CN111417404A - 重组胶原蛋白和弹性蛋白分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了非天然存在的胶原蛋白和弹性蛋白分子。非天然存在的胶原蛋白和弹性蛋白包括截短的胶原蛋白、截短的弹性蛋白及其融合蛋白。非天然存在的胶原蛋白和弹性蛋白在食品、化妆品和许多其他产品和用途中是有用的。

Description

重组胶原蛋白和弹性蛋白分子及其用途

相关申请的交叉引用以及援引并入

本申请要求于2018年9月27日提交的标题为“RECOMBINANT COLLAGEN ANDELASTIN MOLECULES AND USES THEREOF”的美国专利申请号16/144,914的优先权，该专利申请根据35 USC 119(e)要求于2017年9月28日提交的美国临时专利申请62/564,964和于2018年4月13日提交的美国临时专利申请62/657,591的权益，这两个临时申请标题均为“RECOMBINANT COLLAGEN AND ELASTINMOLECULES AND USES THEREOF”，其公开内容通过引用全文并入本文。

技术领域

本公开内容涉及非天然存在的全长和截短的胶原蛋白分子以及全长和截短的弹性蛋白分子及其用途。

背景技术

胶原蛋白和类似蛋白质是生物圈中最丰富的蛋白质。胶原蛋白和弹性蛋白是在动物的皮肤、结缔组织和骨骼以及其他组织中发现的结构蛋白。在人类中，体内胶原蛋白的含量约为总蛋白质的三分之一，约占皮肤干重的四分之三。弹性蛋白是在结缔组织和其他类型组织中发现的一种高弹性的蛋白质。

胶原蛋白的结构是三螺旋，其中三个多肽链一起形成螺旋形卷曲。单独的多肽链由命名为GLY-X-Y的重复的三联体氨基酸序列组成。X和Y可以是任何氨基酸，而第三个氨基酸是甘氨酸。在胶原蛋白中发现了高浓度的氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。最常见的三联体是脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸(Gly-Pro-Hyp)，约占胶原蛋白三联体的10.5％。

明胶是通过胶原蛋白的部分水解而获得的产物。典型地，明胶是通过酸水解、碱水解和酶水解或通过将胶原蛋白在水溶液中加热(例如，煮沸动物的骨头和皮肤、煮沸鱼鳞等)而产生的。

明胶用于许多产品中，包括化妆品、食品、药品、医疗设备、照相胶片、粘合剂、粘合剂和许多其他产品。明胶的物理和化学性质按特定的应用调整。这些物理/化学性质包括凝胶强度、熔点温度、粘度、颜色、浊度、pH、等电点等。

弹性蛋白是一种弹性的蛋白质，对于动脉、肺、肌腱、韧带、皮肤和其他组织的正常功能至关重要。弹性蛋白向组织提供拉伸并恢复其原始形状的能力。蛋白质原弹性蛋白是弹性蛋白的结构单元。与包含一个基因家族的胶原蛋白相反，人体内只有一个原弹性蛋白基因。当表达时，单个弹性蛋白基因被剪接以产生不同形式的原弹性蛋白。许多原弹性蛋白分子缔合在一起形成弹性蛋白。

L型细菌，或L形式，是衍生自亲本物种(N型)的细菌菌株，其能够作为缺细胞壁的细胞(原生质球类型)或无细胞壁的细胞(原生质体类型)生长。参见Madoff S(Ed):TheBacterial L-Forms.New York:Marcel Dekker Inc.,1986；Mattmann LH(Ed):Cell WallDeficient Forms.Boca Raton:CRC Press；1993；和Gumpert J,Taubeneck U:Characteristic properties and biological significance of stable protoplasttype L-forms.In Protoplasts,Lecture Proceedings of the 6th InternationalProtoplast Symposium:Basel.Experientia 1983,46(suppl):227-241。

原生质体类型的L形式已经在无细胞壁状态下培养，且代表了遗传稳定的突变体，其表现出极端多效性变化，包括无法形成细胞壁、荚膜、鞭毛、菌毛、孢子和间体、改变的菌落和细胞形态、细胞质膜的脂质和蛋白质组分的质和量的变化、细胞外蛋白水解活性的缺乏、对噬菌体的抵抗力以及无法在实验室条件之外增殖的能力。参见Gumpert和Taubeneck(同上)；和Hoischen等人,Lipid and fatty acid composition of cytoplasmicmembranes from Streptomyces hygroscopic and its stable protoplast type L-form.J Bacteriol 1997,179:3430-3436。

发明内容

在一方面，提供了由宿主细胞产生的非天然存在的胶原蛋白。非天然存在的胶原蛋白是水母(水螅)胶原蛋白、人胶原蛋白、Chondrosia reniformis(肾海绵)胶原蛋白或Rhincodon typus(鲸鲨)胶原蛋白。在一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白是全长或截短的胶原蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白被在50个氨基酸到500个氨基酸之间的内部截短所截短。在另一个实施方案中，截短在胶原蛋白多肽的C末端或N末端。非天然存在的胶原蛋白是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:112。

在另一方面，非天然存在的胶原蛋白还包含氨基酸序列，该氨基酸序列包括分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白标签、蛋白酶切割位点、β-内酰胺酶和/或GEK氨基酸三聚体重复和/或GDK氨基酸三聚体重复。当非天然存在的胶原蛋白包含甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复时，GEK和/或GDK三聚体重复的数目范围可以是从2至50个三聚体重复。在一方面，分泌标签是DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA或杂交分泌标签，该杂交分泌标签包含与第二分泌标签的一部分融合的一个分泌标签的一部分。示例性分泌标签是DsbA。

在一方面，提供了包含在0.005％到30％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白的组合物。该组合物还可以包含至少一种另外的成分，该另外的成分包括局部用载体或防腐剂。

在一方面，包含非天然存在的胶原蛋白的组合物是应用于皮肤的局部用组合物。该局部用组合物用于减少皮肤损伤或促进受损皮肤的修复。

在一方面提供了用于减少皮肤损伤或促进受损皮肤的修复的方法。该方法包括将包含弹性蛋白的组合物应用于受试者的皮肤。该方法增加受试者皮肤的成纤维细胞或角质形成细胞的活力。在另一方面，该组合物的应用增加受试者皮肤的成纤维细胞对前胶原的合成。在另一方面，该组合物的局部应用保护皮肤或角质形成细胞免受UV伤害。在另一个实施方案中，本文公开的胶原蛋白或弹性蛋白减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。

本文提供的另一方面是增加皮肤细胞活力的方法。该方法包括将胶原蛋白或弹性蛋白分子应用于皮肤或皮肤细胞。所提供的胶原蛋白或弹性蛋白增加角质形成细胞和/或成纤维细胞在暴露于UV辐射、城市灰尘或其他有害刺激时的活力。

本文提供的另一方面是用于减少皮肤细胞中炎性细胞因子产生的方法。在一个实施方案中，皮肤细胞是角质形成细胞。该方法包括将胶原蛋白或弹性蛋白分子应用于皮肤细胞。炎性细胞因子的产生包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-18和IL-1RA。

在另一方面，提供了保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法。该方法包括将本文公开的胶原蛋白或弹性蛋白应用于皮肤细胞的步骤。皮肤细胞向胶原蛋白或弹性蛋白的暴露增加皮肤细胞的活力。在一个实施方案中，皮肤细胞是角质形成细胞或成纤维细胞。

在一方面，提供了由宿主细胞产生的非天然存在的弹性蛋白。非天然存在的弹性蛋白是水母弹性蛋白、人弹性蛋白、Chondrosia reniformis(肾海绵)弹性蛋白或Rhincodon typus弹性蛋白。在一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白是全长或截短的弹性蛋白。在一个实施方案中，弹性蛋白被在50个氨基酸到500个氨基酸之间的内部截短所截短。在另一个实施方案中，截短在弹性蛋白多肽的C末端或N末端。该非天然存在的弹性蛋白是SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:110。

在另一方面，非天然存在的弹性蛋白还包含氨基酸序列，该氨基酸序列包括分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白标签、蛋白酶切割位点、β-内酰胺酶和/或GEK氨基酸三聚体重复和/或GDK氨基酸三聚体重复。当非天然存在的胶原蛋白包含甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复时，GEK和/或GDK三聚体重复的数目范围可以是从2至50个三聚体重复。在一方面，分泌标签是DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA或杂交分泌标签，该杂交分泌标签包含与第二分泌标签的一部分融合的一个分泌标签的一部分。示例性的分泌标签是DsbA。

在另一个实施方案中，提供了包含在0.005％到30％w/w之间的非天然存在的弹性蛋白的组合物。该组合物还可以包含至少一种另外的成分，该另外的成分包括局部用载体或防腐剂。

在一方面，包含非天然存在的弹性蛋白的组合物是应用于皮肤的局部用组合物。该局部用组合物用于减少皮肤损伤或促进受损皮肤的修复。

一个实施方案提供了用于减少皮肤损伤或促进受损皮肤的修复的方法。该方法包括将包含弹性蛋白的组合物应用于受试者的皮肤。该方法增加受试者皮肤的成纤维细胞的活力。在另一方面，该组合物的应用增加受试者皮肤的成纤维细胞对前胶原的合成。在另一方面，该组合物的局部应用保护皮肤或角质形成细胞免受UV伤害。在另一个实施方案中，本文公开的胶原蛋白或弹性蛋白减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。

另一个实施方案提供了编码非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白的多核苷酸。该多核苷酸编码来自水母、人、Chondrosia reniformis(肾海绵)或Rhincodontypus的胶原蛋白或弹性蛋白。编码的胶原蛋白或弹性蛋白可以是全长或截短的。在一个实施方案中，胶原蛋白或弹性蛋白被在50个氨基酸到500个氨基酸之间的内部截短所截短。

在一个实施方案中，提供了编码融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包含与胶原蛋白或弹性蛋白一起的分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白标签、蛋白酶切割位点、β-内酰胺酶和/或GEK氨基酸三聚体重复和/或GDK氨基酸三聚体重复。非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白可以包含甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复，GEK和/或GDK三聚体重复的数目范围可以是从2至50个三聚体重复。在一方面，分泌标签是DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA或杂交分泌标签，该杂交分泌标签包含与第二分泌标签的一部分融合的一个分泌标签的一部分。示例性实施方案分泌标签是DsbA。

多核苷酸和载体可用于转化宿主细胞并表达多核苷酸。提供了编码非天然存在的胶原的多核苷酸，其中该多核苷酸为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:105。提供了编码非天然存在的弹性蛋白的多核苷酸，其中该多核苷酸为SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:99或SEQID NO:101。

公开了表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何宿主细胞，包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和用于表达外源多核苷酸的任何其他细胞。

提供了细菌宿主细胞，其中该细胞已经被修饰以抑制细胞分裂并且周质空间增加。示例性宿主细胞是大肠杆菌(E.col i)。

一个实施方案提供了一种产生非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白的方法。该方法包括以下步骤：用包含编码胶原蛋白或弹性蛋白的多核苷酸的重组宿主细胞接种培养基，培养宿主细胞，以及从宿主细胞分离非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白。

附图说明

图1描绘了经转换细胞与未转换细胞之间的生理状态差异。A)未转换大肠杆菌细胞。B)与图A相同但是经历了生理转换的大肠杆菌种群。C)含有胞质RFP和周质GFP的经转换大肠杆菌细胞的相差。D)图C中的细胞的荧光成像说明了靶向蛋白质定位。

图2描绘了经转换细胞中增强的蛋白质产生。A-B)用于T7可诱导蛋白产生的靶蛋白是在大肠杆菌BL21中产生的周质表达的GFP。使用相同的细胞种群并在OD 1.1下诱导。A)蛋白梯(泳道1)，IPTG诱导的蛋白质产生(泳道2)，具有生理转换的IPTG诱导的蛋白质产生(泳道3)。B)细胞GFP诱导的培养物的两个小瓶，其中仅有IPTG的在左侧，有IPTG+转换的在右侧。C)使用经转换细胞的22kDa胶原蛋白的表达，其显示了蛋白梯(泳道1)，蛋白质产生后的上清液(泳道2)，细胞沉淀(泳道3)。

图3描绘了大肠杆菌细胞随时间转换的时移图像。图4示出了经历生理转换的其他生物体。A)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的正常生理学。B)根癌农杆菌经转换的生理学。C)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1的正常生理学。D)铜绿假单胞菌PAO1经转换的生理学。E)缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)的正常生理学。F)缺陷短波单胞菌经转换的生理学。G)根癌农杆菌的正常生理学。H)根癌农杆菌经转换的生理学。

图4示出了经历生理转换的其他生物体。A)根癌农杆菌的正常生理学。B)根癌农杆菌经转换的生理学。C)铜绿假单胞菌PAO1的正常生理学。D)铜绿假单胞菌PAO1经转换的生理学。E)缺陷短波单胞菌的正常生理学。F)缺陷短波单胞菌经转换的生理学。G)根癌农杆菌的正常生理学。H)根癌农杆菌经转换的生理学。

图5示出了通过用截短的胶原蛋白处理人角质形成细胞，TT二聚体形成的减少。

具体实施方式

在下面的描述中，阐述了某些具体细节以便提供对本公开内容的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开内容。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

术语“由……组成”是指“包括且限于”。

术语“基本上由……组成”是指，组合物、方法或结构可以包括其他成分、步骤和/或部分，但前提是所述其他成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖性。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，可以以范围格式来呈现本公开内容的各种实施方案。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开内容的范围的刻板限制。因此，应该认为范围的描述已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应视为已具体公开了诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等的子范围，以及该范围内的各个数字，例如，1、2、3、4、5和6。这适用于任何范围宽度。

每当在本文中指示数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数值(分数或整数)。短语“在”第一指示数字与第二指示数字“之间”的范围和“从”第一指示数字“至”第二指示数字的范围在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字及其之间的所有分数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于对化学、药理、生物、生化和医学领域的从业者而言已知的那些方式、手段、技术和过程，或化学、药理、生物、生化和医学领域的从业者容易从已知方式、手段、技术和过程开发出的那些方式、手段、技术和过程。

如本文所用，术语“胶原蛋白”或“类胶原蛋白”是指可以与一种或多种胶原蛋白或类胶原蛋白多肽缔合以形成四级结构的单体多肽。胶原蛋白可用酸、碱或热处理以制备明胶。天然胶原蛋白的四级结构是三螺旋，其通常由三个多肽组成。在形成天然胶原蛋白的三个多肽中，通常有两个是相同的，并被称为α链。第三个多肽被称为β链。因此，典型的天然胶原蛋白可以称为AAB，其中该胶原蛋白由两条α(“A”)链和一条β(“B”)链组成。如本文所用，术语“前胶原”是指可以被加工成天然存在的胶原蛋白的由细胞产生的多肽。

如本文所用，术语“弹性蛋白”是指弹性的并且具有拉伸或收缩并恢复其原始形状的功能的多肽。弹性蛋白天然存在于结缔组织中。

如本文所用，术语“表达载体”或“载体”是指能够指导外源基因表达的核酸装配体。表达载体可以包含可操作地连接至外源基因、限制性核酸内切酶位点、编码一种或多种选择标记的核酸以及可用于重组技术实践的其他核酸的启动子。

如本文所用，术语“成纤维细胞”是指合成前胶原和其他结构蛋白的细胞。成纤维细胞广泛分布在体内，并存在于皮肤、结缔组织和其他组织中。

术语“荧光蛋白”是在基因工程技术中常用的用作外源多核苷酸表达的报道分子的蛋白质。该蛋白质当暴露在紫外线或蓝光下时发荧光并发出明亮的可见光。发出绿光的蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)，而发出红光的蛋白质是红色荧光蛋白(RFP)。

如本文所用，术语“明胶”是指已经通过暴露于酸、碱或热而被进一步加工的胶原蛋白。不希望受到理论或机理的束缚，但是认为用酸、碱或热处理胶原蛋白使胶原蛋白多肽变性。变性胶原蛋白的水溶液形成用于食品、化妆品、药品、工业产品、医疗产品、实验室培养物生长培养基和许多其他应用的可逆性凝胶。

如本文所用，术语“基因”是指编码特定蛋白质的多核苷酸，其可以单独指代编码区或可以包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。

术语“组氨酸标签”是重组多肽上的一串连续的2-30个组氨酸残基。

术语“宿主细胞”是经工程化以表达导入的外源多核苷酸的细胞。

术语“角质形成细胞”是产生在皮肤的表皮层中发现的角蛋白的细胞。

如本文所用，术语“内酰胺酶”是指水解含有内酰胺(环酰胺)部分的抗生素的酶。“Beta-内酰胺酶”或“β-内酰胺酶”是水解含有β-内酰胺部分的抗生素的酶。

如本文所用，术语“非天然存在的”是指通常在自然界中不存在的胶原蛋白或弹性蛋白。重组制备非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白是重组胶原蛋白或重组弹性蛋白。在一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白是截短的胶原蛋白。其他非天然存在的胶原蛋白多肽包括嵌合胶原蛋白。嵌合胶原蛋白是其中胶原蛋白多肽的一部分与第二胶原蛋白多肽的一部分邻接的多肽。例如，包含水母胶原蛋白的一部分与人胶原蛋白的一部分邻接的胶原蛋白分子是嵌合胶原蛋白。在另一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白包含融合多肽，该融合多肽包含另外的氨基酸，诸如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点、GEK重复、GDK重复和/或β-内酰胺酶。在一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白是截短的弹性蛋白。其他非天然存在的弹性蛋白多肽包括嵌合弹性蛋白。嵌合弹性蛋白是其中弹性蛋白多肽的一部分与第二弹性蛋白多肽的一部分邻接的多肽。例如，包含水母弹性蛋白的一部分与人弹性蛋白的一部分邻接的胶原蛋白分子是嵌合弹性蛋白。在另一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白包含融合多肽，该融合多肽包含另外的氨基酸，诸如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点和/或β-内酰胺酶。嵌合明胶或嵌合弹性蛋白可包含另外的氨基酸，诸如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点、GEK重复、GDK重复和/或β-内酰胺酶。

术语“蛋白酶切割位点”是被特定的蛋白酶切割的氨基酸序列。

术语“分泌标签”或“信号肽”是指募集宿主细胞的细胞机器以将表达的蛋白质转运至宿主细胞的特定位置或细胞器的氨基酸序列。

术语“截短的胶原蛋白”是指小于全长胶原蛋白的单体多肽，其中全长胶原蛋白的一个或多个部分不存在。胶原蛋白多肽在C末端或N末端被截短，或者通过去除全长胶原蛋白多肽的内部部分被截短。

术语“截短的弹性蛋白”是指小于全长弹性蛋白的单体多肽，其中全长弹性蛋白的一个或多个部分不存在。弹性蛋白多肽在C末端或N末端被截短，或者通过去除全长弹性蛋白多肽的内部部分被截短。

在通过引用并入的共同所有的申请PCT/US17/24857中公开了一种使用修饰的细菌细胞(经转换细胞)的表达系统，其中细胞分裂受到抑制，并且周质空间的生长大大增强。在该表达系统中，表达的蛋白质靶向周质空间。与非转换细胞相比，这些经转换细胞中重组蛋白的产生显著增加。在结构上，该细胞包括内膜和外膜，但缺少功能性肽聚糖细胞壁，同时细胞形状为球形，且体积随时间增加。值得注意的是，虽然周质空间通常仅占总细胞体积的10-20％，但本文所述的转换状态的周质区室可占总细胞体积的超过20％、30％、40％或50％以及高达60％、70％、80％或90％。

PCT/US17/24857的修饰的细菌细胞衍生自革兰氏阴性细菌，例如选自：γ-变形菌和α-变形菌。在一些实施方案中，该细菌选自：大肠杆菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、根癌农杆菌和缺陷短波单胞菌。在特定的实施方案中，该细菌是大肠杆菌，例如BL21(DE3)菌株。

在另一方面，宿主细菌细胞在包含镁盐的培养基中具有增大的周质空间，其中培养基中镁离子的浓度为至少约3、4、5或6mM。在进一步的实施方案中，培养基中镁离子的浓度为至少约7、8、9或10mM。在一些实施方案中，培养基中镁离子的浓度在约5mM至25mM之间、约6mM和/或约20、15或10mM之间。在一些实施方案中，镁盐选自：硫酸镁和氯化镁。

在其他实施方案中，培养基还包含渗透压稳定剂，包括，例如，糖(例如，阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、山梨糖醇、甘露醇、果糖、半乳糖、三氯蔗糖、麦芽三糖赤藓糖醇、核糖醇、季戊四醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、木糖醇、艾杜糖醇、麦芽三糖等)、甜菜碱(例如，三甲基甘氨酸)、脯氨酸、氯化钠，其中培养基中渗透压稳定剂的浓度为至少约4％、5％、6％或7％(w/v)。在进一步的实施方案中，渗透压稳定剂的浓度为至少约8％、9％或10％(w/v)。在一些实施方案中，培养基中渗透压稳定剂的浓度在约5％至约20％(w/v)之间。

在一些实施方案中，细胞培养物可进一步包含氯化铵、硫酸铵、氯化钙、氨基酸、硫酸亚铁(II)、硫酸镁、蛋白胨、磷酸钾、氯化钠、磷酸钠和酵母提取物。

宿主细菌细胞的培养可以连续或不连续；为分批过程、补料分批过程或重复补料分批过程。

在一些实施方案中，抗生素选自：β-内酰胺抗生素(例如青霉素、头孢菌素、碳青霉烯和单环内酰胺)、膦酸抗生素、多肽抗生素和糖肽抗生素。在特定的实施方案中，抗生素选自阿拉磷、阿莫西林、氨苄西林、氨曲南、杆菌肽、羧苄青霉素、头孢孟多、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢噻吩、膦胺霉素、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素g、青霉素v、磷霉素、primaxin和万古霉素。

在不受理论束缚的情况下，促进重组蛋白产生并抑制细胞分裂的细胞形态似乎是由在上述培养基条件下去除细胞壁所驱动的。在一些实施方案中，去除/抑制细胞壁合成的方法可以通过使用抑制肽聚糖合成的抗生素(诸如氨苄西林、羧苄青霉素、青霉素或磷霉素)，或本领域已知的其他方法来进行。

当具有合适的周质靶向信号序列时，重组产生的多肽可被分泌到细菌细胞的周质空间中。Joly,J.C.和Laird,M.W.,in The Periplasm ed.Ehrmann,M.,ASM Press,Washington D.C.,(2007)345-360。在周质的化学氧化环境中，有利于二硫键的形成，从而有利于多肽的功能正确的折叠。

通常，信号序列可以是表达载体的组分，或者可以是插入载体中的外源基因的一部分。所选的信号序列应该是被宿主细胞识别和加工的序列(即被信号肽酶切割)。对于不识别和加工外源基因的天然信号序列的细菌宿主细胞，该信号序列被任何众所周知的细菌信号序列取代。在一些实施方案中，可以使用DsbA信号序列将重组产生的多肽靶向周质空间。Dinh和Bernhardt,J Bacteriol,Sept.2011,4984-4987。

在一方面，提供了由宿主细胞产生的非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白是水母胶原蛋白或弹性蛋白、人胶原蛋白或弹性蛋白或Chondrosia reniformis(肾海绵)胶原蛋白或弹性蛋白或Rhincodon typus胶原蛋白或弹性蛋白。非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白是截短的胶原蛋白。该截短是内部截短、在胶原蛋白或弹性蛋白的N末端部分处的截短或在胶原蛋白或弹性蛋白的C末端部分处的截短。胶原蛋白或弹性蛋白被在50个氨基酸到1000个氨基酸之间、50个氨基酸到950个氨基酸之间、50个氨基酸到900个氨基酸之间、50个氨基酸到850个氨基酸之间、50个氨基酸到800个氨基酸之间、50个氨基酸到750个氨基酸之间、50个氨基酸到700个氨基酸之间、50个氨基酸到650个氨基酸之间、50个氨基酸到600个氨基酸之间、50个氨基酸到550个氨基酸之间、50个氨基酸到500个氨基酸之间、50个氨基酸到450个氨基酸之间、50个氨基酸到400个氨基酸之间、50个氨基酸到350个氨基酸之间、50个氨基酸到300个氨基酸之间、50个氨基酸到250个氨基酸之间、50个氨基酸到200个氨基酸之间、50个氨基酸到150个氨基酸之间或50个氨基酸到100个氨基酸之间的截短所截短。在另一个实施方案中，胶原蛋白或弹性蛋白被截短50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个氨基酸。非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白由本文公开的多核苷酸序列的一部分或整个多核苷酸序列编码。

非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白还包含含有分泌标签的氨基酸序列。分泌标签将胶原蛋白或弹性蛋白导向宿主细胞的周质空间。在特定实施方案中，信号肽衍生自DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA或杂交分泌标签，该杂交分泌标签包含与第二分泌标签的一部分融合的一个分泌标签的一部分。在一方面，分泌标签附接至非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。在另一方面，将分泌标签从非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白切割。

非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白还包含组氨酸标签。组氨酸标签或多组氨酸标签是附接至胶原蛋白或弹性蛋白的2至20个组氨酸残基的序列。组氨酸标签包含2至20个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至18个组氨酸残基、5至16个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至14个组氨酸残基、5至13个组氨酸残基、5至12个组氨酸残基、5至11个组氨酸残基、5至10个组氨酸残基、6至12个组氨酸残基、6至11个组氨酸残基或7至10个组氨酸残基。组氨酸标签可用于通过使用基于镍的色谱介质的色谱方法来纯化蛋白质。示例性的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。荧光蛋白是本领域众所周知的。在一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白包含GFP和/或RFP。在一个实施方案中，超折叠GFP与非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白融合。超折叠GFP是即使与弱折叠多肽融合也能正确折叠的GFP。在一方面，组氨酸标签附接至非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。在另一方面，将组氨酸标签从非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白切割。

非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白还包含蛋白酶切割位点。蛋白酶切割位点可用于切割重组产生的胶原蛋白或弹性蛋白以去除多肽的部分。多肽的可被去除的部分包括分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白标签和/或β-内酰胺酶。蛋白酶包括内切蛋白酶、外切蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。示例性的蛋白酶切割位点包括被凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、肠肽酶和鼻病毒3C蛋白酶切割的氨基酸。在一方面，切割标签附接至非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。在另一方面，通过适当的蛋白酶从非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白去除切割标签。

非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白还包含作为β-内酰胺酶的酶。β-内酰胺酶可用作选择标记。在一方面，β-内酰胺酶附接至非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。在另一方面，将β-内酰胺酶从非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白切割。

非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白还包含GEK氨基酸三聚体重复和/或GDK氨基酸三聚体重复。GEK和GDK三聚体重复有助于胶原蛋白和/或明胶的胶凝。在一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白包含2-50个GEK和/或2-50个GDK三聚体重复、2-40个GEK和/或2-40个GDK三聚体重复、2-30个GEK和/或2-30个GDK三聚体重复、2-20个GEK和/或2-20个GDK三聚体重复、2-15个GEK和/或2-15个GDK三聚体重复、2-10个GEK和/或2-10个GDK三聚体重复、2-9个GEK和/或2-9个GDK三聚体重复、2-8个GEK和/或2-8个GDK三聚体重复、2-7个GEK和/或2-7个GDK三聚体重复、2-6个GEK和/或2-6个GDK三聚体重复、2-5个GEK和/或2-5个GDK三聚体重复或2-4个GEK和/或2-4个GDK三聚体重复。在一方面，GEK三聚体重复或GDK三聚体重复附接至非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白。在另一方面，GEK三聚体重复或GDK三聚体重复从非天然存在的胶原蛋白或弹性蛋白切割。

本文提供了包含在0.005％到30％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白的组合物。该组合物包含在0.005％到20％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白、在0.005％到10％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白、在0.005％到5％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白、在0.005％到2％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白、在0.005％到1％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白、在0.005％到0.5％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白，以及在0.005％到0.2％w/w之间的非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白。

包含在非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白的组合物是个人护理产品。在一些实施方案中，将组合物配制用于局部施用。该组合物可以包含其他适合人使用的化妆品成分。该个人护理产品可用于预防或治疗紫外线辐射对人体皮肤或头发的伤害。该个人护理产品适用于皮肤或头发。该组合物包括，例如，面膜、皮肤清洁剂如肥皂、清洁膏、清洁乳液、清洁乳、洁面扑、洁面乳、洗发水、护发素和沐浴露。

包含非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白的组合物还可以包含至少一种另外的成分，该另外的成分包括局部用载体或防腐剂。局部用载体包括选自脂质体、可生物降解的微胶囊、乳液、喷雾、气溶胶、粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅油、环戊硅氧烷和水的局部用载体。防腐剂包括选自生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基二环噁唑烷、羟苯甲酯、山梨酸、GermabenII、迷迭香提取物和EDTA的防腐剂。

提供了减少皮肤损害、促进受损皮肤的修复、保护皮肤免受UV损害、保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法。该方法包括将包含非天然存在的胶原蛋白和/或非天然存在的弹性蛋白的组合物应用于受试者的皮肤的步骤。不受特定理论或机制的束缚，组合物中的胶原蛋白和/或弹性蛋白通过保护免受UV损害来减少皮肤损害，并且/或者通过当施用于皮肤时增加细胞的活力和/或增加前胶原的合成来促进受损皮肤的修复，并且/或者促进皮肤细胞的活力。在一方面，胶原蛋白和弹性蛋白减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。

在一方面提供了编码非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白的多核苷酸。该多核苷酸编码来自水母、人、Chondrosia reniformis(肾海绵)或Rhincodon typus的胶原蛋白或弹性蛋白。该多核苷酸编码全长或截短的胶原蛋白或弹性蛋白。

另一个方面提供了编码胶原蛋白或弹性蛋白融合蛋白的多核苷酸。弹性蛋白或胶原蛋白融合蛋白包含与胶原蛋白或弹性蛋白一起的分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白标签、蛋白酶切割位点、β-内酰胺酶和/或GEK氨基酸三聚体重复和/或GDK氨基酸三聚体重复。

在一方面，多核苷酸是用于转化宿主细胞并表达该多核苷酸的载体。多核苷酸还包含编码允许宿主生物体在选择剂存在下生长的酶的核酸。选择剂包括某些糖，包括含半乳糖的糖，或抗生素，包括氨苄西林、潮霉素、G418等。用于赋予选择剂抗性的酶包括β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。

在在一方面，提供了表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何宿主细胞，包括革兰氏阴性细菌细胞、革兰氏阳性细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或用于表达外源多核苷酸的任何其他细胞。示例性的革兰氏阴性宿主细胞是大肠杆菌。

教导了细菌宿主细胞，其中该细胞已经被修饰以抑制细胞分裂并且周质空间增加。如本文所讨论和在实施例1中所教导的，β-内酰胺抗生素可用作将野生型细菌细胞转化为经修饰细菌细胞的转换剂，该经修饰细菌细胞中的细胞复制受到抑制并且周质空间增加。示例性的β-内酰胺抗生素包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯和单环内酰胺。

在包含某些盐和其他营养物的培养基中培养细菌的转换形式(L形式)。已测试的支持生理转换生理学的盐和培养基组合物为M63盐培养基、M9盐培养基、PYE培养基和Luria-Bertani(LB)培养基。除碳、氮和无机磷酸盐源外，还可以包含单独或作为与其他补充剂或培养基(诸如复杂氮源)的混合物引入的适当浓度的任何必要的补充剂。在某些实施方案中，培养基还包含一种或多种选自以下的成分：氯化铵、硫酸铵、氯化钙、酪蛋白氨基酸、硫酸亚铁(II)、硫酸镁、蛋白胨、磷酸钾、氯化钠、磷酸钠和酵母提取物。

β-内酰胺酶是赋予原核细胞以内酰胺抗生素抗性的酶。通常，当β-内酰胺酶在细菌宿主细胞中表达时，所表达的β-内酰胺酶蛋白还包含将β-内酰胺酶蛋白导向周质空间的靶向序列(分泌标签)。除非将β-内酰胺酶转运到周质空间，否则它们不具有功能。提供了不使用将酶靶向周质空间的独立分泌标签即可靶向周质的β-内酰胺酶。通过创建其中在蛋白质(诸如GFP、胶原蛋白或GFP/胶原蛋白嵌合体)的N末端添加了周质分泌标签的融合蛋白，缺少天然分泌标签的β-内酰胺酶的功能可用于选择N末端融合蛋白的完整翻译和分泌。使用这种方法，我们已使用DsbA-GFP-胶原蛋白-β-内酰胺酶融合物在靶胶原蛋白中选择有利于翻译和分泌的截短产物。

另一个实施方案提供了产生非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白的方法。该方法包括以下步骤：用包含编码胶原蛋白或弹性蛋白的多核苷酸的重组宿主细胞接种培养基，培养宿主细胞，以及从宿主细胞分离非天然存在的胶原蛋白或非天然存在的弹性蛋白。

提供了一种发酵制备蛋白质的工艺。该工艺包括以下步骤：

a)在包含镁盐的培养基中培养重组革兰氏阴性细菌细胞，其中培养基中镁离子的浓度为至少约6mM，并且其中细菌细胞包含编码该蛋白质的外源基因；

b)向培养基添加抗生素，其中该抗生素抑制细菌细胞中肽聚糖的生物发生；和

c)从培养基收获蛋白质。

细菌可以例如如WO 05/021772中所述地连续培养，或以分批过程(分批培养)或以补料分批过程或重复补料分批过程不连续地培养，以用于产生靶蛋白的目的。在一些实施方案中，蛋白质产生是大规模进行的。多种大规模发酵程序可用于重组蛋白的产生。大规模发酵具有至少1,000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮分配氧气和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳/能量源)。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约20升的发酵罐中的发酵。

为了积累靶蛋白，在足以积累靶蛋白的条件下培养宿主细胞。这样的条件包括，例如，温度、营养物和允许由细胞来表达和积累蛋白质的细胞密度条件。此外，如本领域技术人员所知，这些条件是在其之下细胞可以执行转录、翻译以及对于分泌的蛋白质将蛋白质从一个细胞区室送至另一个细胞区室的基本细胞功能的那些条件。

在合适的温度下培养细菌细胞。例如，对于大肠杆菌的生长，典型温度范围为约20℃至约39℃。在一个实施方案中，温度为约20℃至约37℃。在另一个实施方案中，温度为约30℃。在一个实施方案中，在一个温度下培养处于非转换状态或转换状态的宿主细胞，并转换至另一温度以诱导蛋白质产生。首先在一个温度下培养宿主细胞以繁殖细胞，然后为了诱导蛋白质产生，在较低温度下培养细胞。第一温度为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃C。第二温度为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。在第二温度下的培养进行1小时到100小时、5小时到90小时、5小时到80小时、5小时到70小时、10小时到70小时、15小时到70小时、15小时到65小时、15小时到60小时、20小时到60小时、20小时到55小时、20小时到50小时、24小时到50小时、24小时到48小时、30小时到50小时、30小时到45小时或30小时到40小时。

培养基的pH可以是约5-9的任何pH，主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH为约6.8至约7.4，或约7.0。

为了诱导基因表达，通常将细胞培养直至达到一定的光密度，例如，OD 600为约1.1，在此时开始诱导(例如，通过添加诱导剂、通过耗尽阻遏物、抑制因子或培养基组分等)以诱导编码靶蛋白的外源基因的表达。在一些实施方案中，外源基因的表达可通过选自例如异丙基-β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、四环素、脱水四环素、vavlycin、木糖、铜、锌等的诱导剂诱导。基因表达的诱导还可以通过降低发酵过程中的溶解氧水平来实现。细胞繁殖过程中发酵的溶解氧水平在10％到30％之间。为了诱导基因表达，将溶解氧水平降低至低于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％。在宿主细胞中，无论是处于生理状态还是处于转换状态，都可以如本文所公开的，通过降低发酵温度来诱导蛋白质产生。

在产物积累之后，将细胞涡旋并离心以诱导裂解和重组蛋白的释放。大多数蛋白质在上清液中找到，但任何残留的膜结合蛋白都可以使用去污剂(诸如triton X-100)释放。

在随后的步骤中，以使细胞碎片与产物的共回收最小化的方式回收作为从细胞基质释放的可溶或不溶产物的靶蛋白。可以通过任何方式进行回收，但是在一个实施方案中，回收可以包括通过镍柱的组氨酸标签纯化。参见，例如，Purification of Proteins UsingPolyhistidine Affinity Tags,Methods Enzymology.2000；326:245-254。

实施例

实施例1：表达系统

材料和方法：

菌株：

测试的生理转换和蛋白质产生：

大肠杆菌BL21(DE3)-来自NEB，产品#c2527

大肠杆菌K12NCM3722-来自The Coli Genetic Stock Center，CGSC#12355

测试的生理转换：

γ-变形菌：

需钠弧菌(Vibrio natriegens)-来自ATCC，产品#14048

荧光假单胞菌-来自ATCC，产品#31948

铜绿假单胞菌PAO1-来自ATCC，产品#BAA-47

α-变形菌：

新月柄杆菌-来自ATCC，产品#19089

根癌农杆菌/放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)-来自ATCC，产品#33970

缺陷短波单胞菌-来自ATCC，产品#13184

培养基组合物：

1升5x m63盐：

10g(NH4)2SO4-来自P212121，产品#7783-20-2

68g KH2PO4-来自P212121，产品#7778-77-0

2.5mg FeSO4.7H2O-来自Sigma Aldrich，产品#F7002

用milliQ水将体积升至1升

用KOH(来自P212121，产品#1310-58-3)调节至pH 7

将混合物高压灭菌

1升1M mgSO4：

246.5g MgSO4 7H2O-来自P212121，(Sigma Aldrich，产品#10034-99-8)

用milliQ水将体积升至1升。

将混合物高压灭菌。

1升转换培养基1：

133.4mL 5X m63盐

10mL lM MgSO4

38.6g葡萄糖-来自P212121，产品#50-99-7

66.6g蔗糖-来自P212121，产品#57-50-1

8.33g LB混合物-来自P212121，产品#lb-miller

用milliQ水将体积升至1升。

混合物通过0.22μM孔真空过滤器(Sigma Aldrich，产品#CLS430517)过滤消毒。

1升转换培养基2：

133.4mL 5X m63盐

10mL lM MgSO4

38.6g葡萄糖-来自P212121，产品#50-99-7

66.6g蔗糖-来自P212121，产品#57-50-1

10g酵母提取物-来自FisherSci.com，产品#J60287A1

用milliQ水将体积升至1升。

混合物通过0.22μM孔真空过滤器(Sigma Aldrich，产品#CLS430517)过滤消毒。

用于生物反应器生长：

5升生物反应器培养基MGZ12：

1)将1L在DI水中500g/L浓度的葡萄糖高压灭菌。(VWR，产品#97061-170)。

2)将1L在DI水中500g/L浓度的蔗糖高压灭菌。(Geneseesci.com，产品#62-112)。

3)在3946mL DI水中高压灭菌：

20g(NH4)2HPO4。(VWR，产品#97061-932)。

66.5g KH2PO4。(VWR，产品#97062-348)。

22.5g H3C6H5O7。(VWR，产品#BDH9228-2.5KG)。

2.95g MgSO4.7H2O。(VWR，产品#97062-134)。

10mL痕量金属(Teknova)，1000x。(Teknova，产品#T1001)。

高压灭菌后，向(3)中添加400mL(1)，向(3)中添加65mL 10M NaOH(VWR，产品#97064-480)，向(3)中添加666mL(2)。

根据需要，可以在发酵过程中使用500g/L的葡萄糖进料。

在诱导时添加：

50mL的1M MgSO4.7H2O至5L生物反应器

1至10mM浓度的IPTG。(carbosynth.com，产品#EI05931)。

加入磷霉素(50μg/mL或更高)和羧苄青霉素(100μg/mL或更高)。

生理转换：

最佳地，在OD 600为1至1.1时使生理转换发生，用于使大肠杆菌在摇瓶中以高达1L的体积生长。对于其他测试的物种，培养物在转换培养基中生长，并且一旦培养物达到最大OD 600则进行继代培养。在所有情况下，通过添加100-200ug/mL羧苄青霉素(来自P212121，产品#4800-94-6)和50-100ug/mL磷霉素(来自P212121，产品#26016-99-9)来使生理转换发生。大部分种群在几个小时内处于转换状态。为了确认细胞经过生理转换，在具有完美聚焦系统、Nikon CFI60 Plan Apo 100X NA 1.45物镜、Prior自动滤光轮和载物台、LED-CFP/YFP/mCherry和LED-DA/FI/TX滤镜套件(Semrock)、Lumencor Sola II SE LED照明系统和Hamamatsu Flash 4.0 V2 CMOS相机的尼康Ti-E上将细胞成像。

生理转换的图像分析：

使用ImageJ分析图像以测量尺寸。在转换状态下，将外膜的球体轮廓视为球体以计算总体积(V＝(4/3)πr3)。将胞质体积计算为存在于球体内的椭球体(V＝(4/3)π*(最长半径)*(短半径)2)。为了计算周质体积，从细胞的总体积中减去胞质体积。

蛋白质表达和定量：

含有pET28a(emd Millipore产品#69864)的大肠杆菌BL21(DE3)(NEB产品#c2527)及其携带GFP或胶原蛋白衍生物的衍生物在振动培养箱中在含有50mg/mL卡那霉素(p212121，产品#2251180)的转换培养基中于37℃下生长过夜。第二天，将过夜培养物以1:10的比例稀释到含有50mg/mL卡那霉素的新鲜转换培养基中，开始继代培养。然后对培养物进行生理转换，并同时在OD 600为1到1.1(读取自Molecular Devices Spectramax M2酶标仪上)时诱导蛋白质产生。通过添加100ug/mL羧苄青霉素、50ug/mL磷霉素和100ug/mL IPTG(p212121，产品#367-93-1)来使生理转换和蛋白质产生发生。在转换状态下，蛋白质表达在室温下(约22℃)在轨道摇床上继续8小时至过夜。为了定量总蛋白水平，对培养物的混合部分使用了Quick Start^TM Bradford蛋白质测定法，并在Molecular Devices Spectramax M2酶标仪上对标准曲线进行了定量。为了相对于其余蛋白质群体将靶蛋白产生的相对强度定量，将培养物的混合部分在

TGX^TM凝胶上跑样，并用Bio-Safe^TM考马斯着色剂染色。

蛋白质产生的诱导：

遵循标准程序在生理状态下诱导蛋白质产生。我们一直使用含有质粒pET28a的BL21(DE3)菌株，其驱动IPTG/乳糖可诱导的重组蛋白产生，并使用DsbA信号序列将该重组蛋白靶向周质空间。使用如上所述靶向周质空间的GFP蛋白，我们已经证明了在相同时间内获得和(与在相同光密度下诱导的未转换细胞种群相比)增加5倍的蛋白质产量的能力(图)。在OD 600为1.1时诱导是最佳的，并且诱导持续10小时，此时测得产生的蛋白质为约200mg/mL。

实施例2：全长胶原蛋白的产生

使用本文实施例1中讨论的表达系统产生全长水母胶原蛋白。Podocoryna carnea(水母或水螅)胶原蛋白的野生型全长氨基酸序列在SEQ ID NO:1中提供。

//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4379341？report＝genbank&log$＝protalign&blast_rank＝1&RID＝T1N9ZEUW014

编码全长水母胶原蛋白的非密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中公开。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/3355656？report＝genbank&log$＝ nuclalign&blast_rank＝l&RID＝TSYP7CMV014

合成了编码野生型全长水母胶原蛋白的两个不同的密码子优化的多核苷酸序列。由于密码子优化方法略有不同，因此两个多核苷酸序列略有不同。除了非截短的全长水母胶原蛋白外，多核苷酸还编码分泌标签、9个氨基酸的his标签、短接头和凝血酶切割位点。DsbA分泌标签由核苷酸1-71编码。包含9个组氨酸残基的组氨酸标签由核苷酸73-99编码，并编码氨基酸25-33。接头由核苷酸100-111编码。凝血酶切割标签由核苷酸112-135编码，并编码氨基酸38-45。截短的胶原蛋白由核苷酸136-1422编码。这两个多核苷酸在下面的SEQ ID NO:3和4中公开。

由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多核苷酸编码的氨基酸序列在下面的SEQ IDNO:5中公开。在SEQ ID NO:5中，DsbA分泌标签由核苷酸1-71编码，并编码氨基酸1-24；包含9个组氨酸残基的组氨酸标签由核苷酸73-99编码，并编码氨基酸25-33；接头由核苷酸100-111编码，并编码氨基酸34-37；凝血酶切割标签由核苷酸112-135编码，并编码氨基酸38-45；全长胶原蛋白由核苷酸136-1422编码，并编码氨基酸46-474。

不具有DsbA分泌标签、组氨酸标签、接头和凝血酶切割位点的全长水母胶原蛋白在SEQ ID NO:89中公开。

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多核苷酸是由Gen9 DNA(现在的Ginkgo Bioworks内部合成)合成的。将pET28载体与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR来添加。然后使用SGI Gibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)装配在一起成为最终质粒。然后通过Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

在该实施例中以及在整个本申请中使用的基本培养基如下制备。将基本培养基(表1)分为几个部分进行高压灭菌，这几个部分是盐混合物(磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、无水柠檬酸、七水硫酸镁)、500g/L蔗糖、55％葡萄糖、痕量金属TM5(表2)和氢氧化钠10M。在罩中高压灭菌后以上述浓度将基本培养基混合在一起。

表1摇瓶培养物的基本培养基配方

化学物质	化学式	MW	浓度(g/L)
				磷酸氢二铵	(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	133	4
磷酸二氢钾	KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	137	13.3
				无水柠檬酸	H<sub>3</sub>C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>O<sub>7</sub>	192.14	4.5
七水硫酸镁	MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	246	0.59
				痕量金属TM5			2
葡萄糖	C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>	500	40
				氢氧化钠10M	NaOH	400	5.2
蔗糖500g/L	C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>	500	66.6

表2痕量金属TM5组成

化学物质	化学式	MW	Conc(g/L)
				七水硫酸亚铁	FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	278.02	27.8
氯化钙	CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	147	2.94
				氯化锰	MnCl<sub>2</sub>	125.84	1.26
硫酸锌	ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	179.5	1.8
				氯化镍	NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	237.69	0.48
钼酸钠	Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	241.95	0.48
				亚硒酸钠	Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>	172.94	0.35
硼酸	H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	61.83	0.12

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

通过均质的细胞肉汤的酸处理来纯化胶原蛋白。使用6M盐酸将均质浆液的pH降低至3。将酸化的细胞浆液在混合下于4℃孵育过夜，然后离心。在聚丙烯酰胺凝胶上测试了酸化浆液的上清液，发现与起始沉淀相比，该上清液含有相对较高丰度的胶原蛋白。如此获得的胶原蛋白浆液的盐含量高。为了获得体积和盐的减少，使用具有各0.1m²的超滤盒的EMDMillipore切向流过滤系统进行浓缩和渗滤步骤。平行使用2个盒时，过滤的总面积为0.2m²。在TFF阶段获得了5x的体积减少和19x的盐减少。最终的胶原蛋白浆液在SDS-PAGE凝胶上跑样以确认胶原蛋白的存在。使用多托盘冷冻干燥器将该浆液干燥3天，以获得白色蓬松的胶原蛋白粉末。

在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的胶原蛋白，并在42千道尔顿的预期大小处观察到一条粗而清晰的条带。还通过质谱法分析了纯化的胶原蛋白，并证实了42千道尔顿的蛋白质是水母胶原蛋白。

发酵在范围从25℃至28℃的各种温度下进行。对于某些发酵，将发酵温度保持在恒定温度，并且在发酵完成(OD600为5-10)后立即将胶原蛋白纯化。对于其他发酵，将发酵温度维持期望的时间，当细胞密度达到OD600为5-10时，降低温度以诱导蛋白质产生。通常，温度从28℃降低到25℃。在25℃下继续发酵40-60小时后，分离胶原蛋白。

其他全长水母胶原蛋白

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的全长水母胶原蛋白在下文公开。编码该胶原蛋白的两个密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中提供。核苷酸序列的差异是由于密码子优化策略不同，但是编码相同的蛋白质。氨基酸序列在SEQ ID NO:8中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。胶原蛋白序列由核苷酸73-1359编码，并编码氨基酸25-453。

实施例3：截短的胶原蛋白的产生

合成并表达了被优化用于在大肠杆菌中表达的密码子优化的DNA序列，其编码具有240个内部氨基酸的截短的水母胶原蛋白。DNA序列显示在下面的SEQ ID NO:9中。在SEQID NO:9中，DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码SEQ ID NO:10的氨基酸1-24。包含9个组氨酸残基的组氨酸标签由核苷酸73-99编码，并编码SEQ ID NO:10的氨基酸25-33。接头由核苷酸100-111编码，并编码SEQ ID NO:10的氨基酸34-37。凝血酶切割位点由核苷酸112-135编码，并编码SEQ ID NO:10的氨基酸38-45。截短的胶原蛋白由核苷酸136-822编码，并编码SEQ ID NO:10的氨基酸46-274。

截短的胶原蛋白约为全长胶原蛋白的54％，并在下面的SEQ ID NO:10中公开。

编码不具有DsbA分泌标签、组氨酸标签、接头和凝血酶切割位点的截短的水母胶原蛋白的多核苷酸在SEQ ID NO:85中公开。

不具有DsbA分泌标签、组氨酸标签、接头和凝血酶切割位点的截短的水母胶原蛋白在SEQ ID NO:86中公开。

SEQ ID NO:9的多核苷酸是密码子优化的并由Gen9 DNA(现在的Ginkgo Bioworks内部合成)合成的。将pET28载体与SEQ ID NO:9之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR来添加。然后使用SGIGibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:9)装配在一起成为最终质粒。然后通过EurofinsGenomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

用2.7L的基本培养基+葡萄糖制备生物反应器，并添加300ml的OD600为5-10的培养物以使起始体积达到3L。使用含有搅动、空气和氧气的级联，使细胞在28℃、pH7和溶解氧保持在20％饱和的条件下生长。用28％w/w的氢氧化铵溶液控制pH。一旦40g/L的初始团块(bolus)在13小时左右耗尽，使用基于恒溶氧(DO-stat)的进料算法以补料分批模式进行发酵。初始生长24-26小时后，OD600达到100以上。此时，加入300mL 500g/L蔗糖，并将温度降至25C。使用1mM IPTG诱导高密度培养物产生蛋白质。继续发酵另外20-24小时，并使用台式离心机在9000rcf、15C下持续60分钟以收获细胞。从离心回收的细胞沉淀以2x缓冲液比1x细胞的重量比重悬于pH8下的含0.5M NaCl和0.1M KH2PO4的缓冲液中。

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

发酵在范围从25℃至28℃的各种温度下进行。对于某些发酵，将发酵温度保持在恒定温度，并且在发酵完成(OD600为5-10)后立即将胶原蛋白纯化。对于其他发酵，将发酵温度维持期望的时间，当达到细胞密度达到OD600为5-10时，降低温度以诱导蛋白质产生。通常，温度从28℃降低到25℃。在25℃下继续发酵40-60小时后，分离胶原蛋白。

通过均质的细胞肉汤的酸处理来纯化胶原蛋白。另外，还对在离心并重悬于上述缓冲液后从生物反应器回收的未均质的全细胞进行了酸处理。用6M盐酸将重悬的全细胞的均质浆液的pH降低至3。将酸化的细胞浆液在混合下于4℃孵育过夜，然后离心。在聚丙烯酰胺凝胶上测试了酸化浆液的上清液，发现与起始沉淀相比，该上清液含有相对较高丰度的胶原蛋白。如此获得的胶原蛋白浆液的盐含量高。为了获得体积和盐的减少，使用具有各0.1m²的超滤盒的EMD Millipore切向流过滤系统进行浓缩和渗滤步骤。平行使用2个盒时，过滤的总面积为0.2m²。在TFF阶段获得了5x的体积减少和19x的盐减少。最终的胶原蛋白浆液在SDS-PAGE凝胶上跑样以确认胶原蛋白的存在。使用多托盘冷冻干燥器将该浆液干燥3天，以获得白色蓬松的胶原蛋白粉末。

在SDS-PAGE凝胶上分析得自均质细胞肉汤或未均质细胞的纯化的截短胶原蛋白，并在27千道尔顿的预期大小处观察到一条粗而清晰的条带。还通过质谱法分析了纯化的胶原蛋白，并证实了27千道尔顿的蛋白质是水母胶原蛋白。

下文提供了全长和截短的胶原蛋白的另一种纯化方法。

将发酵肉汤与0.3-0.5％w/v的聚乙烯亚胺(PEI)混合。与PEI孵育15分钟后，将发酵肉汤在9000rcf离心15分钟以回收上清液，其中含有胶原蛋白。弃去含有细胞的沉淀，将经PEI处理的含胶原蛋白的上清液与钠基膨润土(最终w/v为0.2％)(

WyomingBentonite)混合并离心。弃去含有膨润土的沉淀并回收上清液。

使用5kDa盒在切向流过滤系统(TFF)(EMD Millipore)上将膨润土处理的上清液浓缩3-6倍。胶原蛋白得到保留且在渗透液流中几乎没有损失。为了去除盐，使用相同的TFF装置对浓缩步骤中的滞留物进行渗滤。蛋白质溶液的最终电导率＜10毫西门子。典型的电导率在400微西门子至1.5毫西门子之间。高度浓缩的胶原蛋白溶液具有更高的电导率，该更高的电导率接近4毫西门子。本领域技术人员将理解，取决于胶原蛋白的浓度，可以观察到高于10毫西门子的电导率。接下来，使用W-L 9000 10x 40粒状树脂(Carbon ActivatedCorporation)，用活性炭对脱盐并浓缩的蛋白质进行处理。将5％w/v的碳树脂与含胶原蛋白的蛋白质进料混合并在45-50℃下温和搅动混合。在存在或不存在助滤剂诸如硅藻土(Sigma Aldrich)的情况下，使用衬有Ertel压滤垫M-953(Ertel Alsop)的布氏漏斗过滤经碳处理的浆液。过滤后，将胶原蛋白溶液通过0.2微米过滤器过滤，然后用钠基膨润土(最终w/v为0.2％)(

Wyoming Bentonite)处理一至几个小时并在9000rcf下离心15-30分钟以获得高纯度、透明和无颗粒的胶原蛋白溶液。当需要去除内毒素蛋白时，将蛋白质通过诸如Sartobind-Q(Sartorius-Stedim)之类的色谱过滤器以特异性去除内毒素蛋白质。

在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的胶原蛋白，并在30千道尔顿处观察到一条粗而清晰的条带。大小上移是由于胶原蛋白分子的结构和高甘氨酸/脯氨酸氨基酸含量引起的。还通过质谱法分析了纯化的胶原蛋白，并证实了30千道尔顿的蛋白质是截短的胶原蛋白。

使用Agilent 1100系列HPLC通过HPLC进一步分析截短的胶原蛋白。柱为具有4.6mm内径、μM粒径和1000埃孔径的50mm Agilent PLRP-S反相柱。

通过在HPLC级水中的0.04％叠氮化钠溶液中以1:1稀释来制备样品。稀释后，将所得混合物通过0.45um过滤器过滤，以除去任何可能堵塞HPLC柱的大颗粒。为了进行分析，将样品用20mM醋酸铵缓冲液在约pH 4.5的HPLC级水中适当稀释。混合样品后，将其转移至300μl微量瓶中，然后将其置于自动进样器中。使用操作HPLC的软件ChemStation，可以更改分析参数，诸如样品流速、柱温、流动相流速、流动相组成等。在一个示例性但非限制性的分析中，参数为：样品流速为1mL/min，柱温为80℃，柱压为60-70bar，流动相组成为97.9％水/1.9％乙腈以及0.2％三氟乙酸；用于分析的UV波长为214.4nm，进样量为10μL而样品运行时间为10分钟。

在这些条件下，SEQ ID NO:91的截短的水母胶原蛋白具有约5.4分钟的洗脱时间。ChemStation对洗脱峰的峰面积进行定量，并使用将峰面积与蛋白质浓度直接关联的校准曲线计算蛋白质浓度。使用已知的胶原蛋白溶液生成校准曲线，该胶原蛋白溶液经过连续稀释以包含范围从0.06mg/mL至1.00mg/mL的胶原蛋白浓度。

不具有His标签-接头-凝血酶切割位点的截短的胶原蛋白

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的水母胶原蛋白在下文公开。编码该胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:11中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:12中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。截短的胶原蛋白序列由核苷酸73-639编码，并编码氨基酸25-213。

编码不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的水母胶原蛋白的多核苷酸在SEQ ID NO:90中公开。

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的水母胶原蛋白在SEQ ID NO:91中公开。

具有GEK重复的截短的胶原蛋白

具有GEK重复的水母胶原蛋白在下文公开。编码该胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:13中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:14中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。GEK重复由核苷酸73-126编码，并编码氨基酸25-42的GEK重复。截短的胶原蛋白序列由核苷酸127-693编码，并编码氨基酸43-231。

SEQ ID NO:13的多核苷酸是密码子优化的并由Gen9 DNA(现在的GinkgoBioworks内部合成)合成的。将pET28载体与SEQ ID NO:13之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR来添加。然后使用SGIGibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:13)装配在一起成为最终质粒。然后通过EurofinsGenomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

用2.7L的基本培养基+葡萄糖制备生物反应器，并添加300ml的OD600为5-10的培养物以使起始体积达到3L。使用含有搅动、空气和氧气的级联，使细胞在28℃、pH7和溶解氧保持在20％饱和的条件下生长。用28％w/w的氢氧化铵溶液控制pH。一旦40g/L的初始团块在13小时左右耗尽，使用基于恒溶氧的进料算法以补料分批模式进行发酵。初始生长24-26小时后，OD600达到100以上。此时，加入300mL 500g/L蔗糖，并将温度降至25C。使用1mMIPTG诱导高密度培养物产生蛋白质。继续发酵另外20-24小时，并使用台式离心机在9000rcf、15C下持续60分钟以收获细胞。从离心回收的细胞沉淀以2x缓冲液比1x细胞的重量比重悬于pH8下的含0.5M NaCl和0.1M KH2PO4的缓冲液中。

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

如上所述，通过对在离心并重悬于缓冲液后从生物反应器回收的全细胞进行酸处理来纯化胶原蛋白。用6M盐酸将均质浆液或重悬的悬浮液的pH降低至3。将酸化的细胞浆液在混合下于4℃孵育过夜，然后离心。在聚丙烯酰胺凝胶上测试了酸化浆液的上清液，发现与起始沉淀相比，该上清液含有相对较高丰度的胶原蛋白。如此获得的胶原蛋白浆液的盐含量高。为了获得体积和盐的减少，使用具有各0.1m²的超滤盒的EMD Millipore切向流过滤系统进行浓缩和渗滤步骤。平行使用2个盒时，过滤的总面积为0.2m²。在TFF阶段获得了5x的体积减少和19x的盐减少。最终的胶原蛋白浆液在SDS-PAGE凝胶上跑样以确认胶原蛋白的存在。使用多托盘冷冻干燥器将该浆液干燥3天，以获得白色蓬松的胶原蛋白粉末。

在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的胶原蛋白，观察到其以35千道尔顿的表观分子量运行。35千道尔顿的条带不符合22千道尔顿的预期大小。预期大小与表观大小之间的上移被认为是由于GEK重复与凝胶基质相互作用。质谱法证实该35kDa条带是具有GEK重复的正确的胶原蛋白。

具有GDK重复的截短的胶原蛋白

具有GDK重复的水母胶原蛋白在下文公开。编码该胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:15中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:16中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。GDK重复由核苷酸73-126编码，并编码氨基酸25-42的GDK重复。截短的胶原蛋白序列由核苷酸127-693编码，并编码氨基酸43-231。

SEQ ID NO:15的多核苷酸是密码子优化的并由Gen9 DNA(现在的GinkgoBioworks内部合成)合成的。将pET28载体与SEQ ID NO:15之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR来添加。然后使用SGIGibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:15)装配在一起成为最终质粒。然后通过Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

用2.7L的基本培养基+葡萄糖制备生物反应器，并添加300ml的OD600为5-10的培养物以使起始体积达到3L。使用含有搅动、空气和氧气的级联，使细胞在28℃、pH7和溶解氧保持在20％饱和的条件下生长。用28％w/w的氢氧化铵溶液控制pH。一旦40g/L的初始团块在13小时左右耗尽，使用基于恒溶氧的进料算法以补料分批模式进行发酵。初始生长24-26小时后，OD600达到100以上。此时，加入300mL 500g/L蔗糖，并将温度降至25C。使用1mMIPTG诱导高密度培养物产生蛋白质。继续发酵另外20-24小时，并使用台式离心机在9000rcf、15C下持续60分钟以收获细胞。从离心回收的细胞沉淀以2x缓冲液比1x细胞的重量比重悬于pH8下的含0.5M NaCl和0.1M KH2PO4的缓冲液中。

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

如上所述，通过对在离心并重悬于缓冲液后从生物反应器回收的全细胞进行酸处理来纯化胶原蛋白。使用6M盐酸将均质浆液的pH降低至3。将酸化的细胞浆液在混合下于4℃孵育过夜，然后离心。在聚丙烯酰胺凝胶上测试了酸化浆液的上清液，发现与起始沉淀相比，该上清液含有相对较高丰度的胶原蛋白。如此获得的胶原蛋白浆液的盐含量高。为了获得体积和盐的减少，使用具有各0.1m²的超滤盒的EMD Millipore切向流过滤系统进行浓缩和渗滤步骤。平行使用2个盒时，过滤的总面积为0.2m²。在TFF阶段获得了5x的体积减少和19x的盐减少。最终的胶原蛋白浆液在SDS-PAGE凝胶上跑样以确认胶原蛋白的存在。使用多托盘冷冻干燥器将该浆液干燥3天，以获得白色蓬松的胶原蛋白粉末。

在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的胶原蛋白，观察到其以35千道尔顿的表观分子量运行。35千道尔顿的条带不符合22千道尔顿的预期大小。预期大小与表观大小之间的上移被认为是由于GDK重复与凝胶基质相互作用。质谱法证实该35kDa条带是具有GDK重复的正确的胶原蛋白。

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的截短的胶原蛋白(版本1)：

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的水母胶原蛋白在下文公开。编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:17中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:18中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。His标签由核苷酸73-99编码，并编码氨基酸25-33的9组氨酸标签。接头由核苷酸100-111编码，并编码氨基酸34-37。凝血酶切割位点由核苷酸112-135编码，并编码氨基酸38-45。具有接头的绿色荧光蛋白(GFP)由核苷酸136-873编码，并编码氨基酸46-291。截短的胶原蛋白序列由核苷酸874-1440编码，并编码氨基酸292-480。具有接头的β-内酰胺酶由核苷酸1441-2232编码，并编码氨基酸481-744。即使该多肽不具有独立的分泌标签，β-内酰胺酶也正确地靶向周质空间。DsbA分泌标签将整个转录物(具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合蛋白的截短的胶原蛋白)导向周质空间，并且β-内酰胺酶功能正常。

通过组装几个DNA片段来构建SEQ ID NO:17的多核苷酸。含有胶原蛋白的序列是密码子优化的并由Gen9 DNA(现在的GinkgoBioworks内部合成)合成的。该GFP也由Gen9合成。通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR将β-内酰胺酶从质粒pKD46(http://cgsc2.biology.yale.edu/Strain.php7ID＝68099)中克隆出来。将pET28载体、GFP、胶原蛋白和β-内酰胺酶之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶使用PCR进行添加。然后使用SGI Gibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-l-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入片段装配在一起成为最终质粒。然后通过Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

用2.7L的基本培养基+葡萄糖制备生物反应器，并添加300ml的OD600为5-10的培养物以使起始体积达到3L。使用含有搅动、空气和氧气的级联，使细胞在28℃、pH7和溶解氧保持在20％饱和的条件下生长。用28％w/w的氢氧化铵溶液控制pH。一旦40g/L的初始团块在13小时左右耗尽，使用基于恒溶氧的进料算法以补料分批模式进行发酵。初始生长24-26小时后，OD600达到100以上。此时，加入300mL 500g/L蔗糖，并将温度降至25C。使用1mMIPTG诱导高密度培养物产生蛋白质。继续发酵另外20-24小时，并使用台式离心机在9000rcf、15C下持续60分钟以收获细胞。从离心回收的细胞沉淀以2x缓冲液比1x细胞的重量比重悬于pH8下的含0.5M NaCl和0.1M KH2PO4的缓冲液中。

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

通过对在离心并重悬于上述缓冲液后从生物反应器回收的未均质全细胞进行酸处理来纯化胶原蛋白。使用6M盐酸将重悬的悬浮液的pH降低至3。将酸化的细胞浆液在混合下于4℃孵育过夜，然后离心。然后使用10N NaOH将pH升高至9，并在聚丙烯酰胺凝胶上测试浆液的上清液，发现与起始沉淀相比，该上清液含有相对较高丰度的胶原蛋白。如此获得的胶原蛋白浆液的盐含量高。为了获得体积和盐的减少，使用具有各0.1m²的超滤盒的EMDMillipore切向流过滤系统进行浓缩和渗滤步骤。平行使用2个盒时，过滤的总面积为0.2m²。在TFF阶段获得了5x的体积减少和19x的盐减少。最终的胶原蛋白浆液在SDS-PAGE凝胶上跑样以确认胶原蛋白的存在。使用多托盘冷冻干燥器将此浆液干燥3天，以获得白色蓬松的胶原蛋白粉末。

在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的胶原蛋白-GFP-β-内酰胺酶融合蛋白，观察到其以90千道尔顿的表观分子量运行。融合蛋白的预期大小为85kd。质谱法证实该90kDa条带是正确的胶原蛋白融合蛋白。

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的截短的胶原蛋白(版本2)：

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的水母胶原蛋白在下文公开。编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:19中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:20中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。His标签由核苷酸73-99编码，并编码氨基酸25-33的9组氨酸标签。接头由核苷酸100-111编码，并编码氨基酸34-37。凝血酶切割位点由核苷酸112-135编码，并编码氨基酸38-45。具有接头的绿色荧光蛋白(GFP)由核苷酸136-873编码，并编码氨基酸46-291。截短的胶原蛋白序列由核苷酸874-1440编码，并编码氨基酸292-480。具有接头的β-内酰胺酶由核苷酸1441-2232编码，并编码氨基酸481-744。

实施例4：全长弹性蛋白的产生

如下所述地表达全长人弹性蛋白。下文提供了人弹性蛋白的野生型全长氨基酸序列。

http://www.uniprot.org/uniprot/P15502

编码全长弹性蛋白的非密码子优化的多核苷酸序列在下文中公开。在SEQ ID NO:22中，核苷酸1-78编码DsbA分泌标签，核苷酸79-2358编码全长人弹性蛋白。

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点的密码子优化的弹性蛋白

编码具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点的全长人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在下文公开。在SEQ ID NO:23中：核苷酸1-72编码DsbA分泌标签，该DsbA分泌标签编码SEQ ID NO:24的氨基酸1-24；核苷酸73-99编码9 His标签，该9His标签编码SEQ ID NO:24的氨基酸25-33；核苷酸100-111编码接头，该接头编码SEQ ID NO:24的氨基酸34-37；核苷酸112-135编码凝血酶切割位点，该凝血酶切割位点编码SEQ ID NO:24的氨基酸38-45；核苷酸136-2415编码SEQ ID NO:24的全长人弹性蛋白的氨基酸46-805。

编码不具有天然序列标签的全长人弹性蛋白的多核苷酸在SEQ ID NO:87中公开。

不具有天然序列标签的全长人弹性蛋白序列在SEQ ID NO:88中公开。

具有DsbA分泌标签的密码子优化的弹性蛋白

编码具有DsbA分泌标签的全长人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQID NO:25中公开。在SEQ ID NO:25中：核苷酸1-72编码DsbA分泌标签，该DsbA分泌标签编码SEQ ID NO:26的氨基酸1-24；核苷酸73-2355编码SEQ ID NO:26的全长人弹性蛋白的氨基酸25-785。

SEQ ID NO:22的多核苷酸是密码子优化的并由Gen9 DNA(现在的GinkgoBioworks内部合成)合成的。将pET28载体与SEQ ID NO:22之间的重叠设计为30至40bp长，并通过酶PrimeStar GXL聚合酶(http://www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase？sitex＝10020:22372:US)使用PCR来添加。然后使用SGIGibson装配(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:22)装配在一起成为最终质粒。然后通过Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)的桑格测序验证质粒的序列。

在基本培养基中培养转化的细胞，并以细胞比甘油为50:50的比例将其冷冻在具有甘油的1.5等分试样中。将一小瓶此冷冻培养物在50ml的基本培养基中于37℃、200rpm下过夜恢复。将细胞转移到300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到OD600为5-10。

用2.7L的基本培养基+葡萄糖制备生物反应器，并添加300ml的OD600为5-10的培养物以使起始体积达到3L。使用含有搅动、空气和氧气的级联，使细胞在28℃、pH7和溶解氧保持在20％饱和的条件下生长。用28％w/w的氢氧化铵溶液控制pH。一旦40g/L的初始团块在13小时左右耗尽，使用基于恒溶氧的进料算法以补料分批模式进行发酵。初始生长24-26小时后，OD600达到100以上。此时，加入300mL 500g/L蔗糖，并将温度降至25C。使用1mMIPTG诱导高密度培养物产生蛋白质。继续发酵另外20-24小时，并使用台式离心机在9000rcf、15C下持续60分钟以收获细胞。从离心回收的细胞沉淀以2x缓冲液比1x细胞的重量比重悬于pH8下的含0.5M NaCl和0.1M KH2PO4的缓冲液中。

发酵在范围从25℃至28℃的各种温度下进行。对于某些发酵，将发酵温度保持在恒定温度，并且在发酵完成(OD600为5-10)后立即将弹性蛋白纯化。对于其他发酵，将发酵温度维持期望的时间，当细胞密度达到OD600为5-10时，降低温度以诱导蛋白质产生。通常，温度从28℃降低到25℃。在25℃下继续发酵40-60小时后，分离弹性蛋白。

将收获的细胞在匀浆器中以14,000psi的压力破碎2次。所得浆液含有胶原蛋白以及其他蛋白质。

在SDS-PAGE凝胶上分析来自均质的细胞的上清液，并且在约70千道尔顿处观察到对应于68千道尔顿的预期大小的清晰条带。通过质谱法分析纯化的弹性蛋白。

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的全长弹性蛋白

具有DsbA分泌标签-His标签-接头-凝血酶切割位点和GFPβ-内酰胺酶融合的人弹性蛋白在下文公开。编码该弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:27中提供。氨基酸序列在SEQ ID NO:28中公开。DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。His标签由核苷酸73-99编码，并编码氨基酸25-33的9组氨酸标签。接头由核苷酸100-111编码，并编码氨基酸34-37。凝血酶切割位点由核苷酸112-135编码，并编码氨基酸38-45。具有接头的绿色荧光蛋白(GFP)由核苷酸136-873编码，并编码氨基酸46-291。全长弹性蛋白序列由核苷酸874-3153编码，并编码氨基酸292-1051。具有接头的β-内酰胺酶由核苷酸3154-3945编码，并编码氨基酸1052-1315。

实施例5：截短的弹性蛋白的产生

使用实施例4中所述的表达系统产生截短的人弹性蛋白。缺乏天然分泌标签的全长氨基酸序列在SEQ ID NO:29中公开。

编码缺乏天然分泌标签的全长人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQID NO:30中公开。

在C末端被截短的60.7kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:31中公开。60.7kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸706-761。

编码截短的60.7kDa人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:32中公开。

在N末端被截短的58.8kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:33中公开。58.8kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-85。

编码58.8kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:34中公开。

在C末端被截短的57kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:35中公开。57kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸661-761。

编码57kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:36中公开。

在C末端被截短的53.9kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:37中公开。53.9kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸624-761。

编码53.9kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:38中公开。

在C末端被截短的45.3kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:39中公开。45.3kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸529-761。

编码45.3kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:40中公开。

在N末端被截短的44.4kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:41中公开。44.4kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-246。

编码44.4kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:42中公开。

在N末端被截短的40.4kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:43中公开。40.4kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-295。

编码40.4kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:44中公开。

在C末端被截短的39.8kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:45中公开。39.8kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸462-761。

编码39.8kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:46中公开。

在C末端被截短的36.1kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:47中公开。36.1kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸418-761。

编码36.1kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:48中公开。

在N末端被截短的34.9kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:49中公开。34.9kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-360。

编码34.9kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:50中公开。

在C末端被截短的32kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:51中公开。32kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸373-761。

编码32kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:52中公开。

在C末端被截短的29.9kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:53中公开。60.7kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸347-761。

编码29.9kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:54中公开。

在N末端被截短的29.4kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:55中公开。29.4kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-425。

编码29.4kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:56中公开。

在N末端被截短的25.3kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:57中公开。25.3kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-473。

编码25.3kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:58中公开。

在C末端被截短的24.1kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:59中公开。24.1kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸277-761。

编码24.1kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:60中公开。

在C末端被截短的20.3kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:61中公开。20.3kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸229-761。

编码20.3kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:62中公开。

在N末端被截短的19.6kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:63中公开。19.6kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-542。

编码19.6kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:64中公开。

在N末端被截短的11kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:65中公开。11kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-635。

编码11kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:66中公开。

在N末端被截短的7.9kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:67中公开。7.9kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-674。

编码7.9kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:68中公开。

在C末端被截短的6.3kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:69中公开。6.3kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸74-761。

编码6.3kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:70中公开：

在N末端被截短的4.3kDa人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:71中公开。4.3kDa的截短弹性蛋白从全长弹性蛋白删除了氨基酸2-717。

编码4.3kDa的截短人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列在SEQ ID NO:72中公开。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白1

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白1的氨基酸序列在SEQ ID NO:98中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:99的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:98的氨基酸1-19。弹性蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:99的核苷酸58-657，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:98的氨基酸20-219。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:99的核苷酸658-684，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:98的氨基酸220-228。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白1的核酸序列在SEQ ID NO:99中公开。

如本文所述将SEQ ID NO:99的多核苷酸亚克隆到载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的弹性蛋白。纯化的弹性蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约25千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹(western)。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白2

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白2型的氨基酸序列在SEQ ID NO:100中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:101的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ IDNO:100的氨基酸1-19。弹性蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:101的核苷酸58-657，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:100的氨基酸20-219。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:101的核苷酸658-684，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:100的氨基酸220-228。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人弹性蛋白2的核酸序列在SEQ ID NO:101中公开。

如本文所述将SEQ ID NO:101的多核苷酸亚克隆到载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞表达，并纯化截短的弹性蛋白。纯化的弹性蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约25千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

实施例6：截短的胶原蛋白对成纤维细胞的细胞活力、前胶原合成和弹性蛋白合成的作用

使用人成纤维细胞的细胞培养物来评估实施例2的截短的水母胶原蛋白分子以确定其对胶原蛋白和弹性蛋白合成的作用。人成纤维细胞的细胞培养物还用于确定人成纤维细胞暴露于截短的水母胶原蛋白后的活力。

从实施例3的组氨酸标记的截短的胶原蛋白制备2％w/w截短胶原蛋白的原液。然后将来自2％截短胶原蛋白的原液的等分试样用于下述实验中。

成纤维细胞的制备

将成纤维细胞接种到24孔板的各个孔中的0.5ml成纤维细胞生长培养基(FGM)中，并在37±2℃和5±1％CO₂下孵育过夜。在第二天，通过抽吸除去培养基以消除任何非粘附细胞，并替换为0.5ml新鲜的FGM。使细胞生长直至汇合，每48至72小时更换培养基。达到汇合后，将细胞用补充有1.5％FBS的DMEM处理24小时，以清除来自正常培养基中所含生长因子的任何作用。在24小时的清除期后，用以指定浓度溶解在含1.5％FBS的FGM中的截短的水母胶原蛋白处理细胞。转化生长因子β(TGF-β)(20ng/ml)被用作胶原蛋白和弹性蛋白合成的阳性对照。未经处理的细胞(阴性对照)仅接受含1.5％FBS的DMEM。将细胞孵育48小时，并在孵育期结束时收集细胞培养基并冷冻保存(-75℃)或立即测定。材料一式三份进行测试。

MTT测定

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物，一种四唑)测定是用于确定细胞的代谢活性的比色测定。通过MTT测定评估细胞数的变化。当细胞暴露于MTT时，活细胞中的线粒体对MTT的还原导致形成不溶性紫色甲臢(formazin)晶体，然后用异丙醇从细胞中提取该晶体并进行分光光度法定量。无生命的细胞无法还原MTT，因此无法产生紫色甲臢晶体。紫色颜色的强度与有生命的细胞(代谢活性细胞)的数量成正比。紫色颜色的强度与细胞的代谢活性成正比，与测试材料的毒性成反比。

在上述讨论的2天孵育之后，去除细胞培养基(参见上文)，并用PBS洗涤成纤维细胞两次以去除任何残留的水母糖原分子。最后一次洗涤后，向每个孔中加入500μl补充有0.5mg/ml MTT的DMEM，并将细胞在37±2℃和5±1％CO₂下孵育1小时。孵育后，去除DMEM/MTT溶液，并再次用PBS洗涤细胞一次，然后将0.5ml异丙醇添加至孔中以提取紫色甲臢晶体。将200微升异丙醇提取物转移至96孔板，并使用异丙醇作为空白在540nm下读取该板。

计算阴性对照细胞的平均MTT吸光度值，并将其用于代表100％的细胞活力。然后，将来自经历各种处理的细胞的各个MTT吸光度值除以阴性对照细胞的平均值并表示为百分比，以确定每种处理引起的细胞活力的变化。

在该实施例的表1、表2和表3中，通过在测定中使用2％截短胶原蛋白原液的指定等分试样来进行实验。例如，在测试“10％胶原蛋白溶液”的样品中，使用足以提供10％测定体积的量的2％截短胶原蛋白的等分试样。对于1.0ml的总测定体积，使用100μl的2％截短胶原蛋白原液。在表1、表2和表3中，“10％胶原蛋白溶液”是0.2％胶原蛋白，“5％胶原蛋白溶液”是0.1％胶原蛋白，“1％胶原蛋白溶液”是0.02％胶原蛋白，“0.5％胶原蛋白溶液”是0.01％胶原蛋白，“0.1％胶原蛋白溶液”是0.002％胶原蛋白，“0.05％胶原蛋白溶液”是0.001％胶原蛋白，“0.01％胶原蛋白溶液”是0.0002％胶原蛋白，“0.005％胶原蛋白溶液”是0.0001％胶原蛋白。

MTT测定的结果在表3中示出。这些值表示为平均活力百分比±与平均值的偏差。

表3.MTT测定

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)。

组氨酸标记的截短的水母胶原蛋白通过增加人成纤维细胞的细胞活力而显示出保护作用。在表3中可以看到，当成纤维细胞暴露于0.02％至0.2％截短的水母胶原蛋白时，在MTT测定中观察到最高值。

前胶原合成

成纤维细胞是细胞外基质肽，包括结构蛋白胶原蛋白和弹性蛋白的主要来源。前胶原是由成纤维细胞在皮肤的真皮层中合成的大肽，并且是胶原蛋白的前体。当肽被加工形成成熟的胶原蛋白时，前肽部分被切掉(I型C肽)。然后，成熟的胶原蛋白和I型C肽片段都被释放到细胞外环境中。当合成胶原蛋白时，I型C肽片段会累积至组织培养基中。由于前胶原肽的两个部分之间的化学计量比为1:1，因此测定I型C肽将反映合成的胶原蛋白的量。可以通过基于ELISA的方法测定I型C肽。

制备了一系列范围从0ng/ml至640ng/ml的I型C肽标准品。接下来，通过从板框上去除任何不需要的板条，然后向用于测定的每个孔中加入100μl过氧化物酶标记的抗前胶原I型-C肽原抗体来制备ELISA微孔板。然后将二十(20)μl的样品(收集的组织培养基)或标准品添加到适当的孔中，盖上微孔板，使其在37℃下孵育3±0.25小时。孵育后，对孔进行抽吸并用400μl洗涤缓冲液洗涤三次。去除最后洗涤液后，将100μl过氧化物酶底物溶液(过氧化氢+四甲基联苯胺作为色原)加入到每个孔中，并将板在室温下孵育15±5分钟。孵育后，将100μl终止溶液(1N硫酸)加入到每个孔中，并使用酶标仪在450nm下读取该板。

为了量化存在的每种物质的量，使用每种物质的已知浓度生成标准曲线。进行回归分析以建立最佳拟合这些数据点的线。测试材料和未经处理的样品的吸光度值用于估计每个样品中存在的每种物质的量。

ELISA测定的结果示于表4。

表4.I型胶原测定。示出的值为平均浓度(ng/ml)±与平均值的偏差。

处理方式	I型C肽(ng/ml)
		未经处理	1718±94
20ng/ml TGF-B	3028±332*
		10％胶原蛋白溶液	1940±100
5％胶原蛋白溶液	2394±125*
		1％胶原蛋白溶液	1773±183
0.5％胶原蛋白溶液	1127±19*
		0.1％胶原蛋白溶液	1158±10*
0.05％胶原蛋白溶液	1416±64
		0.01％胶原蛋白溶液	1835±404
0.005％胶原蛋白溶液	1551±149

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)。

观察到截短的组氨酸标记的水母胶原蛋白对胶原蛋白的合成具有双相作用。在1％、5％和10％水平下，胶原蛋白合成增加。在5％的浓度下，截短的水母胶原蛋白显著增加了胶原蛋白的合成，p值小于0.05。

弹性蛋白合成

弹性蛋白是给予组织在短暂拉伸后回弹的能力的弹性纤维网络的主要组分。此蛋白质由成纤维细胞释放至细胞外空间(可溶性弹性蛋白)，该弹性蛋白随后在细胞外空间与其他弹性蛋白交联，形成广泛的纤维和薄片网络(不溶性弹性蛋白)。可通过基于ELISA的方法从细胞培养基中容易地测量可溶性弹性蛋白。

将可溶性α-弹性蛋白以1.25μg/mL的浓度溶于0.1M碳酸钠(pH 9.0)中。然后将150μl的此溶液施加于96孔maxisorp Nunc板的孔中，并将该板在4℃下孵育过夜。在第二天，将孔用含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS饱和。然后将该板与此封闭溶液在37℃下孵育1小时，然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤两次。

生成了一系列范围从0至100ng/ml的α-弹性蛋白标准品。然后将180μl标准品或截短的水母胶原蛋白转移至650μl微量离心管中。制备抗弹性蛋白抗体溶液(将抗体以1:100的比例稀释在含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS中)，并将20μl的该溶液添加到该管中。然后将该管在4±2℃下孵育过夜。在第二天，从每个管转移150μl到96孔弹性蛋白ELISA板，并将该板在室温下孵育1小时。然后将该板用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次。洗涤后，添加200μl含有稀释在含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS中的与过氧化物酶连接的二抗的溶液，并将该板在室温下孵育1小时。将该板洗涤3次后，添加200μl的底物溶液，并将该板在黑暗中在室温下孵育10至30分钟。在此最终孵育之后，使用酶标仪在460nm处读取该板。

表5.这些值同样表示为平均浓度(ng/ml)±与平均值的偏差。

处理方式	弹性蛋白(ng/ml)
		未经处理	79±19
20ng/ml TGFB1	243±35*
		10％胶原蛋白溶液	68±18
5％胶原蛋白溶液	99±13
		1％胶原蛋白溶液	126±21
0.5％胶原蛋白溶液	145±21*
		0.1％胶原蛋白溶液	76±14
0.05％胶原蛋白溶液	58±6
		0.01％胶原蛋白溶液	53±5
0.005％胶原蛋白溶液	56±24

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)。

如表5所示，截短的his标记的水母胶原蛋白在以0.5％的浓度使用时显著增加了弹性蛋白的产生。

实施例7：截短的胶原蛋白对角质形成细胞增殖和UVB保护的作用

使用人类角质形成细胞的细胞培养物模型来评估测试材料对细胞增殖产生作用的能力。另外，还评估了测试材料对暴露于UVB后的细胞活力的影响。

从实施例1的截短的胶原蛋白制备2％w/w截短胶原蛋白原液。然后将来自该2％截短胶原蛋白原液的等分试样用于下述实验中。

此研究分为两个部分进行。在第一部分中，将培养的角质形成细胞与测试材料一起孵育48小时，然后使用MTT测定评估活细胞的数量变化。在研究的第二部分中，将培养的角质形成细胞用UVB照射，然后用测试材料处理48小时。在48小时时间段结束时，再次通过MTT测定评估活细胞的数量。

可以使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物，一种四唑)测定来确定活细胞的细胞数量变化。MTT测定是细胞代谢活性的比色分析，其反映了活细胞的数量。活细胞中的线粒体对MTT的还原导致形成不溶性紫色甲臢晶体，然后用异丙醇从细胞中提取该晶体并进行分光光度法定量。紫色颜色的强度与代谢活性细胞的数量成正比。

增殖测定

为了增殖测定，将角质形成细胞接种到不使用生长因子的96孔板中，并在37±2℃和5±1％CO₂下孵育24小时。在此初始孵育之后，将培养基替换为补充有测试材料的培养基。正常培养基(具有生长因子)用作阳性对照。如上所述，在添加测试材料后，将细胞培养48小时。在孵育期结束时，使用MTT测定来确定活细胞数量的变化。

UVB保护测定

对于UVB保护测定，将角质形成细胞接种到使用正常培养基的96孔板中，并在37±2℃和5±1％CO₂下孵育24小时。在此初始孵育后，将培养基替换为100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将细胞暴露于UVB(40mJ/cm2)。在暴露于UVB后，将PBS替换为补充有测试材料的新鲜培养基(100μg/ml抗坏血酸作为阳性对照)，并将细胞在37±2℃和5±1％CO₂下培养48小时。在48小时的孵育结束时，使用MTT测定来确定细胞活力。

MTT测定

孵育48小时后，去除细胞培养基并替换为200μl补充有0.5mg/ml MTT的培养基。将孔板在37±2℃和5±1％CO₂下孵育1小时。孵育后，去除MTT溶液，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞一次，然后将200μl的异丙醇添加至孔中以提取紫色甲臢晶体。使用异丙醇作为空白，在540nm处读取96孔板。

计算未用测试材料处理(增殖测定：未经处理的组)或未暴露于UVB(UVB保护测定：未暴露于UVB的组)的细胞的平均吸光度值，并用于代表100％的细胞活力。然后，将经过各种处理的细胞的各个吸光度值除以代表100％细胞活力的平均吸光度值并表示为百分比，以确定每种处理引起的细胞活力的变化。

使用his标记的截短的水母胶原蛋白的增殖测定的结果示于表6。使用his标记的截短的水母胶原蛋白的UVB保护测定的结果示于表7。两种测定的值表示为平均活力±标准偏差。

表6.增殖测定

未经处理	100±3.4
		阳性对照(生长因子)	139±3.8*
10％胶原蛋白溶液	103±9.4
		5％胶原蛋白溶液	97±7.3
1％胶原蛋白溶液	94±5.0
		0.5％胶原蛋白溶液	93±7.0
0.1％胶原蛋白溶液	95±2.5
		0.05％胶原蛋白溶液	99±6.0
0.01％胶原蛋白溶液	96±6.4
		0.005％胶原蛋白溶液	96±2.8

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)

表7.UVB保护测定

未暴露于UVB	100±1.7*
		未经处理	77±1.8
100ug/ml Trolox	92±2.0*
		10％胶原蛋白溶液	76±8.6
5％胶原蛋白溶液	92±3.9*
		1％胶原蛋白溶液	91±2.9*
0.5％胶原蛋白溶液	100±4.5*
		0.1％胶原蛋白溶液	86±4.8
0.05％胶原蛋白溶液	91±1.6*
		0.01％胶原蛋白溶液	83±7.5
0.005％胶原蛋白溶液	82±4.7

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)

对于增殖测定，未经处理的组用于代表100％的细胞活力。高于100％的值反映了活细胞数量的增加，因此指示细胞增殖。在此研究中，未观察到测试材料促进细胞增殖。

另外，使用SEQ ID NO:91的截短的胶原蛋白进行角质形成细胞增殖测定。根据实施例8制备5％原液的1％和0.5％胶原蛋白溶液并进行测试。SEQ ID NO:91的截短的胶原蛋白的角质形成细胞活力测定值分别为102±2.9和102±2.0。所观察到的值具有统计学意义(p＜0.05)。

除了其对细胞增殖的作用之外，还对测试材料进行筛选以确定其是否对暴露于UVB后的细胞恢复有影响。在此研究中，观察到暴露于UVB会导致暴露后48小时的活细胞数量显著减少。但是，用测试材料进行处理可以防止这种细胞活力的下降。在测试材料的浓度范围介于0.05％和5％之间时的作用明显，在浓度为0.05％时具有最佳作用。在此浓度范围内，细胞活力显著大于未处理组(唯一的例外是0.01％的浓度)，表明该材料具有UVB保护作用。由于此材料是在暴露于UVB之后添加的，因此其可以用于减少UVB照射的破坏作用，或者可以帮助受损细胞以更快的速度恢复。对于后者，截短的胶原蛋白在局部施加于皮肤时则是有益的，并且对被UVB损伤的皮肤细胞具有再生作用。

另外，使用SEQ ID NO:91的截短的胶原蛋白进行UVB保护测定。SEQ ID NO:91的l％和0.5％胶原蛋白溶液的角质形成细胞生存力测定值分别为80±4.6和78±2.5。所观察到的值具有统计学意义(p＜0.05)。

实施例8：截短的胶原蛋白对胸腺嘧啶二聚体形成的作用

在暴露于紫外线辐射后，细胞中存在的DNA中的胸腺嘧啶二聚体(TT二聚体)含量增加。TT二聚体形成的增加与皮肤损伤和某些类型的细胞增生性疾病(包括皮肤癌)相关。

将SEQ ID NO:11的多核苷酸在实施例1的表达系统中表达，并如本实施例所述纯化。编码的多肽包括DsbA分泌标签。当多肽通过分泌途径加工时，SEQ ID NO:12的DsbA标签氨基酸1-24被宿主细胞切割。不具有DsbA分泌标签的截短的胶原蛋白在SEQ ID NO:91中提供。

测试了SEQ ID NO:91的截短的胶原蛋白以确定它是否可以减少人表皮角质形成细胞的TT二聚体形成。对于此研究，将细胞暴露于UVB(25mJ/cm2)。暴露后，将细胞用测试材料或Trolox(100ug/ml)处理并孵育过夜。在第二天，提取细胞DNA，并使用基于ELISA的方法测定胸腺嘧啶二聚体含量。

使用正常培养基将人角质形成细胞接种到12孔板中，并在37±2℃和5±1％CO₂下孵育24小时。在此初始孵育后，将培养基替换为100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将细胞暴露于UVB(25mJ/cm2)。在暴露于UVB后，将PBS替换为补充有测试材料或Trolox(100μg/ml，作为阳性对照)的新鲜培养基，并将细胞在37±2℃和5±1％CO₂下培养过夜。孵育结束时，提取细胞DNA。

在过夜孵育后，将细胞培养基从孔中移出，并替换为200μl的PBS和20μl的蛋白酶K。在使板旋转以混合PBS和蛋白酶K后，向每个孔中加入200μl缓冲液AL。在再次使板旋转以混合试剂之后，将板在55±2℃下孵育10分钟。在将板冷却至室温后，通过添加200μl 100％乙醇来沉淀DNA。然后将沉淀的DNA混合物转移至在2ml收集管中的DNEasy离心柱(SpinColumn)中，并以8,000RPM离心1分钟。丢弃流过物和收集管，将500μl的洗涤缓冲液1添加至离心柱，并将该柱放入新的收集管中，并以8,000RPM离心1分钟。再次丢弃流过物和收集管，将500μl的洗涤缓冲液2添加至离心柱，并将该柱放入新的收集管中，并以14,000RPM离心3分钟。然后将该离心柱放入新的1.5ml离心管中，并将110μl超纯水添加到该柱。将该柱在室温下孵育1分钟，然后以8,000RPM离心1分钟。

提取的DNA通过荧光测定法定量。将DNA样品的2μl等分试样与100μl TE缓冲液在96孔板中混合。一系列DNA标准品也转移至96孔板的孔中(一式两份)。最后，将100μl稀释Cyquant Green染料添加到每个孔中，并使用480nm的激发波长和520nm的发射波长确定每个孔的荧光强度。

使用OxiSelect^TM UV诱导的DNA损伤ELISA试剂盒确定胸腺嘧啶二聚体检测。

通过将样品在95℃下孵育10分钟然后在冰上冷却，将基因组DNA样品或标准品的等分试样转化为单链DNA。将100μl的每种样品或标准品转移至DNA结合ELISA板中，并在4℃下孵育过夜。在第二天，将孔用100μl的PBS冲洗一次，然后在室温下用150μl的测定稀释剂封闭1小时。去除测定稀释剂后，将100μl抗CPD抗体添加至每个孔中，并将板在室温下孵育一小时。在此次孵育后，将板用每孔250μl洗涤缓冲液洗涤3次，然后将150μl封闭剂添加至板中。在室温下将板再次封闭一小时，然后如前所述洗涤三遍。然后将100μl二抗添加至每个孔中，并将板在室温下孵育1小时。在再次洗涤该板后，将100μl底物添加至每个孔中，并将板孵育5-20分钟以允许板中产生颜色。通过添加100μl的终止溶液来终止颜色产生反应，并使用酶标仪在460nm下读取该板。

为了量化存在的DNA的量，使用已知浓度的DNA及其各自的荧光强度(以RFU或相对荧光单位测量)生成标准曲线。进行了回归分析以建立最佳拟合这些数据点的线。然后使用每个未知样品的相对荧光单位(RFU)估算DNA的量。

一系列具有已知量的胸腺嘧啶二聚体含量的DNA标准品用于生成标准曲线。此标准曲线用于确定样品DNA中的DNA损伤量。计算每个处理组的平均值，并使用ANOVA进行比较。在表8和图5中，将标准品5％胶原蛋白溶液(在95ml去离子水中的5g截短的胶原蛋白)进一步用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释至指示的溶液百分比。

表8.胸腺嘧啶二聚体测定

处理	胸腺嘧啶二聚体，ng/ml
		未暴露于UVB	0.1±0.2*
未经处理	10.7±1.4*
		100μg/ml Trolox	1.6±0.3*
5％截短的胶原蛋白	3.5±0.3*
		1％截短的胶原蛋白	5.5±1.0*
0.5％截短的胶原蛋白	8.9±0.8
		0.1％截短的胶原蛋白	9.2±0.9
0.05％截短的胶原蛋白	9.2±0.3

*表示与未经处理的组统计学差异显著的值，p＜0.05。

表8显示，5％和1％的截短的胶原蛋白溶液减少了TT二聚体形成，具有统计学意义(p＜0.05)。数据以图形方式示于图5中。

用另一批截短的胶原蛋白(SEQ ID NO:91)重复该实验。在未暴露于UVB的细胞中，TT二聚体的量以ng/ml计为1.3±1.2，在未经处理的细胞中为18.1±0.4，在经100μg/mlTrolox处理的细胞中为7.9±0.3，对于5％胶原蛋白为13.1±0.2，而对于1％胶原蛋白为17.4±0.7。与未经处理的细胞相比，对于未暴露于UVB的细胞、经Trolox处理的细胞、5％胶原蛋白处理的细胞和1％胶原蛋白处理的细胞，TT二聚体形成的减少是统计学显著的(p＜0.05)。

实施例9：人胶原蛋白

截短的人21型胶原蛋白α1

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的人21型胶原蛋白α1在下文公开。编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列在下文公开。在SEQ ID NO:73和74中，DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。在SEQ ID NO:73和74中，截短的胶原蛋白序列由核苷酸73-633编码，并编码氨基酸25-211。

编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:73中提供。

氨基酸序列在SEQ ID NO:74中公开。

编码不具有DsbA分泌标签胶原蛋白的截短的人21型胶原蛋白α1的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:75中提供。

编码不具有DsbA分泌标签的截短的人21型胶原蛋白α1的氨基酸序列在SEQ IDNO:76中提供。

截短的人1型胶原蛋白α2(1)

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的人1型胶原蛋白α2在下文公开。密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列在下文公开。在SEQ ID NO:78和79中，DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。截短的胶原蛋白序列由核苷酸73-636编码，并编码氨基酸25-212。

编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:77中提供。

氨基酸序列在SEQ ID NO:78中公开。

编码不具有DsbA分泌标签的截短的人1型胶原蛋白α2(1)的核酸序列在SEQ IDNO:79中公开。

编码不具有DsbA分泌标签的截短的人1型胶原蛋白α2(1)的氨基酸序列在SEQ IDNO:80中公开。

截短的人1型胶原蛋白α2(2)

不具有His标签、接头和凝血酶切割位点的截短的人1型胶原蛋白α2在下文公开。密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列在下文公开。在SEQ ID NO:82和83中，DsbA分泌标签由核苷酸1-72编码，并编码氨基酸1-24。截短的胶原蛋白序列由核苷酸73-609编码，并编码氨基酸25-203。

编码此胶原蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:81中提供。

氨基酸序列在SEQ ID NO:82中公开。

不具有DsbA分泌标签的截短的人1型胶原蛋白α2(2)的核酸序列在SEQ ID NO:83中公开。

不具有DsbA分泌标签的截短的人1型胶原蛋白α2(2)的氨基酸序列在SEQ ID NO:84中公开。

将SEQ ID NO:73、77或81的多核苷酸亚克隆到载体pET28a中以制备转化载体。用载体转化宿主细胞，如实施例2所述表达多核苷酸。

发酵完成后，使用实施例3中公开的程序从发酵肉汤中纯化截短的人胶原蛋白。如实施例3中公开的，使用SDS-PAGE和HPLC分析纯化的截短的人胶原蛋白。

在SDS-PAGE分析中，所有三种截短的人胶原蛋白均以预期的分子量跑样。在使用HPLC分析截短的人胶原蛋白时，利用了使用实施例3的水母胶原蛋白的标准曲线。人胶原蛋白的滞留时间与水母胶原蛋白略有不同。SEQ ID NO:76的滞留时间为5.645分钟，SEQ IDNO:80的滞留时间为5.631分钟，并将SEQ ID NO:84在两个峰处跑样，并且滞留时间为5.531和5.7分钟。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短5

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短5的氨基酸序列在SEQID NO:92中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:93的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQID NO:92的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:93的核苷酸58-657，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:92的氨基酸20-219。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:93的核苷酸658-684，并且氨基酸序列为氨基酸220-228。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短5的核酸序列在SEQ IDNO:93中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:93的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的胶原蛋白。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约100千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短6

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短6的氨基酸序列在SEQID NO:94中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:95的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQID NO:94的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:95的核苷酸58-657，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:94的氨基酸20-219。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:95的核苷酸658-684，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:94的氨基酸220-228。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短6的核酸序列在SEQ IDNO:95中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:94的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的胶原蛋白。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约25千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短7

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短7的氨基酸序列在SEQID NO:96中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:97的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQID NO:96的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:96的核苷酸58-759，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:96的氨基酸20-253。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:97的核苷酸760-786，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:96的氨基酸254-262。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的人1型胶原蛋白α2截短7的核酸序列在SEQ IDNO:97中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:97的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的胶原蛋白。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约30千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

实施例10：截短的人胶原蛋白对成纤维细胞的保护作用

根据实施例6的方法确定截短的人胶原蛋白对成纤维细胞活力、前胶原合成和弹性蛋白合成的作用。

根据实施例7的方法确定截短的人胶原蛋白对角质形成细胞增殖和UVB保护的作用。

根据实施例8的方法确定截短的胶原蛋白对在暴露于UV辐射后的胸腺嘧啶二聚体形成的作用。

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且能基于此作出的各种修改或改变将由本领域技术人员想到，并且被包括在本申请的精神和范围之内以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

实施例11：截短的胶原蛋白对炎性细胞因子的作用

角质形成细胞和真皮成纤维细胞在皮肤的免疫反应中起重要作用。响应于刺激性化学物质或UV辐射(促炎症/促刺激的刺激物)，角质形成细胞可释放大量细胞因子。这些细胞因子被认为有助于使免疫细胞与炎症部位接触。角质形成细胞释放的细胞因子包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-18和IL-1RA。

用于此研究的测试模型是MatTek EpiDerm。此皮肤模型由正常的人源性表皮角质形成细胞组成，这些细胞已被培养以形成多层、高度分化的人表皮模型。超微结构分析表明存在透明角质颗粒、张力丝束、桥粒和包含按体内表皮特征排列的细胞间层状脂质层的多层角质层。成熟表皮特异性分化的标志物，诸如聚丝蛋白原、K1/K10细胞角蛋白对、内披蛋白和I型表皮转谷氨酰胺酶在该模型中已定位。MatTekEpiDerm还具有有丝分裂和代谢活性。

MatTek EpiDerm组织被用于评估各种测试材料抑制炎症介质IL-1α释放的能力。将测试材料与非处方局部用氢化可的松制剂(阳性对照)以及未经处理的组织(阴性对照1)和未经处理的非发炎组织(阴性对照2)进行比较。该测试还用于评估暴露于测试材料后组织的活力。

IL-1α、IL-6和IL-8合成并存储在角质形成细胞中，并且已被确定为皮肤刺激和炎症的介质。这些细胞因子的释放可以通过基于比色的酶联免疫吸附测定(ELISA)在组织培养基中直接测量。简而言之，与固相支持物共价连接的抗体将结合用过的培养基样品中存在的IL-1a、IL-6或IL-8。与乙酰胆碱酯酶共价连接的二抗将转而检测特异性结合的细胞因子。在加入适当的有色底物后，乙酰胆碱酯酶将产生可通过分光光度法测量的有色终产物。

MatTek EpiDerm组织购自MatTek公司，并在4℃下保存直至使用。使用前，将要使用的组织从琼脂糖运输托盘取出，并放入含有0.9ml不含氢化可的松的测定培养基(37±2℃)的6孔板中。允许组织在37±2℃和5±1％CO₂下孵育过夜。在此初始孵育后，将测定培养基替换为0.9ml新鲜的不含氢化可的松的培养基(37±2℃)。为每种测试材料准备了三份组织。

通过UV照射(UVB)引发组织中的炎症反应。使用UV灯向组织提供300mJ/cm²剂量的UVB辐射。在施加炎症刺激后，立即将50μl或mg的测试材料直接施加至组织表面。非处方氢化可的松乳膏用作阳性对照。对于阴性对照，将组织暴露于炎症刺激，但不使用任何类型的抗炎症材料进行处理。另一组组织不暴露于炎症刺激，以提供用于细胞因子的基线测量。暴露于炎症刺激后，将组织在37±2℃和5±1％CO₂下孵育24小时。孵育24小时后，收集细胞培养基并储存在-75℃下直至分析细胞因子。

通过在PBS中稀释合适的捕捉抗体来制备ELISA板。接下来，将100μl的稀释的捕捉抗体添加至96孔ELISA板的孔中，并将该板在室温下孵育过夜。第二天，将板用300μl洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤三次，然后通过向每个孔中加入300μl封闭缓冲液(含1％BSA的PBS)进行封闭。将板与封闭缓冲液一起孵育至少一小时。孵育后，去除封闭缓冲液并如上所述将板洗涤三次。

制备一系列标准品，并将各100μl的这些标准品分配到适当的96孔板中的两个孔中(一式两份)。随后，将100μl的每个样品添加到其他孔中，并将板在室温下孵育两小时。孵育后，如上所述将板洗涤三次。一旦去除最后的洗涤液，添加100μl生物素缀合的检测抗体。将板在室温下孵育两个小时后，如上所述再次洗涤该板。然后将100μl的HRP-链霉亲和素添加到每个孔中，并将板在室温下孵育20分钟。一旦去除最后的洗涤液，向每个孔中加入100μl的底物溶液(过氧化氢+四甲基联苯胺作为色原)。一旦发生足够水平的显色，将50μl的终止溶液(2N硫酸)添加到每个孔中，并在460nm处读取。

孵育24小时后，将组织用至少100μl磷酸盐缓冲盐水冲洗两次以去除测试材料，然后转移至含有1.0ml补充有MTT(1mg/ml)的测定培养基的6孔板中，并允许在37±2℃和5±1％CO₂下孵育3±0.25小时。孵育后，将组织用100μl磷酸盐缓冲盐水冲洗至少两次，吸干，然后放入每孔含2ml异丙醇的24孔板中。盖上24孔板并允许其在室温下在摇动平台上孵育至少2小时，以从组织中提取还原的MTT。提取后，将200μl异丙醇/MTT混合物样品转移至96孔板，并使用200μl的异丙醇作为空白，使用酶标仪在540nm下读取样品的吸光度。MTT测定在本文实施例6中描述。MTT测定的细胞活力结果与实施例6中获得的结果相似。

IL-1α测定的结果显示在下表9中。SEQ ID NO:91的水母胶原蛋白的2％原液是样品4，而样品3是SEQ ID NO:10的截短的水母胶原蛋白的2％原液。在下面的表9中，所示百分比是用于测试的原液的稀释百分比。例如，1％样品4处理是2％截短胶原蛋白原液的1％溶液。未经处理的细胞产生18.2pg/ml的Il-1a。在用截短的胶原蛋白处理后，所有样品均显示出Il-1a产量降低。1％样品4处理将IL-1a产量降低至13.4pg/ml，这是显著的，p值小于0.05。IL-1a产量的降低表明截短的胶原蛋白具有抗炎症作用。

表9 IL-1a检测

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)

实施例12：截短的胶原蛋白的城市灰尘保护

用角质形成细胞培养物模型评估截短的胶原蛋白通过促进在暴露于城市灰尘后的细胞存活来发挥保护作用的能力。

用测试材料预处理人表皮角质形成细胞，然后暴露于城市灰尘。然后在处理期结束时通过MTT测定确定细胞活力的变化。

将角质形成细胞接种在96孔板的各个孔的100μl的培养基中，并在37±2℃和5±1％CO₂下孵育过夜。在第二天，通过抽吸除去培养基以消除任何非粘附细胞，并替换为100μl的新鲜培养基。使细胞生长直至汇合，每48至72小时更换培养基。

用测试材料预处理随后进行城市灰尘处理

以其在细胞培养基中最终所需浓度的2倍(2x)制备测试材料。还以2x溶液制备了城市灰尘(来自Sigma Chemicals的NIST 1649B)。对于预处理，将50μl的2x测试材料与50μl的培养基结合，并且将细胞孵育24小时。在预处理结束时，去除含有培养基的测试材料并替换为50μl的2x城市灰尘和50μl的培养基。另一组细胞仅用培养基处理(无灰尘暴露)，并用作参考对照以代表100％的细胞活力，然后将细胞孵育24小时，然后进行MTT测定以确定细胞活力的变化。

在处理期结束时，去除细胞培养基，并用PBS洗涤细胞。洗涤后，向每个孔中加入100μl补充有0.5mg/ml MTT的细胞培养基，并将细胞在37±2℃和5±1％CO₂下孵育30分钟。孵育后，去除培养基/MTT溶液，并再次用PBS洗涤细胞一次，然后将100μl的异丙醇添加至孔中以提取紫色甲臢晶体。然后使用异丙醇作为空白，在540nm处读取96孔板。

计算无灰尘暴露细胞的平均MTT吸光度值，并将其用于代表细胞数的100％值。然后，将来自经过各种处理的细胞的各个MTT值除以无灰尘暴露细胞的平均值并表示为百分比，以确定每种处理引起的细胞数的变化。

用测试材料进行预处理再进行灰尘处理的MTT结果示于表10。表10显示，随着用增加量的胶原蛋白处理细胞，在用截短的胶原蛋白预处理并随后暴露于城市灰尘后，细胞活力增加。这些结果显示，截短的胶原蛋白可防止与城市灰尘暴露相关的细胞活力下降。

表10 MTT测定，截短胶原蛋白预处理

*表示与未经处理的组显著不同的值(p＜0.05)

实施例12：具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis(肾海绵)胶原蛋白截短的Chondrosia reniformis(肾海绵)纤维状胶原蛋白1

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白1的氨基酸序列在SEQ ID NO:102中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:103的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:102的氨基酸1-19。纤维状胶原蛋白的核苷酸序列是SEQ IDNO:103的核苷酸58-792，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:102的氨基酸20-264。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:103的核苷酸793-819，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:102的氨基酸265-273。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白1的核酸序列在SEQ ID NO:103中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:103的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白1。纯化的纤维状胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约40千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis(肾海绵)纤维状胶原蛋白2

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白2的氨基酸序列在SEQ ID NO:104中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:105的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:104的氨基酸1-19。纤维状胶原蛋白的核苷酸序列是SEQ IDNO:105的核苷酸58-1323，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:104的氨基酸20-441。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:105的核苷酸1324-1350，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:104的氨基酸442-450。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白2的氨基酸序列在SEQ ID NO:105中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:105的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Chondrosia reniformis纤维状胶原蛋白2。纯化的纤维状胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约55千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis(肾海绵)非纤维状胶原蛋白1

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白1的氨基酸序列在SEQ ID NO:106中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:107的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:106的氨基酸1-19。非纤维状胶原蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO:107的核苷酸58-831，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:106的氨基酸20-277。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:107的核苷酸832-858，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:106的氨基酸278-286。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白1的核酸序列在SEQ ID NO:107中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:107的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白1。纯化的非纤维状胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约30千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis(肾海绵)非纤维状胶原蛋白2

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白2的氨基酸序列在SEQ ID NO:108中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:109的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:108的氨基酸1-19。非纤维状胶原蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO:109的核苷酸58-1509，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:108的氨基酸20-503。FLAG核苷酸序列是SEQ ID NO:109的核苷酸1510-1536，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:108的氨基酸504-512。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白2的核酸序列在SEQ ID NO:109中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:109的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Chondrosia reniformis非纤维状胶原蛋白2。纯化的纤维状胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约60千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

实施例13：具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus(鲸鲨)胶原蛋白截短的Rhincodon typus(鲸鲨)1型胶原蛋白α1截短1

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 1型胶原蛋白截短1的氨基酸序列在SEQ ID NO:110中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:111的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:110的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:111的核苷酸58-630，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:110的氨基酸20-210。FLAG核苷酸序列是SEQ IDNO:111的核苷酸631-657，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:110的氨基酸211-219。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 1型胶原蛋白截短1的核酸序列在SEQ ID NO:111中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:111的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Rhincodon typus 1型胶原蛋白截短1。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约25千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus(鲸鲨)6型胶原蛋白α1截短2

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 6型胶原蛋白截短2的氨基酸序列在SEQ ID NO:112中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:113的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:112的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:113的核苷酸58-684，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:112的氨基酸20-228。FLAG核苷酸序列是SEQ IDNO:113的核苷酸685-711，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:112的氨基酸229-237。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 6型胶原蛋白截短2的核酸序列在SEQ ID NO:113中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:113的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Rhincodon typus 6型胶原蛋白截短2。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约35千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus(鲸鲨)6型胶原蛋白α1截短3

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 6型胶原蛋白α1截短3的氨基酸序列在SEQ ID NO:114中公开。DsbA分泌标签由SEQ ID NO:115的核苷酸1-57编码，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:114的氨基酸1-19。胶原蛋白核苷酸序列是SEQ ID NO:115的核苷酸58-735，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:114的氨基酸20-245。FLAG核苷酸序列是SEQ IDNO:115的核苷酸736-762，并且氨基酸序列为SEQ ID NO:114的氨基酸246-254。

具有DsbA分泌和FLAG标签的截短的Rhincodon typus 6型胶原蛋白α1截短3的核酸序列在SEQ ID NO:115中公开。

如本文所述，将SEQ ID NO:115的多核苷酸亚克隆至载体pET28a中，在宿主大肠杆菌细胞中表达，并纯化截短的Rhincodon typus 1型胶原蛋白截短1。纯化的胶原蛋白在SDS-PAGE上产生一条清晰的条带，并且在约25千道尔顿处观察到抗FLAG蛋白质印迹。在不存在该蛋白质的表达的情况下，在凝胶上不存在出现在该位置的条带。

Claims (70)

1.一种非天然存在的胶原蛋白，其选自水母胶原蛋白、人胶原蛋白、Chondrosiareniformis(肾海绵)胶原蛋白和Rhincodon typus(鲸鲨)胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述非天然存在的胶原蛋白是截短的。

3.根据权利要求2所述的非天然存在的截短的胶原蛋白，其中所述胶原蛋白被在50个氨基酸至300个氨基酸之间的内部截短所截短。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述胶原蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:112。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述胶原蛋白还包含选自分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点和β-内酰胺酶蛋白的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述分泌标签是DsbA。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述胶原蛋白还包含甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复。

8.根据权利要求7所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述非天然存在的胶原蛋白包含在2至50个之间的氨基酸三聚体重复。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的非天然存在的胶原蛋白，其中所述非天然存在的胶原蛋白是水母胶原蛋白。

10.一种包含在0.005％至30％w/w之间的权利要求1至9中任一项所述的非天然存在的胶原蛋白的组合物，其中所述组合物刺激成纤维细胞的生长，并且/或者刺激前胶原的合成，并且/或者减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体形成。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含在0.005％至1％之间的非天然存在的胶原蛋白。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含在0.01％至1％之间的非天然存在的胶原蛋白。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含在0.02％至0.5％之间的非天然存在的胶原蛋白。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物是局部用组合物，所述局部用组合物还包含至少一种另外的成分，所述另外的成分包括局部用载体和/或防腐剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述局部用组合物是面膜。

16.根据权利要求14或15所述的局部用组合物，其中所述局部用载体选自脂质体、可生物降解的微胶囊、乳液、喷雾、气溶胶、粉剂(dusting powder)、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅油、环戊硅氧烷和水。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的局部用组合物，其中所述防腐剂选自生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基二环噁唑烷、羟苯甲酯、山梨酸、GermabenII、迷迭香提取物和EDTA。

18.一种减少皮肤损伤、促进受损皮肤的修复、保护皮肤免受UV损伤或增加皮肤细胞活力的方法，所述方法包括将权利要求1至17中任一项所述的组合物应用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的成纤维细胞的活力增加。

20.根据权利要求18所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的成纤维细胞对前胶原的合成增加。

21.一种非天然存在的弹性蛋白，其选自水母弹性蛋白、人弹性蛋白、Chondrosiareniformis(肾海绵)弹性蛋白或Rhincodon typus弹性蛋白。

22.根据权利要求21所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述非天然存在的弹性蛋白是截短的。

23.根据权利要求22所述的非天然存在的截短的弹性蛋白，其中所述弹性蛋白被至少50个氨基酸的截短所截短。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述弹性蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:98和SEQID NO:100。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述弹性蛋白还包含选自分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点和β-内酰胺酶蛋白的氨基酸序列。

26.根据权利要求25所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述分泌标签是DsbA。

27.根据权利要求21至26中任一项所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述弹性蛋白还包含甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复。

28.根据权利要求27所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述非天然存在的弹性蛋白包含在2至50个之间的氨基酸三聚体重复。

29.根据权利要求21至28中任一项所述的非天然存在的弹性蛋白，其中所述非天然存在的弹性蛋白是人弹性蛋白。

30.一种包含在0.005％至30％w/w之间的权利要求21至29中任一项所述的非天然存在的弹性蛋白的组合物，其中所述组合物刺激成纤维细胞的生长，并且/或者刺激前胶原的合成。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含在0.005％至1％之间的非天然存在的弹性蛋白。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含在0.01％至1％之间的非天然存在的弹性蛋白。

33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含在0.02％至0.5％之间的非天然存在的弹性蛋白。

34.根据权利要求30至33中任一项所述的组合物，其中所述组合物是局部用组合物，所述局部用组合物还包含至少一种另外的成分，所述另外的成分包括局部用载体和/或防腐剂。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述局部用组合物是面膜。

36.根据权利要求34或35所述的局部用组合物，其中所述局部用载体选自脂质体、可生物降解的微胶囊、乳液、喷雾、气溶胶、粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅油、环戊硅氧烷和水。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的局部用组合物，其中所述防腐剂选自生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基二环噁唑烷、羟苯甲酯、山梨酸、GermabenII、迷迭香提取物和EDTA。

38.一种减少皮肤损伤、促进受损皮肤的修复或保护皮肤免受UV损伤的方法，所述方法包括将权利要求21至37中任一项所述的组合物应用于受试者的皮肤的步骤。

39.根据权利要求38所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的成纤维细胞或角质形成细胞的活力增加。

40.根据权利要求38所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的成纤维细胞对前胶原的合成增加。

41.一种编码非天然存在的胶原蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:105。

42.根据权利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是载体。

43.根据权利要求41或42所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含选自编码分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点和β-内酰胺酶蛋白的核酸的核酸。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复的多核苷酸。

45.一种宿主细胞，其包含根据权利要求41或45中任一项所述的多核苷酸。

46.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞将所述非天然存在的胶原蛋白运输至所述宿主细胞的周质空间。

47.根据权利要求45或46所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生水母胶原蛋白。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述大肠杆菌是转换的大肠杆菌。

51.一种产生非天然存在的胶原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在培养基中培养权利要求45至50中任一项所述的宿主细胞；和

b.从所述宿主细胞分离所述非天然存在的胶原蛋白。

52.一种编码非天然存在的弹性蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:101。

53.根据权利要求52所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是载体。

54.根据权利要求52或53所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含选自编码分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点和β-内酰胺酶蛋白的核酸的核酸。

55.根据权利要求52至54中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸(GEK)和/或甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(GDK)序列的一个或多个氨基酸三聚体重复的多核苷酸。

56.一种宿主细胞，其包含根据权利要求52至55中任一项所述的多核苷酸。

57.根据权利要求56所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞将所述非天然存在的胶原蛋白运输至所述宿主细胞的周质空间。

58.根据权利要求56或57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生水母胶原蛋白。

59.根据权利要求56至58中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述大肠杆菌是转换的大肠杆菌。

62.一种产生非天然存在的弹性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在培养基中培养权利要求56至61中任一项所述的宿主细胞；和

b.从所述宿主细胞分离所述非天然存在的胶原蛋白。

63.一种减少由皮肤细胞产生的炎性细胞因子的方法，所述方法包括将权利要求1至17中任一项所述的组合物应用于所述皮肤细胞的步骤。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述炎性细胞因子是IL-1a。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述皮肤细胞是角质形成细胞。

66.一种增加皮肤细胞活力的方法，所述方法包括将权利要求1至17中任一项所述的组合物应用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤。

67.根据权利要求66所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的角质形成细胞的活力增加。

68.根据权利要求66所述的方法，其中存在于所述受试者的皮肤中的成纤维细胞的活力增加。

69.一种保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法，所述方法包括将权利要求1至17中任一项所述的组合物应用于皮肤细胞的步骤，其中所述皮肤细胞的活力增加。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述皮肤细胞是角质形成细胞或成纤维细胞。

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