KR20200122292A - 재조합 콜라겐 및 엘라스틴 분자, 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 비자연적 생성 콜라겐 및 엘라스틴 분자를 제공한다. 비자연적 생성 콜라겐 및 엘라스틴은 말단절단된 콜라겐, 말단절단된 엘라스틴 뿐만 아니라, 그의 융합 단백질을 포함한다. 비자연적 생성 콜라겐 및 엘라스틴은 식품, 화장품 및 다수의 기타 제품 및 용도에서 유용하다.
Description
관련 출원 및 참조로 포함된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 35 USC 119(e)하에 2017년 9월 28일 출원된 미국 특허 가출원 62/564,96, 및 2018년 4월 13일 출원된 미국 특허 가출원 62/657,591(상기 둘 모두, 발명의 명칭: "RECOMBINANT COLLAGEN AND ELASTIN MOLECULES AND USES THEREOF")의 이점을 주장하는, 2018년 9월 27일 출원된 미국 특허 출원 제16/144,914호(발명의 명칭: "RECOMBINANT COLLAGEN AND ELASTIN MOLECULES AND USES THEREOF")에 대해 우선권을 주장하고, 상기 특허들의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 비자연적 생성 전장 및 말단절단된 콜라겐 분자, 및 전장 및 말단절단된 엘라스틴 분자, 및 그의 용도에 관한 것이다.
콜라겐 및 유사 단백질은 생물권에서 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐 및 엘라스틴은 동물의 피부, 결합 조직 및 뼈 및 다른 조직에서 발견되는 구조 단백질이다. 인간에서, 체내 존재하는 콜라겐의 양은 전체 단백질의 대략 ⅓ 정도이고, 피부 건중량의 약 ¾을 차지한다. 엘라스틴은 결합 조직 및 다른 타입의 조직에서 발견되는 고탄력성 단백질이다.
콜라겐의 구조는 3개의 폴리펩티드 가닥이 함께 나선 코일을 형성하는 삼중 나선이다. 개별 폴리펩티드 가닥은 GLY-X-Y로 지정된 반복 트리플렛 아미노산 서열로 구성된다. X 및 Y는 임의의 아미노산일 수 있도, 세 번째 아미노산은 글리신이다. 아미노산 프롤린 및 하이드록시프롤린은 콜라겐에서 고농도로 발견된다. 가장 일반적인 트리플렛은 콜라겐 중의 트리플렛 중 대략 10.5%를 차지하는 프롤린-하이드록시프롤린-글리신(Gly-Pro-Hyp)이다.
젤라틴은 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 수득되는 생성물이다. 전형적으로, 젤라틴은 산 가수분해, 알칼리 가수분해, 및 효소 가수분해에 의해, 또는 콜라겐을 수용액 중에서 열에 노출시킴으로써(예컨대, 동물의 뼈 및 피부를 끓이거나, 생선의 비늘을 끓이거나, 기타 방법에 의해) 생산된다.
젤라틴은 화장품, 식품, 약제, 의료 장치, 사진 필름, 접착제, 결합제 및 다수의 기타 제품을 비롯한 많은 제품에서 사용된다. 젤라틴의 물리적 및 화학적 특성은 특정 적용에 맞게 조정된다. 이러한 물리적/화학적 특성으로는 겔 강도, 융점 온도, 점도, 색상, 혼탁도, pH, 등전점 등을 포함한다.
엘라스틴은 동맥, 폐, 힘줄, 인대, 피부 및 다른 조직의 적절한 기능을 위해 중요한 탄력성 단백질이다. 엘라스틴은 조직에 신장되고, 그의 원래의 형상으로 복귀할 수 있는 능력을 제공한다. 단백질 트로포엘라스틴은 엘라스틴의 빌딩 블록이다. 유전자 패밀리를 포함하는 콜라겐과 달리, 인간에는 하나의 트로포엘라스틴 유전자가 존재한다. 발현될 때, 단일 엘라스틴 유전자는 스플라이싱되고, 이로써, 상이한 형태의 트로포엘라스틴 단백질이 생성된다. 다수의 트로포엘라스틴 분자는 함께 회합되어 엘라스틴을 형성한다.
L 형태의 박테리아, 또는 L 형태는 세포벽 결핍(스페로플라스트 타입) 또는 세포벽이 없는(원형질체 타입) 세포로 성장할 수 있는, 모체 종(N 형태)으로부터 유래된 박테리아 균주이다. 문헌 [Madoff S (Ed): The Bacterial L-Forms. New York: Marcel Dekker Inc., 1986]; [Mattmann LH (Ed): Cell Wall Deficient Forms. Boca Raton: CRC Press; 1993]; 및 [Gumpert J, Taubeneck U: Characteristic properties and biological significance of stable protoplast type L-forms. In Protoplasts, Lecture Proceedings of the 6th International Protoplast Symposium: Basel. Experientia 1983, 46(suppl): 227-241]을 참조한다.
원형질체 타입 L 형태는 세포벽이 없는 형태로 배양되었고, 이는 세포벽, 캡슐, 편모, 선모, 포자 및 메소좀 형성 불능, 콜로니 및 세포 형태 변경, 세포질 막의 지질 및 단백질 성분의 정성적 및 정량적 변화, 세포외 단백질분해 활성 부재, 박테리오파지에 대한 내성, 및 외부 실험실 조건하에서의 증식 불능을 비롯한, 극도의 다면발현적 변화를 보이는, 유전적으로 안정한 돌연변이를 나타낸다. 문헌 [Gumpert and Taubeneck(상기 문헌)]; 및 [Hoischen et al., Lipid and fatty acid composition of cytoplasmic membranes from Streptomyces hygroscopic and its stable protoplas type L-form. J Bacteriol 1997, 179:3430-3436]을 참조한다.
요약
한 측면에서, 숙주 세포에 의해 생산되는 비자연적 생성 콜라겐을 제공한다. 비자연적 생성 콜라겐은 해파리(히드라충강(Hydrozoa)) 콜라겐, 인간 콜라겐, 콘드로시아 레니포미스(Chondrosia reniformis)(신장 해면) 콜라겐, 또는 린코돈 티푸스(Rhincodon typus)(고래 상어) 콜라겐이다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 콜라겐은 전장 또는 말단절단된 콜라겐이다. 한 실시양태에서, 콜라겐은 50개의 아미노산 내지 500개의 아미노산의 내부 말단절단에 의해 말단절단된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 말단절단은 콜라겐 폴리펩티드의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에서 이루어진다. 비자연적 생성 콜라겐은 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 또는 서열 번호 112이다.
또 다른 측면에서, 비자연적 생성 콜라겐은 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질 태그, 프로테아제 절단 부위, 베타-락타마제 및/또는 GEK 아미노산 삼량체 반복부 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복부를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 비자연적 생성 콜라겐이 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 포함할 때, GEK 및/또는 GDK 삼량체 반복부의 개수는 2 내지 50개의 삼량체 반복부 범위일 수 있다. 한 측면에서, 분비 태그는 DsbA, PelB, OmpA, TolB, MalE, lpp, TorA, 또는 HylA, 또는 제2 분비 태그의 일부에 융합된 한 분비 태그의 일부를 포함하는 하이브리드 분비 태그이다. 예시적인 분비 태그는 DsbA이다.
한 측면에서, 0.005% w/w 내지 30% w/w의 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 국소용 담체 또는 보존제를 포함하는 적어도 1종의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 조성물은 피부에 적용하기 위한 국소용 조성물이다. 국소용 조성물은 피부 손상을 감소시키는 데, 또는 손상된 피부의 회복을 촉진시키는 데 사용된다.
한 측면은 피부 손상을 감소시키거나, 또는 손상된 피부의 회복을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 엘라스틴을 포함하는 조성물을 피험체의 피부에 적용시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 피험체의 피부의 섬유아세포 세포 또는 각질형성세포의 생존능을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, 조성물의 적용은 피험체의 피부의 섬유아세포 세포에 의한 프로콜라겐의 합성을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, 조성물의 국소 적용은 UV 손상으로부터 피부 또는 각질형성세포를 보호한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 티민-티민(TT) 이량체 형성은 본원에 개시된 콜라겐 또는 엘라스틴에 의해 감소된다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 피부 세포의 생존능을 증가시키는 방법이다. 본 방법은 콜라겐 또는 엘라스틴 분자를 피부 또는 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함한다. 제공된 바와 같은 콜라겐 또는 엘라스틴은 UV 조사, 도시 분진 또는 다른 손상 자극에의 노출시, 각질형성세포 및/또는 섬유아세포의 생존능을 증가시킨다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 피부 세포에서 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 피부 세포는 각질형성세포이다. 본 방법은 콜라겐 또는 엘라스틴 분자를 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함한다. TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, 및 TL-IRA를 비롯한 염증성 사이토카인의 생성.
또 다른 측면에서, 도시 분진에의 노출의 영향으로부터 피부 세포를 보호하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 개시된 콜라겐 또는 엘라스틴을 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함한다. 피부 세포의 콜라겐 또는 엘라스틴에의 노출시 피부 세포의 생존능을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 피부 세포는 각질형성세포 또는 섬유아세포이다.
한 측면에서, 숙주 세포에 의해 생산된 비자연적 생성 엘라스틴을 제공한다. 비자연적 생성 엘라스틴은 해파리 엘라스틴, 인간 엘라스틴, 콘드로시아 레니포미스(신장 해면) 엘라스틴, 또는 린코돈 티푸스 엘라스틴이다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 엘라스틴은 전장 또는 말단절단된 엘라스틴이다. 한 실시양태에서, 엘라스틴은 50개의 아미노산 내지 500개의 아미노산의 내부 말단절단에 의해 말단절단된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 말단절단은 엘라스틴 폴리펩티드의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에서 이루어진다. 비자연적 생성 엘라스틴은 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 98, 또는 서열 번호 110이다.
또 다른 측면에서, 비자연적 생성 엘라스틴은 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질 태그, 프로테아제 절단 부위, 베타-락타마제 및/또는 GEK 아미노산 삼량체 반복부 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복부를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 비자연적 생성 콜라겐이 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 포함할 때, GEK 및/또는 GDK 삼량체 반복부의 개수는 2 내지 50개의 삼량체 반복부 범위일 수 있다. 한 측면에서, 분비 태그는 DsbA, PelB, OmpA, TolB, MalE, lpp, TorA, 또는 HylA, 또는 제2 분비 태그의 일부에 융합된 한 분비 태그의 일부를 포함하는 하이브리드 분비 태그이다. 예시적인 분비 태그는 DsbA이다.
또 다른 실시양태에서, 0.005% w/w 내지 30% w/w의 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 국소용 담체 또는 보존제를 포함하는 적어도 1종의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물은 피부에 적용시키기 위한 국소용 조성물이다. 국소용 조성물은 피부 손상을 감소시키는 데, 또는 손상된 피부의 회복을 촉진시키는 데 사용된다.
한 실시양태는 피부 손상을 감소시키거나, 또는 손상된 피부의 회복을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 엘라스틴을 포함하는 조성물을 피험체의 피부에 적용시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 피험체의 피부의 섬유아세포 세포의 생존능을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, 조성물의 적용은 피험체의 피부의 섬유아세포 세포에 의한 프로콜라겐의 합성을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, 조성물의 국소 적용은 UV 손상으로부터 피부 또는 각질형성세포를 보호한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 티민-티민(TT) 이량체 형성은 본원에 개시된 콜라겐 또는 엘라스틴에 의해 감소된다.
또 다른 실시양태는 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 해파리, 인간, 콘드로시아 레니포미스(신장 해면), 또는 린코돈 티푸스로부터의 콜라겐 또는 엘라스틴을 코딩한다. 코딩된 콜라겐 또는 엘라스틴은 전장 또는 말단절단된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 콜라겐 또는 엘라스틴은 50개의 아미노산 내지 500개의 아미노산의 내부 말단절단에 의해 말단절단된 것이다.
한 실시양태에서, 콜라겐 또는 엘라스틴과 함께, 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질 태그, 프로테아제 절단 부위, 베타-락타마제 함께 및/또는 GEK 아미노산 삼량체 반복부 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복부를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 포함할 수 있고, GEK 및/또는 GDK 삼량체 반복부의 개수는 2 내지 50개의 삼량체 반복부 범위일 수 있다. 한 측면에서, 분비 태그는 DsbA, PelB, OmpA, TolB, MalE, lpp, TorA, 또는 HylA, 또는 제2 분비 태그의 일부에 융합된 한 분비 태그의 일부를 포함하는 하이브리드 분비 태그이다. 예시적인 실시양태 분비 태그는 DsbA이다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터는 숙주 세포를 형질전환시키고, 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 비자연적 생성 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 90, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 또는 서열 번호 105인 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 비자연적 생성 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 및 서열 번호 72, 서열 번호 99, 또는 서열 번호 101인 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포를 개시한다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 및 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 사용되는 임의의 다른 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포일 수 있다.
세포가 세포 분열을 억제시키도록 변형되고, 원형질막주위 공간이 증가된 박테리아 숙주 세포를 제공한다. 예시적인 숙주 세포는 E. 콜라이(E. coli)이다.
한 실시양태는 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 콜라겐 또는 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양 배지에 접종하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포로부터 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 단리시키는 단계를 포함한다.
도 1은 전환된 세포와 비전환된 세포 사이의 생리적 상태의 차이를 도시한 것이다. a) 비전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포. B) 도 a와 동일하지만, 생리적 전환이 진행된 동일한 에스케리키아 콜라이 집단. c) 세포질 RFP 및 원형질막주위 GFP를 함유하는 전환된 에스케리키아 콜라이 세포의 위상차. d) 도 c의 세포의 형광 영상화는 표적화된 단백질 국재화를 도시한다.
도 2는 전환된 세포에서의 증진된 단백질 생산을 도시한 것이다. a-b) T7 유도성 단백질 생산을 위한 표적 단백질은 에스케리키아 콜라이 BL21에서 생산된, 원형질막주위 발현 GFP이다. 동일한 세포 집단을 사용하였고, OD 1.1에서 유도되었다. a) 단백질 래더(레인 1), IPTG로 유도된 단백질 생산(레인 2), 생리적으로 전환된, IPTG로 유도된 단백질 생산(레인 3). b) 좌측의 IPTG 단독 및 우측의 IPTG+전환하의, 세포 GFP 유도 배양물의 두 바이알. c) 단백질 래더(레인 1), 단백질 생산 이후의 상청액(레인 2), 세포 펠릿(레인 3)을 보여주는, 전환된 세포를 이용한 22 kDa 콜라겐의 발현.
도 3은 시간 경과에 따라 전환되는 에스케리키아 콜라이 세포의 타임 랩스를 도시한 것이다.
도 4는 생리적 전환이 진행된 다른 유기체를 도시한 것이다. a) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 정상 생리. b) 아그로박테리움 투메파시엔스 전환된 생리. c) 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 정상 생리. d) 슈도모나스 아에루기노사 PAO1 전환된 생리. e) 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta) 정상 생리. f) 브레분디모나스 디미누타 전환된 생리. g) 아그로박테리움 투메파시엔스 정상 생리. H) 아그로박테리움 투메파시엔스 전환된 생리.
도 5는 인간 각질형성세포의 말단절단된 콜라겐으로의 처리에 의한 TT 이량체 형성 감소를 도시한 것이다.
도 2는 전환된 세포에서의 증진된 단백질 생산을 도시한 것이다. a-b) T7 유도성 단백질 생산을 위한 표적 단백질은 에스케리키아 콜라이 BL21에서 생산된, 원형질막주위 발현 GFP이다. 동일한 세포 집단을 사용하였고, OD 1.1에서 유도되었다. a) 단백질 래더(레인 1), IPTG로 유도된 단백질 생산(레인 2), 생리적으로 전환된, IPTG로 유도된 단백질 생산(레인 3). b) 좌측의 IPTG 단독 및 우측의 IPTG+전환하의, 세포 GFP 유도 배양물의 두 바이알. c) 단백질 래더(레인 1), 단백질 생산 이후의 상청액(레인 2), 세포 펠릿(레인 3)을 보여주는, 전환된 세포를 이용한 22 kDa 콜라겐의 발현.
도 3은 시간 경과에 따라 전환되는 에스케리키아 콜라이 세포의 타임 랩스를 도시한 것이다.
도 4는 생리적 전환이 진행된 다른 유기체를 도시한 것이다. a) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 정상 생리. b) 아그로박테리움 투메파시엔스 전환된 생리. c) 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 정상 생리. d) 슈도모나스 아에루기노사 PAO1 전환된 생리. e) 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta) 정상 생리. f) 브레분디모나스 디미누타 전환된 생리. g) 아그로박테리움 투메파시엔스 정상 생리. H) 아그로박테리움 투메파시엔스 전환된 생리.
도 5는 인간 각질형성세포의 말단절단된 콜라겐으로의 처리에 의한 TT 이량체 형성 감소를 도시한 것이다.
설명
하기 설명에서, 특정의 구체적인 설명은 본 개시내용의 다양한 실시양태를 철저히 이해시키기 위해 기재된다. 그러나, 당업자는 본 개시내용은 이러한 설명 없이도 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 ±10%를 지칭한다.
"∼으로 이루어진"이라는 용어는 "∼을 포함하나, 이에 제한되지 않는"이라는 것을 의미한다.
"본질적으로 ∼으로 이루어진"이라는 용어는, 추가 성분 단계 및/또는 파트가 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적인 특징 및 신규 특징을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만 오직 조성물, 방법 또는 구조은 추가 성분, 단계 및/또는 파트를 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "한 화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"이라는 용어는 그의 혼합물을 비롯한, 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 본 개시내용의 다양한 실시양태는 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷으로 기술한 것은 단지 편의를 위해서 및 간략하게 하기 위해서 사용된 것으로 이해되어야 하며, 본 개시내용의 범주의 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위로 기술된 것은 모든 가능한 하위 범위 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 1 내지 6과 같이 범위로 기술된 것은 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위 뿐만 아니라, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6과 같은, 상기 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본원에서 수치 범위가 명시되는 경우에는 언제나, 명시된 범위 내의 임의의 언급된 수치(분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 한다. 제1 명시된 수치 내지 제2 명시된 수치 "범위의/범위이다"라는 어구 및 제1 명시된 수치"부터" 제2 명시된 수치"까지" "범위의/범위이다"라는 어구는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 제1 및 제2 명시된 수치 및 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 한다.
본원에서 사용되는 바, "방법"이라는 용어는 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 당업자에 공지되어 있거나, 또는 상기 당업자에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발될 수 있는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 주어진 임무를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "콜라겐" 또는 "콜라겐 유사"라는 용어는 하나 이상의 콜라겐 또는 콜라겐 유사 폴리펩티드와 회합하여 4차 구조를 형성할 수 있는 단일 폴리펩티드를 지칭한다. 콜라겐은 젤라틴 제조를 위해 산, 염기, 또는 열로 처리될 수 있다. 천연 콜라겐의 4차 구조는 전형적으로 3개의 폴리펩티드로 구성된 삼중 나선이다. 천연 콜라겐을 형성하는 3개의 폴리펩티드 중 2개는 보통 동일하고, 알파 쇄로 지칭된다. 세 번째 폴리펩티드는 베타 쇄로 지칭된다. 따라서, 전형적인 천연 콜라겐은 AAB로 지칭될 수 있고, 여기서, 콜라겐은 2개의 알파("A") 가닥 및 1개의 베타("B") 가닥으로 구성된다. 본원에서 사용되는 바, "프로콜라겐"이라는 용어는 자연적으로 발생된 콜라겐으로 프로세싱될 수 있는, 세포에 의해 생산된 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "엘라스틴"이라는 용어는 탄력적이고, 신장 또는 수축하고, 그의 원래의 형상으로 복귀하는 기능이 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 엘라스틴은 자연적으로 결합 조직에서 발견된다.
본원에서 사용되는 바, "발현 벡터" 또는 "벡터"라는 용어는 외인성 유전자의 발현을 지시할 수 있는 핵산 어셈블리를 지칭한다. 발현 벡터는 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터, 제한 엔도뉴클레아제 부위, 하나 이상의 선별 마커를 코딩하는 핵산, 및 재조합 기술의 실시에 유용한 다른 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "섬유아세포"라는 용어는 프로콜라겐 및 다른 구조 단백질을 합성하는 세포를 지칭한다. 섬유아세포는 체내 광범위하게 분포되어 있고, 피부, 결합 조직 및 다른 조직에서도 발견된다.
본원에서 사용되는 바, "형광성 단백질"이라는 용어는 유전 공학 기술에서 보편적으로 사용되는, 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현의 리포터로서 사용되는 단백질이다. 자외선 또는 청색광에 노출되었을 때, 단백질은 형광을 내고, 밝은 가시광선을 방출한다. 녹색광을 방출하는 단백질은 녹색 형광성 단백질(GFP: green fluorescent protein)이고, 적색광을 방출하는 단백질은 적색 형광성 단백질(RFP: red fluorescent protein)이다.
본원에서 사용되는 바, "젤라틴"이라는 용어는 산, 염기, 또는 열에의 노출에 의해 추가로 프로세싱된 콜라겐을 지칭한다. 이론 또는 기전으로 제한하고자 하지 않으면서, 산, 염기, 또는 열로 콜라겐을 처리하는 것이 콜리겐 폴리펩티드를 변성시킨다고 간주된다. 변성된 콜라겐 수용액은 식품, 화장품, 약제, 공산품, 의료품, 실험실 배양용 성장 배지, 및 다수의 다른 적용에서 사용되는 가역성 겔을 형성한다.
본원에서 사용되는 바, "유전자"라는 용어는 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 이는 코딩 영역만을 단독으로 지칭할 수 있거나, 또는 코딩 서열 앞의(5' 비코딩 서열) 및 그 뒤의(3' 비코딩 서열) 조절 서열을 포함할 수 있다.
"히스티딘 태그"라는 용어는 재조합 폴리펩티드 상의 2-30개의 인접한 히스티딘 잔기 시리즈이다.
"숙주 세포"라는 용어는 도입된 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 세포이다.
"각질형성세포"라는 용어는 피부의 표피 층에서 발견되는 케라틴을 생산하는 세포이다.
본원에서 사용되는 바, "락타마제"라는 용어는 람탐(사이클릭 아미드) 모이어티를 함유하는 항생제를 가수분해하는 효소를 지칭한다. "베타-락타마제" 또는 "β-락타마제"는 β-람탐 모이어티를 함유하는 항생제를 가수분해하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바, "비자연적 생성"이라는 용어는 콜라겐 또는 엘라스틴이 자연상에서는 보통 발견되지 않는다는 것을 지칭한다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 재조합적으로 제조된 것이다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 재조합 콜라겐 또는 재조합 엘라스틴이다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 콜라겐은 말단절단된 콜라겐이다. 다른 비자연적 생성 콜라겐 폴리펩티드는 키메라 콜라겐을 포함한다. 키메라 콜라겐은 콜라겐 폴리펩티드의 한 부분이 제2 콜라겐 폴리펩티드의 한 부분과 인접해 있는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 인간 콜라겐의 한 부분과 인접해 있는 해파리 콜라겐의 한 부분을 포함하는 콜라겐 분자는 키메라 콜라겐이다. 또 다른 실시양태에서, 비자연적 생성 콜라겐은 추가의 아미노산, 예컨대, 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위, GEK 반복부, GDK 반복부, 및/또는 베타-락타마제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 엘라스틴은 말단절단된 엘라스틴이다. 다른 비자연적 생성 엘라스틴 폴리펩티드는 키메라 엘라스틴을 포함한다. 키메라 엘라스틴은 엘라스틴 폴리펩티드의 한 부분이 제2 엘라스틴 폴리펩티드의 한 부분과 인접해 있는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 인간 엘라스틴의 한 부분과 인접해 있는 해파리 엘라스틴의 한 부분을 포함하는 콜라겐 분자는 키메라 엘라스틴이다. 또 다른 실시양태에서, 비자연적 생성 엘라스틴은 추가의 아미노산, 예컨대, 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위 및/또는 베타-락타마제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 키메라 젤라틴 또는 키메라 엘라스틴은 추가의 아미노산, 예컨대, 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위, GEK 반복부, GDK 반복부, 및/또는 베타-락타마제를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "프로테아제 절단 부위"라는 용어는 특이적인 프로케아제에 의해 절단되는 아미노산 서열이다.
"분비 태그" 또는 "신호 펩티드"라는 용어는 숙주 세포의 세포 기구를 동원하여 발현된 단백질을 숙주 세포의 특정 위치 또는 세포내 소기관으로 수송하는 아미노산 서열을 지칭한다.
"말단절단된 콜라겐"이라는 용어는 전장의 콜라겐의 하나 이상의 부분이 존재하지 않는, 전장의 콜라겐보다 더 작은 단량체 폴리펩티드를 지칭한다. 콜라겐 폴리펩티드는 C-말단 단부, N-말단 단부에서 말단절단된 것이거나, 또는 전장의 콜라겐 폴리펩티드의 내부 부분(들)의 제거에 의해 말단절단된 것이다.
"말단절단된 엘라스틴"이라는 용어는 전장 엘라스틴의 하나 이상의 부분이 존재하지 않는, 전장 엘라스틴보다 더 작은 단량체 폴리펩티드를 지칭한다. 엘라스틴 폴리펩티드는 C-말단 단부, N-말단 단부에서 말단절단된 것이거나, 또는 전장 엘라스틴 폴리펩티드의 내부 부분(들)의 제거에 의해 말단절단된 것이다.
참조로 포함된 공유 출원 PCT/US17/24857에서, 세포 분열이 억제되고, 원형질막주위 공간의 성장이 크게 증진된, 변형된 박테리아 세포(전환된 세포)를 이용하는 발현 시스템이 개시되었다. 상기 발현 시스템에서, 발현된 단백질은 원형질막주위 공간으로 표적화된다. 상기 전환된 세포에서 재조합 단백질 생산은 비전환된 세포의 것과 비교하였을 때, 크게 증가되어 있다. 구조상, 세포는 내막 및 외막, 둘 모두를 포함하지만, 기능성 펩티도글리칸 세포벽은 없고, 동시에 세포 형상의 구형이며, 시간이 경과함에 따라 부피는 증가한다. 특히, 원형질막주위 공간은 보통 전체 세포 부피의 단지 10-20%를 차지하지만, 본원에 기술된 전환된 상태의 원형질막주위 구획은 전체 세포 부피의 20%, 30%, 40% 또는 50%, 및 최대 60%, 70%, 80% 또는 90%를 차지할 수 있다.
PCT/US17/24857의 변형된 박테리아 세포는 예컨대, 감마프로테오박테리아 및 알파프로테오박테리아로부터 선택되는 그람 음성 박테리아로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 에스케리키아 콜라이, 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 아그로박테리움 투메파시엔스, 및 브레분디모나스 디미누타로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 박테리아는 에스케리키아 콜라이, 예컨대, BL21(DE3) 균주이다.
또 다른 측면에서, 숙주 박테리아 세포는 마그네슘 염을 포함하는 배양 배지 중에서 확장된 원형질막주위 공간을 갖고, 여기서, 배지 중 마그네슘 이온의 농도는 적어도 약 3, 4, 5 또는 6 mM이다. 추가 실시양태에서, 배지 중 마그네슘 이온의 농도는 적어도 약 7, 8, 9 또는 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 배지 중 마그네슘 이온의 농도는 약 5 mM 내지 25 mM, 약 6 mM 및/또는 약 20, 15 또는 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 마그네슘 염은 황산마그네슘 및 염화마그네슘으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 배양 배지는 예컨대, 당(예컨대, 아라비노스, 글루코스, 수크로스, 글리세롤, 소르비톨, 만닛톨, 프럭토스, 갈락토스, 사카로스, 말토트리오스에리트리톨, 리비톨, 펜타에리트리톨, 아라비톨, 갈락티톨, 크실리톨, 이디톨, 말토트리오스 등), 베타인(예컨대, 트리메틸글리신), 프롤린, 염화나트륨을 비롯한, 삼투 안정제를 추가로 포함하고, 여기서, 배지 중 삼투 안정제의 농도는 적어도 약 4%(w/v), 5%(w/v), 6%(w/v), 또는 7%(w/v)이다. 추가 실시양태에서, 삼투 안정제의 농도는 적어도 약 8%(w/v), 9%(w/v), 또는 10%(w/v)이다. 일부 실시양태에서, 배지 중 삼투 안정제의 농도는 약 5%(w/v) 내지 약 20%(w/v)이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양물은 염화암모늄, 황산암모늄, 염화칼슘, 아미노산, 황산철(II), 황산마그네슘, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 및 효모 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
숙주 박테리아 세포는 연속적으로 또는 불연속적으로; 회분식 공정, 유가식 공정 또는 반복 유가식 공정으로 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항생제는 β-람탐 항생제(예컨대, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 및 모노박탐), 포스폰산 항생제, 폴리펩티드 항생제, 및 당펩티드 항생제로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항생제는 알라포스팔린, 아목시실린, 암피실린, 아즈트레오남, 바시트라신, 카르베니실린, 세파만돌, 세포탁심, 세프수로딘, 세팔로틴, 포스미도마이신, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 g, 페니실린 v, 포스포마이신, 프리막신, 및 반코마이신으로부터 선택된다.
이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 재조합 단백질 생산을 촉진시키고, 세포 분열을 억제하는 세포 형태는 상기 언급된 배지 조건하에서의 세포벽 제거에 의해 구동되는 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 세포벽 합성을 제거/억제시키는 방법은 펩티도글리칸 합성을 억제시키는 항생제(예컨대, 암피실린, 카르베니실린, 페니실린 또는 포스포마이신), 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 통해 이루어질 수 있다.
적절한 원형질막주위 표적화 신호 서열을 가질 때, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드는 박테리아 세포의 원형질막주위 공간 내로 분비될 수 있다(문헌 [Joly, J.C. and Laird, M.W., in The Periplasm ed. Ehrmann, M., ASM Press, Washington D.C., (2007) 345-360]). 원형질막주위의 화학적 산화 환경에서, 디술피드 결합의 형성 및 이에 의한 폴리펩티드의 기능적으로 올바른 폴딩이 바람직하다.
일반적으로, 신호 서열은 발현 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 외인성 유전자의 일부분일 수 있다. 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고, 프로세싱되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 외인성 유전자의 천연 신호 서열을 인식 및 프로세스하지 않는 박테리아 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 임의의 일반적으로 공지된 박테리아 신호 서열에 의해 치환된다. 일부 실시양태에서, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드는 DsbA 신호 서열을 사용하여 원형질막주위 공간으로 표적화될 수 있다(문헌 [Dinh and Bernhardt, JBacteriol, Sept. 2011, 4984-4987]).
한 측면에서, 숙주 세포에 의해 생산된 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴을 제공한다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 해파리 콜라겐 또는 엘라스틴, 인간 콜라겐 또는 엘라스틴, 또는 콘드로시아 레니포미스(신장 해면) 콜라겐 또는 엘라스틴, 또는 린코돈 티푸스 콜라겐 또는 엘라스틴이다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 말단절단된 콜라겐이다. 말단절단은 내부 말단절단, 콜라겐 또는 엘라스틴의 N 말단부에서의 말단절단, 또는 콜라겐 또는 엘라스틴의 C 말단부에서의 말단절단이다. 콜라겐 또는 엘라스틴은 50개의 아미노산 내지 1,000개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 950개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 900개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 850개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 800개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 850개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 800개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 750개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 700개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 650개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 600개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 650개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 500개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 450개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 400개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 350개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 300개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 250개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 200개의 아미노산, 50개의 아미노산 내지 150개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산 내지 100개의 아미노산의 말단절단에 의해 말단절단된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 콜라겐 또는 엘라스틴은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, ,510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000개의 아미노산에 의해 말단절단된 것이다. 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전체 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴은 분비 태그를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 분비 태그는 콜라겐 또는 엘라스틴을 숙주 세포의 원형질막주위 공간으로 유도한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 DsbA, PelB, OmpA, TolB, MalE, lpp, TorA, 또는 HylA로부터 유도되거나, 또는 제2 분비 태그의 한 부분에 융합된 한 분비 태그의 일부분을 포함하는 하이브리드 분비 태그이다. 한 측면에서, 분비 태그는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착된다. 또 다른 측면에서, 분비 태그는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴으로부터 절단된다.
비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 히스티딘 태그를 추가로 포함한다. 히스티딘 태그 또는 폴리히스티딘 태그는 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착되는 2 내지 20개의 히스티딘 잔기로 이루어진 서열이다. 히스티딘 태그는 2 내지 20개의 히스티딘 잔기, 5 내지 15개의 히스티딘 잔기, 5 내지 18개의 히스티딘 잔기, 5 내지 16개의 히스티딘 잔기, 5 내지 15개의 히스티딘 잔기, 5 내지 14개의 히스티딘 잔기, 5 내지 13개의 히스티딘 잔기, 5 내지 12개의 히스티딘 잔기, 5 내지 11개, 5 내지 10개의 히스티딘 잔기, 6 내지 12개의 히스티딘 잔기, 6 내지 11개의 히스티딘 잔기, 또는 7 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 히스티딘 태그는 니켈 기반 크로마토그래피 매질을 이용하는 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 정제에서 유용하다. 예시적인 형광성 단백질로는 녹색 형광성 단백질(GFP) 또는 적색 형광성 단백질(RFP)을 포함한다. 형광성 단백질은 당업계에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 GFP 및/또는 RFP를 포함한다. 한 실시양태에서, 슈퍼폴더 GFP는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 융합된다. 슈퍼폴더 GFP는 심지어 부적절하게 폴딩된 폴리펩티드에 융합된 경우에도 적절히 폴딩되는 GFP이다. 한 측면에서, 히스티딘 태그는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착된다. 또 다른 측면에서, 히스티딘 태그는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴으로부터 절단된다.
비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함한다. 프로테아제 절단 부위는 재조합적으로 제조된 콜라겐 또는 엘라스틴을 절단하여 폴리펩티드의 일부를 제거하는 데 유용하다. 제거될 수 있는 폴리펩티드의 일부는 분비 태그, 히스티딘 태그, 형광성 단백질 태그 및/또는 베타-락타마제를 포함한다. 프로테아제는 엔도프로테아제, 엑소프로테아제, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르틱 프로테아제, 글루타믹 프로테아제, 및 메탈로프로테아제를 포함한다. 예시적인 프로테아제 절단 부위로는 트롬빈, TEV 프로테아제, 인자 Xa, 엔테로펩티다제, 및 리노바이러스 3C 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산을 포함한다. 한 측면에서, 절단 태그는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착된다. 또 다른 측면에서, 절단 태그는 적절한 프로테아제에 의해 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴으로부터 제거된다.
비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 베타-락타마제인 효소를 추가로 포함한다. 베타-락타마제는 선별 마커로서 유용하다. 한 측면에서, 베타-락타마제는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착된다. 또 다른 측면에서, 베타-락타마제는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴으로부터 절단된다.
비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 GEK 아미노산 삼량체 반복부 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복부를 추가로 포함한다. GEK 및 GDK 삼량체 반복부는 콜라겐 및/또는 젤라틴의 겔화를 촉진시킨다. 한 실시양태에서, 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴은 2-50개의 GEK 및/또는 2-50개의 GDK 삼량체 반복부, 2-40개의 GEK 및/또는 2-40개의 GDK 삼량체 반복부, 2-30개의 GEK 및/또는 2-30개의 GDK 삼량체 반복부, 2-20개의 GEK 및/또는 2-20개의 GDK 삼량체 반복부, 2-15개의 GEK 및/또는 2-15개의 GDK 삼량체 반복부, 2-10개의 GEK 및/또는 2-10개의 GDK 삼량체 반복부, 2-9개의 GEK 및/또는 2-9개의 GDK 삼량체 반복부, 2-8개의 GEK 및/또는 2-8개의 GDK 삼량체 반복부, 2-7개의 GEK 및/또는 2-7개의 GDK 삼량체 반복부, 2-6개의 GEK 및/또는 2-6개의 GDK 삼량체 반복부, 2-5개의 GEK 및/또는 2-5개의 GDK 삼량체 반복부, 또는 2-4개의 GEK 및/또는 2-4개의 GDK 삼량체 반복부를 포함한다. 한 측면에서, GEK 삼량체 반복부 또는 GDK 삼량체 반복부는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴에 부착된다. 또 다른 측면에서, GEK 삼량체 반복부 또는 GDK 삼량체 반복부는 비자연적 생성 콜라겐 또는 엘라스틴으로부터 절단된다.
본원에서는 0.005% w/w 내지 30% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 0.005% w/w 내지 20% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 0.005% w/w 내지 10% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 0.005% w/w 내지 5% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 0.005% w/w 내지 2% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 0.005% w/w 내지 1% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 0.005% w/w 내지 0.5% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴, 및 0.005% w/w 내지 0.2% w/w의 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴을 포함한다.
비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물은 개인 미용 및 위생 용품이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 투여용으로 제제화된다. 조성물은 인간용으로 적합한 다른 화장품 성분을 함유할 수 있다. 개인 미용 및 위생 용품은 자외선에 의한 인간 피부 또는 모발 손상을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 개인 미용 및 위생 용품은 피부 또는 모발에 적용된다. 조성물은 예를 들어, 마스크, 스킨 클렌저, 예컨대, 비누, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 밀크, 클렌징 패드, 페이셜 워시, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너 및 바디 샴푸에 적용된다.
비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물은 국소용 담체 또는 보존제를 포함하는 적어도 1종의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 국소용 담체는 리포솜, 생체분해성 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 파우더(dusting powder), 생체분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 페트롤륨, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 국소용 담체를 포함한다. 보존제는 토코페롤, 디아이오도메틸-p-톨일술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 메틸 파라벤, 소르브산, 게르마벤(Germaben) II, 로즈마리 추출물 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 포함한다.
피부 손상을 감소시키는 방법, 손상된 피부의 회복을 촉진시키는 방법, UV 손상으로부터 피부를 보호하는 방법, 도시 분진에의 노출 효과로부터 피부 세포를 보호하는 방법을 제공한다. 본 방법은 비자연적 생성 콜라겐 및/또는 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물을 피험체의 피부에 적용시키는 단계를 포함한다. 특정 이론 또는 기전으로 제한하고자 하지 않으면서, 조성물 중의 콜라겐 및/또는 엘라스틴은 피부에 적용되었을 때, UV 손상으로부터 보호함으로써 피부 손상을 감소시키고/거나, 세포의 생존능을 증가시키고/거나, 프로콜라겐 합성을 증가시킴으로써 손상된 피부의 회복을 촉진시키고/거나, 피부 세포의 생존능을 촉진시킨다. 한 측면에서, 콜라겐 및 엘라스틴은 티민-티민(TT) 이량체 형성의 형성을 감소시킨다.
한 측면은 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 해파리, 인간, 콘드로시아 레니포미스(신장 해면), 또는 린코돈 티푸스로부터의 콜라겐 또는 엘라스틴을 코딩한다. 폴리뉴클레오티드는 전장 또는 말단절단된 콜라겐 또는 엘라스틴을 코딩한다.
또 다른 측면은 콜라겐 또는 엘라스틴 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 엘라스틴 또는 콜라겐 융합 단백질은 콜라겐 또는 엘라스틴과 함께 분비 태그, 히스티딘 태그, 형광성 단백질 태그, 프로테아제 절단 부위, 베타-락타마제 함께 및/또는 GEK 아미노산 삼량체 반복부 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복부를 포함한다.
한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 벡터이다. 폴리뉴클레오티드는 선별제의 존재하에서 숙주 유기체가 성장할 수 있도록 허용하는 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 선별제는 당을 함유하는 갈락토스를 비롯한 특정 당, 또는 암피실린, 히그로마이신, G418 등을 비롯한 항생제를 포함한다. 선별제에 대한 내성을 부여하는 데 사용되는 효소로는 β-갈락토시다제 또는 β-락타마제를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 그람 음성 박테리아 세포, 그람 양성 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 사용되는 임의의 다른 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 예시적인 그람 음성 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
세포가 세포 분열을 억제시키도록 변형되고, 원형질막주위 공간이 증가된 박테리아 숙주 세포를 교시한다. 본원에서 논의되고, 실시예 1에서 교시된 바와 같이, 베타-람탐 항생제는 야생형 박테리아 세포를, 세포 복제가 억제되고, 원형질막주위 공간이 증가된 변형된 박테리아 세포로 전환시키는 전환으로서 유용하다. 예시적인 베타-람탐 항생제로는 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 및 모노박탐을 포함한다.
전환된 형태의 박테리아(L 형태)를 특정 염 및 다른 영양소를 포함하는 배양 배지 중에서 배양한다. 시험된 생리적 전환체의 생리를 지원하는 염 및 배지 조성물은 M63 염 배지, M9 염 배지, PYE 배지, 및 루리아-베르타니(LB: Luria-Bertani) 배지이다. 탄소, 질소, 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물 또한 단독으로, 또는 또 다른 보충물 또는 배지, 예컨대, 복합 질소 공급원과의 혼합물로서 적절한 농도로 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 염화암모늄, 황산암모늄, 염화칼슘, 카사미노산, 황산철(II), 황산마그네슘, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 및 효모 추출물로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
베타-락타마제는 원핵 세포에서 람탐 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소이다. 전형적으로, 베타-락타마제가 박테리아 숙주 세포에서 발현되었을 때, 발현된 베타-락타마제 단백질은 또한 베타-락타마제 단백질을 원형질막주위 공간으로 유도하는 표적화 서열(분비 태그) 또한 포함한다. 베타-락타마제는 원형질막주위 공간으로 수송되지 않는다면, 작동하지 않는다. 베타-락타마제를 원형질막주위 공간으로 표적화하는 비의존성 분비 태그의 사용 없이, 원형질막주위로 표적화되는 베타-락타마제를 제공한다. 원형질막주위 분비 태그가 단백질, 예컨대, GFP, 콜라겐, 또는 GFP/콜라겐 키메라의 N-말단에 부가된 융합 단백질을 생성함으로써, N-말단 융합 단백질의 전체 번역 및 분비를 선별하는 데 천연 분비 태그가 없는 베타-락타마제의 기능성을 이용할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 번역 및 분비를 촉진시키는 표적 콜라겐 중의 말단절단 생성물을 선별하는 데 DsbA-GFP-콜라겐-베타-락타마제 융합물을 사용하였다.
또 다른 실시양태는 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 콜라겐 또는 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양 배지에 접종하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포로부터 비자연적 생성 콜라겐 또는 비자연적 생성 엘라스틴을 단리시키는 단계를 포함한다.
단백질의 발효 제조 방법을 제공한다. 본 방법은
a) 마그네슘 염을 포함하는 배지 중에서 재조합 그람 음성 박테리아 세포를 배양하는 단계로서, 배지 중 마그네슘 이온의 농도는 적어도 약 6 mM이고, 여기서, 박테리아 세포는 단백질을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것인 단계;
b) 항생제를 배지에 첨가하는 단계로서, 항생제는 박테리아 세포에서 펩티도글리칸 생물발생를 억제시키는 것인 단계; 및
c) 단백질을 배지로부터 수거하는 단계를 포함한다.
박테리아를 표적 단백질을 제조하기 위한 목적으로--예를 들어, WO 05/021772에 기술된 바와 같이--연속적으로, 또는 회분식 공정(회분식 배양)으로, 유가식 또는 반복 유가식 공정으로 불연속적으로 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 생산은 대규모로 수행된다. 재조합 단백질을 제조하는 데 다양한 대규모 발효 방법이 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1,000 ℓ의 용량, 바람직하게, 약 1,000 내지 100,000 ℓ의 용량을 갖는다. 이러한 발효기는 산소 및 영양소, 특히, 글루코스(바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 이용한다. 소규모 발효는 일반적으로 용적이 대략 20 ℓ 이하인 발효기에서의 발효를 지칭한다.
표적 단백질의 축적을 위해, 숙주 세포를 표적 단백질의 축적에 적합한 조건하에서 배양한다. 상기 조건은 예컨대, 세포에 의해 단백질 발현 및 축적될 수 있도록 허용하는 온도, 영양소, 및 세포 밀도 조건을 포함한다. 또한, 상기 조건은 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 세포가 전사, 번역, 및 분비된 단백질을 위해 단백질을 세포의 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 이동시키는 것인 세포의 기본적인 기능을 수행할 수 있도록 허용하는 조건이다.
박테리아 세포는 적합한 온도에서 배양된다. E. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어, 전형적인 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃ 범위이다. 한 실시양태에서, 온도는 약 20℃ 내지 약 37℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 30℃이다. 한 실시양태에서, 비전환된 상태 또는 전환된 상태의 숙주 세포를 한 온도에서 배양하고, 다른 온도로 전환시켜 단백질 생산을 유도한다. 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하여 세포를 증식시킨 후, 단백질 생산을 유도하기 위해, 세포를 더 낮은 온도에서 배양한다. 제1 온도는 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 또는 37℃이다. 제2 온도는 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35° 또는 36℃이다. 제2 온도에서의 배양은 1시간 내지 100시간, 5시간 내지 90시간, 5시간 내지 80시간, 5시간 내지 80시간, 5시간 내지 70시간, 10시간 내지 70시간, 15시간 내지 70시간, 15시간 내지 65시간, 15시간 내지 60시간, 20시간 내지 60시간, 20시간 내지 55시간, 20시간 내지 50시간, 24시간 내지 50시간, 24시간 내지 48시간, 30시간 내지 50시간, 30시간 내지 45시간, 또는 30시간 내지 40시간 수행된다.
배양 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 의존하여 약 pH 5-9인 임의의 pH일 수 있다. E. 콜라이의 경우, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유전자 발현의 유도를 위해, 전형적으로, 세포를 특정 광학 밀도에 도달할 때까지, 예컨대, OD600 약 1.1에 도달할 때까지 배양하고, 상기 지점에서(예컨대, 유도체 첨가에 의해, 리프레서, 써프레서, 또는 배지 성분 등의 고갈에 의해) 유도를 개시하여 표적 단백질을 코딩하는 외인성 유전자의 발현을 유도한다. 일부 실시양태에서, 외인성 유전자의 발현은 예컨대, 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노시드, 락토스, 아라비노스, 말토스, 테트라사이클린, 안하이드로테트라사이클린, 바브리신(vavlycin), 크실로스, 구리, 아연 등으로부터 선택되는 유도제에 의해 유도된다. 유전자 발현의 유도는 또한 발효 동안 용존 산소량 수준을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 세포 증식 동안 발효의 용존 산소량 수준은 10% 내지 30%이다. 유전자 발현을 유도하기 위해, 용존 산소량 수준은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% 미만으로 감소된다. 생리적 상태 또는 전환된 상태의 숙주 세포에서, 단백질 생산은 본원에 개시된 바와 같이 발효 온도를 강하시킴으로써 유도될 수 있다.
생성물 축적 후, 재조합 단백질의 용해 및 유리를 유도하기 위해 세포를 와동시키고, 원심분리한다. 대다수의 단백질은 상청액 중에서 발견되지만, 임의의 남은 막 결합 단백질은 계면활성제(예컨대, 트리톤 X-100)의 사용으로 유리될 수 있다.
후속 단계에서, 세포 매트릭스로부터 유래된 가용성 또는 불용성 생성물로서의 표적 단백질을 생성물과 세포 데브리스의 공동 회수를 최소화하는 방식으로 회수한다. 회수는 임의 수단에 의해 수행될 수 있지만, 한 실시양태에서, 이는 니켈 칼럼을 통한 히스티딘 태그 정제를 포함할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags, Methods Enzymology. 2000; 326: 245 254]를 참조한다.
실시예
실시예
1 발현 시스템
재료 및 방법:
균주:
시험된
생리적
전환체
및 단백질 생산:
E. 콜라이 BL21(DE3)- NEB로부터 입수, 제품 #c2527
E. 콜라이 K12 NCM3722- 더 콜라이 제네틱 스톡 센터(The Coli Genetic Stock Center)로부터 입수, CGSC# 12355.
시험된 생리적 전환체:
감마프로테오박테리아:
비브리오 나트리에겐스 - ATCC로부터 입수, 제품 #14048
슈도모나스 플루오레센스 - ATCC로부터 입수, 제품 # 31948
슈도모나스 아에루기노사 PAO1- ATCC로부터 입수, 제품 # BAA-47.
알파프로테오박테리아:
카울로박터 크레센투스 - ATCC로부터 입수, 제품 #19089
아그로박테리움 투메파시엔스/리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) - ATCC로부터 입수, 제품 #33970
브레분디모나스 디미누타 - ATCC로부터 입수, 제품 #13184.
배지 조성:
1 ℓ
5x m63 염:
10 g(NH4)2SO4 - P212121로부터 입수, 제품 #7783-20-2
68 g KH2PO4 - P212121로부터 입수, 제품 #7778-77-0
2.5 mg FeSO4.7H2O - 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 입수, 제품 #F7002.
밀리Q 수(milliQ water)를 이용하여 부피가 최대 1 ℓ가 되도록 만든다.
KOH(P212121로부터 입수, 제품 #1310-58-3)를 이용하여 pH 7로 조정한다.
혼합물을 오토클레이빙한다.
1 ℓ의
1 M
MgSO4
:
246.5 g MgSO4 7H2O - P212121로부터 입수, (Sigma Aldrich, 제품 #10034-99-8)
밀리Q 수를 이용하여 부피가 최대 1 ℓ가 되도록 만든다.
혼합물을 오토클레이빙한다.
1 ℓ의
전환 배지 1:
133.4 mL 5X m63 염
10 mL 1 M MgSO4
38.6 g 글루코스 - P212121로부터 입수, 제품 #50-99-7
66.6 g 수크로스 - P212121로부터 입수, 제품 #57-50-1
8.33 g LB 믹스 P212121로부터 입수, 제품 #1b-밀러
밀리Q 수를 이용하여 부피가 최대 1 ℓ가 되도록 만든다.
0.22 μM 공극 진공 필터(Sigma Aldrich, 제품 #CLS430517)를 통해 혼합물을 여과 멸균시킨다.
1 ℓ의
전환 배지 2:
133.4 mL 5X m63 염
10 mL 1 M MgSO4
38.6 g 글루코스 - P212121로부터 입수, 제품 #50-99-7
66.6 g 수크로스 - P212121로부터 입수, 제품 #57-50-1
10 g 효모 추출물 - 피셔사이.컴(FisherSci.com)으로부터 입수, 제품 #J60287A1
밀리Q 수를 이용하여 부피가 최대 1 ℓ가 되도록 만든다.
0.22 μM 공극 진공 필터(Sigma Aldrich, 제품 #CLS430517)를 통해 혼합물을 여과 멸균시킨다.
생물반응기 성장을 위해:
5 ℓ의 생물반응기 배지 MGZ12:
1) 1 L의 글루코스를 DI 수(VWR, 제품 #97061-170) 중 500 g/L의 농도로 오토클레이빙한다.
2) 1 L의 수크로스를 DI 수(Geneseesci.com, 제품 #62-112) 중 500 g/L의 농도로 오토클레이빙한다.
3) 3,946 mL의 DI 수 중에서 오토클레이빙한다.
20 g(NH4)2HPO4. (VWR, 제품 # 97061-932).
66.5 g KH2PO4. (VWR, 제품 # 97062-348).
22.5 g H3C6H5O7. (VWR, 제품 #BDH9228-2.5KG).
2.95 g MgSO4.7H2O. (VWR, 제품 # 97062-134).
10 mL 미량 금속(Teknova), 1,000x. (Teknova, 제품 #T1001).
오토클레이빙한 후, 400 mL의 (1)을 (3)에, 65 mL의 10 M NaOH (VWR, 제품 #97064-480)를 (3)에, 및 666 mL의 (2)를 (3)에 첨가한다.
필요에 따라, 발효 실행 동안 500 g/L의 글루코스 피드를 사용할 수 있다. 유도시:
50 mL의 1 M MgSO4.7H2O를 5 L 생물반응기에 첨가한다
1 내지 10 mM 농도의 IPTG. (carbosynth.com, 제품 # EI05931).
포스포마이신(50 ㎍/mL 이상) 및 카르베니실린(100 ㎍/mL 이상)을 첨가한다.
생리적
전환체:
생리적 전환체는 최대 1 L 부피의 진탕 플라스크 중에서의 성장을 위해 E. 콜라이의 경우, OD 600 1 내지 1.1에서 최적으로 플리핑된다(flipped). 시험된 다른 종의 경우, 배양물을 전환 배지 중에서 배양물이 일단 최대 OD 600에 도달하고 나면, 계대배양하였다. 모든 경우에서, 생리적 전환체는 100-200 ug/mL 카르베니실린(P212121로부터 입수, 제품 #4800-94-6) 및 50-100 ug/mL 포스포마이신(P212121로부터 입수, 제품 #26016-99-9)의 첨가를 통해 플리핑된다. 집단의 대다수는 몇 시간 이내에 전환된 상태가 된다. 세포가 생리적 전환체가 되었는지를 확인하기 위해, 세포를, 퍼펙트 포커스 시스템(perfect focus system), 니콘 CFI60 플랜 아포(Nikon CFI60 Plan Apo) 100X NA 1.45 대물렌즈, 프라이어(Prior) 자동 필터 휠 및 스테이지, LED-CFP/YFP/mCherry 및 LED-DA/FI/TX 필터 세트(Semrock)가 자착된 니콘 Ti-E(Nikon Ti-E), 루멘코르 솔라(Lumencor Sola) II SE LED 조명 시스템, 및 하마마츠 플래쉬(Hamamatsu Flash) 4.0 V2 CMOS 카메라에서 영상화하였다.
생리적
전환체의
영상 분석:
이미지J(ImageJ)를 이용하여 영상을 분석하여 치수를 측정하였다. 전환된 상태에서, 외막의 구 모양의 외곽선을 구형으로 처리하여 전체 부피(V=(4/3)πr3)를 계산한다. 세포질 부피를 구 내에 존재하는 타원체로서 계산한다(V=(4/3)π*(최장 반경)*(최단 반경)2). 원형질막주위 부피를 계산하기 위해, 세포의 총 부피에서 세포질 부피를 감산한다.
단백질 발현 및 정량화:
GFP 또는 콜라겐 유도체를 보유하는 pET28a(emd Millipore 제품 #69864) 및 그의 유도체를 함유하는 E. 콜라이 BL21(DE3)(NEB 제품 #c2527)을, 50 mg/mL 카나마이신(p212121 제품 # 2251180)을 함유하는 전환 배지 중에서 37℃에서 밤새도록 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 다음날, 밤새도록 배양된 배양물의 1:10 희석액을, 50 mg/mL 카나마이신을 함유하는 신선한 전환 배지로 하여 계대배양을 시작한다. 이어서, 배양물은 생리적으로 전환되고, 동시에 단백질 생산은 OD 600 1 내지 1.1에서 유도된다(Molecular Devices Spectramax M2 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독). 생리적 전환체 및 단백질 생산은 100 ug/mL 카르베니실린, 50 ug/mL 포스포마이신, 및 100 ug/mL IPTG(p212121 제품 #367-93-1)의 첨가를 통해 플리핑된다. 회전 진탕기 상에서 실온하에(대략 22℃) 8시간 내지 밤새도록 전환된 상태에서 단백질 발현을 계속 진행한다. 총 단백질 수준을 정량화하기 위해, 배양물 중 혼합된 부분에 대해 퀵 스타트™ 브래드포드 프로테인 어세이(Quick Start™ Bradford Protein Assay)를 사용하였고, 몰레큘러 디바이시스 스펙트라맥스 M2(Molecular Devices Spectramax M2) 마이크로플레이트 판독기에서 표준 곡선을 정량화한다. 단백질 집단 중 남은 잔여분 대비 표적 단백질 생산의 상대적인 강도를 정량화하기 위해, 배양물 중 혼합된 부분을 미니-프로테안® TGX™ 겔즈(Mini-PROTEAN® TGX™ Gels) 상에서 전개시키고, 바이오-세이프™ 쿠마시 스테인(Bio-Safe™ Coomassie Stain)으로 염색하였다.
단백질 생산 유도:
표준 방법에 따라 생리적 상태로 단백질 생산을 유도하였다. 본 발명자들은, 재조합 단백질의 IPTG/락토스 유도성 생산을 구동하고, DsbA 신호 서열을 사용하여 상기 단백질을 원형질막주위 공간으로 표적화하는 플라스미드 pET28a를 함유하는 균주 BL21(DE3)을 사용하였다. 상기 기술된 바와 같이 원형질막주위 공간으로 표적화된 GFP 단백질을 사용하여, 본 발명자들은 동일한 시간량(수치) 동안 동일한 광학 밀도로 유도된 비전환 세포 집단과 비교하였을 때, 단백질 생산을 5배 획득 및 증가시킬 수 있는 능력을 입증하였다. 유도는 OD600 1.1에서 최적이었고, 유도는 10시간 동안 계속 진행되었고, 이 시점에서 생산된 단백질은 약 200 mg/mL로 측정되었다.
실시예
2: 전장의 콜라겐 제조
본원 실시예 1에서 논의된 발현 시스템을 이용하여 전장의 해파리 콜라겐를 제조하였다. 포도코리나 카르네아(Podocoryna carnea)(해파리 또는 히드라충강) 콜라겐의 야생형, 전장의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제공되어 있다.
전장의 해파리 콜라겐을 코딩하는 비코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2에 개시되어 있다.
야생형, 전장의 해파리 콜라겐을 코딩하는 2개의 상이한 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하였다. 두 폴리뉴클레오티드 서열은 약간 다른 코돈 최적화 방법에 기인하여 경미한 차이를 보였다. 비말단절단된, 전장의 해파리 콜라겐 이외에도, 폴리뉴클레오티드는 또한 분비 태그, 9개의 아미노산의 his 태그, 짧은 링커, 및 트롬빈 절단 부위를 코딩하였다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-71에 의해 코딩된다. 9개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 아미노산 25-33을 코딩한다. 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩된다. 트롬빈 절단 태그는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 아미노산 38-45를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐은 뉴클레오티드 136-1422에 의해 코딩된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하기 서열 번호 3 및 4에 개시되어 있다.
서열 번호 3 및 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열은 하기 서열 번호 5에 개시되어 있다. 서열 번호 5에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-71에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩하고; 9개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 아미노산 25-33을 코딩하고; 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩되고, 아미노산 34-37을 코딩하고; 트롬빈 절단 태그는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 아미노산 38-45를 코딩하고; 전장의 콜라겐은 뉴클레오티드 136-1422에 의해 코딩되고, 아미노산 46-474를 코딩한다.
DsbA 분비 태그, 히스티딘 태그, 링커 및 트롬빈 절단 부위가 없는 전장의 해파리 콜라겐은 서열 번호 89에 개시되어 있다
서열 번호 3 및 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드를 진9 DNA(Gen9 DNA), 현 깅코 바이오웍스(Ginkgo Bioworks)의 사내 합성에 의해 합성하였다. pET28 벡터와 서열 번호 3 및 서열 번호 4 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL(PrimeStar GXL) 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA(서열 번호 3 또는 서열 번호 4)를 SGI 깁슨 어셈블리(SGI Gibson assembly)(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(Eurofins Genomics)(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어(Sanger) 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
본 실시예 및 본 출원 전체에 걸쳐 사용된 최소 배지는 하기와 같이 제조된다. 최소 배지(표 1)를 염 믹스(인산암모늄 이염기성, 인산칼륨 일염기성, 시트르산 무수물, 황산마그네슘 7수화물), 수크로스 500 g/L, 글루코스 55%, 미량 금속 TM5(표 2), 및 수산화나트륨 10 M인 여러 별개의 분획으로 오토클레이빙하였다. 이어서, 최소 배지를 후드에서 오토클레이빙한 후, 상기 농도로 함께 혼합하였다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
균질화된 세포 브로쓰를 산으로 처리하여 콜라겐을 정제하였다. 6 M 염산을 이용하여 균질화된 슬러리의 pH를 3으로 감소시켰다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 산성화된 슬러리의 상청액을 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 시험하였고, 이는 출발 펠릿과 비교하였을 때, 비교적 높은 존재비로 콜라겐을 함유하는 것으로 나타났다.그렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염의 함유량이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 ㎡인 한외여과 카세트가 장착된 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템(EMD Millipore Tangential Flow Filtration system)을 이용하여 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다. 동시에 2개의 카세트를 이용함에 따라 총 여과 면적은 0.2 ㎡였다. TFF 단계에서 부피는 5x만큼 감소되었고, 염은 19x만큼 감소되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 다중 트레이 동결건조기를 사용하여 3일에 걸쳐 상기 슬러리를 건조시켜 백색, 솜털형(fluffy) 콜라겐 분말을 수득하였다.
정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 42 킬로달톤의 예상된 크기에서 진하고, 투명한 밴드가 관찰되었다. 정제된 콜라겐을 또한 질량 분석법에 의해 분석하였고, 42 킬로달톤의 단백질은 해파리 콜라겐인 것으로 확인되었다.
25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 발효를 수행하였다. 일부 발효의 경우, 발효 온도를 일정한 온도로 유지시켰고, 발효 완료 즉시 (OD600 5-10) 콜라겐을 정제하였다. 다른 발효의 경우, 발효 온도를 원하는 기간 동안 유지시켰고, 세포 밀도가 OD600 5-10에 도달하였을 때, 온도를 강하시켜 단백질 생산을 유도하였다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 강하시켰다. 25℃에서 40-60시간 동안 계속해서 발효시킨 후, 콜라겐을 단리시켰다.
추가의 전장의 해파리 콜라겐
His 태그, 링커, 및 트롬빈 절단 부위가 없는 전장의 해파리 콜라겐을 하기에 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 2개의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6 및 서열 번호 7에 제공되어 있다. 상이한 코돈 최적화 전략법에 기인하여 뉴클레오티드 서열은 상이하지만, 동일한 단백질을 코딩한다. 아미노산 서열은 서열 번호 8에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 73-1359에 의해 코딩되고, 아미노산 25-453을 코딩한다.
실시예
3: 말단절단된 콜라겐 제조
240개의 내부 아미노산이 말단절단된 해파리 콜라겐을 코딩하는, E. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된, 코돈 최적화된 DNA 서열을 합성하고, 발현시켰다. DNA 서열은 하기 서열 번호 9에 제시되어 있다. 서열 번호 9에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 서열 번호 10의 아미노산 1-24를 코딩한다. 9개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 서열 번호 10의 아미노산 25-33을 코딩한다. 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩되고, 서열 번호 10의 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 절단 부위는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 서열 번호 10의 아미노산 38-45를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐은 뉴클레오티드 136-822에 의해 코딩되고, 서열 번호 10의 아미노산 46-274를 코딩한다.
말단절단된 콜라겐은 전장의 콜라겐의 대략 54%이고, 이는 하기 서열 번호 10에 개시되어 있다.
DsbA 분비 태그, 히스티딘 태그, 링커 및 트롬빈 절단 부위가 없는, 말단절단된 해파리 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 85에 개시되어 있다.
DsbA 분비 태그, 히스티딘 태그, 링커 및 트롬빈 절단 부위가 없는, 말단절단된 해파리 콜라겐은 서열 번호 86에 개시되어 있다.
서열 번호 9의 폴리뉴클레오티드를 진9 DNA, 현 깅코 바이오웍스의 사내 합성에 의해 코돈 최적화하고, 합성하였다. pET28 벡터와 서열 번호 9 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA(서열 번호 9)를 SGI 깁슨 어셈블리(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
2.7 L의 최소 배지 + 글루코스를 이용하여 생물반응기를 준비하고, 300 ml의 OD600 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피가 3 L가 되도록 만들었다. 교반, 대기 및 산소를 함유하는 캐스케이드를 이용하여 용존 산소량을 20% 포화도로 유지시키면서, 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. 28% w/w 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 조절하였다. 일단 40 g/L의 초기 볼루스가 약 13시간 동안 고갈되고 나면, DO-stat 기반 공급 알고리즘을 이용하여 유가식 모드로 발효를 수행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 강하시켰다. 단백질 생산을 위해 1 mM IPTG를 이용하여 고밀도 배양을 유도하였다. 추가로 20-24시간 동안 계속해서 발효시키고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠릿을, 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제(pH 8) 중에 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량비로 재현탁시켰다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 발효를 수행하였다. 일부 발효의 경우, 발효 온도를 일정한 온도로 유지시켰고, 발효 완료 즉시 (OD600 5-10) 콜라겐을 정제하였다. 다른 발효의 경우, 발효 온도를 원하는 기간 동안 유지시켰고, 세포 밀도가 OD600 5-10에 도달하였을 때, 온도를 강하시켜 단백질 생산을 유도하였다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 강하시켰다. 25℃에서 40-60시간 동안 계속해서 발효시킨 후, 콜라겐을 단리시켰다.
균질화된 세포 브로쓰를 산으로 처리하여 콜라겐을 정제하였다. 추가로, 상기 기술된 바와 같이 원심분리 및 완충제 중 재현탁을 수행한 후, 생물반응기로부터 회수된, 비균질환된 전체 세포에 대하여 산 처리 또한 수행하였다. 6 M 염산을 이용하여 재현탁된 전체 세포의 균질화된 슬러리의 pH를 3으로 감소시켰다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 산성화된 슬러리의 상청액을 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 시험하였고, 이는 출발 펠릿과 비교하였을 때, 비교적 높은 존재비로 콜라겐을 함유하는 것으로 나타났다. 그렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염의 함유량이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 ㎡인 한외여과 카세트가 장착된 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다. 동시에 2개의 카세트를 이용함에 따라 총 여과 면적은 0.2 ㎡였다. TFF 단계에서 부피는 5x만큼 감소되었고, 염은 19x만큼 감소되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 다중 트레이 동결건조기를 사용하여 3일에 걸쳐 상기 슬러리를 건조시켜 백색, 솜털형 콜라겐 분말을 수득하였다.
균질화된 세포 브로쓰 또는 비균질화된 세포로부터 수득된, 정제된 말단절단된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 27 킬로달톤의 예상된 크기에서 진하고, 투명한 밴드가 관찰되었다. 정제된 콜라겐을 또한 질량 분석법에 의해 분석하였고, 27 킬로달톤의 단백질은 해파리 콜라겐인 것으로 확인되었다.
전장의 콜라겐 및 말단절단된 콜라겐의 대안적 정제 방법은 하기에 제공되어 있다.
발효 브로쓰를 0.3-0.5% w/v의 폴리 에틸 이민(PEI: Poly Ethyl Imine)과 혼합하였다. PEI와 함께 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 발효 브로쓰를 9000 rcf로 15분 동안 원심분리하여 상청액을 회수하였고, 이는 콜라겐 단백질을 함유하였다. 세포를 함유하는 펠릿을 폐기하고, PEI 처리된 콜라겐을 함유하는 상청액을 소듐 벤토나이트(Sodium Bentonite)(0.2% 최종 w/v)(Wyopure®, Wyoming Bentonite)와 혼합하고, 원심분리하였다. 벤토나이트를 함유하는 펠릿을 폐기하고, 상청액을 회수하였다.
벤토나이트로 처리된 상청액을 5 kDa 카세트를 이용하여 접선 유도 여과 시스템(TFF: tangential flow filtration)(EMD Millipore) 상에서 3-6배로 농축시켰다. 투과액 스트림 중 손실을 거의 없었고, 콜라겐은 유지되었다. 염을 제거하기 위해, 농축 단계로부터의 보유액을 동일한 TFF 셋업을 이용하여 투석여과하였다. 단백질 용액의 최종 전도도는 < 10 밀리지멘스였다. 전형적인 전도도는 400 마이크로지멘스 내지 1.5 밀리지멘스였다. 고도로 농축된 콜라겐 용액은 4 밀리지멘스에 가까운, 더 높은 전도도를 가졌다. 콜라겐의 농도에 의존하여 10 밀리지멘스보다 높은 전도도가 관찰될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이어서, 탈염 및 농축된 단백질을 W-L 9000 10 x 40 과립상 수지(Carbon Activated Corporation)를 이용하여 활성탄으로 처리하였다. 5% w/v의 탄소 수지를 콜라겐 함유 단백질 피드를 혼합하고, 가볍게 교반하면서, 45-50℃에서 혼합하였다. 여과 보조물, 예컨대, 규조토(Diatomaceous Earth)(Sigma Aldrich)의 존재 또는 부재하에서 에르텔 필터 프레스 패드 M-953(Ertel Filter Press Pad M-953)(Ertel Alsop)이 라이닝된 부흐너(Buchner) 깔때기를 이용하여, 탄소 처리된 슬러리를 여과하였다. 여과 후, 콜라겐 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, 1 내지 수 시간 동안 소듐 벤토나이트(0.2% w/v 최종)(Wyopure®, Wyoming Bentonite)로 처리하고, 9000 rcf로 15-30분 동안 원심분리하여 고도로 순수하고, 투명하고, 미립자가 없는 콜라겐 용액을 수득하였다. 내독소 단백질 제거를 원하는 경우, 단백질을 크로마토그래피 필터, 예컨대, 사르토바인드-Q(Sartobind-Q)(Sartorius-Stedim)를 통해 통과시켜 구체적으로 내독소 단백질을 제거하였다.
정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 30 킬로달톤에서 진하고, 투명한 밴드가 관찰되었다. 크기의 업시프트(upshift)는 콜라겐 분자의 구조 및 높은 글리신/프롤린 아미노산 함량에 기인한다. 정제된 콜라겐을 또한 질량 분석법에 의해 분석하였고, 30 킬로달톤 단백질은 말단절단된 콜라겐인 것으로 확인되었다.
말단절단된 콜라겐을 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC를 사용하여 HPLC에 의해 추가로 분석하였다. 칼럼은 내경 4.6 mm, μM 입자 크기 및 1,000 옹스트롬 공극 크기인 50 mm 애질런트 PLRP-S 역상 칼럼이었다.
HPLC 등급의 물 중 0.04% 아지드화나트륨 용액 중에 1:1 희석함으로써 샘플을 제조하였다. 희석 후, 생성된 혼합물을 0.45 um 필터를 통해 여과하여 HPLC 칼럼을 막을 수 있는 임의의 큰 입자를 제거하였다. 분석을 위해, 샘플을 약 pH 4.5의 HPLC 등급의 물 중 20 mM 아세트산암모늄 완충제로 적절히 희석한다. 샘플을 혼합한 후, 300 ㎕ 마이크로바이알로 옮긴 후, 이를 오토샘플러에 배치하였다. 켐스테이션(ChemStation)을 이용하여, HPLC를 작동시키는 소프트웨어, 분석 파라미터, 예컨대, 샘플 유속, 칼럼 온도, 이동상 유속, 이동상 조성 등을 변경할 수 있다. 한 예시적인, 그러나, 비제한적인 분석에서, 파라미터는 하기와 같았다: 샘플 유속 1 mL/min, 칼럼 온도 80℃, 칼럼 압력 60-70 bar, 이동상 조성 97.9% 물/0.2% 트리플루오로아세트산을 포함하는 1.9% 아세토니트릴; 분석을 위한 UV 파장 214.4 nm, 주입 부피 10 ㎕, 및 샘플 전개 시간 10분.
상기 조건하에서, 서열 번호 91의 말단절단된 해파리 콜레이션(collation)의 용출 시간은 약 5.4분이었다. 켐스테이션은 용출 피크의 피크 면적을 정량화하고, 피크 면적을 단백질 농도와 직접 결부시키는 검정 곡선을 이용하여 단백질 농도를 계산한다. 0.06 mg/mL 내지 1.00 mg/mL 범위의 콜라겐 농도를 함유하도록 연속 희석된 공지된 콜라겐 용액을 사용하여 검정 곡선을 작성한다.
His 태그-링커-트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 콜라겐
His 태그, 링커, 및 트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 해파리 콜라겐을 하기에 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 12에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 73-639에 의해 코딩되고, 아미노산 25-213을 코딩한다.
His 태그, 링커 및 트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 해파리 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 90에 개시되어 있다.
His 태그, 링커 및 트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 해파리 콜라겐은 서열 번호 91에 개시되어 있다.
GEK
반복부를
포함하는 말단절단된 콜라겐
GEK 반복부를 포함하는 해파리 콜라겐을 하기에서 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 13에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 14에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. GEK 반복부는 뉴클레오티드 73-126에 의해 코딩되고, 아미노산 25-42의 GEK 반복부를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 127-693에 의해 코딩되고, 아미노산 43-231을 코딩한다.
서열 번호 13의 폴리뉴클레오티드를 진9 DNA, 현 깅코 바이오웍스의 사내 합성에 의해 코돈 최적화하고, 합성하였다. pET28 벡터와 서열 번호 13 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA(서열 번호 13)를 SGI 깁슨 어셈블리(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
2.7 L의 최소 배지 + 글루코스를 이용하여 생물반응기를 준비하고, 300 ml의 OD600 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피가 3 L가 되도록 만들었다. 교반, 대기 및 산소를 함유하는 캐스케이드를 이용하여 용존 산소량을 20% 포화도로 유지시키면서, 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. 28% w/w 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 조절하였다. 일단 40 g/L의 초기 볼루스가 약 13시간 동안 고갈되고 나면, DO-stat 기반 공급 알고리즘을 이용하여 유가식 모드로 발효를 수행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 강하시켰다. 단백질 생산을 위해 1 mM IPTG를 이용하여 고밀도 배양을 유도하였다. 추가로 20-24시간 동안 계속해서 발효시키고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠릿을, 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제(pH 8) 중에 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량비로 재현탁시켰다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
상기 기술된 바와 같이 원심분리 및 완충제 중 재현탁을 수행한 후, 생물반응기로부터 회수된, 전체 세포를 산으로 처리하여 콜라겐을 정제하였다. 6 M 염산을 이용하여 균질화된 슬러리 또는 재현탁된 현탁액의 pH를 3으로 감소시켰다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 산성화된 슬러리의 상청액을 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 시험하였고, 이는 출발 펠릿과 비교하였을 때, 비교적 높은 존재비로 콜라겐을 함유하는 것으로 나타났다. 그렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염의 함유량이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 ㎡인 한외여과 카세트가 장착된 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다. 동시에 2개의 카세트를 이용함에 따라 총 여과 면적은 0.2 ㎡였다. TFF 단계에서 부피는 5x만큼 감소되었고, 염은 19x만큼 감소되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 다중 트레이 동결건조기를 사용하여 3일에 걸쳐 상기 슬러리를 건조시켜 백색, 솜털형 콜라겐 분말을 수득하였다.
정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 겉보기 분자량 35 킬로달톤으로 전개되는 것으로 관찰되었다. 35 킬로달톤 밴드는 22 킬로달톤의 예상된 크기와 일치하지 않았다. 예상 크기와 겉보기 크기 사이의 업시프트는 GEK 반복부가 겔 매트릭스와 상호작용하기 때문인 것으로 간주된다. 질량 분석법에 의해 35 kDa 밴드는 정확한 GEK 반복부를 포함하는 콜라겐인 것으로 확인되었다.
GDK
반복부를
포함하는 말단절단된 콜라겐
GDK 반복부를 포함하는 해파리 콜라겐을 하기에서 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 15에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 16에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. GDK 반복부는 뉴클레오티드 73-126에 의해 코딩되고, 아미노산 25-42의 GDK 반복부를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 127-693에 의해 코딩되고, 아미노산 43-231을 코딩한다.
서열 번호 15의 폴리뉴클레오티드를 진9 DNA, 현 깅코 바이오웍스의 사내 합성에 의해 코돈 최적화하고, 합성하였다. pET28 벡터와 서열 번호 15 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA(서열 번호 15)를 SGI 깁슨 어셈블리(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
2.7 L의 최소 배지 + 글루코스를 이용하여 생물반응기를 준비하고, 300 ml의 OD600 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피가 3 L가 되도록 만들었다. 교반, 대기 및 산소를 함유하는 캐스케이드를 이용하여 용존 산소량을 20% 포화도로 유지시키면서, 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. 28% w/w 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 조절하였다. 일단 40 g/L의 초기 볼루스가 약 13시간 동안 고갈되고 나면, DO-stat 기반 공급 알고리즘을 이용하여 유가식 모드로 발효를 수행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 강하시켰다. 단백질 생산을 위해 1 mM IPTG를 이용하여 고밀도 배양을 유도하였다. 추가로 20-24시간 동안 계속해서 발효시키고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠릿을, 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제(pH 8) 중에 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량비로 재현탁시켰다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
상기 기술된 바와 같이 원심분리 및 완충제 중 재현탁을 수행한 후, 생물반응기로부터 회수된, 전체 세포를 산으로 처리하여 콜라겐을 정제하였다. 6 M 염산을 이용하여 균질화된 슬러리의 pH를 3으로 감소시켰다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 산성화된 슬러리의 상청액을 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 시험하였고, 이는 출발 펠릿과 비교하였을 때, 비교적 높은 존재비로 콜라겐을 함유하는 것으로 나타났다. 그렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염의 함유량이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 ㎡인 한외여과 카세트가 장착된 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다. 동시에 2개의 카세트를 이용함에 따라 총 여과 면적은 0.2 ㎡였다. TFF 단계에서 부피는 5x만큼 감소되었고, 염은 19x만큼 감소되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 다중 트레이 동결건조기를 사용하여 3일에 걸쳐 상기 슬러리를 건조시켜 백색, 솜털형 콜라겐 분말을 수득하였다.
정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 겉보기 분자량 35 킬로달톤으로 전개되는 것으로 관찰되었다. 35 킬로달톤 밴드는 22 킬로달톤의 예상된 크기와 일치하지 않았다. 예상 크기와 겉보기 크기 사이의 업시프트는 GDK 반복부가 겔 매트릭스와 상호작용하기 때문인 것으로 간주된다. 질량 분석법에 의해 35 kDa 밴드는 정확한 GDK 반복부를 포함하는 콜라겐인 것으로 확인되었다.
DsbA
분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및
GFP
베타-
락타마제
융
합물을 포함하는 말단절단된 콜라겐(버전 1):
DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합물을 포함하는 해파리 콜라겐을 하기에서 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 17에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 18에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. His 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 아미노산 25-33의 9개의 히스티딘의 태그를 코딩한다. 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩되고, 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 절단부는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 아미노산 38-45를 코딩한다. 링커를 포함하는 녹색 형광성 단백질(GFP)은 뉴클레오티드 136-873에 의해 코딩되고, 아미노산 46-291을 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 874-1440에 의해 코딩되고, 아미노산 292-480을 코딩한다. 링커를 포함하는 베타-락타마제는 뉴클레오티드 1441-2232에 의해 코딩되고, 아미노산 481-744를 코딩한다. 비록 폴리펩티드가 비의존성 분비 태그를 갖지는 않았지만, 베타-락타마제는 적절하게 원형질막주위 공간으로 표적화되었다. DsbA 분비 태그는 전체 전사체(DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합 단백질을 포함하는 말단절단된 콜라겐)를 원형질막주위 공간으로 유도하였고, 베타-락타마제는 적절하게 작용하였다.
수개의 DNA 단편을 어셈블리하여 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드를 구성하였다. 콜라겐 함유 서열을 진9 DNA, 현 깅코 바이오웍스의 사내 합성에 의해 코돈 최적화하고, 합성하였다. GFP 또한 진9에 의해 합성하였다. 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 플라스미드 pKD46(http://cgsc2.biology.yale. edu/Strain.php?ID=68099)으로부터 베타-락타마제를 클로닝하였다. pET28 벡터, GFP, 콜라겐, 및 베타-락타마제 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA를 SGI 깁슨 어셈블리(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
2.7 L의 최소 배지 + 글루코스를 이용하여 생물반응기를 준비하고, 300 ml의 OD600 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피가 3 L가 되도록 만들었다. 교반, 대기 및 산소를 함유하는 캐스케이드를 이용하여 용존 산소량을 20% 포화도로 유지시키면서, 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. 28% w/w 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 조절하였다. 일단 40 g/L의 초기 볼루스가 약 13시간 동안 고갈되고 나면, DO-stat 기반 공급 알고리즘을 이용하여 유가식 모드로 발효를 수행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 강하시켰다. 단백질 생산을 위해 1 mM IPTG를 이용하여 고밀도 배양을 유도하였다. 추가로 20-24시간 동안 계속해서 발효시키고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠릿을, 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제(pH 8) 중에 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량비로 재현탁시켰다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
상기 기술된 바와 같이 원심분리 및 완충제 중 재현탁을 수행한 후, 생물반응기로부터 회수된, 비균질화된 전체 세포를 산으로 처리하여 콜라겐을 정제하였다. 6 M 염산을 이용하여 재현탁된 현탁액의 pH를 3으로 감소시켰다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원심분리하였다. 이어서, 10 N NaOH를 이용하여 pH를 9로 상승시키고, 슬러리의 상청액을 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 시험하였고, 이는 출발 펠릿과 비교하였을 때, 비교적 높은 존재비로 콜라겐을 함유하는 것으로 나타났다. 그렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염의 함유량이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 ㎡인 한외여과 카세트가 장착된 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다. 동시에 2개의 카세트를 이용함에 따라 총 여과 면적은 0.2 ㎡였다. TFF 단계에서 부피는 5x만큼 감소되었고, 염은 19x만큼 감소되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 다중 트레이 동결건조기를 사용하여 3일에 걸쳐 상기 슬러리를 건조시켜 백색, 솜털형 콜라겐 분말을 수득하였다.
정제된 콜라겐-GFP-베타-락타마제 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 겉보기 분자량 90 킬로달톤으로 전개되는 것으로 관찰되었다. 융합 단백질의 예상 크기는 85 kd이다. 질량 분석법에 의해 90 kDa 밴드는 정확한 콜라겐 융합 단백질인 것으로 확인되었다.
DsbA
분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및
GFP
베타-
락타마제
융
합물을 포함하는 말단절단된 콜라겐(버전 2):
DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합물을 포함하는 해파리 콜라겐을 하기에서 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 20에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. His 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 아미노산 25-33의 9개의 히스티딘의 태그를 코딩한다. 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩되고, 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 절단부는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 아미노산 38-45를 코딩한다. 링커를 포함하는 녹색 형광성 단백질(GFP)은 뉴클레오티드 136-873에 의해 코딩되고, 아미노산 46-291을 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 874-1440에 의해 코딩되고, 아미노산 292-480을 코딩한다. 링커를 포함하는 베타-락타마제는 뉴클레오티드 1441-2232에 의해 코딩되고, 아미노산 481-744를 코딩한다.
실시예
4: 전장의 엘라스틴 제조
전장의 인간 엘라스틴을 하기에 기술된 바와 같이 발현시켰다. 인간 엘라스틴의 야생형, 전장의 아미노산 서열은 하기에 제공되어 있다.
전장의 엘라스틴을 코딩하는 비코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 개시되어 있다. 서열 번호 22에서, 뉴클레오티드 1-78은 DsbA 분비 태그를 코딩하고, 뉴클레오티드 79-2358은 전장의 인간 엘라스틴을 코딩한다.
DsbA
분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위를 포함하는 코돈 최적화된 엘라스틴
DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위를 포함하는 전장의 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 하기에 개시한다. 서열 번호 23에서: 뉴클레오티드 1-72는 서열 번호 24의 아미노산 1-24를 코딩하는 DsbA 분비 태그를 코딩하고; 뉴클레오티드 73-99는 서열 번호 24의 아미노산 25-33을 코딩하는 9개의 His 태그를 코딩하고; 뉴클레오티드 100-111은 서열 번호 24의 아미노산 34-37을 코딩하는 링커를 코딩하고; 뉴클레오티드 112-135는 서열 번호 24의 아미노산 38-45를 코딩하는 트롬빈 절단 태그를 코딩하고; 뉴클레오티드 136-2415는 서열 번호 24의 전장의 인간 엘라스틴의 아미노산 46-805를 코딩한다.
천연 서열 태그를 포함하는 전장의 인간 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 87에 개시되어 있다.
천연 서열 태그를 포함하는 전장의 인간 엘라스틴 서열은 서열 번호 88에 개시되어 있다.
DsbA
분비 태그를 포함하는 코돈 최적화된 엘라스틴
DsbA 분비 태그를 포함하는 전장의 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 25에 개시되어 있다. 서열 번호 25에서: 뉴클레오티드 1-72는 서열 번호 26의 아미노산 1-24를 코딩하는 DsbA 분비 태그를 코딩하고; 뉴클레오티드 73-2355는 서열 번호 26의 전장의 인간 엘라스틴의 아미노산 25-785를 코딩한다.
서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드를 진9 DNA, 현 깅코 바이오웍스의 사내 합성에 의해 코돈 최적화하고, 합성하였다. pET28 벡터와 서열 번호 22 사이의 중복부는 길이가 30 내지 40 bp가 되도록 디자인하였고, 효소 프라임스타 GXL 폴리머라제(http://www. clontech. com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 이용하여 PCR을 사용하여 부가하였다. 이어서, 개방형 pET28a 벡터 및 인서트 DNA(서열 번호 22)를 SGI 깁슨 어셈블리(https://us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 이용하여 최종 플라스미드로 함께 어셈블리하였다. 이어서, 유로핀즈 게노믹스(www.eurofinsgenomics.com)를 통해 생어 서열분석을 통하여 플라스미드의 서열을 확인하였다.
형질전환된 세포를 최소 배지 중에서 배양하고, 세포 대 글리세롤의 비율을 50:50으로 하여 글리세롤과 함께 1.5 분취량으로 냉동시켰다. 상기 냉동된 배양물 한 바이알을 50 ml 최소 배지 중 37℃에서 200 rpm으로 밤새도록 소생시켰다. 세포를 300 ml 최소 배지로 옮기고, OD600이 5-10에 도달할 때까지 6-9시간 동안 성장시켰다.
2.7 L의 최소 배지 + 글루코스를 이용하여 생물반응기를 준비하고, 300 ml의 OD600 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피가 3 L가 되도록 만들었다. 교반, 대기 및 산소를 함유하는 캐스케이드를 이용하여 용존 산소량을 20% 포화도로 유지시키면서, 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. 28% w/w 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 조절하였다. 일단 40 g/L의 초기 볼루스가 약 13시간 동안 고갈되고 나면, DO-stat 기반 공급 알고리즘을 이용하여 유가식 모드로 발효를 수행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 강하시켰다. 단백질 생산을 위해 1 mM IPTG를 이용하여 고밀도 배양을 유도하였다. 추가로 20-24시간 동안 계속해서 발효시키고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠릿을, 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제(pH 8) 중에 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량비로 재현탁시켰다.
25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 발효를 수행하였다. 일부 발효의 경우, 발효 온도를 일정한 온도로 유지시켰고, 발효 완료 즉시 (OD600 5-10) 엘라스틴을 정제하였다. 다른 발효의 경우, 발효 온도를 원하는 기간 동안 유지시키고, 세포 밀도가 OD600 5-10에의 도달시, 온도를 강하시켜 단백질 생산을 유도한다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 강하시킨다. 25℃에서 40-60시간 동안 계속해서 발효시킨 후, 엘라스틴을 단리시킨다.
수거된 세포를 균질기에서 14,000 psi 압력하에 2회 통과시켜 파괴시켰다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.
균질화된 세포로부터의 상청액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 68 킬로달톤의 예상된 크키에 상응하는 약 70 킬로달톤에서 투명 밴드가 관찰되었다. 정제된 엘라스틴을 질량 분석법에 의해 분석한다.
DsbA
분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및
GFP
베타-
락타마제
융
합물을 포함하는 전장의 엘라스틴
DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 절단 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합물을 포함하는 인간 엘라스틴을 하기에 개시한다. 상기 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열 번호 28에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. His 태그는 뉴클레오티드 73-99에 의해 코딩되고, 아미노산 25-33의 9개의 히스티딘의 태그를 코딩한다. 링커는 뉴클레오티드 100-111에 의해 코딩되고, 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 절단부는 뉴클레오티드 112-135에 의해 코딩되고, 아미노산 38-45를 코딩한다. 링커를 포함하는 녹색 형광성 단백질(GFP)은 뉴클레오티드 136-873에 의해 코딩되고, 아미노산 46-291을 코딩한다. 전장 엘라스틴 서열은 뉴클레오티드 874-3153에 의해 코딩되고, 아미노산 292-1051을 코딩한다. 링커를 포함하는 베타-락타마제는 뉴클레오티드 3154-3945에 의해 코딩되고, 아미노산 1052-1315를 코딩한다.
실시예
5: 말단절단된 엘라스틴 제조
실시예 4에 기술된 바와 같은 발현 시스템을 사용하여 말단절단된 인간 엘라스틴을 제조한다. 천연 분비 태그가 없는 전장의 아미노산 서열은 서열 번호 29에 개시되어 있다.
천연 분비 태그가 없는 전장의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 30에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 60.7 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 31에 개시되어 있다. 60.7 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 706-761이 결실되어 있다.
말단절단된 60.7 kDa 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 32에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 58.8 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 33에 개시되어 있다. 58.8 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-85가 결실되어 있다.
58.8 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 34에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 57 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 35에 개시되어 있다. 57 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 661-761이 결실되어 있다.
57 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 36에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 53.9 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 37에 개시되어 있다. 53.9 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 624-761이 결실되어 있다.
53.9 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 38에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 45.3 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 39에 개시되어 있다. 45.3 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 529-761이 결실되어 있다.
45.3 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 44.4 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 41에 개시되어 있다. 44.4 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-246이 결실되어 있다.
44.4 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 42에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 40.4 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 43에 개시되어 있다. 40.4 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-295이 결실되어 있다.
40.4 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 44에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 39.8 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 45에 개시되어 있다. 39.8 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 462-761이 결실되어 있다.
39.8 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 46에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 36.1 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 47에 개시되어 있다. 36.1 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 418-761이 결실되어 있다.
36.1 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 48에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 34.9 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 49에 개시되어 있다. 34.9 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-360이 결실되어 있다.
34.9 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 50에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 32 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 51에 개시되어 있다. 32 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 373-761이 결실되어 있다.
32 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 52에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 29.9 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 53에 개시되어 있다. 60.7 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 347-761이 결실되어 있다.
29.9 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 54에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 29.4 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 55에 개시되어 있다. 29.4 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-425이 결실되어 있다.
29.4 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 56에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 25.3 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 57에 개시되어 있다. 25.3 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-473이 결실되어 있다.
25.3 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 58에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 24.1 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 59에 개시되어 있다. 24.1 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 277-761이 결실되어 있다.
24.1 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 60에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 20.3 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 61에 개시되어 있다. 20.3 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 229-761이 결실되어 있다.
20.3 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 62에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 19.6 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 63에 개시되어 있다. 19.6 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-542이 결실되어 있다.
19.6 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 64에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 11 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 65에 개시되어 있다. 11 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-635이 결실되어 있다.
11 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 66에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 7.9 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 67에 개시되어 있다. 7.9 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-674이 결실되어 있다.
7.9 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 68에 개시되어 있다.
C-말단에서 말단절단된 6.3 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 69에 개시되어 있다. 6.3 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 74-761이 결실되어 있다.
6.3 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 70에 개시되어 있다.
N-말단에서 말단절단된 4.3 kDa 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열 번호 71에 개시되어 있다. 4.3 kDa 말단절단된 엘라스틴은 전장의 엘라스틴으로부터 아미노산 2-717이 결실되어 있다.
4.3 kDa 말단절단된 인간 엘라스틴을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 72에 개시되어 있다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 1
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 1의 아미노산 서열은 서열 번호 98에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 99의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 98의 아미노산 1-19이다. 엘라스틴 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 99의 뉴클레오티드 58-657이고, 아미노산 서열은 서열 번호 98의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 99의 뉴클레오티드 658-684이고, 아미노산 서열은 서열 번호 98의 아미노산 220-228이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 1의 핵산 서열은 서열 번호 99에 개시되어 있다.
서열 번호 99의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 엘라스틴을 정제하였다. 정제된 엘라스틴은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 2
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 타입 2의 아미노산 서열은 서열 번호 100에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 101의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 100의 아미노산 1-19이다. 엘라스틴 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 101의 뉴클레오티드 58-657이고, 아미노산 서열은 서열 번호 100의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 101의 뉴클레오티드 658-684이고, 아미노산 서열은 서열 번호 100의 아미노산 220-228이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 엘라스틴 2의 핵산 서열은 서열 번호 101에 개시되어 있다.
서열 번호 101의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 엘라스틴을 정제하였다. 정제된 엘라스틴은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
실시예
6: 말단절단된 콜라겐이 섬유아세포 세포
생존능
,
프로콜라겐
합성, 및 엘라스틴 합성에 미치는 효과
인간 섬유아세포 세포 배양물을 이용하여 실시예 2의 말단절단된 해파리 콜라겐 분자가 프로콜라겐, 및 엘라스틴 합성에 미치는 효과를 측정할 수 있는 그의 능력에 대해 사정하였다. 또한, 인간 섬유아세포 세포 배양물을 이용하여 말단절단된 해파리 콜라겐에의 노출 이후, 인간 섬유아세포 세포의 생존능 증가를 측정하였다.
실시예 3의 히스티딘 태그부착된 말단절단된 콜라겐으로부터 2% w/w 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액을 제조하였다. 이어서, 2% 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액으로부터의 분취량을 하기 기술되는 실험에서 사용하였다.
섬유아세포 제조
섬유아세포를 0.5 ml 섬유아세포 성장 배지(FGM: Fibroblast Growth Media) 중 24웰 플레이트의 개별 웰에 시딩하고, 37 ± 2℃ 및 5 ± 1% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 흡인을 통해 배지를 제거하여 임의의 비부착 세포를 제거하고, 0.5 ml의 신선한 FGM으로 대체하였다. 매 48 내지 72시간마다 배지를 교체해주면서, 세포를 전면생장시까지 성장시켰다. 전면생장에 도달하였을 때, 1.5% FBS로 보충된 DMEM으로 세포를 24시간 동안 처리하여 일반 배양 배지 중에 포함되어 있는 성장 인자로부터의 임의의 효과를 세척해 내었다. 24시간 세척 기간 후, 1.5% FBS를 포함하는 FGM에 용해된 명시된 농도의 말단절단된 해파리 콜라겐으로 세포를 처리하였다. 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β: Transforming Growth Factor Beta)(20 ng/ml)를 콜라겐 및 엘라스틴 합성에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 처리되지 않은 세포(음성 대조군)는 단지 1.5% FBS를 포함하는 DMEM만을 받았다. 세포를 48시간 동안 인큐베이션시키고, 인큐베이션 기간 종료시, 세포 배양 배지를 수집하고, 냉동 보관하거나(-75℃), 즉시 검정하였다. 재료는 삼중으로 시험하였다.
MTT
검정법
MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 테트라졸) 검정법은 세포의 대사 활성을 측정하는 데 사용되는 비색 검정법이다. MTT 검정법을 통해 세포 개수 변화를 사정하였다. 세포의 MTT에의 노출시, 생존가능한 세포 중 미토콘드리아에 의해 MTT가 환원됨에 따라 불용성의 보라색 포르마진 결정이 형성되고, 이는 이소프로판올에 의해 세포로부터 추출되고, 분광광도법에 의해 정량화된다. 살아있지 않은 세포는 MTT를 환원시킬 수 없고, 그러므로, 보라색 포르마진 결정을 생산할 수 없다. 보라색 색상의 강도는 살아있는 세포(대사적으로 활성인 세포)의 개수와 정비례한다. 보라색 색상의 강도는 세포의 대사 활성과 정비례하고, 시험 물질의 독성과 반비례한다.
상기 논의된 2일 동안의 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 제거하고(상기 참조), 섬유아세포를 PBS로 2회 세척하여 임의의 남아있는 해파리 글리칸 분자를 제거하였다. 최종 세척 후, 0.5 mg/ml MTT로 보충된 500 ㎕ DMEM을 각 웰에 첨가하고, 세포를 37 ± 2℃ 및 5 ± 1% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, DMEM/MTT 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 다시 1회 세척한 후, 0.5 ml의 이소프로필 알콜을 웰에 첨가하여 보라색 포르마진 결정을 추출하였다. 200 ㎕의 이소프로필 추출물을 96웰 플레이트로 옮기고, 블랭크로서 이소프로필 알콜을 사용하여 540 nm에서 플레이트를 판독하였다.
음성 대조군 세포에 대한 평균 MTT 흡광도 값을 계산하고, 이를 100% 세포 생존능을 나타내는 것으로 사용하였다. 이어서, 다양하게 처리된 세포로부터의 개별 MTT 흡광도 값을 음성 대조군 세포에 대한 평균 값으로 나누고, 이를 각 처리에 의해 유발된 세포 생존능의 변화를 측정하는 비율로서 표시하였다.
본 실시예의 표 1, 2, 및 3에서, 본 검정법에서는 2% 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액의 지정된 분취량을 사용하여 실험을 수행하였다. 예를 들어, "10% 콜라겐 용액"을 시험함 샘플에서는 10%의 검정 부피를 제공하는 데 충분한 양으로 2% 말단절단된 콜라겐의 분취량을 사용하였다. 총 검정 부피가 1.0 ml인 경우, 100 ㎕의 2% 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액을 사용하였다. 표 1, 2, 및 3에서, "10% 콜라겐 용액"은 0.2% 콜라겐이고, "5% 콜라겐 용액"은 0.1% 콜라겐이고, "1% 콜라겐 용액"은 0.02% 콜라겐이고, "0,5% 콜라겐 용액"은 0.01% 콜라겐이고, "0.1% 콜라겐 용액"은 0.002% 콜라겐이고, "0.05% 콜라겐 용액"은 0.001% 콜라겐이고, "0.01% 콜라겐 용액"은 0.0002% 콜라겐이고, "0.005% 콜라겐 용액"은 0.0001% 콜라겐이다.
MTT 검정법에 대한 결과는 표 3에 제시되어 있고, 그 값은 평균 생존율(%) ± 평균으로부터의 편차로 제시되어 있다.
히스티딘 태그부착된 말단절단된 해파리 콜라겐은 인간 섬유아세포 세포의 세포 생존능을 증가시킴으로써 보호 효과를 보였다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, MTT 검정법에서 최고값은 섬유아세포 세포를 0.02% 내지 0.2% 말단절단된 해파리 콜라겐에 노출시켰을 때 관찰되었다.
프로콜라겐
합성
섬유아세포는 구조 단백질 콜라겐 및 엘라스틴을 비롯한, 세포외 매트릭스 펩티드의 주요 공급원이다. 프로콜라겐은 피부의 진피층 중의 섬유아세포에 의해 합성된 큰 펩티드이고, 콜라겐에 대한 전구체이다. 펩티드는 프로세싱되어 성숙한 콜라겐 단백질을 형성하고, 프로펩티드 부분은 절단된다(타입 I C-펩티드). 이어서, 성숙한 콜라겐 단백질 및 타입 I C-펩티드 단편, 둘 모두세포외 환경으로 방출된다. 콜라겐이 합성됨에 따라, 타입 I C-펩티드 단편은 조직 배양 배지 내에 축적된다. 프로콜라겐 펩티드의 두 파트 사이에 화학량론적 비가 1:1이기 때문에, 타입 I C-펩티드에 대한 검정이 합성된 콜라겐의 양을 반영하게 될 것이다. 타입 1 C-펩티드를 ELISA 기반 방법을 통해 검정할 수 있다.
일련의 타입 I C-펩티드 표준을 0 ng/ml 내지 640 ng/ml 범위로 제조하였다. 이어서, 플레이트 프레임으로부터 임의의 불필요한 스트립을 제거한 후, 검정법에서 사용된 각 웰에 100 ㎕의 퍼옥시다제 표지된 항프로콜라겐 타입 I-C 펩티드 항체를 첨가함으로써 ELISA 마이크로플레이트를 제조하였다. 이어서, 이십(20) ㎕의 샘플(수집된 조직 배양 배지) 또는 표준을 적절한 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트를 덮고, 37℃에서 3 ± 0.25시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 웰을 흡인하고, 400 ㎕의 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 마지막 세척물 제거 후, 100 ㎕의 퍼옥시다제 기질 용액(발색원으로서 과산화수소 + 테트라메틸벤지딘)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15 ± 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 100 ㎕의 정지액(1 N 황산)을 각 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 플레이트를 판독하였다.
각 기질의 존재량을 정량화하기 위해, 공지된 농도의 각 기질을 이용하여 표준 곡선을 작성하였다. 회귀 분석을 수행하여 상기 데이터 점과의 최적합 선을 확립하였다. 시험 물질 및 처리되지 않은 샘플에 대한 흡광도 값을 사용하여 각 샘플 중에 존재하는 각 기질의 양을 추정하였다.
ELISA 검정법에 대한 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다.
히스티딘 태그부착된 말단절단된 해파리 콜라겐은 콜라겐 합성에 대하여 2상 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 1%, 5% 및 10% 수준에서, 콜라겐 합성은 증가하였다. 5% 농도에서, 말단절단된 해파리 콜라겐은 콜라겐 합성을 유의적으로 증가시켰다(p 값 0.05 미만).
엘라스틴 합성
엘라스틴은 조직이 일시적인 신장 후에 재수축할 수 있도록 하는 능력을 조직에 제공하는 탄성 섬유 네트워크의 주요 성분이다. 상기 단백질(가용성 엘라스틴)은 섬유아세포에 의해 세포외 공간으로 방출되고, 이어서, 상기 세포외 공간에서 다른 엘라스틴 단백질과 가교 결합하여 섬유 및 시트로 이루어진 광범위한 네트워크(불용성 엘라스틴)를 형성한다. 가용성 엘라스틴은 ELISA 기반 방법을 통해 세포 배양 배지로부터 쉽게 측정될 수 있다.
가용성 α-엘라스틴을 0.1 M 탄산나트륨(pH 9.0) 중에 1.25 ㎍/ml의 농도로 용해시켰다. 이어서, 150 ㎕의 상기 용액을 96웰 맥시소르프 눈크(maxisorp Nunc) 플레이트의 웰에 적용시키고, 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 웰을 0.25% BSA 및 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 PBS로 포화시켰다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 상기 차단 용액과 함께 인큐베이션시킨 후, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다.
0 내지 100 ng/ml 범위의 α-엘라스틴 표준 한 세트를 생성하였다. 이어서, 180 ㎕의 표준 또는 말단절단된 해파리 콜라겐을 650 ㎕ 미량 원심분리기 튜브로 옮겨 놓았다. 항엘라스틴 항체 용액을 제조하고(항체를 0.25% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중에서 1:100으로 희석하고), 20 ㎕의 상기 용액을 상기 튜브에 첨가하였다. 이어서, 튜브를 4 ± 2℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 150 ㎕를 각 튜브로부터 96웰 엘라스틴 ELISA 플레이트로 옮기고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후, 0.25% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중에 희석된 퍼옥시다제 결합 2차 항체를 함유하는 200 ㎕의 용액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3회에 걸쳐 세척한 후, 200 ㎕의 기질 용액을 첨가하고, 플레이트를 암실에서 10 내지 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기 최종 인큐베이션 후, 플레이트 판독기를 이용하여 플레이트를 460 nm에서 판독하였다.
표 5에 제시된 바와 같이, 말단절단된 his-태그부착된 해파리 콜라겐은 0.5% 농도로 사용되었을 때, 엘라스틴 생산을 유의적으로 증가시켰다.
실시예
7: 말단절단된 콜라겐이 각질형성세포 증식 및
UVB
보호에 미치는 효과
인간 각질형성세포 세포 배양물 모델을 사용하여 시험 물질이 세포 증식에 효과를 발휘할 수 있는 능력에 대하여 사정하였다. 추가로, UVB에의 노출 후, 시험 물질이 세포 생존능에 미치는 영향도 사정하였다.
실시예 1의 말단절단된 콜라겐으로부터 2% w/w 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액을 제조하였다. 이어서, 2% 말단절단된 콜라겐의 스톡 용액으로부터의 분취량을 하기 기술되는 실험에서 사용하였다.
본 연구는 2개 파트로 수행되었다. 제1 파트에서, 배양된 각질형성세포를 시험 물질과 함께 48시간 동안 인큐베이션시킨 후, MTT 검정법을 사용하여 생존가능한 세포의 개수 변화를 사정하였다. 본 연구의 제2 파트에서, 배양된 각질형성세포에 UVB를 조사한 후, 48시간 동안 시험 물질로 처리하였다. 48시간의 기간 종료시, MTT 검정법을 통해 생존가능한 세포의 개수를 다시 사정하였다.
MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 테트라졸) 검정법을 이용하여 생존가능한 세포의 세포 개수의 변화를 측정할 수 있다. MTT 검정법은, 생존가능한 세포의 개수를 반영하는, 세포의 대사 활성의 비색 분석법이다. 생존가능한 세포 중 미토콘드리아에 의해 MTT가 환원됨에 따라 불용성의 보라색 포르마진 결정이 형성되고, 이는 이소프로판올에 의해 세포로부터 추출되고, 분광광도법에 의해 정량화된다. 보라색 색상의 강도는 대사적으로 활성인 세포의 개수와 정비례한다.
증식 검정법
증식 검정법을 위해, 성장 배지를 사용하지 않고, 각질형성세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 초기 인큐베이션 후, 배지를, 시험 물질로 보충된 배지로 대체하였다. (성장 인자를 포함하는) 일반 배지를 양성 대조군으로서 사용하였다. 시험 물질 첨가 후, 세포를 상기 기술된 바와 같이 48시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 기간 종료시, MTT 검정법을 이용하여 생존가능한 세포의 개수 변화를 측정하였다.
UVB
보호 검정법
UVB 보호 검정법을 위해, 일반 배지를 사용하여 각질형성세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 초기 인큐베이션 후, 배지를 100 ㎕의 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)로 대체하고, 세포를 UVB(40 mJ/㎠)에 노출시켰다. UVB 노출 후, PBS를 시험 물질(100 ㎍/ml의 아스코르브산은 양성 대조군으로서 작용하였다)로 보충된 신선한 배지로 대체하고, 세포를 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 48시간 인큐베이션 종료시, MTT 검정법을 이용하여 세포 생존능을 측정하였다.
MTT
검정법
48시간 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 200 ㎕의, 0.5 mg/ml MTT로 보충된 배양 배지로 대체하였다. 웰 플레이트를 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, MTT 용액을 제거하고, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수로 1회 세척한 후, 20 ㎕의 이소프로필 알콜을 웰에 첨가하여 보라색 포르마진 결정을 추출하였다. 블랭크로서 이소프로필 알콜을 사용하여 540 nm에서 96웰 플레이트를 판독하였다.
시험 물질로 처리되지 않은 세포(증식 검정법: 처리되지 않은 군) 또는 UVB에 노출되지 않은 세포(UVB 보호 검정법: UVB 비노출군)에 대한 평균 흡광도 값을 계산하고, 이를 100% 세포 생존능을 나타내는 것으로 사용하였다. 이어서, 다양하게 처리된 세포로부터의 개별 흡광도 값을 100% 세포 생존능을 나타내는 평균 흡광도 값으로 나누고, 이를 각 처리에 의해 유발된 세포 생존능의 변화를 측정하는 비율로서 표시하였다.
his 태그부착된 말단절단된 해파리 콜라겐을 이용한 증식 검정법에 대한 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다. his 태그부착된 말단절단된 해파리 콜라겐을 이용한 UVB 보호 검정법에 대한 결과는 하기 표 7에 제시되어 있다. 상기 두 검정법 모두에 대한 값은 평균 생존능±표준 편차로 제시되어 있다.
증식 검정법을 위해, 처리되지 않은 군을 100% 세포 생존능을 나타내는 것으로 사용하였다. 100%를 초과하는 값은 생존가능한 세포 개수의 증가를 반영하고, 따라서, 이는 세포 증식을 나타내는 것이다. 본 연구에서, 시험 물질은 세포 증식을 촉진시키는 것으로 관찰되지는 않았다.
추가로, 서열 번호 91의 말단절단된 콜라겐을 이용하여 각질형성세포 증식 검정법을 수행하였다. 5% 스톡 용액의 1% 및 0.5% 콜라겐 용액을 실시예 8에 따라 제조하고, 시험하였다. 서열 번호 91의 말단절단된 콜라겐의 각질형성세포 세포 생존능 검정법 값은 각각 102±2.9 및 102±2.0이었다. 관찰된 값은 통계학적으로 유의적이었다(p < 0.05).
시험 물질이 세포 증식에 미치는 효과 이외에도, 시험 물질을 또한 스크리닝하여 UVB 노출 후 세포 회복에 영향을 주는지 여부를 측정하였다. 본 연구에서, UVB에의 노출은 노출 후 48시간째 생존가능한 세포의 개수를 유의적으로 감소시킨 것으로 관찰되었다. 그러나, 시험 물질 처리는 이러한 세포 생존능 감소를 막았다. 상기 효과는 0.05% 내지 5%의 시험 물질인 농도 범위 내에서는 명백하였고, 최적의 효과는 0.05% 농도에서 이루어졌다. 상기 농도 범위 내에서, 세포 생존능은 처리되지 않은 군보다 유의적으로 더 컸고(유일한 예외는 0.01% 농도였다), 이는 물질이 UVB 보호 효과를 갖는다는 것을 입증하는 것이다. UVB 노출 이후에 상기 물질을 첨가하였는 바, 이는 UVB 조사의 손상 효과를 감소시키는 데 작용할 수 있거나, 또는 손상된 세포가 더 빠른 속도로 회복될 수 있도록 도울 수 있다. 후자와 관련하여, 이때 말단절단된 콜라겐은 피부에 국소 적용되는 경우에 유익하고, UVB에 의해 손상된 피부 세포에 대해 재생 효과를 갖는다.
추가로, 서열 번호 91의 말단절단된 콜라겐을 이용하여 UVB 보호 검정법을 수행하였다. 서열 번호 91의 1% 및 0.5% 콜라겐 용액의 각질형성세포 세포 생존능 검정법 값은 각각 80±4.6 및 78±2.5였다. 관찰된 값은 통계학적으로 유의적이었다(p < 0.05).
실시예
8: 말단절단된 콜라겐이 티민
이량체
형성에 미치는 효과
자외선 조사에의 노출시, 세포에 존재하는 DNA 중의 티민 이량체(TT 이량체)는 증가한다. TT 이량체 형성 증가는 피부 손상, 및 피부암을 비롯한, 특정 타입의 세포 증식성 질환과 상관관계를 갖는다.
서열 번호 11의 폴리뉴클레오티드를 실시예 1의 발현 시스템에서 발현시키고, 본 실시예예 기술된 바와 같이 정제하였다. 코딩된 폴리펩티드는 DsbA 분비 태그를 포함한다. 폴리펩티드가 분비 경로를 통해 프로세싱됨에 따라, DsbA 태그인 서열 번호 12의 아미노산 1-24는 숙주 세포에 의해 절단된다. DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 콜라겐은 서열 번호 91에 제공되어 있다.
서열 번호 91의 말단절단된 콜라겐이 인간 표피 각질형성세포에서 TT 이량체 형성을 감소시킬 수 있는지 여부에 대하여 상기 콜라겐을 시험하였다. 본 연구를 위해, 세포를 UVB(25 mJ/㎠)에 노출시켰다. 노출 후, 세포를 시험 물질 또는 트롤록스(Trolox)(100 ug/ml)로 처리하고, 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 세포 DNA를 추출하고, ELISA 기반 방법을 사용하여 티민 이량체 함량에 대해 검정하였다.
일반 배지를 사용하여 인간 각질형성세포를 12웰 플레이트에 시딩하고, 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 초기 인큐베이션 후, 배지를 100 ㎕의 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)로 대체하고, 세포를 UVB(25 mJ/㎠)에 노출시켰다. UVB 노출 후, PBS를 시험 물질 또는 트롤록스(100 ㎍/ml, 이는 양성 대조군으로서 작용하였다)로 보충된 신선한 배지로 대체하고, 세포를 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 종료시, 세포 DNA를 추출하였다.
밤새도록 인큐베이션시킨 후, 세포 배양 배지를 웰로부터 제거하고, 200 ㎕의 PBS 및 20 ㎕의 프로테이나제 K로 대체하였다. 플레이트를 와동시켜 PBS 및 프로테이나제 K를 혼합한 후, 200 ㎕의 완충제 AL을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 와동시켜 시약을 혼합한 후, 플레이트를 55±2℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 실온으로 냉각시킨 후, 200 ㎕의 100% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 이어서, 침전된 DNA 혼합물을 2 ml 수집 튜브 중 DN이지 스핀 칼럼즈(DNEasy Spin Columns)로 옮기고, 1분 동안 8,000 RPM으로 원심분리하였다. 통과액 및 수집 튜브를 폐기하고, 500 ㎕의 세척 완충제 1(Wash Buffer One)을 스핀 칼럼에 첨가하고, 칼럼을 새 수집 튜브에 배치하고, 1분 동안 8,000 RPM으로 원심분리하였다. 통과액 및 수집 튜브를 다시 폐기하고, 500 ㎕의 세척 완충제 2(Wash Buffer Two)를 스핀 칼럼에 첨가하고, 칼럼을 새 수집 튜브에 배치하고, 3분 동안 14,000 RPM으로 원심분리하였다. 이어서, 스핀 칼럼을 새 1.5 ml 원심분리 튜브에 배치하고, 110 ㎕의 초순수를 칼럼에 첨가하였다. 칼럼을 실온에서 1분 동안 인큐베이션시킨 후, 1분 동안 8,000 RPM으로 원심분리하였다.
추출된 DNA를 형광 검정법을 통해 정량화하였다. 2 ㎕ 분취량의 DNA 샘플을 96웰 플레이트 중에서 100 ㎕ TE 완충제와 혼합하였다. 일련의 DNA 표준 또한 96웰 플레이트 중의 웰로 옮겨 놓았다(이중으로). 마지막으로, 100 ㎕의 묽은 사이퀀트 그린(Cyquant Green) 염료를 각 웰에 첨가하고, 여기 파장 480 nm 및 방출 파장 520 nm을 이용하여 각 웰의 형광 강도를 측정하였다.
옥시셀렉트™ UV 유도 DNA 손상 ELISA 키트(OxiSelect™ UV-Induced DNA Damage ELISA Kit)를 이용하여 티민 이량체 검출을 측정하였다.
샘플을 95℃에서 10분 동안 인큐베이션시켜 분취량의 게놈 DNA 샘플 또는 표준을 단일 가닥 DNA로 전환시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 100 ㎕의 각 샘플 또는 표준을 DNA 결합 ELISA 플레이트로 옮기고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 웰을 100 ㎕의 PBS로 1회 세정한 후, 이어서, 실온에서 1시간 동안 150 ㎕의 검정 희석제(Assay Diluent)로 차단하였다. 검정 희석제를 제거한 후, 100 ㎕의 항CPD 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 후, 플레이트를 웰당 250 ㎕의 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척한 후, 150 ㎕의 차단 시약(Blocking Reagent)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트는 다시 앞서 기술된 바와 같이 실온에서 1시간 동안 차단된 후, 이어서, 3회에 걸쳐 세척될 것이다. 이어서, 100 ㎕의 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세척한 후, 100 ㎕의 기질을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5-20분 동안 인큐베이션시켜 플레이트에서 발색이 일어나도록 하였다. 100 ㎕의 정지액을 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, 플레이트 판독기를 이용하여 460 nm에서 플레이트를 판독하였다.
DNA 존재량을 정량화하기 위해, 공지된 농도의 DNA 및 그의 각 형광 강도(RFU 또는 상대적인 형광 단위(relative fluorescence unit)로 측정)를 이용하여 표준 곡선을 작성하였다. 회귀 분석을 수행하여 상기 데이터 점과의 최적합 선을 확립하였다. 이어서, 각 비공지된 샘플에 대한 상대적인 형광 단위(RFU: relative fluorescence unit)를 사용하여 DNA의 양을 추정하였다.
공지된 양의 티민 이량체 함량을 갖는 일련의 DNA 표준을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 상기 표준 곡선을 사용하여 샘플 DNA 중 DNA 손상량을 측정하였다. 각 처리군에 대한 평균을 계산하고, ANOVA를 이용하여 비교하였다. 하기 표 8 및 도 5에서, 표준 5% 콜라겐 용액(95 ml 탈이온수 중 5 g 말단절단된 콜라겐)을 명시된 비율의 용액이 되도록 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)로 추가로 희석하였다.
표 8은 5% 및 1% 말단절단된 콜라겐 용액이 통계적 유의도(p < 0.05)로 TT 이량체 형성을 감소시켰다는 것을 나타낸다. 본 데이터는 도 5에 그래프로 제시되어 있다.
상이한 로트의 말단절단된 콜라겐(서열 번호 91)을 이용하여 본 실험을 반복하였다. UVB에 노출되지 않은 세포 중의 TT 이량체의 양(ng/ml)은 1.3 ± 1.2이고, 처리되지 않은 세포 중의 것은 18.1 ± 0.4이고, 100 ㎍/ml 트롤록스로 처리된 세포 중의 것은 7.9 ± 0.3이고, 5% 콜라겐 중의 것은 13.1 ± 0.2이고, 1% 콜라겐 중의 것은 17.4 ± 0.7이었다. UVB에 노출되지 않은 세포, 트롤록스로 처리된 세포, 5% 콜라겐으로 처리된 세포, 및 1% 콜라겐으로 처리된 세포에 대한 TT 이량체 형성 감소는 처리되지 않은 세포와 비교하여 통계적으로 유의적이었다(p < 0.05).
실시예
9: 인간 콜라겐
말단절단된 인간 콜라겐 타입 21 알파 1
His 태그, 링커, 및 트롬빈 절단 부위가 없는, 말단절단된 인간 콜라겐 타입 21 알파 1을 하기에 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 하기에 개시한다. 서열 번호 73 및 74에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. 서열 번호 73 및 74에서, 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 73-633에 의해 코딩되고, 아미노산 25-211을 코딩한다.
상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 73에 제공되어 있다.
아미노산 서열은 서열 번호 74에 개시되어 있다.
DsbA 분비 태그 콜라겐이 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 21 알파 1을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 75에 제공되어 있다.
DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 21 알파 1의 아미노산 서열은 서열 번호 76에 개시되어 있다.
말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(1)
His 태그, 링커, 및 트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2를 하기에 개시한다. 상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 하기에 개시한다. 서열 번호 78 및 79에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 73-636에 의해 코딩되고, 아미노산 25-212를 코딩한다.
상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 77에 제공되어 있다.
아미노산 서열은 서열 번호 78에 개시되어 있다.
DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(1)의 핵산 서열은 서열 번호 79에 제공되어 있다.
DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(1)의 아미노산 서열은 서열 번호 80에 제공되어 있다.
말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(2)
His 태그, 링커, 및 트롬빈 절단 부위가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2를 하기에 개시한다. 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 하기에 개시한다. 서열 번호 82 및 83에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되고, 아미노산 1-24를 코딩한다. 말단절단된 콜라겐 서열은 뉴클레오티드 73-609에 의해 코딩되고, 아미노산 25-203을 코딩한다.
상기 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 81에 제공되어 있다.
아미노산 서열은 서열 번호 82에 개시되어 있다.
DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(2)의 핵산 서열은 서열 번호 83에 제공되어 있다.
DsbA 분비 태그가 없는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2(2)의 아미노산 서열은 서열 번호 84에 개시되어 있다.
서열 번호 73, 77 또는 81의 폴리뉴클레오티드를 본원에 기술된 바와 같이 벡터 pET28a에서 서브클로닝하여 형질전환 벡터를 제조하였다. 숙주 세포를 벡터로 형질전환시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 폴리뉴클레오티드를 발현시켰다.
발효 완료 후, 실시예 3에 개시된 방법을 사용하여 발효 브로쓰로부터 말단절단된 인간 콜라겐을 정제하였다. 실시예 3에 개시된 바와 같이 SDS-PAGE 및 HPLC를 사용하여 정제된 말단절단된 인간 콜라겐을 분석하였다.
SDS-PAGE 분석에서 3개의 말단절단된 인간 콜라겐 모두 예상된 분자량에서 전개되었다. HPLC를 사용하여 말단절단된 인간 콜라겐을 분석할 때, 실시예 3의 해파리 콜라겐을 이용하는 표준 곡선을 사용하였다. 인간 콜라겐의 머무름 시간은 해파리 콜라겐과 약간 상이하였다. 서열 번호 76의 머무름 시간은 5.645분이고, 서열 번호 80의 머무름 시간은 5.631분이고, 서열 번호 84는 2개의 피크로 전개되었고, 머무름 시간은 5.531 및 5.7분이었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 5
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 5의 아미노산 서열은 서열 번호 92에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 93의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 92의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 93의 뉴클레오티드 58-657이고, 아미노산 서열은 서열 번호 92의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 93의 뉴클레오티드 658-684이고, 아미노산 서열은 아미노산 220-228이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 5의 핵산 서열은 서열 번호 93에 개시되어 있다.
서열 번호 93의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콜라겐을 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 100 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 6
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 6의 아미노산 서열은 서열 번호 94에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 95의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 94의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 95의 뉴클레오티드 58-657이고, 아미노산 서열은 서열 번호 94의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 95의 뉴클레오티드 658-684이고, 아미노산 서열은 서열 번호 94의 아미노산 220-228이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 6의 핵산 서열은 서열 번호 95에 개시되어 있다.
서열 번호 94의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콜라겐을 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 7
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 7의 아미노산 서열은 서열 번호 96에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 96의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 96의 뉴클레오티드 58-759이고, 아미노산 서열은 서열 번호 96의 아미노산 20-253이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 760-786이고, 아미노산 서열은 서열 번호 96의 아미노산 254-262이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 인간 콜라겐 타입 1 알파 2 말단절단 7의 핵산 서열은 서열 번호 97에 개시되어 있다.
서열 번호 97의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콜라겐을 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 30 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
실시예
10: 말단절단된 인간 콜라겐이 섬유아세포에 미치는 보호 효과
실시예 6의 방법에 따라 말단절단된 인간 콜라겐이 섬유아세포 세포 생존능, 프로콜라겐 합성, 및 엘라스틴 합성에 미치는 효과를 측정한다.
실시예 7의 방법에 따라 말단절단된 인간 콜라겐이 각질형성세포 증식 및 UVB 보호에 미치는 효과를 측정한다.
실시예 8의 방법에 따라 말단절단된 콜라겐이 UV 조사에의 노출 이후의 티민 이량체 형성에 미치는 효과를 측정한다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 그러한 견지에서 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 수 있고, 본 출원의 정신 및 범위 및 청구범위의 범주 내에 포함되어야 함을 이해한다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
실시예
11: 말단절단된 콜라겐이 염증성 사이토카인에 미치는 효과
각질형성세포 및 진피 섬유아세포는 피부의 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 자극성 화학물질 또는 UV 조사(염증유발성/자극유발성(pro-irritation) 자극)에의 반응으로, 각질형성세포는 매우 다양한 사이토카인을 방출할 수 있다. 이러한 사이토카인은 면역 세포를 염증 부위로 조달하는 데 도움을 주는 것으로 간주된다. 각질형성세포에 의해 방출된 사이토카인으로는 TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, 및 IL-1RA를 포함한다.
본 연구에서 사용된 시험 모델은 MatTek EpiDerm이었다. 상기 피부 모델은, 배양되어 다층의 고도로 분화된 인간 표피 모델을 형성하는, 정상 인간 유래 표피 각질형성세포로 구성된다. 초미세구조 분석 결과, 생체내 표피의 특징을 나타내는 패턴으로 배열된, 각질유리 과립, 토노필라멘트 번들, 데스모솜, 및 세포간 라멜라 지질 층을 함유하는 다층 각질층이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 성숙한 표피 특이적 분화의 마커, 예컨대, 프로필라그린, K1/K10 사이토케라틴 쌍, 인볼루크린, 및 타입 I 표피 트랜스글루타미나제는 상기 모델에 국재화되었다. MatTek EpiDerm은 또한 유사 분열로 및 대사적으로 활성을 띤다.
MatTek EpiDerm 조직을 사용하여 염증성 매개인자 IL-1α 방출을 억제시킬 수 있는 각종 시험 물질의 능력을 사정하였다. 시험 물질을 일반 의약품(over the counter) 국소용 하이드로코르티손 제제(양성 대조군) 뿐만 아니라, 처리되지 않은 조직(음성 대조군 1) 및 처리되지 않은, 비염증 조직(음성 대조군 2)과 비교하였다. 본 시험을 사용하여 시험 물질에의 노출 이후, 조직의 생존능 또한 사정하였다.
IL-1α, IL-6 및 IL-8은 각질형성세포에서 합성되고, 보관되며, 피부 자극 및 염증의 매개인자로서 확인되었다. 상기 사이토카인의 방출을 조직 배양 배지 중에서 비색 기반 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay)을 통해 직접 측정할 수 있다. 간략하면, 고체 지지체에 공유 결합된 항체는 폐(spent) 배양 배지 샘플 중에 존재하는 IL-1α, IL-6 또는 IL-8에 결합할 것이다. 결과적으로, 아세틸콜린에스테라제 효소에 공유 부착된 2차 항체는 특이적으로 결합된 사이토카인을 검출할 것이다. 적절한 색상의 기질 첨가시, 아세틸콜린에스테라제 효소는 착색된 생성물을 생성할 것이며, 이는 분광광도법에 의해 측정될 수 있다.
MatTek EpiDerm 조직을 MatTek 코포레이션(MatTek corporation)으로부터 구입하였고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다. 사용 전, 사용하고자 하는 조직을 아가로스-쉬핑 트레이로부터 제거하고, 0.9 ml의 하이드로코르티손 무함유 검정용 배지(37±2℃)를 함유하는 6엘 플레이트에 배치하였다. 조직을 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시킬 수 있었다. 상기 초기 인큐베이션 후, 검정용 배지를 0.9 ml의 신선한 하이드로코르티손 무함유 배지(37±2℃)로 대체하였다. 각 시험 물질을 위해 3개의 조직을 제조하였다.
UV 조사(UVB)를 통해 조직에서 염증 반응을 개시하였다. UV 램프를 사용하여 300 mJ/㎠ 선량으로 UVB를 조직에 조사하였다. 염증 자극 적용 후 즉시, 50 ㎕ 또는 50 mg의 시험 물질을 조직 표면 상에 직접 적용시켰였다. 일반 의약품 하이드로코르티손 크림을 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군의 경우, 조직을 염증 자극에 노출시켰지만, 어느 타입의 항염증성 물질로도 처리하지 않았다. 추가의 한 조직 세트는 사이토카인에 대한 기준선 측정값을 제공하기 위해 염증 자극에 노출시키지 않고 그대로 두었다. 조직을 염증 자극에 노출시킨 후 24시간 동안 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 인큐베이션시켰다. 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포 배양 배지를 수집하고, 사이토카인에 대해 분석할 때까지 -75℃에서 보관하였다.
PBS 중에서 적절한 포획 항체를 희석하여 ELISA 플레이트를 제조하였다. 이어서, 100 ㎕의 희석된 포획 항체를 96웰 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 300 ㎕의 세척 완충제(PBS 중 0.05% 트윈 20)로 3회에 걸쳐 세척한 후, 이어서, 300 ㎕의 차단 완충제(PBS 중 1% BSA)를 각 웰에 첨가하여 차단시켰다. 플레이트를 차단 완충제와 함께 적어도 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 차단 완충제를 제거하고, 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 3회에 걸쳐 세척하였다.
일련의 표준을 제조하고, 상기 표준을 각각 100 ㎕씩 적절한 96웰 플레이트 중 2개의 웰(이중)에 분배하였다. 이어서, 100 ㎕의 각 샘플을 추가 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 3회에 걸쳐 세척하였다. 일단 최종 세액을 제거하고 나면, 100 ㎕의 비오틴 접합된 검출 항체를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 다시 세척하였다. 이어서, 100 ㎕의 HRP-스트렙트아비딘을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 일단 최종 세액을 제거하고 나면, 100 ㎕의 기질 용액(발색원으로서 과산화수소 + 테트라메틸벤지딘)을 각 웰에 첨가하였다. 일단 발색이 충분한 수준으로 일어나고 나면, 50 ㎕의 정지액(2 N 황산)을 각 웰에 첨가하고, 460 nm에서 플레이트를 판독하였다.
24시간 인큐베이션 후, 조직을 적어도 100 ㎕의 포스페이트 완충처리된 염수로 2회에 걸쳐 세정하여 시험 물질을 제거한 후, 이어서, MTT(1 mg/ml)로 보충된, 1.0 ml의 검정용 배지를 함유하는 6웰 플레이트로 옮기고, 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 3 ± 0.25시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 조직을 100 ㎕의 포스페이트 완충처리된 염수로 적어도 2회에 걸쳐 세정하고, 블롯팅 건조시킨 후, 웰당 2 ml의 이소프로판올을 함유하는 24웰 플레이트에 배치하였다. 24웰 플레이트를 덮고, 진동 플랫폼에서 실온에서 적어도 2시간 인큐베이션시켜 환원된 MTT를 조직으로부터 추출하였다. 추출 후, 이소프로판올/MTT 혼합물로 이루어진 200 ㎕의 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고, 블랭크로서 200 ㎕의 이소프로판올을 사용하여 플레이트 판독기로 540 nm에서 샘플의 흡광도를 판독하였다. MTT 검정법은 본원 실시예 6에 기술되어 있다. MTT 검정법의 세포 생존능 결과는 실시예 6에서 수득된 결과와 유사하였다.
IL-1α 검정법의 결과는 하기 표 9에 제시되어 있다. 서열 번호 91의 해파리 콜라겐의 2% 스톡 용액은 샘플 4이고, 샘플 3은 서열 번호 10의 말단절단된 해파리 콜라겐의 2% 스톡 용액이다. 하기 표 9에서, 명시된 비율(%)은 본 시험에서 사용된 스톡 용액의 희석률(%)이다. 예를 들어, 1% 샘플 4 처리는 2% 스톡 말단절단된 콜라겐 용액의 1% 용액이다. 처리되지 않은 세포는 18.2 pg/ml의 IL-1a를 생산하였다. 말단절단된 콜라겐으로 처리하였을 때, 모든 샘플은 IL-1a 생산 감소를 보였다. 1% 샘플 4 처리는 IL-1A 생산을 13.4 pg/ml로 감소시켰으며, 이는 p 값 0.05 미만으로 유의적이다. IL-1a 생산 감소는 말단절단된 콜라겐이 항염증성 효과를 갖는다는 것을 시사하는 것이다.
실시예
12: 말단절단된 콜라겐에 의한 도시 분진 보호
각질형성세포 세포 배양물 모델을 사용하여 도시 분진에의 노출 이후 세포 생존을 촉진시킴으로써 보호 효과를 발휘할 수 있는 말단절단된 콜라겐의 능력을 사정하였다.
인간 표피 각질형성세포를 시험 물질로 전처리한 후, 도시 분진에 노출시켰다. 이어서, 처리 기간 종료시, MTT 검정법을 통해 세포 생존능 변화를 측정하였다.
각질형성세포를 100 ㎕ 배지 중 96웰 플레이트의 개별 웰에 시딩하고, 37 ± 2℃ 및 5 ± 1% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 흡인을 통해 배지를 제거하여 임의의 비부착 세포를 제거하고, 100 ㎕의 신선한 배지로 대체하였다. 매 48 내지 72시간마다 배지를 교체해주면서, 세포를 전면생장시까지 성장시켰다.
시험 물질로 전처리, 이어서, 도시 분진 처리
시험 물질을 세포 배양 배지 중에서 그의 최종의 원하는 농도의 2x로 제조하였다. 도시 분진(Sigma Chemicals로부터 입수한 NIST 1649B) 또한 2x 용액으로 제조하였다. 처리를 위해, 50 ㎕의 2x 시험 물질을 50 ㎕의 배양 배지와 조합하고, 세포를 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 전처리 기간 종료시, 시험 물질을 함유하는 배양 배지를 제거하고, 50 ㎕의 2x 도시 분진 및 50 ㎕의 배지로 대체하였다. 또 다른 세포 세트는 배지로만 처리하고(분진에 비노출), 100% 세포 생존능을 나타내는 참조 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 세포를 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 그에 대해 MTT 검정법을 수행하여 세포 생존능 변화를 측정하였다.
처리 기간 종료시, 세포 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 세척 후, 100 ㎕의, 0.5 mg/ml MTT로 보충된 세포 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 배지/MTT 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 다시 1회 세척한 후, 100 ㎕의 이소프로필 알콜을 웰에 첨가하여 보라색 포르마진 결정을 추출하였다. 이어서, 블랭크로서 이소프로필 알콜을 사용하여 540 nm에서 96웰 플레이트를 판독하였다.
분진에 노출되지 않은 세포에 대한 평균 MTT 흡광도 값을 계산하고, 세포 개수에 대해 100% 값을 나타내는 것으로 사용하였다. 이어서, 다양하게 처리된 세포로부터의 개별 MTT 값을 분진에 노출되지 않은 세포에 대한 평균 값으로 나누고, 이를 각 처리에 의해 유발된 세포 개수의 변화를 측정하는 비율로서 표시하였다.
시험 물질 전처리, 이어서, 분진 처리에 대한 MTT 결과는 하기 표 10에 제시되어 있다. 표 10은, 콜라겐의 양을 증가시켜 가면서 콜라겐으로 세포를 처리함에 따라, 말단절단된 콜라겐으로 전처리한 후, 이어서, 도시 분진에 노출시켰을 때, 세포 생존능은 증가하였다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 말단절단된 콜라겐이 도시 분진 노출과 연관된 세포 생존능 감소로부터 보호한다는 것을 보여주는 것이다.
실시예
12:
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
콘드로시아
레니포미스
(신장 해면) 콜라겐 말단절단된
콘드로시아
레니포미스
(신장 해면)
원섬유
상 콜라겐 1
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 1의 아미노산 서열은 서열 번호 102에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 103의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 102의 아미노산 1-19이다. 원섬유상 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 103의 뉴클레오티드 58-792이고, 아미노산 서열은 서열 번호 102의 아미노산 20-264이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 103의 뉴클레오티드 793-819이고, 아미노산 서열은 서열 번호 102의 아미노산 265-273이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 1의 핵산 서열은 서열 번호 103에 개시되어 있다.
서열 번호 103의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 1을 정제하였다. 정제된 원섬유상 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 40 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
콘드로시아
레니포미스
(신장 해면) 원섬유상 콜라겐 2
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 2의 아미노산 서열은 서열 번호 104에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 105의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 104의 아미노산 1-19이다. 원섬유상 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 105의 뉴클레오티드 58-1323이고, 아미노산 서열은 서열 번호 104의 아미노산 20-441이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 105의 뉴클레오티드 1324-1350이고, 아미노산 서열은 서열 번호 105의 아미노산 442-450이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 2의 핵산 서열은 서열 번호 105에 개시되어 있다.
서열 번호 105의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 원섬유상 콜라겐 2를 정제하였다. 정제된 원섬유상 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 55 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
콘드로시아
레니포미스
(신장 해면) 비원섬유상 콜라겐 1
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 1의 아미노산 서열은 서열 번호 106에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 107의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 106의 아미노산 1-19이다. 비원섬유상 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 107의 뉴클레오티드 58-831이고, 아미노산 서열은 서열 번호 106의 아미노산 20-277이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 107의 뉴클레오티드 832-858이고, 아미노산 서열은 서열 번호 106의 아미노산 278-286이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 1의 핵산 서열은 서열 번호 107에 개시되어 있다.
서열 번호 107의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 1을 정제하였다. 정제된 비원섬유상 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 30 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스(신장 해면) 비원섬유상 콜라겐 2
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 2의 아미노산 서열은 서열 번호 108에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 109의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 108의 아미노산 1-19이다. 비원섬유상 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 109의 뉴클레오티드 58-1509이고, 아미노산 서열은 서열 번호 108의 아미노산 20-503이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 109의 뉴클레오티드 1510-1536이고, 아미노산 서열은 서열 번호 108의 아미노산 504-512이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 2의 핵산 서열은 서열 번호 109에 개시되어 있다.
서열 번호 109의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 콘드로시아 레니포미스 비원섬유상 콜라겐 2를 정제하였다. 정제된 원섬유상 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 60 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
실시예
13: 말단절단된
린코돈
티푸스(
고래 상어
) 콜라겐
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
린코돈
티푸스(
고래 상어
) 콜라겐 타입 1 알파 1 말단절단 1
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 1 말단절단 1의 아미노산 서열은 서열 번호 110에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 111의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 110의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 111의 뉴클레오티드 58-630이고, 아미노산 서열은 서열 번호 110의 아미노산 20-210이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 111의 뉴클레오티드 631-657이고, 아미노산 서열은 서열 번호 110의 아미노산 211-219이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 1 말단절단 1의 핵산 서열은 서열 번호 111에 개시되어 있다.
서열 번호 111의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 1 말단절단 1을 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
린코돈
티푸스(
고래 상어
) 콜라겐 타입 6 알파 1 말단절단 2
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 6 말단절단 2의 아미노산 서열은 서열 번호 112에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 113의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 112의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 113의 뉴클레오티드 58-684이고, 아미노산 서열은 서열 번호 112의 아미노산 20-228이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 113의 뉴클레오티드 685-711이고, 아미노산 서열은 서열 번호 112의 아미노산 229-237이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 6 말단절단 2의 핵산 서열은 서열 번호 113에 개시되어 있다.
서열 번호 113의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 6 말단절단 2를 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 35 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
DsbA
분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된
린코돈
티푸스(
고래 상어
) 콜라겐 타입 6 알파 1 말단절단 3
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 6 알파 1 말단절단 3의 아미노산 서열은 서열 번호 114에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열 번호 115의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열 번호 114의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115의 뉴클레오티드 58-735이고, 아미노산 서열은 서열 번호 114의 아미노산 20-245이다. FLAG 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115의 뉴클레오티드 736-762이고, 아미노산 서열은 서열 번호 114의 아미노산 246-254이다.
DsbA 분비 및 FLAG 태그를 포함하는 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 6 알파 1 말단절단 3의 핵산 서열은 서열 번호 115에 개시되어 있다.
서열 번호 115의 폴리뉴클레오티드를 벡터 pET28a로 서브클로닝하고, 숙주 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 본원에 기술된 바와 같이 말단절단된 린코돈 티푸스 콜라겐 타입 1 말단절단 1을 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 투명한 밴드를 생성하였고, 항FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 상기 단백질의 발현 부재하에서는 겔 상의 상기 위치에서 출현하는 존재하는 밴드는 없었다.
SEQUENCE LISTING
<110> GELTOR, INC.
<120> RECOMBINANT COLLAGEN AND ELASTIN MOLECULES AND USES THEREOF
<130> GLTRP002WO
<140> PCT/US2018/053601
<141> 2018-09-28
<150> 16/144,914
<151> 2018-09-27
<150> 62/657,591
<151> 2018-04-13
<150> 62/564,964
<151> 2017-09-28
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 429
<212> PRT
<213> Podocoryna carnea
<400> 1
Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Gln Gly Arg Thr Gly Ala Ala Gly Lys Gln Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Ala Asp Gly Ala Arg Gly Pro Leu Gly Ser Ile Gly Gln Gln
35 40 45
Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Leu Arg Gly
50 55 60
Asp Thr Gly Leu Ala Gly Val Lys Gly Val Ala Gly Pro Ser Gly Arg
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Pro Gly Gln Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Arg Gly
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Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Lys Gly Ile Ala Gly Ser Asp Gly
100 105 110
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115 120 125
Arg Gly Gln Arg Gly Pro Ser Gly Glu Asp Gly Asn Pro Gly Leu Gln
130 135 140
Gly Leu Pro Gly Ser Asp Gly Glu Pro Gly Glu Glu Gly Gln Pro Gly
145 150 155 160
Arg Ser Gly Gln Pro Gly Gln Gln Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Val Gly Pro Arg Gly Ser Lys Gly Pro Ser Gly Asp Arg Gly Asp Arg
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Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Gln Thr Gly Ser Ala Gly Asn Val Gly
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Glu Asp Gly Glu Gln Gly Gly Lys Gly Val Asp Gly Ala Ser Gly Pro
210 215 220
Ser Gly Ala Leu Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Asp Thr
225 230 235 240
Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Ser Gly Leu Pro Gly
245 250 255
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Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly
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Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile
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Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro
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Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly
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Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro
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Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly
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Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro
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Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg
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<211> 1289
<212> DNA
<213> Podocoryna carnea
<400> 2
ggaccacaag gtgttgtagg agctgatggc aaagatggaa caccgggaga gaaaggtgag 60
caaggacgaa ccggagctgc aggaaaacag ggaagccctg gagcagatgg agcaagaggc 120
cctcttggat caattggaca acaaggtgct cgtggagaac ctggtgatcc aggatctccc 180
ggcttaagag gagatactgg attggctgga gtcaaaggag tagcaggacc atctggtcga 240
cctggacaac ccggtgcaaa tggattacct ggtgtgaatg gcagaggcgg tttgagaggc 300
aaacctggtg ctaaaggaat tgctggcagt gatggagaag cgggagaatc tggcgcacct 360
ggacagtccg gacctaccgg tccacgtggt caacgaggac caagtggtga ggatggtaat 420
cctggattac agggattgcc tggttctgat ggagagcccg gagaggaagg acaacctgga 480
agatctggtc aaccaggaca gcaaggacca cgtggttccc ctggagaggt aggaccaaga 540
ggatctaaag gtccatcagg agatcgtggt gacaggggag agagaggtgt tcctggacaa 600
acaggttcgg ctggaaatgt aggagaagat ggagagcaag gaggcaaagg tgtcgatgga 660
gcgagtggac caagtggagc tcttggtgct cgtggtcccc caggaagtag aggtgacacc 720
ggggcagtgg gacctcccgg acctactggg cgatctggtt tacctggaaa cgcaggacaa 780
aagggaccaa gtggtgaacc aggtagtcca ggaaaagcag gatcagctgg tgaacagggt 840
cctcctggta aagacggatc aaatggtgaa cctggatctc ctggcaaaga gggtgaacgt 900
ggtcttgctg gtccaccagg tccagatggc agacgtggtg aaacgggatc tccaggtatc 960
gctggtgctc ttggtaaacc aggtttggaa ggacctaaag gttatccagg attaagagga 1020
agagatggaa ccaatggcaa acgaggagaa caaggagaaa ctggtcctga tggagtcaga 1080
ggtattcctg gaaatgatgg acaatctggc aaaccaggta ttgatggtat tgacggaaca 1140
aatggtcaac caggtgaggc tggataccaa ggtggtagag gtacacgtgg tcagttaggt 1200
gaaactggtg atgtcggaca gaatggagat cgaggagctc ctggtcctga tggatctaaa 1260
ggttctgctg gtagaccagg acttcgtgg 1289
<210> 3
<211> 1425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 3
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atcaccatca ccaccaccac catcaccact ctggctcgag cctggtgccg 120
cgcggcagcc atatgggtcc gcagggtgtt gttggtgcag atggtaaaga cggtaccccg 180
ggtgaaaaag gagaacaggg acgtacaggt gcagcaggta aacagggcag cccgggtgcc 240
gatggtgccc gtggcccgct gggtagcatt ggtcagcagg gtgcaagagg cgaaccgggc 300
gatccgggta gtccgggcct gcgtggtgat acgggtctgg ccggtgttaa aggcgttgca 360
ggtccttcag gtcgtccagg tcaaccgggt gcaaatggtc tgccgggtgt taatggtcgt 420
ggcggtctgc gtggcaaacc gggagcaaaa ggtattgcag gtagcgatgg agaagccggt 480
gaaagcggtg ccccgggtca gagtggtccg accggtccgc gcggtcagcg tggtccgtct 540
ggtgaagatg gcaatccggg tctgcagggt ctgcctggta gtgatggcga accaggtgaa 600
gaaggtcagc cgggtcgttc aggccagccg ggccagcagg gcccgcgtgg tagcccgggc 660
gaagttggcc cgcggggtag taaaggtcct agtggcgatc gcggtgatcg tggtgaacgc 720
ggtgttcctg gtcagaccgg tagcgcaggt aatgttggcg aagatggtga acagggtggc 780
aaaggtgttg atggtgcaag cggtccgagc ggtgcactgg gtgcacgtgg tcctccgggc 840
agccgtggtg acaccggtgc agttggtccg cctggcccga ccggccgtag tggcttaccg 900
ggtaatgcag gtcagaaagg tccgtcaggt gaacctggca gccctggtaa agcaggtagt 960
gccggtgagc agggtccgcc gggcaaagat ggtagtaatg gtgagccggg tagccctggc 1020
aaagaaggtg aacgtggtct ggcaggaccg ccgggtcctg atggtcgccg cggtgaaacg 1080
ggttcaccgg gtattgccgg tgccctgggt aaaccaggtc tggaaggtcc gaaaggttat 1140
cctggtctgc gcggtcgtga tggtaccaat ggcaaacgtg gcgaacaggg cgaaaccggt 1200
ccagatggtg ttcgtggtat tccgggtaac gatggtcaga gcggtaaacc gggcattgat 1260
ggtattgatg gcaccaatgg tcagcctggc gaagcaggtt atcagggtgg tcgcggtacc 1320
cgtggtcagc tgggtgaaac aggtgatgtt ggtcagaatg gtgatcgcgg cgcaccgggt 1380
ccggatggta gcaaaggtag cgccggtcgt ccgggtttac gttaa 1425
<210> 4
<211> 1425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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ggtgttcctg gtcagaccgg tagcgcaggt aatgttggcg aagatggtga acagggtggc 780
aaaggtgttg atggtgcaag cggtccgagc ggtgcactgg gtgcacgtgg tcctccgggc 840
agccgtggtg acaccggtgc agttggtccg cctggcccga ccggccgtag cggcctgccg 900
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<213> Artificial Sequence
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polypeptide"
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50 55 60
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145 150 155 160
Glu Ser Gly Ala Pro Gly Gln Ser Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Gln
165 170 175
Arg Gly Pro Ser Gly Glu Asp Gly Asn Pro Gly Leu Gln Gly Leu Pro
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Leu Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Asp Thr Gly Ala Val
275 280 285
Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Ser Gly Leu Pro Gly Asn Ala Gly
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325 330 335
Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
340 345 350
Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Ala
355 360 365
Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Leu Arg
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Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly Glu Thr Gly
385 390 395 400
Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln Ser Gly Lys
405 410 415
Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro Gly Glu Ala
420 425 430
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<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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ggtgcccgtg gcccgctggg tagcattggt cagcagggtg cacgtggcga accgggcgat 240
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ggtctgcgtg gcaaaccggg tgcaaaaggt attgcaggta gcgatggcga agccggtgaa 420
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gaagatggca atccgggtct gcagggtctg cctggtagcg atggcgaacc aggtgaagaa 540
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gttcctggtc agaccggtag cgcaggtaat gttggcgaag atggtgaaca gggtggcaaa 720
ggtgttgatg gtgcaagcgg tccgagcggt gcactgggtg cacgtggtcc tccgggcagc 780
cgtggtgaca ccggtgcagt tggtccgcct ggcccgaccg gccgtagcgg cctgccgggt 840
aatgcaggtc agaaaggtcc gtctggtgaa cctggcagcc ctggtaaagc aggtagcgcc 900
ggtgagcagg gtccgccggg caaagatggt agcaatggtg agccgggtag ccctggcaaa 960
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ggtcagctgg gtgaaaccgg tgatgttggt cagaatggtg atcgcggcgc accgggtccg 1320
gatggtagca aaggtagcgc cggtcgtccg ggtctgcgtt aa 1362
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130 135 140
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Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
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Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
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210 215 220
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser
245 250 255
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
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<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 19
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atcaccatca ccaccaccac catcaccact ctggctcgag cctggtgccg 120
cgcggcagcc atatgtctgg ctcgagcagt aaaggtgaag aactgttcac cggtgttgtt 180
ccgatcctgg ttgaactgga tggtgatgtt aacggccaca aattctctgt tcgtggtgaa 240
ggtgaaggtg atgcaaccaa cggtaaactg accctgaaat tcatctgcac taccggtaaa 300
ctgccggttc catggccgac tctggtgact accctgacct atggtgttca gtgtttttct 360
cgttacccgg atcacatgaa gcagcatgat ttcttcaaat ctgcaatgcc ggaaggttat 420
gtacaggagc gcaccatttc tttcaaagac gatggcacct acaaaacccg tgcagaggtt 480
aaatttgaag gtgatactct ggtgaaccgt attgaactga aaggcattga tttcaaagag 540
gacggcaaca tcctgggcca caaactggaa tataacttca actcccataa cgtttacatc 600
accgcagaca aacagaagaa cggtatcaaa gctaacttca aaattcgcca taacgttgaa 660
gacggtagcg tacagctggc ggaccactac cagcagaaca ctccgatcgg tgatggtccg 720
gttctgctgc cggataacca ctacctgtcc acccagtcta aactgtccaa agacccgaac 780
gaaaagcgcg accacatggt gctgctggag ttcgttactg cagcaggtat cacgcacggc 840
atggatgaac tctacaaatc tggcgcgccg ggcggtccgc agggtgttgt tggtgcagat 900
ggtaaagacg gtaccccggg taatgcaggt cagaaaggtc cgtcaggtga acctggcagc 960
cctggtaaag caggtagtgc cggtgagcag ggtccgccgg gcaaagatgg tagtaatggt 1020
gagccgggta gccctggcaa agaaggtgaa cgtggtctgg caggaccgcc gggtcctgat 1080
ggtcgccgcg gtgaaacggg ttcaccgggt attgccggtg ccctgggtaa accaggtctg 1140
gaaggtccga aaggttatcc tggtctgcgc ggtcgtgatg gtaccaatgg caaacgtggc 1200
gaacagggcg aaaccggtcc agatggtgtt cgtggtattc cgggtaacga tggtcagagc 1260
ggtaaaccgg gcattgatgg tattgatggc accaatggtc agcctggcga agcaggttat 1320
cagggtggtc gcggtacccg tggtcagctg ggtgaaacag gtgatgttgg tcagaatggt 1380
gatcgcggcg caccgggtcc ggatggtagc aaaggtagcg ccggtcgtcc gggtttacgt 1440
cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 1500
tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 1560
tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 1620
gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 1680
tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 1740
gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 1800
aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 1860
gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 1920
atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 1980
caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 2040
ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 2100
attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 2160
agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 2220
aagcattggt aa 2232
<210> 20
<211> 743
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 20
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp His His His His His His His His
20 25 30
His Ser Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Ser Gly Ser
35 40 45
Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
50 55 60
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
65 70 75 80
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
85 90 95
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
115 120 125
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
130 135 140
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
145 150 155 160
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
165 170 175
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
180 185 190
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
195 200 205
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
210 215 220
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser
245 250 255
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
260 265 270
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly
275 280 285
Ala Pro Gly Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly
290 295 300
Thr Pro Gly Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp
325 330 335
Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly
340 345 350
Leu Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser
355 360 365
Pro Gly Ile Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys
370 375 380
Gly Tyr Pro Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly
385 390 395 400
Glu Gln Gly Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn
405 410 415
Asp Gly Gln Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn
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Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly
435 440 445
Gln Leu Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg Gly Ala
450 455 460
Pro Gly Pro Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg
465 470 475 480
His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly
485 490 495
Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu
500 505 510
Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe Pro Met Met Ser Thr Phe Lys
515 520 525
Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu
530 535 540
Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr
545 550 555 560
Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr Asp Gly Met Thr Val Arg Glu
565 570 575
Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu
580 585 590
Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys Glu Leu Thr Ala Phe Leu His
595 600 605
Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg Asp Thr Thr Met Pro Val Ala
625 630 635 640
Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu
645 650 655
Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp Met Glu Ala Asp Lys Val Ala
660 665 670
Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp
675 680 685
Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu
690 695 700
Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly
705 710 715 720
Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly
725 730 735
Ala Ser Leu Ile Lys His Trp
740
<210> 21
<211> 786
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Ala Gly Leu Thr Ala Ala Ala Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ile Leu His Pro Ser Arg Pro Gly Gly Val Pro Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu
35 40 45
Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys
50 55 60
Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly
65 70 75 80
Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val
85 90 95
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu
100 105 110
Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val
115 120 125
Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val
130 135 140
Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe
145 150 155 160
Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys
165 170 175
Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val
180 185 190
Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile
195 200 205
Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly
210 215 220
Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly
225 230 235 240
Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly
260 265 270
Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala
275 280 285
Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala
305 310 315 320
Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val
325 330 335
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro
340 345 350
Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val
355 360 365
Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly
370 375 380
Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly
385 390 395 400
Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly
405 410 415
Val Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val
420 425 430
Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys
435 440 445
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Gly Leu Val
450 455 460
Pro Gly Pro Gln Ala Ala Val Pro Gly Val Pro Gly Thr Gly Gly Val
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys
485 490 495
Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val
500 505 510
Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro
515 520 525
Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val
530 535 540
Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala
545 550 555 560
Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly
565 570 575
Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly
580 585 590
Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
595 600 605
Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu
610 615 620
Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro
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Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys
645 650 655
Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly
660 665 670
Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala
675 680 685
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val
690 695 700
Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro
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Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala
725 730 735
Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly
740 745 750
Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser
755 760 765
Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys
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Arg Lys
785
<210> 22
<211> 2361
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
atggcgggtc tgacggcggc ggccccgcgg cccggagtcc tcctgctcct gctgtccatc 60
ctccacccct ctcggcctgg aggggtccct ggggccattc ctggtggagt tcctggagga 120
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aaacctctta agccagttcc cggagggctt gcgggtgctg gccttggggc agggctcggc 240
gccttccccg cagttacctt tccgggggct ctggtgcctg gtggagtggc tgacgctgct 300
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gtgccgggtg tggggctgcc aggtgtatac ccaggtggcg tgctcccagg agctcggttc 480
cccggtgtgg gggtgctccc tggagttccc actggagcag gagttaagcc caaggctcca 540
ggtgtaggtg gagcttttgc tggaatccca ggagttggac cctttggggg accgcaacct 600
ggagtcccac tggggtatcc catcaaggcc cccaagctgc ctggtggcta tggactgccc 660
tacaccacag ggaaactgcc ctatggctat gggcccggag gagtggctgg tgcagcgggc 720
aaggctggtt acccaacagg gacaggggtt ggcccccagg cagcagcagc agcggcagct 780
aaagcagcag caaagttcgg tgctggagca gccggagtcc tccctggtgt tggaggggct 840
ggtgttcctg gcgtgcctgg ggcaattcct ggaattggag gcatcgcagg cgttgggact 900
ccagctgcag ctgcagctgc agcagcagcc gctaaggcag ccaagtatgg agctgctgca 960
ggcttagtgc ctggtgggcc aggctttggc ccgggagtag ttggtgtccc aggagctggc 1020
gttccaggtg ttggtgtccc aggagctggg attccagttg tcccaggtgc tgggatccca 1080
ggtgctgcgg ttccaggggt tgtgtcacca gaagcagctg ctaaggcagc tgcaaaggca 1140
gccaaatacg gggccaggcc cggagtcgga gttggaggca ttcctactta cggggttgga 1200
gctgggggct ttcccggctt tggtgtcgga gtcggaggta tccctggagt cgcaggtgtc 1260
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ccaggagtgg ggaccccagc agctgcagct gctaaagcag ccgccaaagc cgcccagttt 1500
gggttagttc ctggtgtcgg cgtggctcct ggagttggcg tggctcctgg tgtcggtgtg 1560
gctcctggag ttggcttggc tcctggagtt ggcgtggctc ctggagttgg tgtggctcct 1620
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gccaaggtgg ctgccaaagc ccagctccga gctgcagctg ggcttggtgc tggcatccct 1740
ggacttggag ttggtgtcgg cgtccctgga cttggagttg gtgctggtgt tcctggactt 1800
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ctgtcccctg agctcaggga aggagatccc tcctcctctc agcacctccc cagcaccccc 1920
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gtgcctgggg tccttggagg gctcggggct ctcggtggag taggcatccc aggcggtgtg 2040
gtgggagccg gacccgccgc cgccgctgcc gcagccaaag ctgctgccaa agccgcccag 2100
tttggcctag tgggagccgc tgggctcgga ggactcggag tcggagggct tggagttcca 2160
ggtgttgggg gccttggagg tatacctcca gctgcagccg ctaaagcagc taaatacggt 2220
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gcaagacctg gcttcggatt gtctcccatt ttcccaggtg gggcctgcct ggggaaagct 2340
tgtggccgga agagaaaatg a 2361
<210> 23
<211> 2418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 23
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atcaccatca ccaccaccac catcaccact ctggctcgag cctggtgccg 120
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cctggtgtgg gcgttccagg tgcagggatt cctgttgtgc ctggtgccgg tattcccggc 1140
gcggccgttc cgggggtggt tagcccggaa gccgcagcga aggctgcggc aaaggcagca 1200
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ggggttggtg gcgtccctgg tgttggcggt gtgccaggtg ttggtatttc accggaagca 1380
caggcagcag ccgcagctaa ggcagcgaaa tatggtgccg ccggcgcagg agttttaggt 1440
gggctggttc cgggcccgca ggcagctgtg ccgggggttc caggcaccgg tggtgtccct 1500
ggagtcggta cgccggctgc agcggcagcc aaagcggctg cgaaagcagc acagtttggc 1560
ttagtaccgg gtgtgggagt tgcccccggc gttggcgttg ctccaggggt gggtgttgct 1620
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ctgggtgtcg gagttggagt cccgggtttg ggcgtgggcg cgggagttcc gggactggga 1860
gtgggtgccg gagttcctgg ctttggtgca ggcgcagatg aaggtgttcg tcgtagcctg 1920
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agcccgcgtg ttccgggtgc attagctgca gcaaaagccg ccaagtatgg tgcagccgtg 2040
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ggtgcaggac cggccgccgc agctgcggcc gccaaagcag ctgcaaaagc ggcccagttt 2160
ggtttagtgg gcgccgcagg tttaggcggt ttaggtgtgg gtggactggg tgtacctggc 2220
gtaggcggtc tgggtggaat tccgcccgca gcggccgcga aagcggcaaa atatggcgcg 2280
gcaggcctgg gcggcgtgct gggtggggca ggtcagtttc cgctgggcgg ggttgccgca 2340
cgtccgggat ttggtctgag cccgattttc cctggcggcg catgtctggg taaagcatgt 2400
ggtcgtaaac gtaaataa 2418
<210> 24
<211> 805
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 24
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp His His His His His His His His
20 25 30
His Ser Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Gly Gly Val
35 40 45
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Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro Gly Gly Lys
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Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala Leu Val Pro
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115 120 125
Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala
130 135 140
Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val
145 150 155 160
Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro Gly
165 170 175
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180 185 190
Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly
275 280 285
Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
290 295 300
Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly
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Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val
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Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
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Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro
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Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala
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Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val
85 90 95
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Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro
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Gly Val Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
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Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
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Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala
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Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser
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Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu
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Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro
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Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro
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Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr
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Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu
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ccgtatggtt atggcccggg tggagttgcg ggtgcagcag gtaaagcggg ttatcctacc 660
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Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala
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Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala
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Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu
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245 250 255
Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr
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Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly
275 280 285
Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly
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Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
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Lys
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Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
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Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
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Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
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Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
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Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
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Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
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Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
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Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly
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Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala
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Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val
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Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys
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Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe
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gtacctggcg taggcggtct gggtggaatt ccgcccgcag cggccgcgaa agcggcaaaa 720
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100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Thr Pro
275
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ggtggcgtac caggcgcaat tcctgggggt gtcccaggcg gtgtttttta tccgggcgcc 60
ggtcttggcg cactgggtgg cggtgcactg ggcccgggcg gcaaaccgct gaaaccggta 120
ccaggtggtt tagcaggcgc cggcttaggc gcaggtctgg gagcatttcc ggcagttacc 180
tttccagggg cactggttcc tggaggtgtg gccgatgcag ccgcggcata taaagccgct 240
aaagccggtg cgggtttagg aggcgtccca ggtgtcggtg gcctgggtgt tagcgccggt 300
gcagttgttc cgcagccggg agcaggggtt aaacctggta aagtgccggg agtaggtctg 360
ccaggcgttt atcctggtgg tgttttgccg ggtgcccgtt ttccgggcgt tggtgttctt 420
ccaggcgtgc cgaccggagc cggtgttaaa ccgaaagccc ccggtgttgg aggtgcattt 480
gcaggcatcc cgggagttgg cccgtttggt ggtccgcaac ctggggttcc gttaggttat 540
ccgattaaag caccgaaact gcccggcggt tatggtctgc cgtacacaac cggtaaactg 600
ccgtatggtt atggcccggg tggagttgcg ggtgcagcag gtaaagcggg ttatcctacc 660
ggaaccggtg taggtccgca ggccgctgct gccgccgccg caaaagcagc ggctaaattt 720
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Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
50 55 60
Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln
225
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ggtggcgtac caggcgcaat tcctgggggt gtcccaggcg gtgtttttta tccgggcgcc 60
ggtcttggcg cactgggtgg cggtgcactg ggcccgggcg gcaaaccgct gaaaccggta 120
ccaggtggtt tagcaggcgc cggcttaggc gcaggtctgg gagcatttcc ggcagttacc 180
tttccagggg cactggttcc tggaggtgtg gccgatgcag ccgcggcata taaagccgct 240
aaagccggtg cgggtttagg aggcgtccca ggtgtcggtg gcctgggtgt tagcgccggt 300
gcagttgttc cgcagccggg agcaggggtt aaacctggta aagtgccggg agtaggtctg 360
ccaggcgttt atcctggtgg tgttttgccg ggtgcccgtt ttccgggcgt tggtgttctt 420
ccaggcgtgc cgaccggagc cggtgttaaa ccgaaagccc ccggtgttgg aggtgcattt 480
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Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly
1 5 10 15
Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
20 25 30
Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu
35 40 45
Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser
50 55 60
Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly
85 90 95
Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly
100 105 110
Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
115 120 125
Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly
130 135 140
Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly
145 150 155 160
Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly
165 170 175
Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val
180 185 190
Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala
195 200 205
Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
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polynucleotide"
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caactgcgcg ccgccgcggg cctcggtgca ggtattccgg ggctgggtgt cggagttgga 60
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ggtgatccga gtagcagcca gcatctgccg agcaccccga gcagcccgcg tgttccgggt 240
gcattagctg cagcaaaagc cgccaagtat ggtgcagccg tgccgggcgt cttaggtggt 300
ctgggcgccc tgggtggtgt aggcattccg ggaggtgttg tgggtgcagg accggccgcc 360
gcagctgcgg ccgccaaagc agctgcaaaa gcggcccagt ttggtttagt gggcgccgca 420
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attccgcccg cagcggccgc gaaagcggca aaatatggcg cggcaggcct gggcggcgtg 540
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Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile
1 5 10 15
Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
50 55 60
Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu
85 90 95
Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro
100 105 110
Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
115 120 125
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gtgccgggcg tcttaggtgg tctgggcgcc ctgggtggtg taggcattcc gggaggtgtt 60
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tgtggtcgta aacgtaaata a 381
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Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly
1 5 10 15
Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val
35 40 45
Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro
50 55 60
Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys
65 70 75 80
Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
85
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cagtttggtt tagtgggcgc cgcaggttta ggcggtttag gtgtgggtgg actgggtgta 60
cctggcgtag gcggtctggg tggaattccg cccgcagcgg ccgcgaaagc ggcaaaatat 120
ggcgcggcag gcctgggcgg cgtgctgggt ggggcaggtc agtttccgct gggcggggtt 180
gccgcacgtc cgggatttgg tctgagcccg attttccctg gcggcgcatg tctgggtaaa 240
gcatgtggtc gtaaacgtaa ataa 264
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<211> 72
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Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
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Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp
65 70
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ggtggcgtac caggcgcaat tcctgggggt gtcccaggcg gtgtttttta tccgggcgcc 60
ggtcttggcg cactgggtgg cggtgcactg ggcccgggcg gcaaaccgct gaaaccggta 120
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Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly
1 5 10 15
Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
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ggcctgggcg gcgtgctggg tggggcaggt cagtttccgc tgggcggggt tgccgcacgt 60
ccgggatttg gtctgagccc gattttccct ggcggcgcat gtctgggtaa agcatgtggt 120
cgtaaacgta aataa 135
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<212> DNA
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polynucleotide"
<400> 73
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atgcaggttt tccgggtctg cctggtccgg caggcgaacc gggtcgtcat 120
ggtaaagatg gtctgatggg tagtccgggt tttaaaggtg aagcaggttc accgggtgca 180
cctggtcagg atggcacccg tggtgaaccg ggtattccgg gatttccggg taatcgtggc 240
ctgatgggtc agaaaggtga aattggtccg cctggtcagc agggtaaaaa aggcgcaccg 300
ggtatgccag gactgatggg ttcaaatggc agtccgggtc agccaggcac accgggttca 360
aaaggtagca aaggcgaacc tggtattcag ggtatgcctg gtgcaagcgg tctgaaaggc 420
gagccaggtg ccaccggttc tccgggtgaa ccaggttata tgggtctgcc aggtatccaa 480
ggcaaaaaag gtgataaagg taatcagggc gaaaaaggca ttcagggcca gaaaggcgaa 540
aatggccgtc agggtattcc aggccagcag ggcatccagg gtcatcatgg tgcaaaaggt 600
gaacgtggtg aaaagggcga accaggtgtt cgttaa 636
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg His Gly Lys Asp Gly Leu Met Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Phe Lys Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asp
50 55 60
Gly Thr Arg Gly Glu Pro Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Asn Arg Gly
65 70 75 80
Leu Met Gly Gln Lys Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Gln Gln Gly Lys
85 90 95
Lys Gly Ala Pro Gly Met Pro Gly Leu Met Gly Ser Asn Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Gln Pro Gly Thr Pro Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Glu Pro Gly
115 120 125
Ile Gln Gly Met Pro Gly Ala Ser Gly Leu Lys Gly Glu Pro Gly Ala
130 135 140
Thr Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Tyr Met Gly Leu Pro Gly Ile Gln
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Asp Lys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Gly Ile Gln Gly
165 170 175
Gln Lys Gly Glu Asn Gly Arg Gln Gly Ile Pro Gly Gln Gln Gly Ile
180 185 190
Gln Gly His His Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Pro
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Gly Val Arg
210
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<400> 75
tgcaggtttt ccgggtctgc ctggtccggc aggcgaaccg ggtcgtcatg gtaaagatgg 60
tctgatgggt agtccgggtt ttaaaggtga agcaggttca ccgggtgcac ctggtcagga 120
tggcacccgt ggtgaaccgg gtattccggg atttccgggt aatcgtggcc tgatgggtca 180
gaaaggtgaa attggtccgc ctggtcagca gggtaaaaaa ggcgcaccgg gtatgccagg 240
actgatgggt tcaaatggca gtccgggtca gccaggcaca ccgggttcaa aaggtagcaa 300
aggcgaacct ggtattcagg gtatgcctgg tgcaagcggt ctgaaaggcg agccaggtgc 360
caccggttct ccgggtgaac caggttatat gggtctgcca ggtatccaag gcaaaaaagg 420
tgataaaggt aatcagggcg aaaaaggcat tcagggccag aaaggcgaaa atggccgtca 480
gggtattcca ggccagcagg gcatccaggg tcatcatggt gcaaaaggtg aacgtggtga 540
aaagggcgaa ccaggtgttc gttaa 565
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Ala Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg His
1 5 10 15
Gly Lys Asp Gly Leu Met Gly Ser Pro Gly Phe Lys Gly Glu Ala Gly
20 25 30
Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asp Gly Thr Arg Gly Glu Pro Gly Ile
35 40 45
Pro Gly Phe Pro Gly Asn Arg Gly Leu Met Gly Gln Lys Gly Glu Ile
50 55 60
Gly Pro Pro Gly Gln Gln Gly Lys Lys Gly Ala Pro Gly Met Pro Gly
65 70 75 80
Leu Met Gly Ser Asn Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Thr Pro Gly Ser
85 90 95
Lys Gly Ser Lys Gly Glu Pro Gly Ile Gln Gly Met Pro Gly Ala Ser
100 105 110
Gly Leu Lys Gly Glu Pro Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly
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Tyr Met Gly Leu Pro Gly Ile Gln Gly Lys Lys Gly Asp Lys Gly Asn
130 135 140
Gln Gly Glu Lys Gly Ile Gln Gly Gln Lys Gly Glu Asn Gly Arg Gln
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Gly Ile Pro Gly Gln Gln Gly Ile Gln Gly His His Gly Ala Lys Gly
165 170 175
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ccaccgggtc cgcagggtgt tcaaggtggt aaaggcgaac agggtcctgc cggtcctccg 480
ggttttcagg gactgcctgg tccgagcggt cctgcgggtg aagttggtaa acctggtgaa 540
cgcggtctgc atggtgaatt tggcctgcct gggcctgcag gtccgcgtgg cgaacgtggt 600
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<400> 78
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly
20 25 30
Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg
35 40 45
Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro
50 55 60
Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly
65 70 75 80
Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu
85 90 95
Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro
100 105 110
Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly
115 120 125
Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro
130 135 140
Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro
145 150 155 160
Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly
165 170 175
Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro
180 185 190
Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala
195 200 205
Gly Pro Thr Gly
210
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atgggtccgc ctggtagccg tggtgcaagt ggtccggcag gcgttcgtgg tccgaatggt 60
gatgcaggtc gtccgggtga accgggtctg atgggtcctc gtggtctgcc tggttcaccg 120
ggtaatattg gtcctgcagg taaagaaggt ccggttggtc tgccaggtat tgatggccgt 180
ccgggtccga ttggtccagc cggtgcacgt ggtgaacctg gcaatattgg ttttccgggt 240
cctaaaggtc cgaccggtga tccgggtaaa aatggtgata aaggtcatgc aggtctggca 300
ggcgcacgcg gtgcacctgg tccggatggt aataatggtg cacagggtcc accgggtccg 360
cagggtgttc aaggtggtaa aggcgaacag ggtcctgccg gtcctccggg ttttcaggga 420
ctgcctggtc cgagcggtcc tgcgggtgaa gttggtaaac ctggtgaacg cggtctgcat 480
ggtgaatttg gcctgcctgg gcctgcaggt ccgcgtggcg aacgtggtcc gccaggtgaa 540
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Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile
50 55 60
Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly
65 70 75 80
Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His
85 90 95
Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn
100 105 110
Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly
115 120 125
Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro
130 135 140
Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His
145 150 155 160
Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly
180 185
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<211> 612
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polynucleotide"
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atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atggttttca gggtcctgcc ggtgaaccgg gtgaacctgg tcagacaggt 120
ccggcaggcg cacgtggtcc tgcaggtcct cctggtaaag ccggtgaaga tggtcatccg 180
ggtaaaccgg gtcgtcctgg tgaacgtggt gttgttggtc cgcagggtgc ccgtggtttt 240
ccgggtactc cgggtctgcc aggttttaaa ggtattcgtg gtcataatgg tctggatggt 300
ctgaaaggtc agcctggtgc accgggtgtt aaaggtgaac caggtgctcc gggtgaaaat 360
ggcacaccgg gtcagaccgg tgcgcgtggt ctgcctggcg aacgcggtcg tgttggtgca 420
cctggtccag ccggtgcacg cggtagtgat ggtagcgttg gtccggttgg tccagcgggt 480
ccgattggta gcgcaggtcc accgggtttt ccaggcgcac cgggtccgaa aggtgaaatt 540
ggtgcagttg gtaatgcagg ccctgccggt ccagcaggac cgcgtggtga agttggcctg 600
cctggtctgt aa 612
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<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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polypeptide"
<400> 82
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu
20 25 30
Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala
35 40 45
Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly
50 55 60
Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe
65 70 75 80
Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly
100 105 110
Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala
115 120 125
Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala
130 135 140
Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly
145 150 155 160
Pro Ile Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro
165 170 175
Lys Gly Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala
180 185 190
Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu
195 200
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polynucleotide"
<400> 83
ggttttcagg gtcctgccgg tgaaccgggt gaacctggtc agacaggtcc ggcaggcgca 60
cgtggtcctg caggtcctcc tggtaaagcc ggtgaagatg gtcatccggg taaaccgggt 120
cgtcctggtg aacgtggtgt tgttggtccg cagggtgccc gtggttttcc gggtactccg 180
ggtctgccag gttttaaagg tattcgtggt cataatggtc tggatggtct gaaaggtcag 240
cctggtgcac cgggtgttaa aggtgaacca ggtgctccgg gtgaaaatgg cacaccgggt 300
cagaccggtg cgcgtggtct gcctggcgaa cgcggtcgtg ttggtgcacc tggtccagcc 360
ggtgcacgcg gtagtgatgg tagcgttggt ccggttggtc cagcgggtcc gattggtagc 420
gcaggtccac cgggttttcc aggcgcaccg ggtccgaaag gtgaaattgg tgcagttggt 480
aatgcaggcc ctgccggtcc agcaggaccg cgtggtgaag ttggcctgcc tggtctgtaa 540
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<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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polypeptide"
<400> 84
Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu
20 25 30
Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val
35 40 45
Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln
65 70 75 80
Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn
85 90 95
Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly
100 105 110
Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Ser
115 120 125
Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly Ala Val Gly
145 150 155 160
Asn Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Leu
165 170 175
Pro Gly Leu
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<212> DNA
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polynucleotide"
<400> 85
gtccgcaggg tgttgttggt gcagatggta aagacggtac cccgggtgaa aaaggagaac 60
agggacgtac aggtgcagca ggtaaacagg gcagcccggg tgccgatggt gcccgtggcc 120
cgctgggtag cattggtcag cagggtgcaa gaggcgaacc gggcgatccg ggtagtccgg 180
gcctgcgtgg tgatacgggt ctggccggtg ttaaaggcgt tgcaggtcct tcaggtcgtc 240
caggtcaacc gggtgcaaat ggtctgccgg gtgttaatgg tcgtggcggt ctggaacgtg 300
gtctggcagg accgccgggt cctgatggtc gccgcggtga aacgggttca ccgggtattg 360
ccggtgccct gggtaaacca ggtctggaag gtccgaaagg ttatcctggt ctgcgcggtc 420
gtgatggtac caatggcaaa cgtggcgaac agggcgaaac cggtccagat ggtgttcgtg 480
gtattccggg taacgatggt cagagcggta aaccgggcat tgatggtatt gatggcacca 540
atggtcagcc tggcgaagca ggttatcagg gtggtcgcgg tacccgtggt cagctgggtg 600
aaacaggtga tgttggtcag aatggtgatc gcggcgcacc gggtccggat ggtagcaaag 660
gtagcgccgg tcgtccgggt ttacgttaa 689
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<400> 86
Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Gln Gly Arg Thr Gly Ala Ala Gly Lys Gln Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Ala Asp Gly Ala Arg Gly Pro Leu Gly Ser Ile Gly Gln Gln
35 40 45
Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Leu Arg Gly
50 55 60
Asp Thr Gly Leu Ala Gly Val Lys Gly Val Ala Gly Pro Ser Gly Arg
65 70 75 80
Pro Gly Gln Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Arg Gly
85 90 95
Gly Leu Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg
100 105 110
Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr
130 135 140
Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly
165 170 175
Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly
180 185 190
Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn
195 200 205
Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly
210 215 220
Arg Pro Gly Leu Arg
225
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polynucleotide"
<400> 87
ggtggcgtac caggcgcaat tcctgggggt gtcccaggcg gtgtttttta tccgggcgcc 60
ggtcttggcg cactgggtgg cggtgcactg ggcccgggcg gcaaaccgct gaaaccggta 120
ccaggtggtt tagcaggcgc cggcttaggc gcaggtctgg gagcatttcc ggcagttacc 180
tttccagggg cactggttcc tggaggtgtg gccgatgcag ccgcggcata taaagccgct 240
aaagccggtg cgggtttagg aggcgtccca ggtgtcggtg gcctgggtgt tagcgccggt 300
gcagttgttc cgcagccggg agcaggggtt aaacctggta aagtgccggg agtaggtctg 360
ccaggcgttt atcctggtgg tgttttgccg ggtgcccgtt ttccgggcgt tggtgttctt 420
ccaggcgtgc cgaccggagc cggtgttaaa ccgaaagccc ccggtgttgg aggtgcattt 480
gcaggcatcc cgggagttgg cccgtttggt ggtccgcaac ctggggttcc gttaggttat 540
ccgattaaag caccgaaact gcccggcggt tatggtctgc cgtacacaac cggtaaactg 600
ccgtatggtt atggcccggg tggagttgcg ggtgcagcag gtaaagcggg ttatcctacc 660
ggaaccggtg taggtccgca ggccgctgct gccgccgccg caaaagcagc ggctaaattt 720
ggcgccggag cagcgggtgt tctgcctgga gttggtggtg cgggcgtgcc aggggtacct 780
ggtgcaattc cgggtattgg tggtattgcc ggtgtcggca ccccggccgc ggcagctgcg 840
gcagcggcgg ctgccaaagc tgctaaatac ggtgccgcgg cgggtctggt gccaggaggt 900
ccgggttttg gtccgggagt ggttggcgtg cctggcgcag gcgttcctgg tgtgggcgtt 960
ccaggtgcag ggattcctgt tgtgcctggt gccggtattc ccggcgcggc cgttccgggg 1020
gtggttagcc cggaagccgc agcgaaggct gcggcaaagg cagcaaagta tggcgcacgc 1080
ccaggagtcg gcgtgggtgg tatcccgacc tatggggtgg gcgcaggggg ttttcctggt 1140
ttcggcgtag gtgtaggagg tataccgggc gtggccggtg taccaggggt tggtggcgtc 1200
cctggtgttg gcggtgtgcc aggtgttggt atttcaccgg aagcacaggc agcagccgca 1260
gctaaggcag cgaaatatgg tgccgccggc gcaggagttt taggtgggct ggttccgggc 1320
ccgcaggcag ctgtgccggg ggttccaggc accggtggtg tccctggagt cggtacgccg 1380
gctgcagcgg cagccaaagc ggctgcgaaa gcagcacagt ttggcttagt accgggtgtg 1440
ggagttgccc ccggcgttgg cgttgctcca ggggtgggtg ttgctcctgg cgtcggtctg 1500
gctcctggag tgggcgtagc acccggtgtg ggggtggccc cgggtgttgg ggttgcaccg 1560
ggtatcggtc cgggcggtgt cgcagcagca gctaaaagcg cggcgaaagt tgcggccaaa 1620
gcccaactgc gcgccgccgc gggcctcggt gcaggtattc cggggctggg tgtcggagtt 1680
ggagtcccgg gtttgggcgt gggcgcggga gttccgggac tgggagtggg tgccggagtt 1740
cctggctttg gtgcaggcgc agatgaaggt gttcgtcgta gcctgagtcc ggaactgcgt 1800
gaaggtgatc cgagtagcag ccagcatctg ccgagcaccc cgagcagccc gcgtgttccg 1860
ggtgcattag ctgcagcaaa agccgccaag tatggtgcag ccgtgccggg cgtcttaggt 1920
ggtctgggcg ccctgggtgg tgtaggcatt ccgggaggtg ttgtgggtgc aggaccggcc 1980
gccgcagctg cggccgccaa agcagctgca aaagcggccc agtttggttt agtgggcgcc 2040
gcaggtttag gcggtttagg tgtgggtgga ctgggtgtac ctggcgtagg cggtctgggt 2100
ggaattccgc ccgcagcggc cgcgaaagcg gcaaaatatg gcgcggcagg cctgggcggc 2160
gtgctgggtg gggcaggtca gtttccgctg ggcggggttg ccgcacgtcc gggatttggt 2220
ctgagcccga ttttccctgg cggcgcatgt ctgggtaaag catgtggtcg taaacgtaaa 2280
taa 2283
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<211> 760
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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polypeptide"
<400> 88
Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
50 55 60
Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
275 280 285
Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly
290 295 300
Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
305 310 315 320
Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala
325 330 335
Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile
355 360 365
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly
370 375 380
Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val
385 390 395 400
Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly
420 425 430
Val Leu Gly Gly Leu Val Pro Gly Pro Gln Ala Ala Val Pro Gly Val
435 440 445
Pro Gly Thr Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val
465 470 475 480
Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro
485 490 495
Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val
500 505 510
Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala
515 520 525
Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg
530 535 540
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val
545 550 555 560
Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val
565 570 575
Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg
580 585 590
Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln
595 600 605
His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala
610 615 620
Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly
625 630 635 640
Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly
645 650 655
Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala
660 665 670
Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val
675 680 685
Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro
690 695 700
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly
705 710 715 720
Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg
725 730 735
Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly
740 745 750
Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
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<211> 429
<212> PRT
<213> Podocoryna carnea
<400> 89
Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Gln Gly Arg Thr Gly Ala Ala Gly Lys Gln Gly Ser
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Pro Gly Ala Asp Gly Ala Arg Gly Pro Leu Gly Ser Ile Gly Gln Gln
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Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Leu Arg Gly
50 55 60
Asp Thr Gly Leu Ala Gly Val Lys Gly Val Ala Gly Pro Ser Gly Arg
65 70 75 80
Pro Gly Gln Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Arg Gly
85 90 95
Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Lys Gly Ile Ala Gly Ser Asp Gly
100 105 110
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115 120 125
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Gly Leu Pro Gly Ser Asp Gly Glu Pro Gly Glu Glu Gly Gln Pro Gly
145 150 155 160
Arg Ser Gly Gln Pro Gly Gln Gln Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu
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Val Gly Pro Arg Gly Ser Lys Gly Pro Ser Gly Asp Arg Gly Asp Arg
180 185 190
Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Gln Thr Gly Ser Ala Gly Asn Val Gly
195 200 205
Glu Asp Gly Glu Gln Gly Gly Lys Gly Val Asp Gly Ala Ser Gly Pro
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Ser Gly Ala Leu Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Asp Thr
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Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Ser Gly Leu Pro Gly
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Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys
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Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Asn
275 280 285
Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly
290 295 300
Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile
305 310 315 320
Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro
325 330 335
Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly
340 345 350
Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln
355 360 365
Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly
385 390 395 400
Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro
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Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg
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gccggtgccc tgggtaaacc aggtctggaa ggtccgaaag gttatcctgg tctgcgcggt 300
cgtgatggta ccaatggcaa acgtggcgaa cagggcgaaa ccggtccaga tggtgttcgt 360
ggtattccgg gtaacgatgg tcagagcggt aaaccgggca ttgatggtat tgatggcacc 420
aatggtcagc ctggcgaagc aggttatcag ggtggtcgcg gtacccgtgg tcagctgggt 480
gaaacaggtg atgttggtca gaatggtgat cgcggcgcac cgggtccgga tggtagcaaa 540
ggtagcgccg gtcgtccggg tttacgttaa 570
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Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys
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Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Asn
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Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly
50 55 60
Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile
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Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro
85 90 95
Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly
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Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln
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Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro
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Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly
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Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
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Ala Ser Ala Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly
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Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu
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Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly
65 70 75 80
Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile
85 90 95
Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly
115 120 125
Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu
130 135 140
Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro
145 150 155 160
Gly Pro His Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly
165 170 175
Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro
180 185 190
Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro
195 200 205
Gly Glu Lys Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Gly Asp Tyr Lys Asp
210 215 220
Asp Asp Asp Lys
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cataaaggtg agcgtggtta cccaggtaat attggtccag tcggtgccgc cggtgcgccg 480
ggtcctcatg gccctgtcgg tccagccggt aaacatggta atcgcggtga gacaggtccg 540
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Ala Ser Ala Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Ile Ala
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Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser Val Gly Pro Ala Gly
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50 55 60
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Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Asp Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp
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Asp Asp Asp Lys
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50 55 60
Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Asp Ala Ile Lys Val
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Tyr Cys Asp Phe Ser Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu
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Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn
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Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly Cys Ser Lys Lys Thr
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Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser
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Ala Ser Ala Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly
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Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala
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Pro Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr
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Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly
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Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala
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Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala
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180 185 190
Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro
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Asp Asp Asp Lys
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130 135 140
Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Glu Pro Gly Ser Gly Gly Glu Pro Gly
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Ala Ser Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Pro Glu Gly Ser
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Arg Gly Ala Asp Gly Asn Asn Gly Phe Pro Gly Asp Asp Gly Glu Asn
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Gly Leu Val Gly Ile Pro Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly
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Ala Val Cys Ser Asn Gln Thr Thr Gly Leu Gly Ala Lys Gly Asp Arg
100 105 110
Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Phe Pro Gly Glu Val Gly Arg Pro Gly
115 120 125
Pro Pro Gly Ala Asp Gly Ile Pro Gly Pro Gln Gly Glu Arg Gly Ala
130 135 140
Val Gly Pro Gly Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Thr Pro
145 150 155 160
Gly Ala Asp Gly Ala Asp Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly
165 170 175
Pro Asp Gly Ala Lys Gly Glu Lys Gly Ala Ser Gly Thr Ala Gly Leu
180 185 190
Lys Gly Glu Lys Gly Asp Thr Cys Ile Pro Asp Ser Asn Ser Thr Leu
195 200 205
Gly Met Pro Gly Thr Pro Gly Ala Gly Gly Ser Lys Gly Gln Lys Gly
210 215 220
Glu Ser Gly Ile Val Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Glu Ile Gly Thr
225 230 235 240
Pro Gly His Pro Gly Phe Arg Gly Ala Asp Gly Glu Pro Gly His Lys
245 250 255
Gly Val Pro Gly Arg Ala Gly Ala Gln Gly Asp Arg Gly Asp Pro Gly
260 265 270
Asp Asp Gly Leu Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
275 280 285
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atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggaa 60
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cagaccagcg aagataattg tgaagcagtt aaagttggtc tgccaggtcg tgatggtcgt 240
gaaggtcctc cgggtccgcc tggtccggct ggcagagatg gccgtgatgc agtttgtagc 300
aatcagacca ccggtctggg tgcaaaaggt gatcgtggtc cgccaggtac accgggtttt 360
ccgggtgaag ttggccgtcc gggtccaccg ggtgcagatg gtattccggg tcctcagggt 420
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aaaggcgaaa aaggtgcaag cggcaccgca ggtctgaaag gtgagaaagg cgatacctgt 600
attccggata gcaatagcac cctgggtatg cctggtacac caggtgccgg tggtagcaaa 660
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<213> Artificial Sequence
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly
20 25 30
Gln Lys Gly Glu Leu Gly Ala Val Gly Pro Gln Gly Thr Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Val Arg
50 55 60
Gly Ala Pro Gly Ser Ser Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Asn Pro Gly
65 70 75 80
Asp Asp Gly Pro Val Gly Pro Gln Gly Val Pro Gly Val Asp Gly Ser
85 90 95
Pro Gly Gln Lys Gly Glu Thr Gly Arg Val Gly Pro Arg Gly His Asp
100 105 110
Gly Ile Asn Gly Thr Pro Gly Glu Asp Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly
115 120 125
Pro Asp Gly Ala Lys Gly Glu Lys Gly Thr Ser Gly Thr Ala Gly Leu
130 135 140
Lys Gly Glu Lys Gly Asp Thr Cys Ile Pro Asp Ser Asn Ser Thr Leu
145 150 155 160
Gly Met Pro Gly Thr Pro Gly Ala Gly Trp Ser Lys Gly Gln Lys Gly
165 170 175
Glu Ser Gly Ile Val Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu Ile Gly Thr
180 185 190
Pro Gly Pro Pro Gly Phe Arg Gly Ala Asp Gly Glu Pro Gly Gln Arg
195 200 205
Gly Glu Pro Gly Arg Ala Gly Ala Gln Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly
210 215 220
Asn Asn Gly Arg Asp Gly Phe Pro Gly Asp Pro Gly Ala Asp Gly Ala
225 230 235 240
Pro Gly Gln Lys Gly Glu Leu Gly Ala Ile Gly His Pro Gly Phe Ser
245 250 255
Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly
260 265 270
Val Arg Gly Ala Gln Gly Arg Pro Gly Asp Arg Gly Ser Pro Gly Asp
275 280 285
Val Gly Pro Ile Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Val Pro
290 295 300
Gly Leu Thr Gly Val Gln Gly Arg Asp Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala
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Ser Ser Gly Ala Val Tyr Val Arg Trp Gly Arg Thr Thr Cys Pro Ser
325 330 335
Gly Ala Asp Val Val Tyr Ser Gly Arg Ala Ala Gly Ala Lys Tyr Asp
340 345 350
His Ser Gly Gly Thr Ser Asp His His Cys Leu Pro Asn Asn Pro Gln
355 360 365
Tyr Leu Ser Glu Asp Asp Thr Asn Ala Leu Gly Ala Gln Leu Tyr Gly
370 375 380
Val Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Arg Ser Ser Pro Tyr Asn Ser Leu Asp
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Gln Ser Asp Met Pro Cys Val Val Cys Asn Ala Asn Gly Arg Ser Gln
405 410 415
Leu Leu Met Val Pro Ala Arg Tyr Thr Cys Pro Thr Gly Trp Ser Arg
420 425 430
Glu Tyr Tyr Gly Tyr Met Met Ser Glu Gly Lys Ala Lys Asn Arg Glu
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Gly Arg Lys Thr Thr Ile Cys Met Asp Phe Ser Ala Glu Ala Val Pro
450 455 460
Gly Ser Gly Ala Asn Thr Asn Pro Ser Pro Gly Ile Met Met Arg Ala
465 470 475 480
Asn Cys Asn Gly Leu Ala Cys Pro Pro Tyr Gln Ser Asn Thr Pro Leu
485 490 495
Thr Cys Ala Val Cys Thr Lys Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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polynucleotide"
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atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcgggt 60
tttcctggcg ctccgggtgc cgacggtgct ccgggtcaaa aaggtgaact gggtgccgtg 120
ggtccgcagg gcactccggg tctgagtggt cctagtggtc cgaccggtcc accaggtcca 180
aaaggcgtgc gtggtgcacc gggtagcagc ggagccaaag gtgatgcagg taaccctggt 240
gatgacggtc cggttggtcc acagggcgtt ccaggtgttg atggtagccc tggccaaaag 300
ggtgaaaccg gtcgtgtggg tcctcgtggt catgatggta ttaatggcac cccaggtgaa 360
gatggtgcga caggctttcc aggtccggat ggcgcaaagg gtgagaaggg caccagcggt 420
acagctggcc tgaagggcga aaagggcgat acatgcatcc cggattcaaa ttcaacactg 480
ggcatgccag gtacgcctgg cgcaggttgg agtaaaggac aaaaaggcga atcaggcatt 540
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gcagacggcg aaccgggtca gcgtggcgaa cctggtcgtg caggcgcaca aggtgaacgc 660
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cctggccaga aaggcgaact gggagcaatt ggtcatccgg gatttagcgg tccgtcaggt 780
ccgagcggac cgacaggtcc tcctggaccg aaaggtgtac gtggcgcaca gggtcgtcct 840
ggcgatcgtg gcagtccagg tgatgtgggt ccgattggtg cacctggtcc tccaggtgcg 900
gacggcgtgc ctggtttaac aggtgtgcag ggtcgcgacg gtcctaaagg tgaatcagca 960
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gtttatagcg gtcgcgcagc cggtgcaaaa tatgatcatt caggtggcac ctcagatcat 1080
cattgtctgc cgaataatcc gcagtatctg agcgaagatg ataccaatgc actgggtgca 1140
cagctgtatg gtgtggaata tgaaattcgt gatcgtagca gcccgtataa tagcctggat 1200
cagagcgata tgccgtgtgt tgtttgtaat gcaaatggtc gtagccagct gctgatggtt 1260
ccggcacgtt atacatgccc gaccggttgg agccgtgaat attatggtta tatgatgagc 1320
gaaggcaaag ccaaaaatcg cgaaggtcgt aaaaccacca tttgtatgga ttttagcgca 1380
gaagcagttc ctggtagcgg tgcaaatacc aatccgagtc cgggtattat gatgcgtgca 1440
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tgtaccaaag gtgactacaa agacgacgac gacaaataa 1539
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
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Ala Ser Ala Gly Pro Ala Gly Ala Lys Gly Pro Ser Gly Asp Ile Gly
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Arg Pro Gly Glu Ser Gly Ser Pro Gly Ala Arg Gly His Ser Gly Gln
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Pro Gly Arg Thr Gly Ile Ala Gly Asn Gln Gly Leu Pro Gly Thr Ala
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Gly Glu Glu Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Ala Gly Met Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Leu
85 90 95
Pro Gly Lys Pro Gly Asp Arg Gly Asn Val Gly Leu Ala Gly Pro Arg
100 105 110
Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Glu Val Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly
115 120 125
Val Ala Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Leu Ala Gly Ser
130 135 140
Val Gly Phe Gln Gly Met Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gly Glu Pro
145 150 155 160
Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Leu Arg Gly Asp Ala Gly Ser Pro Gly
165 170 175
Met Ile Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala
180 185 190
Ser Gly Ala Gln Gly Leu Leu Gly Pro Arg Gly Thr Ser Gly Ala Pro
195 200 205
Gly Leu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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polypeptide"
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Gln Gly Ile Pro Gly Ser Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys
20 25 30
Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro Asp Gly
35 40 45
Leu Arg Gly Phe Ala Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Pro
50 55 60
Pro Gly Leu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Met Gly Ala Pro Gly Leu Thr
65 70 75 80
Gly Ser Thr Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Ala Gly Ala Ile Gly
85 90 95
Leu Pro Gly Arg Pro Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Glu
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Gly Asp Lys Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Asp Asp
115 120 125
Gly Val Gln Gly Ala Met Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Ser Gln Gly
130 135 140
Pro Pro Gly Asp Tyr Gly Asp Lys Gly Glu Leu Gly Lys Pro Gly Gln
145 150 155 160
Lys Gly Ser Lys Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Pro Gly Pro Ile
165 170 175
Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Ser Asp Gly
180 185 190
Ser Pro Gly Leu Arg Gly Tyr Leu Gly Met Arg Gly Gln Lys Gly Asp
195 200 205
Asp Gly Ile Arg Gly Leu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Val Gly Leu Gln
210 215 220
Gly Leu Pro Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
225 230 235
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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
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Ala Ser Ala Lys Gly Glu Thr Gly Glu Ala Gly Asp Pro Gly Thr Pro
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Gly Glu Pro Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Asp Val Gly Asp Lys Gly
35 40 45
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Pro Gly Glu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Val Gly Pro Ala Gly Phe Pro
65 70 75 80
Gly Asp Pro Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Met Asp Gly
85 90 95
Gly Val Gly Glu Lys Gly Ser Leu Gly Asp Pro Gly Leu Thr Gly Pro
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130 135 140
Ser Lys Gly Ser Pro Gly Gln Glu Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Pro
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Met Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly
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Leu Pro Gly Ile Gln Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
245 250
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His His His His His His His His His His His His His His
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His His His His His His His His His His His His His His His His
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His His His His His His His His His His His His
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His His His His His His His His His His His
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His His His His His His His His His His
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His His His His His His His His His His His His
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
50 55 60
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
65 70 75 80
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
85 90 95
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
100 105 110
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
115 120 125
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys
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Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
20 25 30
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
35 40 45
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
50 55 60
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
65 70 75 80
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
85 90 95
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
100 105 110
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
115 120 125
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
50 55 60
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
65 70 75 80
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
85 90 95
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
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Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
20 25 30
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
35 40 45
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
50 55 60
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
65 70 75 80
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
85 90 95
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
100 105 110
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
115 120
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
50 55 60
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
65 70 75 80
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
85 90
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
20 25 30
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
35 40 45
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
50 55 60
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
65 70 75 80
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
85 90
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
50 55 60
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
20 25 30
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
35 40 45
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
50 55 60
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
35 40 45
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp
20 25 30
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
35 40 45
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
20 25 30
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
20 25 30
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
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Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
20 25
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
20 25
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<211> 24
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
20
<210> 145
<211> 24
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
20
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Lys
20
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<211> 21
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repeating units"
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asp Lys
20
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<211> 18
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Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys
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<211> 18
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repeating units"
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Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Lys
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
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repeating units"
<400> 150
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
1 5 10 15
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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repeating units"
<400> 151
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
1 5 10 15
<210> 152
<211> 12
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peptide"
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<222> (1)..(12)
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repeating units"
<400> 152
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys
1 5 10
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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repeating units"
<400> 153
Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys
1 5 10
Claims (70)
- 해파리 콜라겐, 인간, 콘드로시아 레니포미스(Chondrosia reniformis)(신장 해면), 및 린코돈 티푸스(Rhincodon typus)(고래 상어)로 이루어진 군으로부터 선택되는 비자연적 생성 콜라겐.
- 제1항에 있어서, 비자연적 생성 콜라겐이 말단절단된(truncated) 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제2항에 있어서, 콜라겐이 50개의 아미노산 내지 300개의 아미노산의 내부 말단절단에 의해 말단절단된 것인 비자연적 생성의 말단절단된 콜라겐.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐의 아미노산 서열이 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 및 서열 번호 112로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐이 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 베타-락타마제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제5항에 있어서, 분비 태그가 DsbA인 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐이 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 추가로 포함하는 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제7항에 있어서, 비자연적 생성 콜라겐이 2 내지 50개의 아미노산 삼량체 반복부를 포함하는 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비자연적 생성 콜라겐이 해파리 콜라겐인 것인 비자연적 생성 콜라겐.
- 0.005% w/w 내지 30% w/w의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 섬유아세포 세포의 성장을 자극시키고/거나, 프로콜라겐의 합성을 자극시키고/거나, 티민-티민(TT) 이량체 형성의 형성을 감소시키는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 조성물이 0.005% 내지 1%의 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 조성물이 0.01% 내지 1%의 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 조성물이 0.02% 내지 0.5%의 비자연적 생성 콜라겐을 포함하는 것인 조성물.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소용 조성물이고, 상기 국소용 조성물이 국소용 담체 및/또는 보존제를 포함하는 적어도 1종의 추가 성분을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제14항에 있어서, 국소용 조성물이 마스크인 것인 조성물.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 국소용 담체가 리포솜, 생체분해 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 파우더(dusting powder), 생체분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 페트롤륨, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 국소용 조성물.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제가 토코페롤, 디아이오도메틸-p-톨일술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 메틸 파라벤, 소르브산, 게르마벤(Germaben) II, 로즈마리 추출물 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 국소용 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 피험체의 피부 또는 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함하는, 피부 손상을 감소시키거나, 손상된 피부의 회복을 촉진시키거나, UV 손상으로부터 피부를 보호하거나, 또는 피부 세포의 생존능을 증가시키는 방법.
- 제18항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 섬유아세포 세포의 생존능이 증가되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 섬유아세포 세포에 의한 프로콜라겐의 합성이 증가되는 것인 방법.
- 해파리 엘라스틴, 인간 엘라스틴, 콘드로시아 레니포미스(신장 해면) 엘라스틴, 또는 린코돈 티푸스 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제21항에 있어서, 비자연적 생성 엘라스틴이 말단절단된 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제22항에 있어서, 엘라스틴이 적어도 50개의 아미노산의 말단절단에 의해 말단절단된 것인 비자연적 생성의 말단절단된 엘라스틴.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 엘라스틴의 아미노산 서열이 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 98, 및 서열 번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 엘라스틴이 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 베타-락타마제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제25항에 있어서, 분비 태그가 DsbA인 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 엘라스틴이 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 추가로 포함하는 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제27항에 있어서, 비자연적 생성 엘라스틴이 2 내지 50개의 아미노산 삼량체 반복부를 포함하는 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비자연적 생성 엘라스틴이 인간의 것인 비자연적 생성 엘라스틴.
- 0.005% w/w 내지 30% w/w의, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 섬유아세포 세포의 성장을 자극시키고/거나, 프로콜라겐의 합성을 자극시키는 것인 조성물.
- 제30항에 있어서, 조성물이 0.005% 내지 1%의 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 것인 조성물.
- 제30항에 있어서, 조성물이 0.01% 내지 1%의 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 것인 조성물.
- 제30항에 있어서, 조성물이 0.02% 내지 0.5%의 비자연적 생성 엘라스틴을 포함하는 것인 조성물.
- 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소용 조성물이고, 상기 국소용 조성물이 국소용 담체 및/또는 보존제를 포함하는 적어도 1종의 추가 성분을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제34항에 있어서, 국소용 조성물이 마스크인 것인 조성물.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 국소용 담체가 리포솜, 생체분해 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 파우더, 생체분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 페트롤륨, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 국소용 조성물.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제가 토코페롤, 디아이오도메틸-p-톨일술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 메틸 파라벤, 소르브산, 게르마벤 II, 로즈마리 추출물 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 국소용 조성물.
- 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조성물을 피험체의 피부에 적용시키는 단계를 포함하는, 피부 손상을 감소시키거나, 손상된 피부의 회복을 촉진시키거나, 또는 UV 손상으로부터 피부를 보호하는 방법.
- 제38항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 섬유아세포 세포 또는 각질형성세포의 생존능이 증가되는 것인 방법.
- 제38항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 섬유아세포 세포에 의한 프로콜라겐의 합성이 증가되는 것인 방법.
- 비자연적 생성 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 90, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 및 서열 번호 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 벡터인 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 베타-락타마제 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제41항 또는 제45항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
- 제48항에 있어서, 숙주 세포가 비자연적 생성 콜라겐을 숙주 세포의 원형질막주위 공간으로 수송하는 것인 숙주 세포.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 숙주 세포가 해파리 콜라겐을 생산하는 것인 숙주 세포.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 그람 음성 박테리아인 것인 숙주 세포.
- 제48항에 있어서, 숙주 세포가 E. 콜라이(E. coli)인 것인 방법.
- 제49항에 있어서, E. 콜라이가 전환된(switched) E. 콜라이인 것인 방법.
- a. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하는 단계; 및
b. 숙주 세포로부터 비자연적 생성 콜라겐을 단리시키는 단계
를 포함하는, 비자연적 생성 콜라겐을 제조하는 방법. - 비자연적 생성 엘라스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 99, 및 서열 번호 101로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제52항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 벡터인 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광성 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 베타-락타마제 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열 글리신-글루탐산-리신(GEK) 및/또는 글리신-아스파르트산-리신(GDK)의 하나 이상의 아미노산 삼량체 반복부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
- 제56항에 있어서, 숙주 세포가 비자연적 생성 콜라겐을 숙주 세포의 원형질막주위 공간으로 수송하는 것인 숙주 세포.
- 제56항 또는 제57항에 있어서, 숙주 세포가 해파리 콜라겐을 생산하는 것인 숙주 세포.
- 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 그람 음성 박테리아인 것인 숙주 세포.
- 제59항에 있어서, 숙주 세포가 E. 콜라이인 것인 방법.
- 제60항에 있어서, E. 콜라이가 전환된 E. 콜라이인 것인 방법.
- a. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하는 단계; 및
b. 숙주 세포로부터 비자연적 생성 콜라겐을 단리시키는 단계
를 포함하는, 비자연적 생성 엘라스틴을 제조하는 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함하는, 피부 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 사이토카인이 IL-1a인 것인 방법.
- 제63항에 있어서, 피부 세포가 각질형성세포인 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 피험체의 피부 또는 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함하는, 피부 세포의 생존능을 증가시키는 방법.
- 제66항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 각질형성세포의 생존능이 증가되는 것인 방법.
- 제66항에 있어서, 피험체의 피부에 존재하는 섬유아세포의 생존능이 증가되는 것인 방법.
- 도시 분진에의 노출의 영향으로부터 피부 세포를 보호하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 피부 세포에 적용시키는 단계를 포함하고, 피부 세포의 생존능이 증가되는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 피부 세포가 각질형성세포 또는 섬유아세포인 것인 방법.
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