CN104313053A - 一种生产人源胶原蛋白ⅱ型的方法 - Google Patents

Abstract

本文发明公开了一种生产重组人源胶原蛋白Ⅱ型的方法，属于基因工程的技术领域。其特征在于：利用杆状病毒多基因表达系统，用转化了该杆状病毒多基因表达系统的细菌感染昆虫细胞，产生一种表达多基因的杆状病毒，将病毒液侵染昆虫细胞或注射入家蚕幼虫体内，由此生产重组人源胶原蛋白Ⅱ型全长蛋白，其蛋白结构为3条具有(G-X-Y)_n重复序列的肽链形成三股螺旋结构，保持天然胶原蛋白Ⅱ型的构象，具有天然胶原蛋白Ⅱ型的活性。采用本发明的方法，能表达多个基因，利于生产胶原蛋白Ⅱ型全长蛋白；本发明工艺方法简单，操作简便，工艺路线短。

Description

一种生产人源胶原蛋白Ⅱ型的方法

技术领域

本发明涉及一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，属于基因工程的技术领域。

背景技术

胶原蛋白又称胶原，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25％-30％。其广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织的重要结构蛋白，具有支撑器官和保护机体的功能。

目前研究报道显示，自Miller和Matukas于1969年发现II型胶原蛋白以来，在脊椎动物中已发现超过28种不同类型的胶原蛋白，它们由至少46种截然不同的多肽链组成。这些不同类型的胶原蛋白都至少包含一个三重螺旋的结构域，有的多达96％(I型)，少则10％(XII型)。胶原蛋白的基本组成大同小异，在氨基酸序列上都含有(Gly-X-Y)n重复序列，这些重复序列是构成三聚体结构基础，其中X通常为Pro，Y通常为Hy-Pro或Hy-Lys。在胶原蛋白中，脯氨酸(Pro)与赖氨酸(Lys)含量尤为丰富，而这正是α肽链能形成三螺旋的关键组分。羟基脯氨酸(Hyp)是在胶原蛋白一级结构形成后由特定的酶-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)作用于序列中的脯氨酸(Pro)形成的，Hyp羟基通过通过分子间氢键对稳定胶原蛋白的三重螺旋结构起着重要的作用。

人源II型胶原蛋白是人体透明软骨、玻璃体、胚胎角膜和神经视网膜的主要成分，此外，II型胶原对于软骨的修复是很有用的，而且有望用于人造软骨及人造角膜等生物医学材料中。但目前这些材料都来自于动物，而动物源的胶原会产生免疫反应而且有病毒隐患，此外，缺乏大量的组织及大规模纯化胶原蛋白所面临的挑战使利用这些材料很难，重组表达技术可解决上述问题。目前虽已在哺乳细胞、昆虫、酵母、大肠杆菌、烟草、老鼠和蚕中成功表达了重组胶原，但只有在哺乳细胞中在不表达脯氨酰4-羟化酶基因时，胶原蛋白基因可表达出羟基化的胶原蛋白，但由于其表达水平太低，无法进行大规模的生产。

发明内容

为克服现有技术中的上述缺点，本发明通过对载体基因上游改造，构建能同时表达胶原蛋白II型、红色荧光蛋白、脯氨酸羟化酶的病毒，并且提供了一种表达效率高、工艺简单的胶原蛋白II型的表达方法。

本发明主要目的在于：利用多基因杆状病毒表达系统表达人源II型胶原蛋白。

具体地，本发明提供一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)人工合成SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM(图7)中构建重组质粒pFBDM-col II，具体地，可以插入载体pFBDM的MCS1中的位点中；

(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列，具体地，可以插入载体pFBDM的MCS2中的位点中；应该理解，IRES序列和荧光蛋白编码序列与人源胶原蛋白II型α1链全长基因是符合阅读框地插入到载体pFBDM中；

(3)人工合成SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ IDNo.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同符合阅读框地连接至转移载体pUCDM(图8)，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ，具体地，P4Hα可以插入载体pUCDM的MCS1中的位点中，P4Hβ可以插入载体pUCDM的MCS2中的位点中；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；

(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染昆虫细胞(例如，家蚕细胞BmN，SF9细胞)产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞，进行重组蛋白的表达；并且

(6)收集感染的昆虫细胞的培养液上清，亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活。

其中，当使用家蚕进行重组蛋白表达时，上述步骤(5)和(6)可以相应地修改为下述步骤(5’)和(6’)：

(5’)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染家蚕细胞BmN细胞产生杆状病毒，并利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕5龄期幼虫，感染4天后收获显现所述荧光蛋白颜色(可通过体视荧光显微镜观察)的蚕体的表皮；并且

(6’)将步骤(5’)的表皮破碎离心收集上清，将表达的重组人源胶原蛋白II型通过亲和纯化，得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活。

其中，SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因可以通过人工合成获得，或者可以通过以EX-5512-B31为模板PCR扩增得到。

所用的荧光蛋白编码序列可以选自编码红色或绿色荧光蛋白的基因序列，例如，但不限于，编码GFP、YFP、mCherry的基因序列。其中，在荧光蛋白基因开放阅读框前端加入IRES序列(内部核糖体进入位点)，这样改造的目的是通过IRES的特性提高所述荧光蛋白的表达量。IRES序列如SEQ ID No.5所示。

人源脯氨酸羟化酶P4Hα和P4Hβ亚基基因的序列可以通过人工合成获得，或者通过选用带有该基因的序列作为模板通过PCR扩增得到。

在本发明的技术方案中，实现了重组人源胶原蛋白II型和人源脯氨酸羟化酶以及荧光蛋白的共表达，其中共表达人源脯氨酸羟化酶的目的是将表达的人源胶原蛋白II型中的脯氨酸羟基化，从而获得高质量的胶原蛋白II型(胶原蛋白脯氨酸被羟基化的程度是决定胶原蛋白质量高低的标准，脯氨酸羟化酶与胶原蛋白共表达，能够最大化地使胶原蛋白的脯氨酸被羟基化成羟脯氨酸)，共表达荧光蛋白的目的是在家蚕中表达时便于筛选带有表达的人源胶原蛋白II形的家蚕(会显现荧光蛋白的颜色，可通过体视荧光显微镜观察)。

在一个优选的实施方案中，所述生产重组人源胶原蛋白II型的方法包括下述步骤：

(1)合成人源胶原蛋白II型α1链全长基因(序列如SEQ ID No.1所示)；

(2)合成基因IRES(序列如SEQ ID No.5所示)与mCherry(序列如SEQ ID No.6所不)；

(3)将步骤(1)所合成的人源胶原II型α1链全长基因(SEQ ID No.1)连接到转移载体pFBDM(购至深圳市宝珠生物科技有限公司，货号zt323)，构建pFBDM-col II，将步骤(2)所合成的IRES以及mCherry共同连接入pFBDM-col II，构建重组质粒pFBDM-IM-col II，构建载体时需转化大肠杆菌感受态细胞(例如Top 10)；

(4)合成人源脯氨酸羟化酶P4Hα和P4Hβ亚基基因(序列分别为SEQID No.2和SEQ ID No.3)；

(5)将步骤(4)所合成的人源脯氨酸羟化酶P4Hα与β亚基基因共同(此处的“共同”应该理解不论同时还是先后，只要将α与β亚基基因都连接到同一个pUCDM载体中并且二者的连接符合阅读框就行)连接至转移载体pUCDM(Sun，Jingchen，et al，A High Efficient Method ofConstructing Recombinant Bombyx mori(Silkworm)MultipleNucleopolyhedrovirus Based on Zero-Background Tn7-MediatedTransposition in Escherichia coli，Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.2，pp524-529)，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(6)将重组质粒pFBDM-IM-col II和pUCDM-P4Hα-P4Hβ分别通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞(本实验室按照常规方法改造，改造方法参见Sun，Jingchen et al，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)，57，117-125(Printed in Great Britain)doi：10.1042/BA20100148)，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA：BmMNPV-pFBDM-IM-col II-pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(7)对步骤(5)构建的重组大肠杆菌在Grace培养基(购自Gibco)中直接感染家蚕细胞BmN(ATCC CRL-8910)产生杆状病毒BmMNPV-hcol II。利用杆状病毒注射感染5龄期家蚕幼虫，饲养环境为28℃，湿度60％至70％之间，每天给予足够的桑叶以及每天及时清除蚕粪，4天后，蚕出现荧光后收获，确立了一种利用家蚕蚕体能有效生产人源胶原蛋白的培养方式。

(8)将蚕体处死，去掉丝腺、中肠以及头前部口器，加入胰蛋白酶抑制剂(购自Biosharp，浓度100ug/ml)，研磨破碎，15000rpm离心10分钟，取上清，通过镍亲和层析柱、分子筛纯化出胶原蛋白II型。

(9)纯化后的蛋白样品冻干浓缩，在96孔板里加入40ul经过0.22nm的微孔滤膜过滤的胶原蛋白样品，在超净台内吹干过夜。阴性组为生理盐水以及超纯水。利用balb/c3T3(ATCC CCL-163)细胞悬液接种到底层铺有类人胶原蛋白膜的培养皿中，培养4h。用MTT法比较各组细胞数，测定胶原蛋白活性。

换言之，本发明提供一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，其特征在于：利用杆状病毒载体表达系统，构建出载体pFBDM-IM-col II和pUCDM-P4Hα-P4Hβ，通过转座的手段，将带有目的基因的片段整合入BmMultiBacNPV基因组中；将携带有外源基因的重组杆状病毒DAP营养缺陷型大肠杆菌SW106菌液直接添加到BmN细胞培养基里，细菌入侵细胞后，因为缺乏必需营养不能自身繁殖而死亡，裂解后病毒基因组被动进入细胞，从而构建出重组病毒BmMNPV-hcol II；利用构建出的重组病毒BmMNPV-hcol II注射感染家蚕幼虫，通过体视荧光显微镜观察红色荧光(即由mCherry表达的荧光蛋白)来判断人源胶原蛋白是否表达。

其中asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106通过在大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵inv基因，缺失asd基因改造获得，其特征在于具有入侵细胞昆虫细胞的功能(即，inv基因的功能)，并在缺失DAP情况下死亡(即，缺失asd基因引起)。关于asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106的改造方法参见Sun，Jingchen et al，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)，57，117-125(Printed in Great Britain)doi：10.1042/BA20100148。

本发明的生产重组人源胶原蛋白II型的方法特征在于利用杆状病毒表达系统表达全长的人源II型胶原蛋白。杆状病毒是有囊膜的dsDNA大形病毒，宿主仅限于无脊椎动物。杆状病毒基因组是大小为80到160kb的单一闭合环状双链DNA分子，其基因组能在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后会组装在杆状病毒壳衣内，壳衣具有较大的柔韧性，可容纳大片段外源DNA的插入，是理想的表达大片段DNA的载体。现阶段多用核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)作为外源基因表达载体的杆状病毒。杆状病毒表达系统相对于其它表达系统具有下述特点：①杆状病毒所表达的重组蛋白具有完整的生物学功能，杆状病毒表达系统可为表达的外源蛋白在细胞内进行二硫键的搭配、正确折叠及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在功能与结构上更加接近天然蛋白。②能进行翻译后的加工修饰。杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括磷酸化、糖基化、磷酸化、信号肽切除、切割和分解等，所修饰的位点与天然蛋白在细胞内的修饰位点完全一样。③能容纳大分子的插入片段。杆状病毒自身毒粒可以扩大，能包装较大的基因片段。④具有同时表达多个基因的能力。杆状病毒表达系统具有在同一细胞内表达多个基因的能力，YAO等所建立的杆状病毒表达系统具有能同时表达10个基因的能力。⑤表达水平高。与其它真核表达系统比较，杆状病毒表达系统能获得高量表达的重组蛋白，最高可使目的蛋白的表达量达到细胞总蛋白的50％。

在本发明的生产人源胶原蛋白II型全长的方法中，其利用家蚕幼虫表达全长的人源II型胶原蛋白。家蚕核型多角体病毒(Bombyx morimulticapsid Polyhedrosis Virus，BmMNPV)是一种带外壳的双链DNA病毒，可以感染多种鳞翅目昆虫，被用作基因表达系统的载体。利用带有外源目的基因的BmMNPV(BmMNPV-hcol II)感染家蚕蚕体表达目的蛋白。

在本发明的生产人源胶原蛋白II型全长的方法中，大肠杆菌宿主菌SW106具有入侵细胞昆虫细胞BmN的功能，并在缺失DAP情况下死亡。目前本实验室在杆状病毒载体表达系统的发展中也取得了一些成果，例如：利用零背景Tn7转座菌株构建重组Bacmid；利用侵染蛋白介导的营养缺陷型的大肠杆菌进行无脂质体转染系统等。(龙虎等，南方医科大学学报，1673-4254(2010)07-1491-05；Sun，Jingchen，et al，，Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.2，pp524-529；Sun，Jingchen et al，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)，57，117-125(Printed in Great Britain)doi：10.1042/BA20100148)。其中，利用侵染蛋白介导的营养缺陷型的大肠杆菌asd缺失型rSW106-inv，直接将细菌加入细胞中感染，细菌中所表达的侵染蛋白会入侵到细胞内，又因为其自身不能合成其细胞壁的主要成分DAP(二氨基庚二酸)，不能继续繁殖而死亡，细菌内的bacmid释放出来，在昆虫细胞内进行转录进而表达组装出杆状病毒。

在本发明的生产人源胶原蛋白II型全长的方法中，构建出的病毒感染细胞后，通过构建入载体的荧光蛋白标签(例如，红色或者绿色的荧光蛋白标签等)作为判定细胞是否感染成功与人源胶原蛋白II型是否表达。其中上述所用的荧光蛋白标签可以选自gfp、yfp、mCherry等。在本发明中，在mCherry荧光蛋白基因开放阅读框前端加入IRES序列(内部核糖体进 入位点)，这样改造的目的是通过IRES的特性提高mCherry的表达量。

利用本发明的方法生产的重组人源胶原蛋白II型具有由3条(G-X-Y)_n重复序列的肽链形成三股螺旋结构，其中X表示Pro，Y表示Hy-Pro或Hy-Lys，n表示多段重复。换言之，利用本发明的方法生产的重组人源胶原蛋白II型保持天然胶原蛋白II型的构象，具有天然胶原蛋白II型的活性。

本研究基于杆状病毒表达系统能够多基因表达，承载大基因片段及高水平表达的优点，通过基因改造实现了重组人源胶原蛋白II型和人源脯氨酸羟化酶的共表达，其中胶原蛋白脯氨酸被羟基化的程度是决定胶原蛋白质量高低的标准，脯氨酸羟化酶与胶原蛋白共表达，能够最大化地使胶原蛋白的脯氨酸被羟基化成羟脯氨酸。而这种技术，只需要一种病毒，即可表达多个基因。基于这种思路，本发明人建立了一种简便、快速和高效的胶原蛋白生产工艺，为其实际应用提供理论基础，因此本发明的工作具有一定的理论和实际意义。

本发明具有以下优点：

(1)本发明采用胶原蛋白II型，表达其全长序列，表达产物具有胶原蛋白特征的三股螺旋结构。

(2)生产的人源胶原蛋白II型全长具有非常好的稳定性与亲水性，其氨基酸序列与天然人源胶原蛋白II型完全相同。应用人体不产生排斥反应与过敏反应，可用于医疗美容领域。

(3)方法简单、操作容易、成本低廉、容易实现规模产业化的优点。

综上所述，本发明提供下述技术方案：

1.一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)获得SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM中构建重组质粒pFBDM-col II；

(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列；

(3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同符合阅读框地连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；

(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染昆虫细胞产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞，进行重组蛋白的表达；并且

(6)收集感染的昆虫细胞的培养液上清，亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活；

其中步骤(5)的昆虫细胞为家蚕细胞BmN或SF9细胞。

2.一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)获得SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM-IM中构建重组质粒pFBDM-col II；

(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列；

(3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；

(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染家蚕细胞BmN，产生杆状病毒，并利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕5龄期幼虫，感染4天后收获在体视荧光显微镜下显现所述荧光蛋白颜色的蚕体的表皮；并且

(6)将步骤(5)的表皮破碎离心收集上清，将表达的重组人源胶原蛋白II型通过亲和纯化，得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活。

3.根据第1或2项所述的方法，其中所述人源胶原蛋白II型α1链全长基因插入载体pFBDM的MCS1中的位点中，并且所述IRES序列和荧光蛋白编码序列插入载体pFBDM的MCS2中的位点中，并且所述IRES序列和荧光蛋白编码序列与人源胶原蛋白II型α1链全长基因是符合阅读框地插入到载体pFBDM中。

4.根据第1或2项所述的方法，其中在步骤(3)中，所述人源脯氨酸羟化酶α亚基序列插入载体pUCDM的MCS1中的位点中，并且所述人源脯氨酸羟化酶β亚基序列可以插入载体pUCDM的MCS2中的位点中。

5.根据第1或2项所述的方法，其中步骤(2)所用的荧光蛋白编码序列编码选自GFP、YFP或mCherry的荧光蛋白。

6.根据第5项所述的方法，其中步骤(2)所用的荧光蛋白编码序列编码mCherry荧光蛋白。

7.根据第1或2项所述的方法，其中asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106通过在大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵inv基因，缺失asd基因改造获得。

8.根据第1项所述的方法，其中步骤(5)中得到的感染成功的家蚕细胞BmN或SF9细胞的培养条件为：商业化Grace培养基成分，PH 6.4，添加浓度为80ug/ml的抗坏血酸盐，温度28℃，静止培养3天。

9.根据第1或2项所述的方法，其中步骤(6)的亲和纯化利用镍柱进行。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1：载体EX-5512-B21双酶切图(Xba I和Avr II)。泳道1：1kb分子量标记，从下至上依次为1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb；泳道2：载体EX-5512-B21双酶切，箭头所示的目标条带为胶原蛋白II型，大小为4635bp。

图2：重组质粒pFBDM-col II双酶切鉴定图。泳道1：1kb分子量标记(同图1)；泳道2：pFBDM-col II双酶切，箭头所示的目标条带为胶原蛋白II型，大小为4635bp。

图3：用本发明的方法制备的胶原II型表达产物PAGE图以及WesternBlot检测图。泳道1：蛋白分子量标记，从上往下分别为97.2、66.4、44.3KD；泳道2：空白对照；泳道3-4：胶原II型BmN细胞蛋白表达，目的蛋白条带如箭头所示；泳道5-6：Western Blot检测条带，目的蛋白条带如箭头所示。

图4：携带红色荧光标签的BmMNPV-hcol II病毒感染细胞的红色荧光图。

图5：胶原蛋白活性测定，分别为0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml用本发明的方法制备的胶原蛋白II型、牛纤连蛋白阳性对照(0.004mg/ml)以及空白阴性对照(生理盐水)处理的细胞的粘连情况。

图6：用本发明的方法制备的胶原蛋白II型的扫描电镜(SEM)观察。

图7：pFBDM质粒图谱(MultiBac Expression System User Manual，2004)。

图8：pUCDM质粒图谱(MultiBac Expression System User Manual，2004)。

序列表说明

具体实施方式

以下结合具体事例详细说明本发明技术方案的实施方式和效果，并非对本发明的限制。

实施例1：重组质粒的获得

根据EX-5512-B31(由GeneCopoeia合成，Accession No.：NM_033150，其ORF序列如SEQ ID No.4所示，其中包含人源胶原蛋白II型全长序列(SEQ ID No.1))的多克隆位点，选择酶切位点Xba I和Avr II对EX-5512-B31进行双酶切，获得所需目的基因，即，人源胶原蛋白II型α1链全长基因(序列如SEQ ID No.1所示)。并合成基因IRES(序列如SEQID No.5所示)与mCherry(序列如SEQ ID No.6所示)。然后，利用XbaI(Xba I和Avr II互为同尾酶)将人源胶原蛋白II型α1链全长基因(序列如SEQ ID No.1所示)连接至转移载体pFBDM(购至深圳市宝珠生物科技有限公司，货号zt323)，构建pFBDM-col II，将合成的IRES以及mCherry共同连接入pFBDM-col II，构建重组质粒pFBDM-IM-col II。

人工合成SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同符合阅读框地连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ。pUCDM载体的信息参见Sun，Jingchen，et al，A High Efficient Method of Constructing RecombinantBombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based onZero-Background Tn7-Mediated Transposition in Escherichia coli，Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.2，pp524-529。

实施例2：重组人源胶原蛋白II型病毒感染BmN构建表达载体病毒

将实施例1构建的重组质粒pFBDM-IM-col II和pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106(本实验室保存改造，改造方法参见Sun，Jingchen et al，Production of recombinant Bombyxmori nucleopolyhedrovirus in silkworm by intrahaemocoelic injection withinvasive diaminopimelate auxotrophic Escherichia coli containingBmNPV-Bacmid，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)57，117-125(Printed inGreat Britain)doi：10.1042/BA20100148)，构建生产人源胶原蛋白II型的重组基因工程菌SW106-pFBDM-col II-IM-pUCDM-P4Hα-P4Hβ。

在LB-Kan-Tet-Spe-Gm-Cm-DAP固体培养基(培养基成分：普通的LB培养基，Kan-Tet-Spe-Gm-Cm-DAP是抗生素以及营养成分，其中包含50ug/ml的卡那霉素(Kan)、10ug/ml四环素(Tet)、50ug/ml壮观霉素(Spe)、30ug/ml庆大霉素(Gm)、170ug/ml氯霉素(Cm)和50mM二氨基庚二酸(DAP))上培养过夜，挑单菌落接种于LB-Kan-Tet-Spe-Gm-Cm-DAP液体培养基(LB液体培养基成分，含有浓度分别为50ug/ml的卡那霉素(Kan)、10ug/ml四环素(Tet)、50ug/ml壮观霉素(Spe)、30ug/ml庆大霉素(Gm)、170ug/ml氯霉素(Cm)和50mM二氨基庚二酸(DAP))中培养10-12h，OD600到0.8，取1ml菌液到1.5ml EP管，3000rpm离心3min，弃上清，用灭菌水重悬菌液，3000rpm离心3min，重复洗3次。吸尽上清液后，加入1ml Grace培养基(购自Gibco)，并用Grace培养基将原始菌液稀释100倍与1000倍。将BmN细胞铺于24孔板中，过夜，用Grace培养基洗细胞3次，将上述稀释100倍与1000倍的重组大肠杆菌菌液加入上述BmN细胞中，28℃孵育4h，吸掉Grace培养基，加入500μl Grace完全培养基。3d后观察荧光，并用Western Blot检测表达产物。

本领域技术人员应该理解，此处，也可以用重组大肠杆菌菌液侵染斜纹夜蛾SF9细胞来表达人源胶原蛋白II型。

实施例3：病毒注射家蚕表达胶原蛋白II型

将实施例2转化成功的重组大肠杆菌在Grace培养基(购自Gibco)中直接感染家蚕细胞BmN(ATCC CRL-8910)，能够产生杆状病毒BmMNPV-hcol II、将所述病毒上清以12000rpm离心1分钟，去除残留的BmN细胞，取上清。用微量注射器将病毒上清注射家蚕5龄期幼虫倒数第二节，每头蚕注射10ul，28℃，湿度60％至70％，饲养4天后，在体视荧光显微镜观察下挑选表皮出现红色荧光(mCherry所致)的家蚕。

实施例4：重组人源胶原蛋白II型的纯化

将实施例3中的出现红色荧光的蚕体处死，去掉丝腺、中肠以及头前部口器，加入100ug/ml胰蛋白酶抑制剂(购自Biosharp)，15000rpm离心10分钟，取上清，加入3倍体积的PB(成分上缺少PBS的氯化钠，纯化的基本溶液)溶液(pH 6.0)。用20mM PB、200mM NaCl(ph 6.0)溶液3ml/min平衡Ni-NTA亲和柱，将表达上清液以1ml/min注入Ni-NTA亲和柱，用20mM PB、200mM NaCl、20mM咪唑洗脱杂蛋白，20mM PB、200mM NaCl、150mM咪唑洗脱蛋白。收集流穿蛋白、20mM咪唑洗脱杂蛋白、150mM咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAGE胶以及Western Blot检测纯化产物。

实施例5：重组人源胶原蛋白II型的测活

(1)胶原蛋白样品铺板过夜

在96孔板里加入40ul经过0.22nm的微孔滤膜过滤的胶原蛋白样品，在超净台内吹干过夜。阳性组为牛纤连蛋白(0.004mg/ml)，阴性组为生理盐水或超纯水。

(2)细胞铺板：

用PBS清洗balb/c3T3细胞(ATCC CCL-163)，然后添加等体积的0.02％EDTA和0.25％的胰酶液进行处理，离心收集细胞；用含10％FBS的1640培养基(购自Gibco)进行重悬，细胞密度控制在1.6×10⁵个/mL；将细胞悬液接种到底层铺有类人胶原蛋白膜的培养皿中，胶原蛋白40ul/孔提前吹干过夜；37℃培养4-5h，维持CO2浓度为5％(必要时根据显微镜观察各组细胞的粘附生长情况，确定培养的具体时间)；用PBS冲洗掉没有粘附的细胞：用100ul PBS沿板壁缓慢加入，再吸去PBS，重新加入100ul含10％FBS的1640，继续培养4h。

(3)用MTT法比较各组细胞数：

将培养4h后的细胞，加入10ul/孔MTT，继续培养2-4h，吸去培养液，加入终止液100ul/孔DMSO，室温放置30min，酶标仪双波长(570、630)下比色。

结果显示(图5)，其中高剂量为0.2mg/ml，中剂量为0.1mg/ml，低剂量为0.05mg/ml，阳性对照为0.004mg/ml的牛纤连蛋白，空白对照为生理盐水。利用本发明的方法制备的重组人源胶原蛋白II型相比空白组有明显的增强细胞粘附，有助于细胞生长的作用。

实施例6：胶原蛋白II型扫描电镜(SEM)观察

样品台上贴上导电胶带，将冻干后的胶原蛋白II型样品，取小量粘于导电胶带上，经过蒸金处理，放置于扫描电镜下进行观察。

结果显示(图6)，利用本发明的方法制备的重组人源胶原蛋白II型具有天然胶原蛋白在SEM下特有的模孔结构。这说明利用本发明的方法制备的重组人源胶原蛋白II型保持天然胶原蛋白II型的构象，具有天然胶原蛋白II型的活性。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (9)

1.一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)获得SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM中构建重组质粒pFBDM-col II；

(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列；

(3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同符合阅读框地连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；

(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染昆虫细胞产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞，进行重组蛋白的表达；并且

(6)收集感染的昆虫细胞的培养液上清，亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活；

其中步骤(5)的昆虫细胞为家蚕细胞BmN或SF9细胞。

2.一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)获得SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM-IM中构建重组质粒pFBDM-col II；

(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列；

(3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-P4Hα-P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；

(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染家蚕细胞BmN，产生杆状病毒，并利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕5龄期幼虫，感染4天后收获在体视荧光显微镜下显现所述荧光蛋白颜色的蚕体的表皮；并且

(6)将步骤(5)的表皮破碎离心收集上清，将表达的重组人源胶原蛋白II型通过亲和纯化，得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述人源胶原蛋白II型α1链全长基因插入载体pFBDM的MCS1中的位点中，并且所述IRES序列和荧光蛋白编码序列插入载体pFBDM的MCS2中的位点中，并且所述IRES序列和荧光蛋白编码序列与人源胶原蛋白II型α1链全长基因是符合阅读框地插入到载体pFBDM中。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(3)中，所述人源脯氨酸羟化酶α亚基序列插入载体pUCDM的MCS1中的位点中，并且所述人源脯氨酸羟化酶β亚基序列插入载体pUCDM的MCS2中的位点中。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)所用的荧光蛋白编码序列编码选自GFP、YFP或mCherry的荧光蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(2)所用的荧光蛋白编码序列编码mCherry荧光蛋白。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106通过在大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵inv基因，缺失asd基因改造获得。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中得到的感染成功的家蚕细胞BmN或SF9细胞的培养条件为：商业化Grace培养基成分，PH6.4，添加浓度为80ug/ml的抗坏血酸盐，温度28℃，静止培养3天。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(6)的亲和纯化利用镍柱进行。