CN116333094B - 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 - Google Patents
一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116333094B CN116333094B CN202310055281.XA CN202310055281A CN116333094B CN 116333094 B CN116333094 B CN 116333094B CN 202310055281 A CN202310055281 A CN 202310055281A CN 116333094 B CN116333094 B CN 116333094B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant
- type
- collagen
- collagen alpha
- alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 title abstract description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 102000019199 alpha-Mannosidase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010012864 alpha-Mannosidase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 claims description 2
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 claims 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 30
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 abstract description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 11
- 101000875027 Homo sapiens Collagen alpha-1(X) chain Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000044123 human COL10A1 Human genes 0.000 description 9
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 6
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- 102000014870 Collagen Type XII Human genes 0.000 description 1
- 108010039001 Collagen Type XII Proteins 0.000 description 1
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108050002220 Green fluorescent protein, GFP Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000945357 Homo sapiens Collagen alpha-1(I) chain Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用，所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明属于生物工程技术领域，为了解决在大肠杆菌原核表达系统中难以表达可溶性的全长人胶原蛋白和在酵母表达系统中形成重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在差异性问题，本发明提出采用人胚胎肾细胞Expi293F表达重组I型人源化胶原蛋白α1链，并使用融合表达质粒提高蛋白表达量，实现I型人源化胶原蛋白α1链全长区段表达，所得到的重组蛋白序列与I型人胶原蛋白α1链接近，活性研究表明，本发明所表达的重组I型人源化胶原蛋白α1具有很好的促进细胞迁移的活性，可广泛运用于生物医药领域、组织工程领域、护肤领域和食品领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质之一（占总蛋白质量的25%~30%），是人各种结缔组织中发现的细胞外基质中的主要结构蛋白，其参与许多人体器官组织的组成，如皮肤、角膜、神经视网膜、骨骼、肌肉等。
胶原蛋白超家族目前发现有28种，根据蛋白链的类型、结构、结合等大致分为纤维胶原蛋白和非纤维胶原蛋白，胶原蛋白的共同结构特征是存在一个三螺旋结构，其结构范围广泛，如：I型胶原为96%，而XII型胶原小于10%；组成三螺旋的肽链称为α链，三条肽链可以相同形成同源三聚体或异源三聚体；胶原蛋白的螺旋区段最大特征是氨基酸呈现Gly-X-Y重复序列，X和Y通常分别是脯氨酸和4-羟基脯氨酸，这种重复序列能够形成链间氢键和静电相互作用，使得胶原蛋白形成稳定的三螺旋结构。
胶原蛋白在医药领域、护肤领域和食品领域都具有广泛的应用，此外，胶原蛋白还有很多探索研究，有望拓展其前沿应用，如：新型MI-RHCMA水凝胶贴片可在体内诱导受损角膜间质的再生（MI-RHCMA水凝胶采用聚源生物重组人源化胶原蛋白制成）；胶原蛋白结合3D-生物打印技术重建人类心脏的组分；利用人源III型胶原制成的生物合成角膜光学透明，可替代供体疗法或转基因猪治疗方法，并无需使用免疫抑制药物；使用人源III型胶原蛋白完成心脏瓣膜人工合成以及子宫内膜灌注修复。
目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取猪、牛等的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，或是从深海鱼类的鱼皮中进行提取，从动物组织中提取胶原蛋白的技术虽然成熟，但存在着免疫原性、和来源有限等确定，难以满足巨大的市场需求。
随着基因工程技术的大规模应用，通过基因工程生成重组胶原蛋白成为解决胶原蛋白来源限制问题最有潜力的方法，动物来源的胶原蛋白相比，重组胶原蛋白不仅具有生产周期短，成本低，适用于大规模生产的优势，还能避免动物蛋白免疫原性、动物源疾病等问题，因此重组胶原蛋白特别是重组人源胶原蛋白的制备是目前胶原蛋白生产研究的热点。
由于全长的胶原蛋白分子量大（一般大于100kDa），且具有多种蛋白翻译后修饰，如脯氨酸、赖氨酸羟基化，糖基化等，现有技术在大肠杆菌原核表达系统中难以表达可溶性的全长人胶原蛋白，而在酵母表达系统中，因酵母中蛋白翻译后修饰过程与人体存在差异，所形成的重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在较多不同。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组人源化I型胶原蛋白α1的质粒构建、表达方法及其应用，为了解决在大肠杆菌原核表达系统中难以表达可溶性的全长人胶原蛋白和在酵母表达系统中形成重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在较大的差异性问题，本发明采用人胚胎肾细胞Expi293F表达重组I型人源化胶原蛋白α1链，并使用融合表达质粒提高蛋白表达量，实现了I型人源化胶原蛋白α1链全长区段表达，所得到的重组蛋白序列与I型人胶原蛋白α1链接近（N端多三个氨基酸），免疫原性低，安全性高。活性研究表明，本发明所表达的重组I型人源化胶原蛋白α1具有很好的促进细胞迁移的活性，具有很大的应用潜力。
用于解决问题的技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种重组I型人源化胶原蛋白α1，所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列包括来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列和I型人源胶原蛋白α1链162-1218氨基酸序列。
优选地，所述I型人源胶原蛋白α1链第162-1218位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述I型人源胶原蛋白α1链第162-1218位点的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，人源细胞表达的蛋白具有多种翻译后修饰，因此所述I型人源胶原蛋白α1链分子量为138 kDa。
优选地，所述来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，以SEQID NO:4所示的序列与以SEQ ID NO:1所示的序列直接相连。
进一步地，本发明的目的之二在于提供一种重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体，所述表达载体包含所述重组I型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列和基础载体pcDNA3.1。
进一步地，所述表达载体的表达方法为将所述重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体转染宿主细胞进行表达。
优选地，所述宿主细胞为人胚胎肾细胞Expi293F。
进一步地，所述重组I型人源化胶原蛋白的表达方法包括如下步骤：
（1）质粒提取：将所述表达载体转化至大肠杆菌DH5α中，接种到LB液体培养基，37℃，200rpm，培养30min，将转化后的菌液涂布于LB固体培养基平板，于培养箱37℃倒置培养12h，挑取阳性单个菌落加入到50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养12h，提取质粒；
（2）蛋白表达：Expi293F细胞在37℃，110rpm，湿度80%，二氧化碳7%摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基，当细胞密度达到1.5-2.5×106/mL，活细胞率>95%时进行细胞转染，所述细胞转染方法包括如下步骤：将转染试剂加入细胞培养基，轻柔混匀，为溶液A；将步骤（1）中获得的质粒加入细胞培养基，轻柔混匀，为溶液B；将溶液B加入溶液A中，轻柔混匀，静置15min；然后将A和B的混合液加入到悬浮培养的Expi293F细胞中，继续培养6-7天，待活细胞率低于50%，收集细胞获得细胞混悬液；
（3）蛋白纯化：将步骤（2）中获得的细胞混悬液经4℃，11000rpm离心10min，取上清培养基，与镍柱孵育，利用重力洗脱，使用含10mM咪唑的PBS溶液50mL洗镍柱，分别用30mM、50mM、100mM、200mM和300mM咪唑的PBS溶液进行梯度洗脱，使用SDS-PAGE检测蛋白，合并洗脱液，超滤管除去咪唑获得纯化后的蛋白；
（4）GFP融合蛋白切除：将所述纯化后的蛋白加入酶反应溶液中，然后加入酶溶液50U，4℃过夜反应，将蛋白溶液与镍柱孵育，除掉标签蛋白和酶即获得目标蛋白重组I型人源化胶原蛋白α1。
进一步地，本发明的目的之三在于提供一种重组I型人源化胶原蛋白α1的应用，所述应用为将所述重组I型人源化胶原蛋白α1应用于促进小鼠胚胎成纤维细胞迁移的活性研究。
与现有技术相比较，本发明取得的技术效果如下：
为了解决在大肠杆菌原核表达系统中难以表达可溶性的全长人胶原蛋白和在酵母表达系统中形成重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在较大的差异性问题，本发明采用人胚胎肾细胞Expi293F表达重组I型人源化胶原蛋白α1链，并使用融合表达质粒提高蛋白表达量，实现了I型人源化胶原蛋白α1链全长区段表达，所得到的重组蛋白序列与I型人胶原蛋白α1链接近（N端多三个氨基酸）；
本发明选择人胶原蛋白α1链162-1218氨基酸序列链接到载体pcDNA3.1上，通过在目的蛋白N端添加分泌信号肽、融合蛋白（绿色荧光蛋白，GFP）和TEV酶切序列优化表达载体，分泌信号肽可将基因表达的重组蛋白运送到细胞培养基中，提高重组蛋白的表达量；融合蛋白GFP提高重组蛋白抗化学变性剂的能力，改进重组蛋白折叠动力学，有利于得到有活性的重组蛋白；TEV酶切序列可以被烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶识别并切割，去掉融合蛋白得到无标签的、接近人胶原蛋白序列的目标重组蛋白，提高重组蛋白的安全性；
优化后的表达载体转染人胚胎肾细胞Expi293F，分泌表达可溶性GFP融合的重组I型人源化胶原蛋白α1，相同表达条件，无GFP的表达载体未检测到可溶性重组蛋白的表达，GFP有利于高分子量蛋白的正确折叠，提高活性蛋白的表达量，GFP蛋白融合表达以提高蛋白表达量的质粒，TEV酶切除融合蛋白GFP，得到重组I型人源化胶原蛋白α1，实现了较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；
本发明得到的重组I型人源化胶原蛋白α1是具有活性的重组蛋白，活性研究表明，重组I型人源化胶原蛋白α1对BALB/c 3T3细胞有促进细胞迁移的活性，12小时划痕恢复率分别为58.1%（10 μg/mL）和98.6%（100 μg/mL），远高于对照组38.2％(0 μg/mL)。
附图说明
图1为本发明重组I型人源化胶原蛋白α1的SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明重组I型人源化胶原蛋白α1促进细胞迁移实验结果图；
图3为本发明重组I型人源化胶原蛋白α1促进细胞迁移划痕恢复率统计图。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
本发明提供了一种重组I型人源化胶原蛋白α1，所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重组I型人源化胶原蛋白α1的分子量为95 kDa。
所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列包括来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列和I型人源胶原蛋白α1链162-1218氨基酸序列。
所述I型人源胶原蛋白α1链第162-1218位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述I型人源胶原蛋白α1链第162-1218位点的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，人源细胞表达的蛋白具有多种翻译后修饰，因此所述I型人源胶原蛋白α1链分子量为138 kDa。
所述来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
同时，本发明提供了一种重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体，所述表达载体包含所述重组I型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列和基础载体pcDNA3.1。
本发明还提供了一种重组I型人源化胶原蛋白α1的人源细胞蛋白表达系统的表达方法，所述表达方法为将所述重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体转染宿主细胞进行表达，所述宿主细胞为人胚胎肾细胞Expi293F。
实施例1
构建表达载体
根据来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白（GFP蛋白）氨基酸序列及TEV酶切序列，进行密码子优化并合成基因序列（如SEQ ID NO:4所示），插入质粒pcDNA3.1的NheI和BamHI两个酶切位点之间，构成可用于分泌表达融合蛋白质粒；再由生工生物工程有限公司合成I型人胶原蛋白α1链162-1218氨基酸基因序列（SEQ ID NO:2），插入上述融合蛋白质粒的BamHI和XhoⅠ两个酶切位点之间，构建得到能够表达重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体。
实施例2
表达重组I型人源化胶原蛋白α1
（1）质粒提取：将实施例1中所构建的质粒载体转化至大肠杆菌DH5α中，接种到LB液体培养基（每升培养基包含10g蛋白胨、5g酵母粉和5gNaCl），37℃，200rpm，培养30min，将转化后的菌液涂布于LB固体培养基平板（含0.1mg/mL氨苄），于培养箱37℃倒置培养12h，挑取阳性单个菌落加入到50mL LB液体培养基（0.1mg/mL氨苄）中，37℃，200rpm，培养12h，利用质粒大量抽提试剂盒（碧云天：D0025-3）提取质粒，使用Nanodrop仪器检测质粒的浓度，4℃保存。
（2）蛋白表达：Expi293F细胞在37℃，110rpm，湿度80%，二氧化碳7%摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基（吉泰依科赛：HE000-N012）。当细胞密度达到1.5-2.5×106/mL，活细胞率>95%时，使用碧云天质粒转染试剂盒（C0518）进行Expi293F细胞转染，具体方法为：将80μL转染试剂加入1mL细胞培养基，轻柔混匀，为溶液A；40μg质粒加入1mL细胞培养基，轻柔混匀，为溶液B。溶液B加入溶液A中，轻柔混匀，静置15min。将A和B的混合液加入到40mL悬浮培养的Expi293F细胞中，继续培养6~7天，每天检测活细胞率，待活细胞率低于50%，收集细胞。
（3）蛋白纯化：细胞混悬液经4℃，11000rpm离心10min，取上清培养基，与5mL镍柱孵育（赛默飞：88221），利用重力洗脱，含10mM咪唑的PBS溶液50mL洗镍柱，分别用30mM、50mM、100mM、200mM和300mM咪唑的PBS溶液进行梯度洗脱，SDS-PAGE检测蛋白，将含有目标蛋白且纯度好的PBS洗脱液合并，超滤管（Millipore，UFC9010）除去咪唑。
（4）GFP融合蛋白切除：使用试剂盒（碧云天：P2307）去除融合蛋白，200μL GFP融合胶原蛋白的PBS溶液加入酶反应溶液20μL，然后加入酶溶液50U，4℃过夜反应，SDS-PAGE检测反应完全，即原来蛋白条带消失，出现新的分子量小的蛋白条带，蛋白溶液与镍柱孵育，除掉标签蛋白和酶，穿透液中为目标蛋白重组I型人源化胶原蛋白α1，如图2所示，使用蛋白凝胶电泳检测获得的重组I型人源化胶原蛋白α1。
实施例3
重组I型人源化胶原蛋白α1促进细胞迁移活性测定
使用马克笔在6孔板背后，用直尺均匀划横线，每隔0.5-1cm左右一道，每孔画5条线。每孔加入约5*105个BALB/c3T3细胞，培养过夜使细胞贴壁。第二天用无菌枪头比着直尺划细胞，用PBS洗3次，去除划下的细胞，加入（1-2%FBS）的DMEM培养基，设置对照组、不同重组I型人源化胶原蛋白α1浓度的实验组（10μg/mL和100μg/mL），细胞放回培养箱。按0、6、12、24小时取样拍照。每个实验条件拍三张照片，ImageJ软件分析计算划痕面积，得到不同时刻划痕恢复率，恢复率为0时刻划痕面积减除对应时刻划痕面积后与0时刻划痕面积比值的百分数，进行三次独立实验数据（均数±标准差），t-test，P<0.05为*（有统计学意义的显著差异），P<0.01为**。
如图2所示，使用10μg/mL的重组I型人源化胶原蛋白α1和10μg/mL的重组I型人源化胶原蛋白α1后，细胞间划痕在24小时已经完全修复，而未使用的对照仍然具有间隙，同时，如图3所示，相较于未使用胶原蛋白的对照组，使用本发明制备的重组I型人源化胶原蛋白α1在0、6、12、24小时均具有促进细胞迁移活性，且浓度越高效果越好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1. 一种重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体，其特征在于：所述重组I型人源化胶原蛋白α1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述I型人源化胶原蛋白α1链第162-1218位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述I型人源化胶原蛋白α1链第162-1218位点的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述重组I型人源化胶原蛋白α1的pcDNA3.1表达载体包括来自克氏锥虫（Trypanosomacruzi）的α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列和I型人源化胶原蛋白α1链162-1218氨基酸序列；
所述SEQ ID NO:3所示的DNA序列插入pcDNA3.1表达载体的BamHI和XhoⅠ两个酶切位点之间；
所述来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中α-甘露糖苷酶的分泌信号肽氨基酸序列、绿色荧光蛋白氨基酸序列、TEV酶切序列的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，所述SEQ ID NO:4所示的DNA序列插入pcDNA3.1表达载体的NheI和BamHI两个酶切位点之间；
所述表达载体的表达方法为将所述重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体转染宿主细胞进行表达；所述宿主细胞为人胚胎肾细胞Expi293F。
2. 根据权利要求1所述的一种重组I型人源化胶原蛋白α1的表达载体，其特征在于：所述重组I型人源化胶原蛋白的表达方法包括如下步骤：Expi293F细胞在37℃，110rpm，湿度80%，二氧化碳7%摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基，当细胞密度达到1.5-2.5×106/mL，活细胞率>95%时，进行细胞转染，所述细胞转染方法包括如下步骤： 将转染试剂加入细胞培养基，轻柔混匀，为溶液A；将重组I型人源化胶原蛋白α1的质粒加入细胞培养基，轻柔混匀，为溶液B；将溶液B加入溶液A中，轻柔混匀，静置15min；然后将A和B的混合液加入到悬浮培养的Expi293F细胞中，继续培养6-7天，待活细胞率低于50%，收集细胞，离心获得培养基上清。
3.一种根据权利要求1所述的重组I型人源化胶原蛋白α1表达载体的应用，所述应用为通过所述表达载体表达构建的重组I型人源化胶原蛋白α1应用于促进小鼠胚胎成纤维细胞迁移的活性研究。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310055281.XA CN116333094B (zh) | 2023-02-04 | 2023-02-04 | 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310055281.XA CN116333094B (zh) | 2023-02-04 | 2023-02-04 | 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116333094A CN116333094A (zh) | 2023-06-27 |
| CN116333094B true CN116333094B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=86891946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310055281.XA Active CN116333094B (zh) | 2023-02-04 | 2023-02-04 | 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116333094B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116925240A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-10-24 | 山东多美康生物医药有限公司 | 一种重组胶原蛋白及其表达方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182355A (zh) * | 2007-10-22 | 2008-05-21 | 中国人民解放军海军医学研究所 | 抗菌肽融合蛋白基因、其重组载体、其转化体及其表达产物 |
| CN101501216A (zh) * | 2006-03-06 | 2009-08-05 | 胡玛基因公司 | 制备重组人凝血酶的方法 |
| CN104313053A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-01-28 | 华南农业大学 | 一种生产人源胶原蛋白ⅱ型的方法 |
| CN108884441A (zh) * | 2016-03-16 | 2018-11-23 | 洋蓟治疗有限公司 | 集落形成培养基及其用途 |
| CN110964099A (zh) * | 2019-02-20 | 2020-04-07 | 江苏悦智生物医药有限公司 | 酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用 |
| WO2021212627A1 (zh) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | 南通大学 | 一种重组人胶原蛋白及其构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020142391A1 (en) * | 1991-06-12 | 2002-10-03 | Kivirikko Kari I. | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems |
-
2023
- 2023-02-04 CN CN202310055281.XA patent/CN116333094B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101501216A (zh) * | 2006-03-06 | 2009-08-05 | 胡玛基因公司 | 制备重组人凝血酶的方法 |
| CN101182355A (zh) * | 2007-10-22 | 2008-05-21 | 中国人民解放军海军医学研究所 | 抗菌肽融合蛋白基因、其重组载体、其转化体及其表达产物 |
| CN104313053A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-01-28 | 华南农业大学 | 一种生产人源胶原蛋白ⅱ型的方法 |
| CN108884441A (zh) * | 2016-03-16 | 2018-11-23 | 洋蓟治疗有限公司 | 集落形成培养基及其用途 |
| CN110964099A (zh) * | 2019-02-20 | 2020-04-07 | 江苏悦智生物医药有限公司 | 酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用 |
| WO2021212627A1 (zh) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | 南通大学 | 一种重组人胶原蛋白及其构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 人基质金属蛋白酶-9在酵母Pichia pastoris中的表达;颜春洪等;中国生物化学与分子生物学报;20000410;第16卷(第02期);第194-199页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116333094A (zh) | 2023-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111334512B (zh) | 含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法 | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| EP4119573A1 (en) | Recombinant human type xvii collagen, preparation method and application thereof | |
| EP3660045A1 (en) | Polypeptide, process for the production thereof and use thereof | |
| WO2017206326A1 (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法 | |
| CN115991764B (zh) | 羟脯氨酸修饰的重组iii型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN116218864B (zh) | 一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用 | |
| CN112552393B (zh) | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统 | |
| CN114106150B (zh) | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 | |
| EP4349871A1 (en) | Polypeptide and use thereof | |
| CN116333094B (zh) | 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 | |
| UA125928C2 (uk) | Пептид аналога інсуліну | |
| CN115558612A (zh) | 重组全长ⅲ型人源化胶原蛋白酵母工程菌株及构建方法 | |
| BR112013010522B1 (pt) | Método para purificação de fator estimulador de colônias de granulócitos humanos a partir de e. coli recombinante | |
| DE4139001A1 (de) | Verfahren zur einschleusung von nukleinsaeuren in zellen | |
| CN116535520A (zh) | 一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN118047857A (zh) | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 | |
| CN112851791B (zh) | 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用 | |
| CN111423516B (zh) | 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用 | |
| CN112239760A (zh) | 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用 | |
| CN108949870B (zh) | 一种生产重组血小板源生长因子的方法 | |
| CN116836263A (zh) | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统 | |
| CN105294851B (zh) | 与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 | |
| EP3575391A1 (en) | Hydrogels for cultivating pancreatic organoids | |
| CN104861076B (zh) | 一种融合多肽及其在促进成骨和血管形成中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240304 Address after: 218 meters north of the intersection of Qingnian Road and Dingdang Road, Tianzhong Street, Dingtao District, Heze City, Shandong Province, 274100 Applicant after: Shandong duomeikang biomedical Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 102299 Beijing Changping District science and Technology Park 37, 6 4 4 Applicant before: Beijing century Wei Medicine Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |