WO2005095445A1

WO2005095445A1 - 新規塩基性抗菌ペプチド及びその利用

Info

Publication number: WO2005095445A1
Application number: PCT/JP2005/005724
Authority: WO
Inventors: Hiroki Nikawa; Taizo Hamada; Masahiro Nishimura; Koichiro Tsuji
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2004-03-30
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2005-10-13
Also published as: JP2005281225A

Abstract

　生体に対しての副作用や阻害作用がきわめて小さく、かつ、有用な活性を有する新規抗菌ペプチドを提供すること、及び、該抗菌ペプチドの抗菌剤又は細胞増殖促進剤としての利用を提供するものである。配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる新規塩基性抗菌ペプチドは、口腔内微生物に対しての広いスペクトルと強い抗菌性をもち、特に虫歯菌であるミュータンス菌に対して強い殺菌作用を有する。更に、この抗菌ペプチドは、間葉系幹細胞や線維芽細胞のような細胞の増殖促進活性を有する。本発明は、該配列番号１に示される抗菌ペプチドのアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、或いは付加した誘導体である塩基性抗菌ペプチドを包含する。また、本発明は、本発明の塩基性抗菌ペプチドの抗菌剤又は細胞増殖促進剤としての利用を包含する。

Description

明細書

新規塩基性抗菌ペプチド及びその利用

技術分野

[0001] 本発明は、新規塩基性抗菌ペプチド、及び、該塩基性抗菌ペプチドの抗菌剤及び細胞増殖促進剤としての利用に関する。

背景技術

[0002] 生物は外界の微生物に対して自らを防御するため、様々な防御機構を備えている力その一つに抗菌性ペプチドを挙げることができる（デンタルダイヤモンド 26, No.356, 85-90, 2001)。かかる抗菌性ペプチドは、本来生物自らが産生しているものであるため、生体に対しての副作用あるいは阻害作用は極めて小さぐしかも細菌（グラム陽性、陰性を含む)及び真菌と広い抗菌スペクトルを持っているために、抗生物質に代わり得るものとして大きな期待を集めている。

[0003] かかる抗菌性のペプチドとして、ヒスタチン（Histatin)、ディフェンシン（Defensin)、ラタトフェリン（Lactoferrin)、ラタトフエリンの分解産物であるラタトフエリシン（

Lactoferrcin)、マガイ-ン（Magainin)、セクロピン（Cecropin)、メリチチン（Melititin)、マキユラチン（maculatin)等の天然由来の抗菌性ペプチドや、オランダの ACTAグループによりヒスタチン誘導体として合成された Dhvar4及び Dhvar5 (FEBS Lett, 449, 105-110, 1999)、更に、本発明者により合成された 2つの抗菌ペプチド (特開 2002 179698号公報、特開 2002— 179699号公報)等の設計された抗菌ペプチドが知られている。

[0004] 天然のヒトヒスタチンファミリ一として、ヒトの顎下及び耳下の唾液分泌液中に見られる、ヒスチジンに富む 12種類の低分子量ペプチド群が知られている（J.Biol.Chem., 261, 1177-1182, 1986 ; J.Biol.Chem., 263, 7472-7477, 1988

； J.Dent.Res., 69, 2-6, 1990)。これらヒスタチン類の中でも、それぞれ 38、 32及び 24 アミノ酸残基力も構成されているヒスタチン 1、 3及び 5がヒト唾液中に多く存在しており、成人健常者の唾液中に 50〜450 /ζ ₈Ζπι1の濃度で存在している（J.Biol.Chem., 273, 20438-20447, 1998)。抗カンジダ作用が最も高いとされているヒスタチン 5は、ヒスタチン 3の 32のアミノ酸残基の 1〜24残基と共通したアミノ酸配列を有している。

[0005] ディフェンシンファミリ一は、 6個のシスティン残基が 3対の分子内ジスルフイド結合を形成するカチオン性のペプチドとして特徴づけられて、る。これらのシスティン残基のジスルフイド結合の組合せにより、ヒトディフェンシンファミリ一は、 α—及び j8—の 2種のサブファミリーに分類される。 1985年に Ganzらにより初めて見出されたヒト a ディフェンシンについては、現在 6個の異なる分子が報告されている。また、ヒト |8 ディフェンシンには、腎臓、脾臓、尿管、気道、その他数種の上皮組織で構成的に発現するヒト j8—ディフェンシン— 1と、皮膚、肺、口腔粘膜、唾液などにも存在することが確認され、 41アミノ酸残基力も成るシスティンリッチのカチオン性ペプチドであるヒト j8—ディフェンシン一 2とが知られている（Eur J Oral Sci; 109, 121-124, 2002) ₀ また、ヒト βディフェンシン 1及びヒト βディフェンシン 2が、歯周炎の原因菌の 1つであるグフム陰'性菌の Actinobacillus actinomycetemcomitanに強ヽ抗菌活'性;^あることや、 Porphyromonas gmgivalis、 Bacteroides rorsythus、 Prevotella intermedia^ Campylobacter rectus ^ Fusobacteriumspecies、 Eubacterium species ^ Treponema speciesなどの歯周炎原因菌にも抗菌活性があることが知られている（特開 2001— 2 88105号公報）。

[0006] 抗菌性のペプチドについては、近年、特許公報に、上記記載のもの以外にも、各種のものが開示されている。例えば、特開平 2— 53799号公報及び特開平 5— 271 096号公報にはカブトガ-由来の抗菌ペプチドが、特表平 2— 500084号公報には蜜蜂の血リンパから単離された抗菌ペプチドが、特開平 5— 78392号公報、特開平 5— 92994号公報、特開平 5— 148295〜7号公報、特開平 9— 124504号公報、特開平 9— 165342号公報、及び特開平 11— 92375号公報にはラタトフエリン分解物から単離された抗菌ペプチド力特開平 6— 80695号公報には力エルの皮膚から分離された抗菌ペプチドが、それぞれ開示されている。

[0007] また、特開平 8— 119995号公報には蚕の体液から単離された抗菌ペプチド (モリシン)が、特開平 10— 1498号公報にはゥシ胎児血清から単離された抗菌ペプチド力特開 2000— 26499号公報には力ブトムシの生産する抗菌ペプチド力特開 20 00— 217578号公報に ίまヒト血漿成分由来の抗菌ペプチド力特表 2002— 50364 1号公報にはカゼインのトリプシン消化物力も単離された抗菌ペプチド力特表 2002 — 522556号公報にはアメリカガエルの皮膚力も分離された抗菌ペプチド力特開 2 003— 267805号公報にはリゾチウムのトリプシン分解物から単離された抗菌べプチドがそれぞれ開示されて!、る。

[0008] 一般に，抗菌性のペプチドは塩基性〜中性であり、かつ両親媒性である。微生物の細胞膜あるいは細胞壁は生体細胞に比べて陰性荷電が非常に高ぐこのようなぺプチドの塩基性 (pi値が高い）という性質は、微生物の細胞膜との (非特異的ではあるが）選択的な初期結合を促進するために必要であると考えられて、る。したがって、 pi値が低く生理学的 pH域で陽性（+ )に荷電しにくいペプチドの場合、その多くが抗菌性はあっても細胞毒性が高いことが知られている。このように、抗菌ペプチドは、本来自然免疫と関連して、外来性の微生物刺激に反応して分泌される。このようなぺプチドは、だ液などのイオン強度の低、溶液中では非常に強、抗菌活性を示す事が知られている（J.Biol.Chem., 273, 20438-20447, 1998 ;Biochim Biophys Acta., Dec 15;1462(l-2), 55-70, 1999)。

例えば、ヒスタチン 5は 20〜50mMPBSで抗菌活性を失うことが知られている。また、歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞によっても産生される β ディフェンシンは組織内ではほとんど抗菌活性は示さない（Jpn. J. Med Mycol, 41, 77-81, 2000)。これは組織液や血液のイオン強度が高、ため抗菌活性が失われて、ると考えられて、る。

[0009] 一方、現在、医科歯科領域において組織再生医学に関する研究及び臨床応用が趨勢を極めている。このような組織再生には、主として患者力も採取した自己細胞（特に幹細胞)を体外で培養 Z増殖 Z分化させ、再生した組織を移植するとヽぅ型がとられている。例えば、間葉系幹細胞を培養 Z増殖させる場合に、主として塩基性線維芽細胞増殖因子 (塩基性 FGF)が用いられて、る（特開 2003— 52365号公報)。しかし、この塩基性 FGFは非常に高価であり、このため大量培養や増殖が非常に高価なものになる。また、培養途中、あるいは生体移植時に感染の恐れがあり、感染した場合には術後経過 ·予後が非常に悪くなると、う問題が残って!/、る。したがって、生体に対して安全であり、し力も安価な細胞増殖因子の開発が切に要望されているのが現状である。特許文献 1：特開平 2— 53799号公報。

特許文献 2：特開平 5— 271096号公報。

特許文献 3：特表平 2— 500084号公報。

特許文献 4：特開平 5— 78392号公報。

特許文献 5 :、特開平 5— 92994号公報。

特許文献 6：特開平 5— 148295〜7号公報。

特許文献 7：特開平 9一 124504号公報。

特許文献 8：特開平 9一 165342号公報。

特許文献 9：特開平 11一 92375号公報。

特許文献 10：特開平 6— 80695号公報。

特許文献 11：特開平 8— 119995号公報。

特許文献 12 :特開平 10— 1498号公報。

特許文献 13：特開 2000— 26499号公報。

特許文献 14 :特開 2000— 217578号公報。

特許文献 15：特開 2001— 288105号公報。

特許文献 16 :特開 2002— 179698号公報。

特許文献 17 :特開 2002— 179699号公報。

特許文献 18：特表 2002 - 503641号公報。

特許文献 19：特表 2002 - 522556号公報。

特許文献 20：特開 2003 - 52365号公報。

特許文献 21：特開 2003— 267805号公報。

非特許文献 1 :デンタルダイヤモンド 26, No.356, 85-90， 2001。非特許文献 2 : FEBS Lett, 449, 105-110， 1999。

非特許文献 3 :J.Biol.Chem.， 261, 1177-1182, 1986。

非特許文献 4 :J.Biol.Chem.， 263, 7472-7477, 1988。

非特許文献 5 :J.Dent.Res.， 69, 2-6, 1990。

非特許文献 6 :J.Biol.Chem.， 273, 20438-20447, 1998。

非特許文献 7 : Eur J Oral Sci; 109， 121-124， 2002。非特許文献 8 :J.Biol.Chem.， 273, 20438-20447, 1998。

非特許文献 9 : Biochim Biophys Acta., Dec 15;1462(1- 2), 55-70, 1999。

非特許文献 10 :Jpn. J. Med Mycol, 41, 77-81, 2000。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明の課題は、生体に対しての副作用や阻害作用がきわめて小さぐかつ、有用な活性を有する新規抗菌ペプチドを提供すること、及び、該抗菌ペプチドの抗菌剤又は細胞増殖促進剤としての利用を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者は、上記課題を解決すベぐ新規抗菌ペプチドについて鋭意探索する中で、本発明者が人為的に設計した新規なアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド力口腔内微生物に対しての広いスペクトルと強い抗菌性をもち、特に虫歯菌であるミュータンス菌に対して強い殺菌作用を有し、更に、この抗菌ペプチドが、間葉系幹細胞や線維芽細胞のような細胞の増殖促進活性を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明の新規抗菌ペプチドは、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなり、本発明は、該抗菌ペプチドのアミノ酸配列において、 1乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、或いは付加した誘導体である塩基性抗菌ペプチドを包含する。また、本発明は、本発明の塩基性抗菌ペプチドの抗菌剤又は細胞増殖促進剤としての利用を包含するものである。

[0013] 本発明の開発の経緯について説明すると、抗菌ペプチドは、本来自然免疫と関連して、外来性の微生物刺激に反応して分泌される。このようなペプチドは、だ液などのイオン強度の低、溶液中では非常に強、抗菌活性を示す事が知られて、る (J Biol Chem 273:20438-47,1998 ; Biochim Biophys Acta. 1999 Dec

15;1462(l-2):55-70) ) _o例えば、ヒスタチン 5は 20〜50mMPBSで抗菌活性を失う事が知られている。一方で、歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞によっても βデフェンシンという抗菌ペプチドが産生される力組織内ではほとんど抗菌活性は示されない（安部茂，山ロ英世;真菌感染に対する生体防御， Jpn. J. Med Mycol, 41, 77-81, 2000)。これは組織液や血液のイオン強度が高、ため抗菌活性が失われて、ると考えられている。

[0014] 本発明者は、これまでに天然の抗菌ペプチドの細胞増殖作用並びに人為的に設計したアミノ酸配列を持つ抗菌ペプチドにつ!/、て合成を行、、その抗菌作用及び細胞増殖作用等について ¾1¾意研究を行なってきたが、今回、人為的に設計した新規なアミノ酸配列を持つペプチド CFH8944)を合成し、その抗菌性並びにラット間葉系幹細胞に対する細胞増殖効果を検討した。その結果として、今回、人為的に設計したペプチドが、カンジダ属酵母に弱いながら殺菌効果を示すと共に、虫歯菌であるミユータンス菌に強ヽ殺菌活性を示す事を見い出した。これは図 1に示す如く Groenink らカグラム陽性菌，グラム陰性菌に広いスペクトルを持つと報告（ FEMS Microbiol Lett. 1999 Oct 15;179(2):217- 22.)している LFBshortよりも有意に強い効果であった

[0015] 更に、本発明者が、今回人為的に設計した新規なアミノ酸配列を持つペプチドについて、その細胞増殖作用について検討したところ、該ペプチドが、ラット間葉系幹細胞に対する細胞増殖効果を示す（図 2)ことを見い出し、本発明を完成するに至つた。本発明の抗菌ペプチドに類するものは、本来自然界に存在するものであるので、生体に対しての副作用や阻害作用がきわめて小さぐ生物に投与した場合に、安全に効能を発揮させることができ、抗生物質などのような生体に対する為害性や副作用を回避することが可能である。し力も、本発明の抗菌性ペプチドは、塩基性 FGFに比ベて非常に安価であり、細胞増殖促進剤としての利用に際して、安価な薬剤としての利用が可能である。また、本発明の抗菌性ペプチドは、口腔内微生物に対しての広いスペクトルと強い抗菌性を持っており、これらの微生物に対する有効な抗菌剤としての利用が可能である。更に、抗菌剤としての使用に対する耐性菌の出現に対しても、自然免疫の成分ということから現在、その可能性は非常に低いことが期待される。

[0016] すなわち具体的には本発明は、（1)配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド、又は、該ペプチドのアミノ酸配列において、 1乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、或いは付加した誘導体である塩基性抗菌ペプチドや、 (2) 上記（1)記載の塩基性抗菌ペプチド、又は、その薬学的に許容される誘導体或いはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする抗菌剤や、（3)抗菌剤が、口腔内微生物用の殺菌剤であることを特徴とする上記 (2)記載の抗菌剤や、（4)口腔内微生物が、ミュータンス菌であることを特徴とする上記（3)記載の抗菌剤や、（5)上記（1) 記載の塩基性抗菌ペプチドからなる細胞増殖促進因子や、（6)細胞増殖の促進が、間葉系幹細胞又は線維芽細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする上記（5)記載の細胞増殖促進因子や、（7)間葉系幹細胞の細胞増殖促進が、歯槽骨の骨髄、口蓋又は歯槽骨の骨膜から分離された間葉系幹細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の細胞増殖促進因子や、 (8)線維芽細胞の細胞増殖促進が、歯肉線維芽細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする上記（5)又は (6) 記載の細胞増殖促進因子や、 (9)上記（5)〜（8)の、ずれか記載の細胞増殖促進因子を有効成分としてなる細胞増殖促進剤からなる。

[0017] また本発明は、（10)上記（9)記載の細胞増殖促進剤を用いて、インビトロ又はインビボの細胞増殖における細胞増殖促進を行なうことを特徴とする細胞の増殖方法や、（11)インビトロの細胞増殖における細胞増殖促進が、間葉系幹細胞の細胞増殖における細胞増殖促進であることを特徴とする上記（10)記載の細胞の増殖方法や、 ( 12)インビボの細胞増殖における細胞増殖促進が、組織移植における、移植組織細胞の増殖促進であることを特徴とする上記（10)記載の細胞の増殖方法力もなる。発明の効果

[0018] 本発明の新規抗菌ペプチドは、生体に対しての副作用や阻害作用がきわめて小さぐ生物に投与した場合に、安全に効能を発揮させることができ、し力も、本発明の抗菌ペプチドは、塩基性 FGFに比べて非常に安価であるので、生体内に投与する抗菌剤として、安全かつ有効な効能の薬剤としての利用が可能であり、また、細胞増殖促進剤として、安価で有効な薬剤としての利用が可能である。特に、本発明の抗菌ペプチドは、口腔内微生物に対しての広いスペクトルと強い抗菌性を持っており、これらの微生物に対する有効な抗菌剤としての利用が可能であり、更に、抗菌剤としての使用に対する耐性菌の出現に対しても、自然免疫の成分ということから現在、その可能性は非常に低いことが期待される。

[0019] また、本発明の抗菌ペプチドは、細胞増殖促進剤として用いて、インビトロ又はインビボの細胞増殖における有効な細胞増殖促進を行なうことができる。そして、本発明の抗菌ペプチドは、安価に提供できるとという利点から、本発明の塩基性抗菌べプチドを有効成分とする細胞増殖剤として用いて、各種細胞、特に幹細胞などをインビト口で、経済的にかつ効率よく増殖させることが可能となる。特に、本発明の細胞増殖促進剤は、インビボにおける実際の臨床応用における組織移植の際の細胞増殖促進剤として有効に利用することができ、力かる場合に抗菌性を有するペプチドとしての細胞の移植後組織内での増殖促進は、術後感染の防止と、う観点からも非常に重要な意味を持つものである。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 本発明は、配列表の配列番号 1に示される新規アミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド、又は、該ペプチドのアミノ酸配列において、 1乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、或いは付加した誘導体である塩基性抗菌ペプチドよりなり、該塩基性抗菌べプチド、又は、その薬学的に許容される誘導体或いはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする抗菌剤、或いは、該塩基性抗菌ペプチドからなる細胞増殖促進剤を提供することからなる。

[0021] 本発明において、抗菌作用の対象となる微生物としては特に限定されないが、本発明の塩基性抗菌ペプチドが広い抗菌スぺ外ルと強い抗菌作用を有する口腔内微生物が、対象となる微生物として挙げることができる。また、本発明の塩基性抗菌べプチドが特に強い殺菌作用を示す虫歯菌であるミュータンス菌が、特に対象となる微生物として挙げることができる。本発明の塩基性抗菌ペプチドからなる細胞増殖促進剤の細胞増殖促進の対象となる細胞としては、特に限定されないが、間葉系幹細胞又は線維芽細胞等の動物細胞を増殖促進の対象として挙げることができ、該細胞の増殖は、細胞増殖促進剤を用いて、インビトロ又はインビボで行なうことができる。間葉系幹細胞の細胞増殖促進としては、歯槽骨の骨髄、口蓋又は歯槽骨の骨膜から分離された間葉系幹細胞 (特開 2003— 52365号公報)の細胞増殖促進をあげることができる。また、インビボの細胞増殖における細胞増殖促進としては、組織移植における、移植組織細胞の増殖促進等を挙げることができる。

[0022] 更に、本発明の細胞増殖促進の対象となる細胞を具体的に挙げれば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、 NK前駆細胞、胚性幹細胞等の幹細胞を挙げることができ、中でも骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、腱細胞、歯根膜、セメント質などの細胞へと分化しうる又はそれらの修復を促進しうる多能性を有する未分化な細胞である間葉系幹細胞を適合した対象として挙げることができる。幹細胞の場合、本発明の細胞の増殖方法には、細胞の分化誘導培養方法も含まれ、例えば、間葉系幹細胞の分化誘導培養は、特開 2003— 52360号公報に記載の方法で行うことができる。

[0023] 非ヒト動物体内などインビボで細胞を増殖させる場合、本発明の細胞増殖剤を局所に添加することにより対象とする細胞を、汚染微生物の増殖抑制下に増殖することができる。この場合、抗菌性ペプチドなどの細胞増殖剤を発現しうる DNAベクターの形態で添加することもできる。インビトロや、細胞が生体力も摘出され、一時的にインビト口で培養されて、生体内に戻されるエタスビボで細胞を増殖させる場合、当該細胞の培養に通常用いられている培地条件下で培養することができる。

[0024] 本発明の塩基性抗菌ペプチドは、遺伝子工学的手法により作製することもできるが、ペプチド合成法により化学的に合成することができる。ペプチド合成には、液相法及び固相法が存在するがいずれの方法も使用することができる。液相法は、反応を溶液状態で行い反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に準じ縮合反応を行、ペプチド鎖を伸長させていく方法である。

[0025] ペプチドの化学合成は、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したァミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させ、次にアミノ保護基を除去後、遊離したァミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸を順次、 C末端から N末端に向かって一つずつ延長していく方法が基本である。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性ィ匕して、結合させようとするアミノ基と反応させる。この活性化には、ジシクロへキシカルボジィミド (DCC)法、活性エステル法、酸無水物法、アジド法等があるがその反応性の高さとラセミ化その他の副反応を考慮して選ばれる。縮合反応時の副反応を防止するためにアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、側鎖 (R)の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応の条件で安定であり、必要なときには速やかに除去されるものが好ましい。また、ァミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは互いに選択的に除去されることが好ましい。

[0026] ァミノ基の保護基としては、例えばべンジルォキシカルボ-ル（Bz)、 tーブチルォキシカルボ-ル（Boc)、 p—ビフエ-ルイソプロピロォキシカルボ-ル、 9—フルォレ- ルメチルォキシカルボ-ル (fmoc)等を挙げることができる。カルボキシ基の保護基としては、たとえばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基を挙げることができる。但し、固相法の場合は、 C末端のカルボキシル基はクロ口トリチル榭脂、クロルメチル榭脂、ォキシメチル榭脂、 P アルコキシベンジルアルコール榭脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルポジイミド等の縮合剤の存在下、あるいは N— 保護アミノ酸活性エステル又はペプチド活性エステルを用いて実施する。縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相の場合はさらにペプチドの C末端と榭脂との結合を切断する。更に、化学合成されたペプチドは通常の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー等により精製される。合成したペプチドは、エドマン分解法で C—末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークェンサ一、 GC MS等で分析することができる。

[0027] 本発明の抗菌ペプチドは、遺伝子工学的手法を用いて調製することもできる。遺伝子工学的手法としては、例えば、本発明の新規ペプチドをコードする DNA配列を合成し、該 DNA配列からなる遺伝子が挿入された発現ベクターにより形質転換又は形質導入された宿主細胞を用いて遺伝子を発現し、新規ペプチドを生産する。該遺伝子工学的手法に用いられる宿主細胞としては、宿主細胞としては、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができる。真核細胞としては動物、植物、昆虫、酵母等の細胞が、また原核細胞としては大腸菌、枯草菌、放線菌等適宜の宿主細胞を用いることができる。また、該遺伝子工学的手法に用いられるベクターとしては、公知の宿主細胞に適合した適宜のベクターを用いることができる。

[0028] 本発明の抗菌ペプチドは、製薬学的に許容される誘導体或いは塩の形態で用いることもできる。抗菌ペプチドの誘導体としては、抗菌ペプチドの一部置換体または付加化合物等のペプチド誘導体であり、例えば、カルボキシル基をアミドィ匕またはァシルイ匕した誘導体を例示することができる。また、力かる塩としては、塩酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩等の無機酸塩、及び、 P—トルエンスルホン酸塩、メタスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。本発明の抗菌剤及び

Z又は細胞増殖促進剤は、他の抗菌剤及び Z又は細胞増殖促進剤と併用することもできる。本発明の抗菌剤は、医薬組成物又は食品の形態として使用することができる。医薬組成物は、医薬品、医薬部外品のいずれも含む。これらは、常法により錠剤、顆粒剤、粉末剤、ゲル、カプセル剤、懸濁剤、注射剤、坐剤、液剤、軟膏、外用剤等の種々の剤型とすることができる。これらの医薬組成物は、抗菌ペプチド又はその製薬学的に許容される塩に、必要に応じてプロテアーゼ阻害剤、さらに製薬学的に許容される担体を配合して製造することができる。

[0029] 具体的には、固形製剤の場合は、抗菌ペプチド等に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、増量剤、被覆剤、糖衣剤等を加え、常法により製造することができる。あるいはリボソーム等で抗菌ペプチド等を包接した製剤形態とすることもできる。液体製剤の場合は、様々な塩及び緩衝剤によって緩衝化された溶液、懸濁液、乳濁液等の形態とすることができる。塩としては、アルカリもしくはアルカリ土類ハロゲンィ匕物、リン酸塩、又は硫酸塩、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、又は硫酸ナトリウム等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばクェン酸塩、リン酸塩、 HEPES、トリス等を、この種の緩衝剤が処置される対象に、生理学的に許容され得る程度で使用することができる。注射剤の場合は、抗菌ペプチド等を、注射用蒸留水等の水性担体に予め溶解、分散、乳化等して注射用液剤とするか、または注射用粉末にして用時に溶解すればよい。

[0030] 投与方法に特に制限はなぐ医薬組成物の形態及び投与対象の性状等に応じて、種々の様式で投与することができる。例えば、経口、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、腹膜内、鼻咽頭等投与が可能である。食品の場合は、ジュース、お茶等の飲料;うどん、そば、トウフ、力マボコ、ゼリー等のゲル状食品等任意の形態の食品とすることができる。これらは、各食品の原料に抗菌ペプチド等を添加し、常法にしたがって製造することができる。また、口腔内微生物を対象にした場合は、うがい薬やハミガキ等、口腔内に適用される製品に配合することも可能である。 [0031] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

[0032] (塩基性抗菌ペプチドの化学合成）

fmoc法による固相合成法により 7種類の塩基性抗菌ペプチドの化学合成を TANA laboratories., Texas, USAに依頼した。 fmoc法による固相合成法で縮合剤としては HATU-N, N-dimethylformamidを使用した。合成後、 HPLC及び逆相クロマトグラフィ ~~により製し 7こ後、 Mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption lonization-TOF/MS)いわゆるトフマスにて分子量を確認した。本化学合成により、本発明の塩基性抗菌ペプチド (JH8944) S列表の配列番号 1]： FKCKKWISLRR Y (Phe Lysし ys Lys Lys Val Vallle Ser Leu Arg Arg Tyr j 得/こ。

実施例 2

[0033] (S.mutansに対する殺菌活性）

殺菌活性の試験は、 Edgertonらの方法で行った（ Edgerton M, Koshlukova SE, Lo TE, Cnrzan Bu, Strau Dinger RM, Raj PA. Candidacidal activity of salivary histatins.

Identification of a nistatin 5— binding protein on Candida albicans. J Biol Chem. 1998

Aug 7;273(32):20438— 47)。

試験の結果、殺カンジダ作用においては、殺カンジダ作用が強いと報告されてい^ J H8194では ( FEMS Microbiol Lett. 1999 Oct 15;179(2):217— 22)、 ΙΟΟ Μで 100 % ±0の殺菌率を示したのに対して、本発明の抗菌ペプチド (JH8944)では 10 μ Μ で 100% ±0の殺菌率を示し，グラム陽性菌，グラム陰性菌に広いスペクトルを持つと報告されている LFBshortよりも有意に強い効果を示した。結果を、図 1に示す。

実施例 3

[0034] (塩基性抗菌ペプチドの間葉系幹細胞に対する細胞増殖効果）

塩基性抗菌ペプチド: ftnoc法により合成した。

ラビット間葉系幹細胞：ラビット腸骨より採取

細胞増殖培地：血清加 MEM培地，

細胞増殖培養条件：5%CO下， 37°C 細胞数測定法法：細胞内 AT P量をルシフェリン /ルシフェラーゼ反応により測定した。

本発明の抗菌ペプチド（JH8944) を用いて、ラビット間葉系細胞（rabitMS C)、ヒト歯肉繊維芽細胞（HGFB)、及びラット embryoZietus由来（3Y1) に対する細胞増殖効果を検討した。各べプチドの濃度は 0〜10 /1111とし、濃度 0の時の細胞増殖を 100として相対比率で検討した。細胞の培養には DME Mメディウムを用い、対数増殖期後期にペプチドの添加を行った。結果は、 0. 1 〜l^g/mlで、本発明の抗菌ペプチド（JH8944) は、非常に高い細胞増殖を示し、どの細胞に対しても /3 FGFと同等かそれ以上の増殖促進効果を示した

(図 2— A、図 2— B)更に、本発明の抗菌ペプチドは、細胞増殖を有意に促進し、無添加の場合と比較して約 200%の増殖効果を示した。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の実施例において、本発明の抗菌ペプチドの S.mutansに対する殺菌活性についての試験の結果を示す図である。図 1は、 S.mutans 0ΜΖΠ5に対する殺菌率を示す図である。

[図 2]本発明の実施例において、本発明の抗菌ペプチド（ J H8944)を用いて、ラビット間葉系細胞（rabitMSC)、ヒト歯肉繊維芽細胞（HGFB)、及びラット embryoZfetus由来（3Y1) に対する細胞増殖効果を検討した結果を示す図である。

差替え用紙（» 6) 細胞数測定法法：細胞内 ATP量をルシフリン Zルシフラーゼ反応により測し 7こ。

本発明の抗菌ペプチド CFH8944)を用いて、ラビット間葉系細胞 (rabit

MSC)、ヒト歯肉繊維芽細胞 (HGFB)、及びラット embryoZfetus由来（3Y1)に対する細胞増殖効果を検討した。各ペプチドの濃度は 0〜10 /ζ ₈Ζπι1とし、濃度 0の時の細胞増殖を 100として相対比率で検討した。細胞の培養には DMEMメディウムを用い、対数増殖期後期にペプチドの添加を行った。結果は、 0. 1〜1 μ gZmlで、本発明の抗菌ペプチド CFH8944)は、非常に高い細胞増殖を示し、どの細胞に対しても iS FGFと同等かそれ以上の増殖促進効果を示した（図 2— A、図 2— B)更に、本発明の抗菌ペプチドは、細胞増殖を有意に促進し、無添加の場合と比較して約 200% の増殖効果を示した。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の実施例において、本発明の抗菌ペプチドの S.mutansに対する殺菌活性につ、ての試験の結果を示す図である。

[図 2]本発明の実施例において、本発明の抗菌ペプチド CFH8944)を用いて、ラビット間葉系細胞 (rabitMSC)、ヒト歯肉繊維芽細胞 (HGFB)、及びラット embryoZfetus 由来（3Y1)に対する細胞増殖効果を検討した結果を示す図である。

Claims

請求の範囲

[I] 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド、又は、該ペプチドのアミノ酸配列において、 1乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、或いは付カロした誘導体である塩基性抗菌ペプチド。

[2] 請求項 1の塩基性抗菌ペプチド、又は、その薬学的に許容される誘導体或いはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする抗菌剤。

[3] 抗菌剤が、口腔内微生物用の殺菌剤であることを特徴とする請求項 2記載の抗菌剤

[4] 口腔内微生物が、ミュータンス菌であることを特徴とする請求項 3記載の抗菌剤。

[5] 請求項 1記載の塩基性抗菌ペプチドからなる細胞増殖促進因子。

[6] 細胞増殖の促進が、間葉系幹細胞又は線維芽細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする請求項 5記載の細胞増殖促進因子。

[7] 間葉系幹細胞の細胞増殖促進が、歯槽骨の骨髄、口蓋又は歯槽骨の骨膜から分離された間葉系幹細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする請求項 5又は請求項 6 記載の細胞増殖促進因子。

[8] 線維芽細胞の細胞増殖促進が、歯肉線維芽細胞の細胞増殖促進であることを特徴とする請求項 5又は請求項 6記載の細胞増殖促進因子。

[9] 請求項 5〜8のいずれか記載の細胞増殖促進因子を有効成分としてなる細胞増殖促進剤。

[10] 請求項 9記載の細胞増殖促進剤を用いて、インビトロ又はインビボの細胞増殖における細胞増殖促進を行なうことを特徴とする細胞の増殖方法。

[II] インビトロの細胞増殖における細胞増殖促進が、間葉系幹細胞の細胞増殖における細胞増殖促進であることを特徴とする請求項 10記載の細胞の増殖方法。

[12] インビボの細胞増殖における細胞増殖促進力組織移植における、移植組織細胞の増殖促進であることを特徴とする請求項 10記載の細胞の増殖方法。