的化学上明确的、无异种物的分化方案(其包括改善的间充质集落形成方案)中，本发明的发明人研究了一些变量，其包括：存在/不存在PDGF；存在/不存在LiCl；低/高激活素A浓度；和低/高接种密度。
测试PDGF，因为在US 7,615,374中声称“PDGF-BB改善了间充质细胞的生长，但是对集落形成不是必要的”。然而，令人意外地，本发明的发明人在本文中描述了与此在先教导相反，相对于通过包含PDGF的培养基中分化而生成的MSC，不存在PDGF生成了具有卓越的免疫抑制特性的MSC。
关于激活素A，本发明的发明人令人意外地发现了相对于较高浓度的激活素A，在包含较低浓度的激活素A的培养基中分化的MSC的免疫抑制被提高。
LiCl活化Wnt信号传导，并且包含在分化培养基中以在最初48小时的分化期间提高了中胚层诱导，这在本领域中是可以理解的。
然而，在本发明之前，尚未在M-CFM中使用LiCl以改善集落形成培养物中集落的形成。这也是本文所公开的方法的令人意外的优点。
因此，本文公开了用于在限定的条件下分化PSC(例如，人ESC或人iPSC)。这样的分化提供了MSC或MSC群体，所述MSC或MSC群体可能是用于这些谱系(lineage)的功能研究的来源以及临床治疗的来源。
认为MSC发挥免疫调节/免疫抑制作用的能力(尤其是通过抑制T细胞)是MSC在广泛范围的病症(其包括GvHD、免疫疾病包括自身免疫疾病，心血管疾病，骨科疾病和移植的实体器官排斥)中的治疗效果的核心。一些特定的实例包括骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全症、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、GvHD、骨髓增生异常综合征；1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗塞、心肌缺血、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、烧伤、大疱性表皮松解、红斑狼疮、类风湿性关节炎、角结膜干燥症、系统性硬化症、支气管肺发育不良、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、ALS、阿尔茨海默症、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘病、多系统萎缩、多发性硬化、帕金森氏病、视网膜色素变性、Romberg氏病、脊髓损伤、中风、肌肉萎缩症、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位症和骨髓或实体器官移植的并发症。
认为MSC在损伤愈合中起到关键作用，并且已经显示出在治疗组织损伤和退行性疾病中(包括在消化系统中，例如在肝硬化和肝功能衰竭中，在肌肉骨骼系统中、在外周组织中、在糖尿病严重肢体缺血中、在骨坏死中、在烧伤相关病症中，在心肌梗塞中、在角膜损伤中、在大脑中、在脊髓中，在肺中，和在治疗辐射暴露中)是有效的。
MSC已经显示出在免疫疾病(包括移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和中风)中的治疗结果。
已经显示出MSC发挥抗T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞的免疫抑制活性。虽然不希望被理论束缚，但是潜在的机制可能包含免疫抑制介质，例如一氧化氮、吲哚胺2,3、双加氧酶、前列腺素E2、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白、CCL-2和程序性死亡配体1。这些介质以底水平表达直到例如被炎性细胞因子(诸如IFNγ、TNFα和IL-17)刺激。
在一些实施方案中，本公开的MSC可以在施用和迁移之后移入到受损组织中。
MSC可以例如通过包括以下的途径系统施用或外周施用：静脉内(IV)、动脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下(SC)、关节内、滑膜内、鞘内、冠状动脉内、经心内膜、手术植入、局部和吸入(例如肺内)。MSC可以与生物相容性材料的支架(scaffold)组合施用。
MSC可以在损伤、病症或疾病进展之前、期间或之后施用。在一个实施方案中，MSC在炎症期间施用。MSC可以(a)作为一种预防措施，(b)一旦已经被诊断为相关病况，(c)当其他治疗失败时，和/或(d)当病况发展到预先定义的严重程度时施用。
在一个实施方案中，在施用前预处理MSC。预处理可以使用生长因子或通过基因编辑，例如，当生长因子可以引发MSC时，以及基因编辑可对MSC赋予新的治疗特性时。
除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义，并参考公开的文本。
应该注意的是，术语“一”或“一个”指一个或多个，例如“一个分子”理解为表示一个或多个分子。因此，术语“一”或“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
在随后的权利要求中和在本发明的说明书中，除非由于明确的语言或必要的暗示在上下文另有要求，否则单词“包含(comprise)”或变体诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包括的意义使用，即指定所述特征的存在但不排除在本发明的多种实施方案中存在或添加其他特征。
如本文所使用的术语“约”预期该数字的±25％大小的给定数字的一系列值。在其他实施方案中，术语“约”预期该数字的±20％、±15％、±10％或±5％大小的给定数字的一系列值。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7至3.3克的值(即3克±10％)，等。
类似地，虽然分化过程包括有序的连续事件，但是该事件的时间设置可变化至少25％。例如，虽然在一个实施方案中可以公开特定的步骤为持续一天，但是该事件可持续多于或少于一天。例如，“一天”可包括约18小时至约30小时的时段。在其他实施方案中，时间段可变化该时段的±20％、±15％、±10％或±5％。为多天时段的指定时间段可以是“一天”的倍数，诸如，例如两天可跨越约36至约60小时的时间，等。在另一个实施方案中，时间变化可减少，例如，其中第2天是从第0天开始的48±3小时；第4天是从第0天开始的96±3小时，并且第5天是从第0天开始的120小时±3小时。
如本文所使用的“多能干细胞”或“PSC”指具有无限自我再生和分化成任何其他细胞类型的能力的细胞。存在有两个主要类型的多能干细胞：胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。
如本文所使用的“胚胎干细胞”或“ESC”指从5-7天大的胚胎分离的细胞，所述胚胎是经已经完成体外授精治疗并且具有剩余的胚胎的患者同意而捐赠的。关于从人胚胎提取细胞的伦理问题在一定程度上阻碍了ESC的使用。
合适的人PSC包括H1和H9人胚胎干细胞。
如本文所使用的“诱导的多能干细胞”或“iPSC”指从成人细胞衍生的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常类似的特征，但是避免了与ESC有关的伦理问题，因为iPSC不是从胚胎衍生的。替代性地，iPSC通常衍生自已经被“重新程序化”回到多能状态的完全分化的成人细胞。
合适的人iPSC包括但不限于衍生自成纤维细胞的iPSC19-9-7T、MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0，以及衍生自骨髓单核细胞的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可从美国威斯康星州麦迪逊的Cellular Dynamics International(CDI；Nasdaq:ICEL)获得。
在一些实施方案中，PSC以约5000个细胞/cm2至约15,000个细胞/cm2，例如，6000个细胞/cm2、7000个细胞/cm2、8000个细胞/cm2、9000个细胞/cm2、10,000个细胞/cm2、11,000个细胞/cm2、12,000个细胞/cm2、13,000个细胞/cm2或14,000个细胞/cm2的初始密度铺板。
在一个实施方案中，足以产生间充质集落的时间为约8天至约14天。在一个实施方案中，足以产生间充质集落的时间为约10天至约14天。在一个实施方案中，足以产生间充质集落的时间为约11天至约13天。在一个实施方案中，足以产生间充质集落的时间为约8天、约9天、约10天、约11天、约13天或约14天。在一个实施方案中，足以产生间充质集落的时间为约12天。
如本文所使用的，“具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞”指一种表达典型原条(primitive streak)和侧板(lateral plate)/胚外中胚层基因的细胞。这些细胞具有响应FGF2而在无血清培养基中形成间充质成血管细胞(MCA)和成血管细胞集落的潜能。根据本发明的方法，这些细胞变成间充质干细胞(MSC)。
术语EMHlin-表示缺乏CD31、VE-钙粘蛋白内皮标记物、CD73和Cd105间充质/内皮标记物、以及CD43和CD45造血标记物的表达。
如本文所使用的，“间充质”或“间充质的”指从中胚层衍生的并且分化成造血组织(淋巴系统和循环系统)和结缔组织(诸如骨骼和软骨)的胚胎性结缔组织。然而，MSC没有分化成造血细胞。
如本文所使用的，“间充质集落”指在真正的MSC之前的CD73-间充质祖细胞。需要例如在纤连蛋白/胶原蛋白包被的板上另外贴壁培养间充质集落以产生CD73+MSC。
如本文所使用的“间充质干细胞”或“MSC”指特定类型的干细胞，其可从范围广泛的组织(包括骨髓、脂肪组织(脂肪)、胎盘和脐带血)中分离。MSC还被称为“间充质基质细胞”。根据本发明的方法，从具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞形成MSC。
MSC分泌生物活性分子，诸如细胞因子、趋化因子和生长因子，并且具有调节免疫系统的能力。MSC已经显示了促进再生和对免疫系统的作用而无需依赖于移入。换言之，MSC本身不必要变成并入宿主中，相反，它们发挥它们的作用，然后在短时间段内消除。然而，可以移入MSC。
治疗性MSC可以是“自体同源的”或“同种异体的”。如本文所使用的，例如，“自体同源的”意指用从骨髓或脂肪组织分离的患者自己的细胞治疗该患者，而“异种同源”意指使用来自供体的细胞治疗其他人。根据本公开，同源异体MSC经由iPSC衍生自供体。
尚未显示出同种异体MSC导致其他人中的免疫反应，因此，它们不要求供体与受体免疫匹配。这具有重要的商业优势。
如本文所使用的“间充质成血管细胞”或“MCA”指为MSC的前体的细胞。可通过本发明的方法产生MSC。
如本文所使用的“分化”指从一个细胞类型到另一个细胞类型的细胞变化的过程，特别是较低特化的细胞类型变成更高特化的细胞类型的过程。
如本文所使用的“培养基”或其复数“培养基(media)”指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。在一些实施方案中，细胞培养基包含IF9S培养基。在一些实施方案中，培养基采用9S浓缩的培养基补充物，其中在IMDM/F12基础培养基中稀释9S浓缩的培养基补充物产生IF9S细胞培养基。浓缩的9S培养基补充物包含如下9种补充物：L-抗坏血酸2-磷酸酯Mg2+盐、1-硫代甘油(单硫代甘油)、额外的亚硒酸钠、聚乙烯醇、GLUTAMAXTM(或谷氨酰胺)、非必需氨基酸、化学上明确的的脂质浓缩物、holo-转铁蛋白和胰岛素。在一些实施方案中，浓缩的9S培养基补充物以在基础培养基中稀释后的最终工作浓度的10倍至1000倍的浓度包含各组分。在一个实施方案中，IF9S培养基包含IMDM、F12和9S，如下：IMDM 0.5x,F12 0.5x,碳酸氢钠2.1mg/mL，L-抗坏血酸2-磷酸酯Mg2+盐(64μg/mL)，1-硫代甘油(50μg/mL(460μM,40μL/L))，亚硒酸钠(除了基础培养基中存在的任何浓度的亚硒酸钠之外还含有的；8.4ng/mL)，聚乙烯醇(10mg/mL)，GLUTAMAXTM(1×)，非必需氨基酸(1×)，化学上明确的脂质浓缩物(1×)，holo-转铁蛋白(10.6μg/mL)和胰岛素(20μg/mL)。
虽然目前公开的培养基可包括特定组分(例如，形态发生素、小分子和造血细胞因子)，但是仍预期具有相同、等同或类似特性的其他组分用于补充或代替公开的那些，如本领域已知的。
在一些实施方案中，IF9S培养基的组分可以被取代。例如，抗坏血酸和1-硫代甘油可以用具有抗氧化特性的任选的化合物补充物和/或含巯基的化合物补充物替代。GLUTAMAXTM可以用任选的L-谷氨酰胺补充物替代。“非必须氨基酸”，即人体可从其他氨基酸产生的氨基酸的一般术语，可用任选的氨基酸补充物替代。“化学上明确的脂质浓缩物”，即由Life Technologies明确分配的溶液，可用任选的脂质补充物替代。另外的亚硒酸盐、胰岛素和holo-转铁蛋白可用任何胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐补充物替代。聚乙烯醇可用任选的生物学上无活性的培养基增稠化合物补充物替代。
如本文所使用的“分化培养基”指设计成支持细胞分化，即支持细胞从一个细胞类型变为另一个细胞类型的过程的培养基。根据本发明的方法，分化培养基用于支持将人PSC变成具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的过程。
在一些实施方案中，在分化培养基中：BMP4的浓度为约10ng/mL至约250mg/mL；激活素A的浓度为约1ng/mL至约15ng/mL；FGF2的浓度为约5ng/mL至约50ng/mL；并且LiCl的浓度为约1mM至约2mM。
在一些实施方案中，在分化培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约45ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约160ng/mL、约170ng/mL、约180ng/mL、约190ng/mL、约200ng/mL、约210ng/mL、约220ng/mL、约230ng/mL、约240ng/mL或约250ng/mL。
分化培养基中激活素A的浓度可为约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL或约15ng/mL。
分化培养基中FGF2的浓度可为约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约45ng/mL或约50ng/mL。
分化培养基中LiCl的浓度可为约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM或约2.5mM。优选地，如本领域中理解的，分化培养基中LiCl的浓度可为约2mM。
在一些实施方案中，分化培养基包含基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸酯Mg2+盐、1-硫代甘油、亚硒酸钠(除了基础培养基中存在的任何亚硒酸钠之外还包含的)、聚乙烯醇、GLUTAMAXTM、非必需氨基酸、化学上明确的脂质浓缩物、holo-转铁蛋白和胰岛素。用于本文所述的分化培养基的合适的基础培养基包括，但不限于，Iscove改良的Dulbecco培养基/F12(IMDM/F12)、没有FGF2和TGF-β的TeSR1基础培养基(mTeSR1TM基础培养基，Stem CellTechnologies)；DF4S基础培养基，即没有FGF2和TGF-β的Essential 8TM培养基(LifeTechnologies；也称为“E8”培养基)，I4S基础培养基，其是使用Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)代替DMEM/F12的DF4S基础培养基，并且IF4S基础培养基是使用IMDM/F12代替DMEM/F12的DF4S基础培养基。优选地，待使用的基础培养基是无白蛋白的。IMDM/F12是适合于快速增殖的、高密度的细胞培养物的具有添加的营养混合物的高度富集的合成培养基。这些培养基是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，在本文中称为“IF9S”的培养基包含IMDM/F12、L-抗坏血酸2-磷酸酯Mg2+盐、1-硫代甘油、亚硒酸钠(除了基础培养基中存在的任何亚硒酸钠之外还包含的)、聚乙烯醇、GLUTAMAXTM、非必需氨基酸、化学上明确的脂质浓缩物、holo-转铁蛋白和胰岛素。
如本文所使用的“间充质集落形成培养基(M-CFM)”指设计成支持从具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞形成间充质集落的培养基。
在一些实施方案中，在M-CFM中：LiCl的浓度为约1mM并且FGF2的浓度为约10ng/mL；或LiCl的浓度为约1mM并且FGF2为约20ng/mL。
在M-CFM中FGF2的浓度可为约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约45ng/mL或约50ng/mL。
在M-CFM中LiCl的浓度可为约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM或约2.5mM。优选地，在M-CFM中LiCl的浓度可为1mM。如上所述，在M-CFM中包含LiCl以改善集落生成培养物中的集落形成在本发明之前是未知的，并且与本领域已知的方法相比，为本文公开的方法提供了明显的优势。
如本文所指，术语“明确的培养基”意指培养基的各组分的特性和数量是已知的。
在一些实施方案中，本文所公开的培养基包含异种物质。如本文所使用的，“异种”或“异种的”指非人类、生物来源的物质。但是，可以定义异种物质。例如，异种物质可以是异种来源的重组蛋白。在一个实施方案中，分化培养基和/或M-CFM包含一种或多种异种物(例如，重组的非人类蛋白)。
在一些实施方案中，所述一种或多种培养基是无异种物的。对临床治疗至关重要的是在衍生的细胞群体中不存在异种物质，即，无非人类的细胞、细胞片段、血清、蛋白质等。在一个实施方案中，无异种物分化的细胞是使用生腱蛋白C或胶原蛋白IV获得的，所述生腱蛋白C或胶原蛋白IV基本上替代了与用于早期分化系统的与OP9细胞的接触。
有利地，明确的培养基可为无异种物的，并且掺入从天然来源(例如来自胎盘或其他人体组织)分离的人蛋白质，或者可以使用重组技术产生的人蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的所有蛋白质都是人的。在一些实施方案中，分化培养基中使用的所有蛋白质是人蛋白质。在一些实施方案中，M-CFM培养基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的所有蛋白质都是人重组蛋白。在一些实施方案中，分化培养基中使用的所有蛋白质都是重组人蛋白质。在一些实施方案中，M-CFM培养基中所使用的所有蛋白质都是重组人蛋白质。
本文所述的所有蛋白质都是本领域技术人员已知的，并且本文所述的大多数或者全部蛋白质是可商购的。
本文所公开的培养基还可制成浓缩的(包括干燥的)形式(诸如2×、10×、100×或1000×浓度)，其在使用之前被稀释。
如本文所使用的“培养”指在受控的条件下培养细胞的过程。
由于有毒代谢物浓度增加、营养物浓度降低，和对于分裂细胞来说细胞数量增加，细胞不能无限期地保持在培养物中。如本文所使用的“传代”指用得到补充给养的浓度的营养物、无有毒代谢物和任选地低于起始培养物的细胞密度产生新培养物的过程。
在一个实施方案中，传代包括：培养间充质集落约3天；在纤连蛋白和/或胶原蛋白I上培养间充质集落；和/或1、2、3、4、5或6次传代。传代的次数可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25次。优选地传代的次数是10次或更少。更优选地，传代的次数是5或6次。
如本文所使用的“含氧量低的”指其中气体混合物的氧气浓度为约3％O2至约10％O2的条件。在一些实施方案中，含氧量低的条件是5％O2，但可以是约4％O2、约6％O2、约7％O2、约8％O2或约9％O2。在其中在含氧量低的条件下允许细胞培养基平衡的实施方案中，由于与在含氧量正常的条件下平衡的细胞培养基相比溶解于培养基中较低浓度的氧气，细胞培养基变得含氧量低。
如本文所使用的“含氧量正常的”指其中气体混合物的氧气浓度为约20％O2，但可以是约18％O2、约19％O2、约21％O2或约22％O2的条件。
如本文所使用的“AA”指激活素A。在一个实施方案中，激活素A作为由在图1中作为SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列表示的多肽的同二聚体存在。
如本文所使用的“BMP4”指骨形态发生蛋白4。在一个实施方案中，BMP4作为由在图2中提供的作为SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的多肽的同二聚体存在。
在一个实施方案中，“I型胶原蛋白”或“胶原蛋白I”作为包含两个由在图3中作为SEQ ID NO:3提供的氨基酸序列表示的多肽和第三个胶原蛋白I链的三螺旋三聚体存在。
在一个实施方案中，“IV型胶原蛋白”或“胶原蛋白IV”作为包含一个由在图4中作为SEQ ID NO:4提供的氨基酸序列表示的多肽和两个另外的胶原蛋白IV链的三螺旋异三聚体存在。
如本文所使用的“FGF2”指成纤维细胞生长因子，也称为碱性成纤维细胞生长因子。在一个实施方案中，FGF2作为由在图5中作为SEQ ID NO:5提供的氨基酸序列表示的多肽存在。
在一个实施方案中，纤连蛋白作为由在图6中作为SEQ ID NO:6提供的氨基酸序列表示的多肽的二聚体存在。
如本文所使用的“PDGF”指血小板衍生生长因子。在一个实施方案中，PDGF作为由在图7中作为SEQ ID NO:7提供的氨基酸序列表示的B亚基多肽的同二聚体(PDGF-BB)存在。本文公开了在培养期间用PDGF(10ng/mL)补充M-CFM对iPSC衍生的MSC的免疫抑制具有显著的负面影响(4倍降低)。
在一个实施方案中，“生腱蛋白C”作为由在图8中作为SEQ ID NO:8提供的氨基酸序列表示的多肽的六聚体存在。
在一些实施方案中，贴壁人PSC在生腱蛋白C上培养或在用生腱蛋白C处理的基底上提供。在一些实施方案中，任何上文提及的细胞(例如，人PSC、人iPSC)在生腱蛋白C上培养。在一些实施方案中，任何描述的细胞接种在用足以将10,000个细胞/cm2贴壁至基底的量的生腱蛋白C处理的基底上。在一些实施方案中，生腱蛋白C是人生腱蛋白C(例如，其包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列，或通过GenBank登录号CAA55309.1提供的氨基酸序列，或可商购，例如Millipore目录号CC065)。在一些实施方案中，基底用至少约0.25μg/cm2至约1μg/cm2(例如0.3μg/cm2、0.4μg/cm2、0.5μg/cm2、0.6μg/cm2、0.7μg/cm2、0.8μg/cm2或0.9μg/cm2)的浓度的生腱蛋白C处理。细胞可以在例如生腱蛋白C包被的细胞培养皿、多孔细胞培养板或微载体珠粒上生长。
当每个平台每个阶段进行比较时，生腱蛋白C和含氧量低的条件的使用可能能够生成与在胶原蛋白IV或OP9细胞上培养的细胞相比更高百分比的具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+原始中胚层细胞和间充质干细胞(诸如大于10％、或大于约20％、或大于约30％、或大于约35％、或大于约40％、或大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％)。
如本文所使用的“卓越的T细胞免疫抑制特性”指相对于参照，MSC产生更大程度抑制T辅助(CD4+)淋巴细胞增殖的能力，例如使用免疫效力测定确定的。
卓越的T细胞免疫抑制特性可为根据本文公开的方法产生的MSC或MSC群体的T细胞免疫抑制特性的约1％增加、约2％增加、约3％增加、约4％增加、约5％增加、约6％增加、约7％增加、约8％增加、约9％增加、约10％增加、约20％增加、约30％增加、约40％增加、约50％增加、约60％增加、约70％增加、约80％增加、约90％增加、约100％或更大的增加。或者，卓越的T细胞免疫抑制特性可为根据本文公开的方法产生的MSC或MSC群体的T细胞免疫抑制特性的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍，或更多增加。
合适的免疫效力测定使用辐射的测试MSC(例如，根据本文公开的方法产生的iPSC-MSC)和辐射的参照样品MSC，上述辐射的测试MSC和辐射的参照样品MSC分别以不同浓度与从健康供体外周血纯化的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记的白细胞一起铺板。通过添加CD3和CD28抗体刺激代表参照样品的一个亚组的T辅助(CD4+)淋巴细胞。使用流式细胞仪对CD4标记的T细胞计数以评估T细胞增殖。IC50值报告为参照样品的函数。更高的IC50值表示更大程度的抑制T辅助(CD4+)淋巴细胞的增殖，并且因此指示卓越的T细胞免疫抑制特性。在用于该测试前辐射MSC样品以消除它们增殖潜能的混杂因素。
本领域的技术人员会理解向受试者施用治疗有效量的根据本发明的方法分化的MSC或MSC群体用于治疗病况、疾病或病症的具体方式会由医师自行决定。施用方式，包括剂量、与其他药剂组合、施用的时间设置和频率等,可以受受试者对用MSC或MSC群体治疗的可能的反应的诊断，以及受试者的状况和历史的影响。
如本文所使用的术语“治疗性组合物”指包含本文所述的MSC或MSC群体的组合物，其已经被配制用于向受试者施用。优选地,治疗性组合物是无菌的。在一个实施方案中，治疗性组合物是无热原的。
MSC或MSC群体会以与良好的医疗实践一致的方式配制、给药和施用。在此上下文中考虑的因素包括要治疗的病症的特定类型、治疗的特定受试者、受试者的临床状况，施用的部位、施用的方法、施用的时序安排、可能的副作用和医疗实践者已知的其他因素。待施用的治疗有效量的MSC或MSC群体会通过这样的考虑来管理。
可以通过任何合适的方法向受试者施用MSC或MSC群体，所述方法包括静脉内(IV)、动脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下(SC)、关节内、滑膜内、鞘内、冠状动脉内、经心内膜、手术植入、局部和吸入(例如肺内)途径。最优选地，IV施用MSC或MSC群体。
术语“治疗有效量”指治疗受试者中的病况、疾病或病症有效的MSC或MSC群体的量。
术语“治疗(treat、treating或treatment)”指治疗性处理和防病或预防性的措施两者，其中目的是预防或减轻受试者中的病况、疾病或病症或减慢(减轻)受试者中的病况、疾病或病症的进展。有治疗需要的受试者包括已经患有病况、疾病或病症的那些受试者，以及要预防病况、疾病或病症的那些受试者。
术语“预防(preventing、prevention、preventative)”或“防病”指避免出现病况、疾病或病症，或阻碍、防卫以免受、或保护以免受病况、疾病或病症(包括异常或症状)的出现。有预防需要的受试者可能倾向于患上该病况、疾病或病症。
术语“减轻(ameliorate或amelioration)”指减少、降低或消除病况、疾病或病症(包括异常或症状)。有治疗需要的受试者可能已经患有该病况、疾病或病症，或可能倾向于患上该病况、疾病或病症，或可能是要预防该病况、疾病或病症的人。
如本文所使用的术语“受试者”指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物，尤其是人，或可以是家养动物、动物园动物或陪伴动物。尽管特别考虑到本文所公开的方法和其产生的MSC或MSC群体适用于人的医学治疗，它们也适用于兽医治疗，其包括家养动物(诸如马、牛和羊)、陪伴动物(诸如狗和猫)或动物园动物(诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物)的治疗。
实施例
实施例1：试剂
表1.试剂
Figure BDA0001800287180000181
Figure BDA0001800287180000191
表1中列出的试剂是本领域技术人员已知的并且具有可接受的组成，例如IMDM和Ham F12。GLUTAMAX包含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，通常在0.85％NaCl中以200mM提供。GLUTAMAX在被培养的细胞切割二肽键时释放L谷氨酰胺。化学上明确的脂质浓缩物包含花生四烯酸2mg/L、胆固醇220mg/L、DL-α-生育酚乙酸酯70mg/L、亚油酸10mg/L、亚麻酸10mg/L、肉豆蔻酸10mg/L、油酸10mg/L、棕榈酸10mg/L、棕榈油酸10mg/L、普兰尼克F-68(pluronicF-68)90g/L、硬脂酸10mg/L、TWEEN
Figure BDA0001800287180000202
2.2g/L、和乙醇。H-1152和Y27632是高效的、细胞可渗透的、选择性的ROCK(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂。
表2.IF6S培养基(10X浓缩)
Figure BDA0001800287180000201
表3.IF9S培养基(1X浓缩；基于IF6S)
IF9S 量 最终浓度
IF6S 5mL 1X
聚乙烯醇(PVA；20mg/mL溶液) 25mL 10mg/mL
holo-转铁蛋白(10.6mg/mL溶液) 50μL 10.6μg/mL
胰岛素 100μL 20μg/mL
胚胎转移级水 至50mL NA
表4.分化培养基(1X浓缩；基于IF9S)
分化培养基 量 最终浓度
IF9S 36mL 1X
FGF2 1.8μg 50ng/mL
LiCl(2M溶液) 36μL 2mM
BMP4(100μg/mL溶液) 18μL 50ng/mL
激活素A(10mg/mL溶液) 5.4μL 1.5ng/mL
表5.间充质集落形成培养基(1X浓缩)
M-CFM 数量 最终浓度
ES-CULT M3120 40mL 40％
STEMSPAN SFEM 30mL 30％
人内皮-SFM 30mL 30％
GLUTAMAX 1mL 1X
L-抗坏血酸(250mM溶液) 100μL 250μM
LiCl(2M溶液) 50μL 1mM
1-硫代甘油(100mM溶液) 100μL 100μM
FGF2 600ng 20ng/mL
表6.间充质无血清扩增培养基(1X浓缩)
M-SFEM 量 最终浓度
人内皮-SFM 5L 50％
STEMLINE II HSFM 5L 50％
GLUTAMAX 100mL 1X
1-硫代甘油 87μL 100μM
FGF2 100μg 10ng/mL
实施例2-将人PSC分化成MSC的方案
1.在E8完全培养基(DMEM/F12基础培养基+E8补充物)+1μM H1152中，在玻连蛋白包被(0.5μg/cm2)的塑料器皿上解冻iPSC。在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育铺板的iPSC。
2.在E8完全培养基(无ROCK抑制剂)中，在玻连蛋白包被(0.5μg/cm2)的塑料器皿上，扩增iPSC三次传代，并在开始分化过程之前，在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育。
3.收获iPSC并作为单细胞/小集落以5x103个细胞/cm2将iPSC接种在E8完全培养基+10μM Y27632中在胶原蛋白IV包被(0.5μg/cm2)的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育24小时。
4.用分化培养基替代E8完全培养基+10μM Y27632，并在37℃、5％CO2、5％O2(含氧量低)下温育48小时。
5.从分化培养基贴壁培养物中收获的集落形成细胞作为单细胞悬浮液，转移至M-CFM悬浮培养物并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育12天。
6.收获集落(第0代)并将其接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白I包被的(0.67μg/cm2纤连蛋白、1.2μg/cm2胶原蛋白I)塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
7.收获集落并将其作为单细胞(第1代)以1.3x104个细胞/cm2接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白1包被的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
8.收获并作为单细胞(第2代)以1.3x104个细胞/cm2接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白1包被的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
9.收获并作为单细胞(第3代)以1.3x104个细胞/cm2接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白1包被的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
10.收获并作为单细胞(第4代)以1.3x104个细胞/cm2接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白1包被的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
11.收获并作为单细胞(第5代)以1.3x104个细胞/cm2接种在M-SFEM中在纤连蛋白/胶原蛋白1包被的塑料器皿上，并在37℃、5％CO2、20％O2(含氧量正常)下温育3天。
12.作为单细胞收获并冷冻最终产物。
进行两个实验(TC-A-96和DAD-V-90)以研究用PDGF-BB(10ng/mL)和/或LiCl(1mM)补充M-CFM对iPSC-MSC的T细胞抑制的影响。使用Waisman Biomanufacturing的免疫效力测定(IPA)评估T细胞抑制。
如表7所示，评价了PDGF和LiCl的以下组合：PDGF+/LiCl+、PDGF-/LiCl-、PDGF+/LiCl-和PDGF-/LiCl+。注意，在TC-A-96实验中比较了两种不同的Dneg1接种密度(5x103个细胞/cm2和1x104个细胞/cm2)和分化培养基中的激活素A(AA)的两种不同浓度(1X AA＝15ng/mL和0.1X AA＝1.5ng/mL)。在DAD-V-90实验中使用了单一的Dneg1接种密度(5x10e3个细胞/cm2)和激活素A浓度(1.5ng/mL)。还要注意，在第一个IPA(IPA 1)中使用单一的leukopak(LPK7)，在第二个IPA(IPA 2)中使用两种leukopak(LPK7和LPK8)。
设计该测定以评估每个MSC系可以抑制T辅助(CD4+)淋巴细胞增殖的程度。使用从健康个体的外周血纯化的冷冻保存的白细胞(衍生自Leucopak(LPK)的外周血单核细胞(PBMC))测试冷冻保存的MSC。因此，预期不同供体的LPK细胞群有变化。针对临床级材料的来自两个不同个体的PMBC测试每个MSC测试样品，并且可以选择将测试限制为研究级材料的单个PMBC样品。每个MSC测试样品的测定与参考标准MSC系共同进行，以确保测定完整性/再现性并使测试样品标准化。Bloom et al.Cytotherapy,2015,17(2):140-51中描述了该测定。
简言之，将测试MSC暴露于21Gy的γ辐射。在48孔组织培养板中，将4x10e5、2x10e5、4x10e4和2x10e4个辐射的MSC铺板到各个孔中。分别用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记PMBC。将标记的PMBC细胞以每个含有上述MSC的孔中4x105个细胞铺板。这导致滴定的PBMC:MSC比率为1:1、1:0.5、1:0.1和1:0.05。一个额外的孔仅用刺激的PBMC铺板，另一孔仅用MSC铺板，并且另一孔为无刺激的1：0.05比率，所有这些都用作对照。随后，向每个孔中加入T细胞刺激性单克隆抗体、抗人CD3-ε和抗人CD28(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)。
在培养的第四天，从各个孔收获细胞。将来自每个孔的细胞与别藻蓝蛋白标记的抗人CD4一起温育。然后使用流式细胞仪经由羧基荧光素强度分析CD4+细胞的增殖。仅MSC的对照用于从共培养孔中门输出MSC。仅PBMC的对照用作最大T细胞增殖的阳性对照，测量MSC介导的针对T细胞增殖的抑制程度。未刺激的1:0.05比率的孔用于生成阴性对照门，针对其测量增殖。
根据测试样本比率，使用最佳拟合曲线来生成IC50值。将IC50值归一化至参考标准(IC50参考标准/IC50测试样品)。这种归一化的IC50对于效力较大(更具抑制性)的样品产生较大的值，对于效力较小的样品产生较小的值。
结果
表7中显示的IC50数据显示，补充有LiCl但不包含PDGF(即PDGF-/LiCl+)的M-CFM对于分化iPSC以产生免疫抑制性的iPSC-MSC是最佳的。此外，较低浓度的激活素A也改善了iPSC-MSC的免疫抑制。
表7.免疫效力测定
Figure BDA0001800287180000241
NA-不适用
实施例3-MSC微RNA分析
根据实施例2产生的MSC进行针对包含1194个miRNA的微RNA(miRNA)微阵列和由miR-127-3p、miR-145-5p、miR-181b-5p、miR-214-3p、miR-299-5p组成的专有miRNA组的分析。5个miRNA的组中的每个miRNA在全部71个MSC样品中都表达，但在94个非MSC样品中不表达，由此能够将细胞分类为MSC或非MSC。
根据实施例2产生的MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p中的每个，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
对于所有测试样品生成的归一化数据(存在于至少一个测试样品中)中可靠检测的微阵列的233个miRNA的主成分分析表明，根据实施例2产生的MSC与其他71个MSC样品中的每个都不同(图9)。
实施例4-供选择的免疫效力测定1
如下评价MSC的免疫效力：将来自不同供体的人PBMC汇集在磷酸盐缓冲盐水中(以使个体间免疫应答的差异最小化)并在黑暗中在37℃用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，2μM)染色15分钟，细胞密度为2x 107个PBMC/mL。通过添加等量的补充有10％人AB血型血清的RPMI-1640培养基终止反应。将3x 105个CFSE标记的PBMC重悬于补充有10％汇集的人血小板裂解物、2IU/mL无防腐剂肝素(Biochrom)、2mM L-谷氨酰胺、10mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES；Gibco)、100IU/mL青霉素(Sigma)和100μg/mL链霉素(Sigma)的RPMI-1640培养基中，然后将其铺板在96孔平底板(Corning)中，每个孔一式三份。使用Gallios 10色流式细胞仪和Kaluza G1.0软件(均为Coulter)测定T细胞增殖。在4至7天后分析有活力的无7-氨基放线菌素-D(7-AAD-；BD Pharmingen)的CD3-APC+(eBioscience)T细胞。使用Modfit 4.1软件(Verity)分析增殖动力学和群体分布。
实施例5-供选择的免疫效力测定2
如下评价MSC的免疫效力：根据制造商的说明用CellTrace紫(CTV；Invitrogen)染色T细胞辅助(CD4+)淋巴细胞，然后在96孔U形底板中用抗CD3/CD28包被的珠粒(Dynabeads，Invitrogen)以5:1的T细胞/珠粒比刺激。然后将应答CD4T细胞与经辐射的(以100Gy)Karpas 299细胞(K299细胞；Sigma)一起温育作为参考标准或与MSC一起温育。将共培养的细胞在RPMI-1640培养基中在37℃在5％CO2中温育72小时。然后用AnnexinV结合缓冲液(BD Biosciences)洗涤细胞，并在室温下在黑暗中用Annexin Vefluorescein异硫氰酸酯或APC(BD Biosciences)染色15分钟。在该温育后，用碘化丙啶(PI)(MolecularProbes)染色细胞，然后立即在LSRII Fortessa(BD Biosciences)上捕获。使用FlowJo软件(版本8.8.6；Tree Star)分析收集的数据。通过膜联蛋白Venegative和PI阴性T细胞群体测量活力。分析该比例的有活力的细胞的CTV暗淡(％增殖)。通过以下等式计算T细胞增殖的抑制：％抑制＝100–(a/b*100)，其中a是存在抑制细胞的情况下的百分比增殖，b是不存在抑制细胞的情况下的百分比增殖。
实施例6-治疗心肌梗塞
将本公开的间充质干细胞(MSC)用于心肌梗塞(心脏病发作)的实验大鼠模型中以在心脏病发作后修复大鼠心脏。
在总共11只大鼠中在诱导心脏病发作后的28天内的期间评估心脏功能和瘢痕大小。用本公开的MSC处理四只动物，用源自骨髓的MSC处理三只动物，并且另外四只动物接受安慰剂/运载体对照(图10)。
细胞移入的评估(图11和12)显示：
-在BM-MSC和PSC-MSC组中在第28天使用人类细胞核和人类线粒体染色，没有细胞移入的现象
与第0天相比，在第28天使用缩短分数(FS％)的功能评估(图13和14)显示出：
-运载体组的LV收缩性的变化最小/无变化
-BM MSC组的LV收缩性
-PSC-MSC组的LV收缩性。
疤痕大小的评估(图15)显示：
-与运载体和BM-MSC组相比，在PSC-MSC组中在第28天瘢痕大小明显减小(天狼星红)。
血管生成的评估(图16)显示：
-组间的血管大小和数量无明显差异(vWF染色)。
结果显示，与其他两组中的动物相比，在第28天在MSC接受者中心脏功能得到改善，瘢痕大小减小。结果表明，本公开的MSC在心脏病发作后引起显著的功能和结构的改善。
在如图17所示的实施例6的研究的修改中，会使用程序化心室刺激(EPS)评估心律失常。
实施例7-治疗GvHD
将动物随机分配到治疗组，并且在所有情况下，经由尾静脉注射相关治疗。在第0天，用2.5Gy轻度辐射6周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠，然后休息4小时。通过静脉内(尾静脉)转移1000万个人PBMC诱导GvHD。诱导疾病后，将小鼠在无病原体条件下饲养在微隔离笼(micro-isolator cage)中，并在整个实验过程中接受酸化的补充有抗生素的水。研究设计总结于表8中。
表8.GvHD研究设计的总结
Figure BDA0001800287180000271
1.在第0天对所有动物进行轻度照射(2.5Gy)。在照射后4小时施用PBMC以诱导GvHD(如果适用)。
2.GvHD对照接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替MSC治疗。
如表9中所述，在每日的GvHD体征/症状-即体重减轻、身姿、活动度、皮毛质地和皮肤完整性的基础上对动物进行评估。通过为每个1级体征/症状分配1个点并且为每个2级体征/症状分配2个点来计算总的GvHD评分。在任一动物中一旦达到8或更高的GvHD评分，就将其安乐死。
表9.GvHD分级
Figure BDA0001800287180000281
主要终点是存活时间。
结果
将iPSC-MSC解冻、洗涤并重悬于无菌PBS中。在第+14天(d14，单剂量方案)或在+14和+18天(d14、d18，双剂量方案)通过尾静脉向相关动物施用200万个iPSC-MSC。
使用标准化评分系统评估GvHD的严重程度，其包括五个不同标准：体重减轻、身姿、活动度、皮毛质地和皮肤完整性。每天评估小鼠并对每个标准从0(最不严重)到2(最严重)评分。通过将五个标准的分数加和来生成临床评分。当临床评分达到“8”时，将小鼠从研究中去除并人道地进行安乐死。将从研究中去除的那天记录为致死GvHD诱导的那天。使用Kaplan-Meier分析和应用的时序检验确定存活益处。p值≤0.05被认为是显著差异。
接受单剂量或双剂量iPSC-MSC方案的动物显示出通常与该临床前模型相关的体重减轻的显著缓解(图18)。
用单剂量或双剂量方案治疗的小鼠显示疾病症状的显著减轻，在GvHD诱导后第+24和+25天的单剂量治疗和双剂量之间注意到症状的进一步显著差异(图19)。
在存活研究中，单剂量和双剂量治疗赋予与GVHD对照相比显著的存活益处(p<0.0001)。与单剂量治疗的动物相比，接受双剂量方案的动物的存活率略有改善，尽管这种增加没有达到统计学显著性(p＝0.0715)。(图20)
从这些存活研究中，我们得出结论，在GvHD的临床前模型中，当以单剂量或双剂量治疗施用时，CYMERUSTMiPSC-MSC保护小鼠免于体重减轻，显著减轻疾病严重程度，并提供强大的生存益处。
序列表
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<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 1
Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe
1 5 10 15
Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile
35 40 45
Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn
50 55 60
His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys
65 70 75 80
Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp
85 90 95
Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu
100 105 110
Cys Gly Cys Ser
115
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 2
Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser
1 5 10 15
Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala
20 25 30
Phe Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
35 40 45
Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser
50 55 60
Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser
65 70 75 80
Met Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln
85 90 95
Glu Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
100 105
<210> 3
<211> 1057
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 3
Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val
1 5 10 15
Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly
35 40 45
Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro
65 70 75 80
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly
85 90 95
Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu
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1140 1145 1150
Ala Asn Pro Asp Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr
1155 1160 1165
Thr Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly
1170 1175 1180
Gln Gln Gly Asn Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser
1185 1190 1195 1200
Cys Thr Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val
1205 1210 1215
Tyr Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile
1220 1225 1230
Ile Pro Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr
1235 1240 1245
Asp Ser Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile
1250 1255 1260
Ile Gly Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile
1265 1270 1275 1280
Phe Glu Asp Phe Val Asp Ser Ser Val Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly
1285 1290 1295
Leu Glu Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Asn
1300 1305 1310
Gly Gly Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr Ala Val Pro
1315 1320 1325
Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1330 1335 1340
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val
1345 1350 1355 1360
Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile
1365 1370 1375
Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr
1380 1385 1390
Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr
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Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile
1410 1415 1420
Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala
1425 1430 1435 1440
Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His
1445 1450 1455
Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser
1460 1465 1470
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1475 1480 1485
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Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg
1525 1530 1535
Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln
1540 1545 1550
Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu
1555 1560 1565
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
1570 1575 1580
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr
1585 1590 1595 1600
Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val Thr Asp Val Gln Asp Asn
1605 1610 1615
Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr Gly Tyr
1620 1625 1630
Arg Val Thr Thr Thr Pro Lys Asn Gly Pro Gly Pro Thr Lys Thr Lys
1635 1640 1645
Thr Ala Gly Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro
1650 1655 1660
Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Pro Ser Gly Glu
1665 1670 1675 1680
Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg Pro Lys
1685 1690 1695
Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp
1700 1705 1710
Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser
1715 1720 1725
Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Glu
1730 1735 1740
Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val
1745 1750 1755 1760
Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly
1765 1770 1775
Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln
1780 1785 1790
Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln
1795 1800 1805
Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro
1810 1815 1820
Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
1825 1830 1835 1840
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys
1845 1850 1855
Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu
1860 1865 1870
Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr
1875 1880 1885
Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe
1890 1895 1900
Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr
1905 1910 1915 1920
Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly
1925 1930 1935
Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
1940 1945 1950
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn
1955 1960 1965
Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln
1970 1975 1980
Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro
1985 1990 1995 2000
Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
2005 2010 2015
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr
2020 2025 2030
Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg
2035 2040 2045
Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn
2050 2055 2060
Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Val Gln Lys Thr
2065 2070 2075 2080
Pro Phe Val Thr His Pro Gly Tyr Asp Thr Gly Asn Gly Ile Gln Leu
2085 2090 2095
Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln Pro Ser Val Gly Gln Gln Met Ile Phe
2100 2105 2110
Glu Glu His Gly Phe Arg Arg Thr Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Pro
2115 2120 2125
Ile Arg His Arg Pro Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val Gly Gln Glu Ala
2130 2135 2140
Leu Ser Gln Thr Thr Ile Ser Trp Ala Pro Phe Gln Asp Thr Ser Glu
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Tyr Ile Ile Ser Cys His Pro Val Gly Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gln
2165 2170 2175
Phe Arg Val Pro Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr Leu Thr Gly Leu Thr
2180 2185 2190
Arg Gly Ala Thr Tyr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Lys Asp Gln Gln
2195 2200 2205
Arg His Lys Val Arg Glu Glu Val Val Thr Val Gly Asn Ser Val Asn
2210 2215 2220
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Val Ser His Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met Ser Glu Ser
2245 2250 2255
Gly Phe Lys Leu Leu Cys Gln Cys Leu Gly Phe Gly Ser Gly His Phe
2260 2265 2270
Arg Cys Asp Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn Gly Val Asn Tyr Lys
2275 2280 2285
Ile Gly Glu Lys Trp Asp Arg Gln Gly Glu Asn Gly Gln Met Met Ser
2290 2295 2300
Cys Thr Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu Phe Lys Cys Asp Pro His
2305 2310 2315 2320
Glu Ala Thr Cys Tyr Asp Asp Gly Lys Thr Tyr His Val Gly Glu Gln
2325 2330 2335
Trp Gln Lys Glu Tyr Leu Gly Ala Ile Cys Ser Cys Thr Cys Phe Gly
2340 2345 2350
Gly Gln Arg Gly Trp Arg Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro Gly Gly Glu
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2385 2390 2395 2400
Phe Met Pro Leu Asp Val Gln Ala Asp Arg Glu Asp Ser Arg Glu
2405 2410 2415
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 7
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Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr
100 105
<210> 8
<211> 2179
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 8
Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys Arg Gln Ser Gly Val Asn
1 5 10 15
Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val Val Phe Asn His Val Tyr
20 25 30
Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys Ser Val Asp Leu Glu Ser
35 40 45
Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro Ser Glu Pro Ser Glu Ser
50 55 60
Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn Gln Ile Val Phe Thr His
65 70 75 80
Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp
85 90 95
Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser
100 105 110
Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala Gly Cys Cys Leu Gln Pro
115 120 125
Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe Cys Ser Gly Arg Gly Asn
130 135 140
Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys Glu Pro Gly Trp Lys Gly
145 150 155 160
Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly Asn Cys His Leu Arg Gly
165 170 175
Arg Cys Ile Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly Glu
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Cys Val Asn Gly Val Cys Ile Cys Phe Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Asp
210 215 220
Cys Ser Arg Glu Ile Cys Pro Val Pro Cys Ser Glu Glu His Gly Thr
225 230 235 240
Cys Val Asp Gly Leu Cys Val Cys His Asp Gly Phe Ala Gly Asp Asp
245 250 255
Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys Tyr Asn Arg Gly Arg Cys
260 265 270
Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys
275 280 285
Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe Asp Arg Gly Arg Cys Ile
290 295 300
Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Gly
305 310 315 320
Lys Pro Thr Cys Pro His Ala Cys His Thr Gln Gly Arg Cys Glu Glu
325 330 335
Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Ala Gly Val Asp Cys Ser Glu
340 345 350
Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg Gly Arg Cys Val Asp Gly
355 360 365
Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly Ala Asp Cys Gly Glu Leu
370 375 380
Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Asn Gly Gln
385 390 395 400
Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Arg
405 410 415
Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg Cys Val Glu Gly Lys Cys
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Asp Arg Gln Cys Pro
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Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Gln Cys Val Cys
485 490 495
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565 570 575
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580 585 590
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835 840 845
Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
850 855 860
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885 890 895
Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala Pro Ile Ser Gly Gly Asp
900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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Thr Ser Leu Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg
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Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala
1125 1130 1135
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1140 1145 1150
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1155 1160 1165
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Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val
1205 1210 1215
Thr Gln Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu
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Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp
1235 1240 1245
Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe
1250 1255 1260
Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu
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Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala
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Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu
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1345 1350 1355 1360
Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser
1365 1370 1375
Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Arg
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Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser
1395 1400 1405
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1410 1415 1420
Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp
1425 1430 1435 1440
Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile Ile Asp Ser Asn Arg Leu
1445 1450 1455
Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala His
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1475 1480 1485
Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr
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1620 1625 1630
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1635 1640 1645
Pro Glu Arg Thr Arg Asp Ile Thr Gly Leu Arg Glu Ala Thr Glu Tyr
1650 1655 1660
Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg Ser Gln Thr Val
1665 1670 1675 1680
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1685 1690 1695
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1700 1705 1710
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1845 1850 1855
Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu Thr
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1890 1895 1900
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1955 1960 1965
Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr Thr Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Lys
1970 1975 1980
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1985 1990 1995 2000
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2005 2010 2015
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Trp Leu Gly Leu Asp Asn Leu Asn Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln Tyr
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2085 2090 2095
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2100 2105 2110
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2115 2120 2125
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2130 2135 2140
Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu His Ser Ile Gln Phe Ala
2145 2150 2155 2160
Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn Leu Glu Gly Arg Arg
2165 2170 2175
Lys Arg Ala

Claims (27)

1.一种用于产生间充质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
(a)在含氧量正常的条件下，在包含LiCl和FGF2但不包含PDGF、BMP4和激活素A的间充质集落形成培养基(M-CFM)中培养原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间；和
(b)贴壁培养(a)的间充质集落以产生所述MSC，
其中，相对于不在所述M-CFM中产生的参照MSC，(b)的MSC具有卓越的T细胞免疫抑制特性，
其中所述原始中胚层细胞是具有间充质成血管细胞(MCA)潜能的原始中胚层细胞，并且其中所述具有MCA潜能的原始中胚层细胞具有EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+表型。
2.权利要求1的方法，其中所述足以形成间充质集落的时间为8天至14天。
3.权利要求1的方法，其中所述足以形成间充质集落的时间为10天至14天。
4.权利要求1的方法，其中所述足以形成间充质集落的时间为11至13天。
5.权利要求1的方法，其中所述足以形成间充质集落的时间为12天。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于通过包括以下步骤的方法产生的参照MSC确定的：
(a’)在含氧量正常的条件下，在包含FGF2和任选的PDGF但不包含LiCl的培养基中培养原始中胚层细胞持续足以形成间充质集落的时间；和
(b’)贴壁培养(a’)的间充质集落以产生所述参照MSC。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述MSC的T细胞免疫抑制特性是相对于在含氧量低的条件下在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的分化培养基中持续2天由从PSC分化的原始中胚层细胞产生的参照MSC确定的。
8.权利要求1至5中任一项的方法，其中T细胞免疫抑制特性包括抑制CD4+T辅助淋巴细胞的增殖。
9.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含1mM LiCl。
10.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含5ng/mL至100ng/mL FGF2。
11.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含10ng/mL至50ng/mL FGF2。
12.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含10ng/mL FGF2。
13.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含20ng/mL FGF2。
14.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含1mM LiCl和10ng/mL FGF2。
15.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述M-CFM包含1mM LiCl和20ng/mL FGF2。
16.权利要求1至5中任一项的方法，其进一步包括，在培养所述原始中胚层细胞之前，使多能干细胞(PSC)分化成原始中胚层细胞，其中使多能干细胞(PSC)分化成原始中胚层细胞包括以下步骤：
在低含氧量的条件下在包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的分化培养基中培养所述PSC2天以形成所述原始中胚层；和
用所述包含LiCl和FGF2但不包含PDGF的M-CFM替代所述分化培养基。
17.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述细胞是人的。
18.权利要求16的方法，其中所述PSC是诱导的PSC(iPSC)。
19.权利要求17的方法，其中所述PSC是诱导的PSC(iPSC)。
20.权利要求16的方法，其中所述分化培养基包含：
10ng/mL至50ng/mL FGF2；
50ng/mL至250ng/mL BMP4；
1ng/mL至15ng/mL激活素A；和/或
1mM至2mM LiCl。
21.权利要求16的方法，其中所述分化培养基包含：
10ng/mL至50ng/mL FGF2；
50ng/mL至250ng/mL BMP4；
10ng/mL至15ng/mL激活素A；和/或
1mM至2mM LiCl。
22.权利要求16的方法，其中所述分化培养基包含：
10ng/mL至50ng/mL FGF2；
50ng/mL至250ng/mL BMP4；
12.5ng/mL激活素A；和/或
1mM至2mM LiCl。
23.权利要求16的方法，其中所述分化培养基包含：
10ng/mL至50ng/mL FGF2；
50ng/mL至250ng/mL BMP4；
1.5ng/mL激活素A；和/或
1mM至2mM LiCl。
24.权利要求16的方法，其中所述分化培养基包含：
50ng/mL FGF2；
50ng/mL BMP4；
1.5ng/mL激活素A；和
2mM LiCl。
25.权利要求1至5中任一项的方法，其包括在胶原蛋白IV和/或生腱蛋白C上培养。
26.权利要求1至5中任一项的方法，其进一步包括传代所述间充质集落和/或MSC。
27.权利要求26的方法，其中传代包括：
培养所述间充质集落和/或MSC3天；
在纤连蛋白和/或胶原蛋白I上培养所述间充质集落和/或MSC；和/或
1、2、3、4、5或6次传代。
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