JP2000508544A - 組換えｄｎａ系におけるヒトプロコラーゲンおよびコラーゲンの合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コラーゲンおよびコラーゲン翻訳後酵素を発現する宿主およびベクターを用いてコラーゲンを製造する方法が開示される。コラーゲン翻訳後酵素としては、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、リシルオキシダーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、およびＮ−プロテイナーゼが挙げられ、これらの酵素は、非哺乳類宿主における適正に折りたたまれた組換えコラーゲンの収量を増大させる。これらの方法、宿主およびベクターによって産生されたコラーゲンには、それぞれ１個のコラーゲン遺伝子または複数のコラーゲン遺伝子から製造されるホモ三量体およびヘテロ三量体コラーゲンの両方が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ系におけるヒトプロコラーゲンおよびコラーゲンの合成関連出願 本出願は、１９９６年４月１２日出願の米国特許出願第０８／６３１，３３６ 合（「’３３６出願」）の一部継続出願であり、これは１９９４年８月１１日出 願の米国特許出願第０８／２１１，８２０号（「’８２０出願」）の一部継続出 願である。’８２０出願は、１９９２年１０月２２日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣ Ｔ／ＵＳ９２／０９０６１のアメリカ合衆国特許法§３７１に基づく米国特許出 願であり、これは現在は放棄されている１９９１年１０月２３日出願の米国特許 出願第０７／７８０，８９９号の一部継続出願である。’８６０出願は、’８２ ０出願および1９９４年３月１６日出願の米国特許出願第０８／２１０，０６３ 号の一部継続出願であり、これは１９９２年６月１０日出願のＰＣＴ特許出願Ｐ ＣＴ／ＵＳ９２／２２３３３のアメリカ合衆国特許法§３７１に基づく米国特許 出願であり、これは現在は放棄されている１９９１年６月１２日出願の米国特許 出願第０７／７１３，９４５号の一部継続出願である、これらの各出願は、参考 のため本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の発明の部分は、一部がＮＩＨ 助成金ＡＲ３８１８８とＡＲ３９７４０に支持された研究の過程で生まれたもの である。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。１．発明の分野 本発明は、プロコラーゲン、コラーゲンおよびこれらの断片の組換え法による 産生に関する。２．発明の背景 細胞外マトリックス。細胞外マトリックスの最も豊富な成分は、コラーゲンで ある。コラーゲン分子は一般にその一次配列中に、３重らせんドメイン（van de r Rest et al.，FASEB J. 5:2814-2823(1991)）の形成を可能にする（−Ｇｌｙ −Ｘ−Ｙ−）ｎ繰り返し配列を含有する、３つのポリペプチド鎖のトリマー集合 の結果である。その生合成の間、コラーゲンを含む３つのポリペプチド鎖は、種 々の翻訳後修飾を受け、これがこれらの３重らせんドメイン（van der Rest e t al.，Adv ．Mol．Cell Biol. 6:1-67(1993)）の形成を可能にする。例えば、コ ラーゲンのプロリン残基はヒドロキシル化されて４−ヒドロキシルプロリンにな り、こうして酵素プロリル４−ヒドロキシラーゼにより鎖間水素結合が形成され る（Kivirikko et al.，Post-translational modifications of proteins（Hard ing，J.J.，Crabbe，M.J.C.編）pp．1-51，CRC Press，Boca Raton，フロリダ州 (1992)）。次に、３重らせん分子はさらにプロセシングされてコラーゲンを生成 する。例えば、コラーゲンの前駆体分子である「プロコラーゲン」を含有するＮ −プロペプチドとＣ−プロペプチドは、翻訳後の過程でそれぞれ酵素Ｎ−プロテ イナーゼとＣ−プロテイナーゼにより切断される。 その種々の形すなわち「型」のコラーゲンの多様な構造的および機能的性質の 結果として、コラーゲンは細胞外マトリックスの高度の多様性に大きく寄与する ことができる。 コラーゲンの型。脊椎動物で１９種類の異なる型のコラーゲン（ウシ、ヒツジ 、ブタ、ニワトリおよびヒトのコラーゲンを含む）が同定されている。これらの 型のコラーゲンは、ローマ数字で番号が付けられ、各型のコラーゲン中の鎖は、 アラビア数字で識別される。天然に存在するコラーゲンの種々の異なる型の構造 および生物学的機能の詳細は、特にAyad et al.，The Extracellular Matrix Fa cts Book ，アカデミックプレス(Academic Press)、サンジエゴ、カリホルニア州 ；Burgeson，R.E.とNimlni，”Collagen types:Molecular Structure and Tissu e Distribution,”Clin ．Orthop. 282:250-272(1992)：Kielty，C.M．et al.，C onnective Tissue And Its Heritable Disorders ，Molecular Genetics，AndMed ical Aspects ， Royce，P.M．とSteinmann，B.，編、Wiley-Liss，ニューヨーク 州、pp．103-147(1993)中の"The Collagen Family:Structure，Assembly And Or ganization In The Extracellular Matrix"に記載されている。 Ｉ型コラーゲンは、骨や皮膚中の主要な線維状コラーゲンである。Ｉ型コラー ゲンは、２つのα１（Ｉ）鎖と１つのα２（Ｉ）鎖からなるヘテロトリマー分子 である。精製されたＩ型コラーゲンに関する詳細は、特にMiller et al.，Metho ds In Enzymology 82:33-64(1982)、アカデミックプレス（Academic Press）に 記載されている。 II型コラーゲンは、３つの同じα（II）鎖からなるホモトリマーコラーゲンで ある。精製されたII型コラーゲンは、特にMiller et al.，Methods In Enzymolo gy 82:33-64(1982)、アカデミックプレス（Academic Press）に記載の方法によ り、組織から調製される。 III型コラーゲンは、皮膚や血管組織中の主要な線維状コラーゲンである。III 型コラーゲンは、３つの同じα（III）鎖からなるホモトリマーコラーゲンであ る。組織からのIII型コラーゲンの精製法に関する詳細は、特にByers et al.，B iochemistry 13:5243-5248（1974）およびMiller et al.，Methods In Enzmolog y 82:33-64(1982)、アカデミックプレス（Academic Press）に記載されている。 IV型コラーゲンは、線維ではなくシートの形で基底膜中に存在する。最も一般 的な型のIV型コラーゲンは、２つのα１（IV）鎖と１つのα２（IV）鎖を含有す る。IV型コラーゲンを含む特定の鎖は組織特異的である。IV型コラーゲンは、特 にFuruto et al.，Methods In Enzymology 144:41-61 (1987)、アカデミックプ レス（Academic Press）に記載された方法により精製される。 Ｖ型コラーゲンは、主に骨、腱、角膜、皮膚、および血管に存在する線維状コ ラーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモトリマーとヘテロトリマーの両方で存 在する。１つの型のＶ型コラーゲンは、２つのα１（Ｖ）鎖とα２（Ｖ）のヘテ ロトリマーである。別の型のＶ型コラーゲンは、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）、およ びα３（Ｖ）のヘテロトリマーである。さらに別の型のＶ型コラーゲンは、α１ （Ｖ）のホモトリマーである。天然の供給源からのＶ型コラーゲンの単離方法は 、特にElstrow et al.，Collagen Rel ．Res. 3:181-193(1983)およびAbedin et al.，Biosci ．Rep. 2:493-502（1982）に記載されている。 VI型コラーゲンは、小さい３重らせん領域と２つの大きな非コラーゲン性の残 りの部分を有する。VI型コラーゲンは、α１（VI）、α２（VI）、およびα３（ VI）鎖からなるヘテロトリマーである。VI型コラーゲンは、多くの結合組織中に 存在する。天然の供給源からのVI型コラーゲンの精製方法は、特にWu et al.，B iochem ．J. 248:373-381(1987)とKielty et al.，J ．Cell Sci. 99:797-807に記 載されている。 VII型コラーゲンは、特定の上皮組織中に存在する線維状コラーゲンである。 ＶII型は、３つのα１（VII）のホモトリマー分子である。組織からのVII型コラ ーゲンの精製方法は、特にLundstromet al.，J ．Biol．Chem．261:9042-9048（1 986）とBentz et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci.USA 80:3168-3172(1983)に記載 されている。 VIII型コラーゲンは、角膜のデスメー膜中にに存在する。VIII型コラーゲンは 、２つのα１（VIII）鎖と１つのα２（VIII）鎖からなるヘテロトリマーである が、他の鎖の組成も報告されている。天然からのVIII型コラーゲンの精製方法は 、特にBenya et al.，J ．Biol．Chem．261:4160-4169（1986）とKapoor et al. ，Biochemistry 25:3930-3937(1986)に記載されている。 IX型コラーゲンは、軟骨や硝子液中に見いだされる線維関連コラーゲンである 。IX型コラーゲンは、α１（IX）、α２（IX）、およびα３（IX）鎖からなるヘ テロトリマー分子である。IX型コラーゲンの精製方法は、特にDuance et al.，B iochem ．J. 221:885-889(1984)、Ayad et al.，Biochem ．J. 262:753-761(1989) 、Grant et al.，The Control of Tissue Damage，Glauert，A.M.編、El Sevier 、アムステルダム、pp.3-28(1988)に記載されている。 X型コラーゲンは、α１（Ｘ）鎖のホモトリマー化合物である。X型コラーゲン は、特に増殖板中に存在する肥大性軟骨から単離されている。 XI型コラーゲンは、II型コラーゲンやIX型コラーゲンに関連する軟骨組織およ び体の他の位置に存在する。XI型コラーゲンは、α１（XI）、α２（XI）、およ びα３（XI）鎖からなるヘテロトリマー分子である。XI型コラーゲンの精製方法 は、特にGrant et al.，In The Control of Tissue Damage，Glauert，A.M.編、 El Sevier、アムステルダム、pp.3-28(1988)に記載されている。 XII型コラーゲンは、主にＩ型コラーゲンに関連して見いだされる線維関連コ ラーゲンである。XII型コラーゲンは、３つのα１（XII）からなるホモトリマー 分子である。XII型コラーゲンおよびその変種の精製方法は、特にDublet et al. ，J．Biol．Chem. 264:13150-13156(1989)、Lundstrom et al.，J ．Biol．Chem. 267:20087-20092(1992)、およびWatt et al.，J ．Biol．Chem. 267:20093-2009 9(1992)に記載されている。 XIII型は、特に皮膚、小腸、骨、軟骨および横紋筋中に存在する非繊維状コラ ーゲンである。XIII型コラーゲンは、特にJuvonen et al.，J ．Biol．Chem. 267 :24700-24707(1992)中に詳細に記載されている。 XIV型は、線維関連コラーゲンである。XIV型コラーゲンは、３つのα１（XIV ）鎖からなるホモトリマー分子である。XIV型コラーゲンの単離方法は、特にAub ert-Foucher et al.，J ．Biol．Chem. 266:19759-19764(1992)、およびwatt et al.，J ．Biol．Chem. 267:20093-20099(1992)に記載されている。 XV型コラーゲンは、XVIIIコラーゲンと構造的に同族である。天然のXV型コラ ーゲンの構造と単離に関する情報は、特にMyers et al.，Proc ．Natl．Acad.Sc i．USA 89:10144-10148(1992)，Huebner et al.，Genomics 14:220-224（1992) ，Kivirikko et al.，J ．Biol．Chem. 269:4773-4779(1994)、およびMuragaki e t al.，J ．Biol．Chem. 264:4042-4046(1994)に記載されている。 XVI型コラーゲンは、皮膚、肺繊維芽細胞、ケラチン細胞、その他に存在する 線維関連コラーゲンである。XVI型コラーゲンの構造およびXVI型コラーゲンをコ ードする遺伝子に関する情報は、特にPan et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1989:6565-6569(1992)、およびYamaguchi et al.，J ．Biochem. 112:856-86３ （1992）に記載されている。 XVII型コラーゲンは、半接着性トランスメンブランコラーゲンである。XVII型 コラーゲンの構造およびXVII型コラーゲンをコードする遺伝子に関する情報は、 特にLi et al.，J ．BIol．Chem. 268(12)：8825−8834(1993)、およびMcGrath e t al.，Nat ．Genet. 11(1):83-86(1995)に記載されている。 XVIII型コラーゲンは、構造がXV型コラーゲンに似ており、肝臓から単離され る。XVIII型コラーゲンの構造と天然の供給源からのXVIII型コラーゲンの単離は 、特にRehn et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:4234-4238(1994)，Oh et al.，Proc ．Natl．Acad．ScI．USA 91:4229-4233(1994)，Rehn et al.，J ．Biol ．Chem. 269:13924-13935(1994)およびOh et al.，Genomics 19:994-999（1994 ）に記載されている。 XIX型コラーゲンは遺伝子構造のために、ＦＡＣＩＴコラゲナーゼファミリー の別のメンバーとして分類される。XIX型のｍＲＮＡが最近、横紋筋肉腫細胞か ら単離された。XIX型コラーゲンの構造と単離は、特にInoguchi et al.，J ．Bio chem. 117:137-146(1995)，Yoshioka et al.，Genomics 13:884-886(1992),Myer s et al.，J ．Biol．Chem. 289:18549-18557（1994）に記載されている。 翻訳後酵素。プロリル４−ヒドロキシラーゼは、細胞によるプロコラーゲンま たはコラーゲンの合成に必要な重要な翻訳後酵素である。この酵素は、繰り返さ れる−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−配列のＹ位のプロリル残基をヒドロキシル化して４−ヒ ドロキシルプロリンにするのに必要である。Prockop et al.，N ．Engl．J．Med. 311:376-386(1984)。プロリル４−ヒドロキシラーゼにより、適切な数のＹ位の プロリル残基が４−ヒドロキシルプロリンにヒドロキシル化されないと、新たに 合成された鎖は、３７℃で折り畳まれて３重らせん構造になることができない。 さらにヒドロキシル化が起きない場合は、このポリペプチドは非らせんのままで あり、細胞による分泌が少なく、自己集合してコラーゲン線維になることができ ない。 脊椎動物のプロリル４−ヒドロキシラーゼは、α２β２テトラマーである。Be rg et al.，J ．Biol．Chem. 248:1175-1192(1973):Tuderman et al.，Eur ．J. B iochem. 52:9-16(1975)。αサブユニット（〜６３kDa）は、プロリル残基のヒド ロキシル化に関与する触媒部位を含有するが、βサブユニットが存在しない場合 は不溶性である。βサブユニット（〜５５kDa）は、タンパク質のジスルフィド イソメラーゼと同一であることがわかり、これはタンパク質基質のチオール／ジ スルフィド交換を触媒し、これによりジスルフィド結合が形成され、これはタン パク質の最も安定な状態の樹立を可能にする。βサブユニットは、プロリル４− ヒドロキシラーゼテトラマーの一部である時、タンパク質のジスルフィドイソメ ラーゼの５０％を保持する。Pihlajaniemi et al.，Embo J. 6:643-649（1987); Parkkonen et al.，Biochem ．J. 256:1005-1011(1988);Koivu et al.，J. Biol ．Chem. 262:6447-6449(1987)。最近、Ｓｆ９細胞中でαおよびβサブユニット を同時に発現することにより、昆虫細胞中で活性のある組換えヒト酵素が産生さ れた。Vuori et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:7467-7470(1992)。 プロリル４−ヒドロキシラーゼ以外に、Ｃ−プロテイナーゼ、Ｎ−プロテイナ ーゼ、リジルオキシダーゼ、およびリジルヒドロキシラーゼを含む他のコラーゲ ン翻訳後酵素が同定され、文献に報告されている。 コラーゲンを発現するための試み。種々の組換え宿主−ベクター系で、多くの 外因性遺伝子が容易に発現されている。しかしタンパク質の最終的形成のために 広範な翻訳後プロセシングが必要な場合は、発現は困難になる。これはおそらく 、本発明以前に、充分な組換え系で正しく形成されたコラーゲンの発現が報告さ れていないためである。Prockop et al.，N ．Engl．J．Med. 311:376-386（1984 ）を参照。 Ｉ型プロコラーゲンの２つの鎖の１つのみを合成した２つの異なる系でレスキ ュー実験が報告されていることが注目される。具体的には、ヒト線維状プロコラ ーゲンｐｒｏα１（Ｉ）鎖の遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１遺伝子は、マウス繊維芽 細胞中で発現することができ、鎖は、Ｉ型コラーゲンの前駆体であるＩ型プロコ ラーゲンの分子を集合させるために使用される。しかし、報告は、マウス起源の ｐｒｏα２（Ｉ）鎖に限定されている。従って合成されたＩ型プロコラーゲンは 、ヒトとマウス起源のハイブリッド分子である。 同様に、ラットのＩ型プロコラーゲンを生成するためのラットの外因性ｐｒｏ α２（Ｉ）遺伝子の発現が報告されている。すなわち、すべての３つの鎖が外因 性遺伝子に由来する組換えプロコラーゲン分子は、当該分野で合成されなかった 。 ヒトコラーゲンの遺伝子を発現させることができないために、ヒトで多くの治 療的用途があり、好ましくない免疫応答（動物起源のコラーゲンを使用すると起 きる）を引き起こさないヒトプロコラーゲンやコラーゲンを得ることが不可能に なっている。また、多くの型のコラーゲンが、組織中では微量にしか存在せず、 組換え産生によってのみ多量に得ることができる。 III．発明の要旨 方法：本発明は、コラーゲン鎖をコードする少なくとも１種の核酸配列および コラーゲン翻訳後酵素をコードする少なくとも１種の核酸配列の発現を含むもの である。 より具体的には、本発明は、細胞内における、少なくとも１個のプロコラーゲ ンもしくはコラーゲン遺伝子（もしくはその他の核酸分子）またはいくつかの異 なるプロコラーゲンもしくはコラーゲン遺伝子（もしくはその他の核酸分子）の 発現方法を提供するものである。さらに、細胞内に導入され（すなわち、形質転 換または形質導入され）、発現した１個のプロコラーゲンもしくはコラーゲン遺 伝子（もしくはその他の核酸分子）またはいくつかの異なるそのような遺伝子の １以上のコピーが存在することが予想される。本発明は、これらの細胞を、コラ ーゲンおよびコラーゲンを修飾する酵素をコードする核酸で形質転換またはトラ ンスフェクトして、それらの細胞がホモ三量体またはヘテロ三量体のプロコラー ゲンまたはコラーゲンに組み立てられる好ましくはヒトの少なくとも１種のプロ コラーゲンまたはコラーゲン鎖を発現させ得る方法を提供するものである。 本発明の１つの実施態様においては、この方法は、細胞内にトランスフェクト され、細胞内で発現する、突然変異体、変異体、ハイブリッドまたは組換え遺伝 子（またはその他の核酸分子）であるプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子を 利用する。そのような突然変異体、変異体、ハイブリッドまたは組換え遺伝子に は、例えば、ハイブリッド遺伝子の切断のために特有の制限部位を付与する突然 変異が含まれ得る。 本発明のさらなる実施態様においては、かかる突然変異は核酸分子によってコ ードされるアミノ酸配列を変更しない１以上の特有の制限部位を付与するが、単 に該分子の操作に有用な特有の制限部位を付与するものである。したがって、修 飾された分子は、いくつかの別個の領域、または特有の制限部位が隣接したＤ− 領域から構成される。分子のこれらの別個の領域は、本明細書中ではカセットと いう。例えば、Ｄ１〜Ｄ４と称するカセットを図４に示す。カセットの複数のコ ピーから形成される分子は、本発明に含まれる本発明の遺伝子の別の変異体であ る。コラーゲナーゼのような内因性酵素に対する抵抗性などの所望の特性を付与 する組換えもしくは突然変異核酸分子またはカセットも本発明に含まれる。 本発明の方法の新規特徴は、比較的大量のヒトプロコラーゲンまたはコラーゲ ンを、その他のプロコラーゲンまたはコラーゲンを作らない組換え細胞培養系に おいて合成することができるということである。プロコラーゲンまたはコラーゲ ンの内因性遺伝子の産物を組換えコラーゲン産物から分離するのが非常に困難で あるので、その他のプロコラーゲンまたはコラーゲンを作る系が好ましい。本発 明の方法を用いると、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリおよびその他の哺乳類のコラ ーゲンを含むプロコラーゲンの精製が非常に容易になる。さらに、本発明の方法 によって合成されるタンパク質の量は、当技術分野で用いられているその他の系 と比べて多いということが示された。 本発明の方法のその他の新しい特徴は、合成されたプロコラーゲンが、プロコ ラーゲンおよびコラーゲンに特徴的な正常な三重らせんコンホメーションを示す ように正確に折りたたまれたタンパク質であるということである。したがって、 このプロコラーゲンを用いて、プロテアーゼで該プロコラーゲンを切断すること によって安定なコラーゲンを作り出すことができる。 本発明は、形質転換またはトランスフェクトされたプロコラーゲンおよびコラ ーゲン遺伝子から単に誘導されるプロコラーゲンまたはコラーゲンの産生方法を 提供する。しかしながら、この方法は、形質転換またはトランスフェクトされた 遺伝子から単に誘導されるプロコラーゲンおよびコラーゲンの製造に限定するも のではない。 ベクター：また、本発明は、本発明の方法に用いられるベクターおよびプラス ミドにも関する。かかるベクターおよび/またはプラスミドは、所望のプロコラ ーゲンおよびコラーゲンをコードする核酸配列、必要なプロモーター、ならびに そのようなプロコラーゲンおよびコラーゲンの適正な発現に必要なその他の配列 からなる。好ましい実施態様においては、本発明のベクターおよびプラスミドに は、さらに、１種以上の翻訳後酵素をコードする少なくとも１種の配列が含まれ る。 本発明の目的は、ヒトおよびその他の起源由来のコラーゲン遺伝子を含む種々 の宿主細胞のための発現ベクターを構築し、種々のコラーゲン翻訳後修飾酵素を 含む発現ベクターを構築することである。 細胞：本発明は、さらに、プロコラーゲンまたはコラーゲンを、単独で、また は１種以上の翻訳後酵素と組み合わされた状態でｍＲＮＡとしてもタンパク質と しても発現する細胞を含む。好ましくは、プロコラーゲンまたはコラーゲン（Ｉ 〜XIX型）、および/または翻訳後酵素は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母 細胞中で発現する。これらの好ましい実施態様にもかかわらず、植物細胞および 藻類細胞などのその他の細胞も作製することができる。 本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物細胞、昆虫細胞および酵母細 胞などの細胞（これらは十分な量の翻訳後酵素を天然で産生しなくてもよい）は 、プロリル4-ヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、Ｎ−プロテイナーゼ、リ シルオキシダーゼまたはリシルヒドロキシラーゼなどの翻訳後酵素をコードする 少なくとも１組の遺伝子で形質転換されている。 ポリペプチド：本発明は、キメラ遺伝子から産生される融合産物などの、本発 明の方法にしたがって発現した組換えポリペプチドを含む。ここで、例えば、コ ラーゲンまたはプロコラーゲンの関連エピトープが、治療およびその他で使用す るために製造され得る。本発明のポリペプチドとしては、さらに、脱グリコシル 化(deglycosolated)、非グリコシル化(unglycosolated)および部分グリコシル化 (partially glycosolated)コラーゲンおよびプロコラーゲンが挙げられる。 本発明の組換えコラーゲンの利点は、これらのコラーゲンがそれらが投与され る哺乳類においてアレルギー応答を生じさせないということである。この組換え コラーゲンは、そのような哺乳類の天然コラーゲンをコードする核酸配列を利用 して製造される。例えば、ヒトは、その他の哺乳類に由来するコラーゲン（例え ばウシ由来コラーゲン）と比較して、ヒトコラーゲンの投与に寛容であると予想 される。さらに、培養細胞から調製された本発明のコラーゲンは、動物源から得 られたコラーゲンよりも高品質であり、より大きくてよりきつく包み込まれた(t ightly packed)タンパク質を形成する。 ＩＶ．図面の簡単な説明 図１は、プロモーター、最初のエキソン、および最初の２つのエキソンを除い たCOL2A1の全部を含む30kbの断片に連結されたヒトCOL1A1遺伝子の最初のイント ロンの大部分を含む遺伝子構築物でトランスフェクトされたHT-1080細胞によっ て培地に分泌されたタンパク質の、ＳＤＳ中でのポリアクリルアミドゲル電気泳 動による分析を示す写真である。 図２は、図１に記載された細胞から培地に分泌されたII型プロコラーゲンが正 確な天然コンホメーションに折りたたまれていることを証明する写真である。 図３は、COL1A1の遺伝子およびCOL1A2の遺伝子で共トランフフェクトされたHT -1080細胞の培地の分析を示す写真である。 図４は、特異的制限エンドヌクレアーゼによる人為的な切断部位を含むように 改変されたヒトＩ型プロコラーゲンのプロα１（Ｉ）鎖のｃＤＮＡの概略図であ る。 図５は、精製されたヒナ鳥プロリル4-ヒドロキシラーゼ（レーン１および４） 、並びにヒトプロリル4-ヒドロキシラーゼのａ−サブユニットおよびＢ−サブユ ニットの遺伝子を発現する、a58/Bウイルス（レーン２および５）またはa59/Bウ イルス（レーン３および６）を感染させたSf9細胞によって培地に分泌されたタ ンパク質の、未変性7.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン１〜３）お よびＳＤＳ中での10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン４〜６）による 分析を示す写真である。a58/Bとa59/Bとは、64塩基対の伸長の差がある。 図６は、Sf9およびHigh Five細胞における組換えヒトIII型プロコラーゲンの 発現を示すゲルである。 図７は、銀染色した５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した、昆虫細胞におけ る組換えヒトＩ型プロコラーゲンの発現を示すゲルである。レーン1は、Ｉ型プ ロコラーゲンのプロα１鎖のみを発現する細胞由来のペプシン消化試料である。 レーン２は、Ｉ型プロコラーゲンのプロα１およびプロα２鎖を共発現する細胞 由来のペプシン消化試料である。 図８は、クーマシー染色した５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した、昆虫細 胞における組換えヒトII型プロコラーゲンの発現を示すゲルである。 図９は、精製されたIII型コラーゲンの還元および非還元条件下でのＳＤＳ− ＰＡＧＥ分析である。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。還元 III型コラーゲン試料をレーン２に、非還元試料をレーン３に示す。分子量マー カーはレーン１で泳動した。三量体α１（III）鎖および単量体α１（III）鎖の 位置を矢印で示す。 図１０は、HighFive昆虫細胞において発現したプロα１（III）鎖の三量体生 成の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。試料を、非還元条件下で５％ＳＤＳ− ＰＡＧＥ上で電気泳動させ、クーマシー染色することによって分析した。レーン １、分子量マーカー；レーン２、細胞抽出物；レーン３、ペプシンで消化した細 胞抽出物：レーン４、１％ＳＤＳに可溶のタンパク質。三量体プロα１（III） 鎖およびα１（III）鎖の位置を矢印で示す。 図１１Ａ〜１１Ｄは、短時間のプロテアーゼ消化によって昆虫細胞において産 生した組換えヒトIII型コラーゲンの熱安定性の分析である。 Ｖ．発明の詳細な説明 Ａ．定義： 「コラーゲン」という用語は、コラーゲンＩ〜XIX型のいずれか、ならびに本 発明の方法にしたがって産生されたあらゆる新規コラーゲンをいう。また、この 用語には、プロコラーゲンとヘテロ−およびホモ−三量体に組み立てられた(ass embled)成熟コラーゲンの両方が包含され、コラーゲン型のいずれかについての プロコラーゲンまたはコラーゲンのあらゆる１本鎖ポリペプチド、および本発明 のコラーゲン構築物のあらゆる組み合わせのヘテロ三量体が包含される。「コラ ーゲン」という用語には、本明細書の文脈が別段指摘していないかぎり、前述の 全てのものが包含されるものである。 「プロコラーゲン」という用語は、三量体組み立て(assembly)、溶解性、精製 またはその他の作用を助ける付加Ｃ−末端および／またはＮ−末端ペプチドを有 しており、後に、Ｎ−プロテイナーゼ、Ｃ−プロテイナーゼまたはその他のタン パク質によって切断される、コラーゲンＩ〜XIX型のいずれか、ならびに本発明 によって産生されたあらゆる新規コラーゲンをいう。 「コラーゲンサブユニット」という用語は、単一の遺伝子によってコードされ るコラーゲンタンパク質ならびに欠失誘導体、保存的置換体等を含む誘導体の１ つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列をいう。 「融合タンパク質」とは、異なるタンパク質由来のペプチド配列が互いに共有 結合しているタンパク質をいう。 「コラーゲン翻訳後酵素」という用語は、プロコラーゲン、コラーゲンまたは コラーゲン分子を含む成分を修飾するあらゆる酵素をいい、限定するものではな いが、プロリル4-ヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、Ｎ−プロテイナーゼ 、リシルヒドロキシラーゼ、およびリシルオキシダーゼが包含される。「コラー ゲン翻訳後酵素」という用語には、本明細書の文脈が別段指摘していないかぎり 、前述の全てのものが包含されるものである。 「感染」という用語は、ウイルスまたはウイルスベクター、好ましくはバキュ ロウイルスまたはSemliki Forestウイルスを用いることによって核酸を生物内に 導入することをいう。 「形質転換」という用語は、ＤＮＡをそのＤＮＡが複製可能なように染色体外 エレメントとして、または染色体組み込みによって生物に導入することを意昧す る。 「トランスフェクション」という用語は、コード配列が実際に発現するか否か にかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。 本明細書中で用いられる「ストリンジェントな条件」という語句は、（１）洗 浄に、低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５ Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ、５０℃を用いる；（２）ハイブリダ イゼーションの際に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アル ブミンを含む５０％(vol/vol)ホルムアミド／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを 含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を４２℃で用いる；または（ ３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣＬ ０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストランサルフェートを４２℃で 用い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃にて洗浄する、ハイブリ ッドダイゼーション条件をいう。 本明細書で用いられる「精製された」という用語は、その指示したコラーゲン またはプロコラーゲンが、その他の生体高分子、例えばポリヌクレオチド、タン パク質などを実質的に含まない状態で存在することを示す。本明細書で用いられ る「精製された」という用語は、指示した生体高分子が、好ましくは少なくとも 95重量％、より好ましくは少なくとも99.8重量％存在することを意味するもので ある（しかし、水、緩衝液、およびその他の小さい分子、特に、分子量が1000ダ ルトン未満の分子は存在してもよい）。 本明細書で用いられる「単離された」という用語は、そのタンパク質分子の天 然供給源中に存在するその他のタンパク質のみならず、それ以外のタンパク質か らも分離されたタンパク質分子をいい、好ましくは、（もし存在するとしても） 溶媒、緩衝液、イオン、またはそのタンパク質分子の溶液に通常存在するその他 の成分のみの存在下で見出されるタンパク質をいう。「単離された」および「精 製された」という用語には、それらの天然供給源中に存在するタンパク質は包含 されない。 Ｂ．本発明に関連する核酸 本発明にしたがって、あらゆるコラーゲンサブユニットまたはその機能的等価 物をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、適切な宿主細胞中で、そのコラ ーゲンサブユニットまたはその機能的等価物の発現を指令する組換えＤＮＡ分子 を作製し得る。本発明の好ましい実施態様は、ヒトコラーゲンまたはその機能的 等価物をコードするポリヌクレオチド配列に関する。また、本発明の好ましい実 施態様としては、Ｉ型、IV型、XIII型、XV型およびXVIII型のコラーゲンサブユ ニットまたはその機能的等価物のポリヌクレオチド配列も挙げられる。 公知のコラーゲン型をコードする核酸配列は、一般的に当技術分野において記 述されている。例えば、Fukaiら，Methods of Enzymology 245:3-28(1994)およ びそこに引用された参考文献を参照されたい。新規コラーゲン／プロコラーゲン または核酸配列が入手できない公知のコラーゲン／プロコラーゲンは、「新規の 」型のコラーゲンを有し、検出可能なレベルでその新規コラーゲンを発現すると 考えられる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。例えば、ｃ ＤＮＡライブラリーは、新規コラーゲンを発現することが知られた細胞系からポ リアデニル化ｍＲＮＡを得ることによって構築することができ、あるいはその組 織／細胞型に対して以前に作られたｃＤＮＡライブラリーを使用することがで きた。ｃＤＮＡライブラリーは適当な核酸プローブを用いてスクリーニングされ 、および／または該ライブラリーはその他のコラーゲンを特異的に認識する適当 なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてスクリーニングされる。適 当な核酸プローブとしては、同一または異なる種由来の新規コラーゲンの公知の 部分をコードするオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。その他の適当なプ ローブとしては、限定するものではないが、同一または類似の遺伝子、および／ または相同ゲノムＤＮＡまたはその断片をコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤ ＮＡ、またはその断片が挙げられる。選択されたプローブによるｃＤＮＡまたは ゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら，Molecular Cloning:A La boratory Manual，ニューヨーク，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 の第10−12章に記載された手順のような当業者に公知の標準手順を用いて行なわ れ得る。新規コラーゲンを同定するためのその他の手段には、直接発現クローニ ングまたは1987年７月28日に特許された米国特許第4,683,195号、またはSambroo kら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，ニューヨーク，Cold Spring Ha rbor Laboratory Press，1989の第14節、またはCurrent Protocols in Molecula r Biology，Ausubelら編集，Greene Publishing Assosiates and Wiley-Intersc ience 1991の第15章に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用 などの、組換えＤＮＡ技術についての公知の技術が含まれる。 本発明にしたがって用い得る改変ＤＮＡ配列としては、同一または機能的に等 価の遺伝子産物をコードする配列になる種々のヌクレオチド残基の欠失体、付加 物または置換体が挙げられる。遺伝子産物自体がコラーゲン配列内にアミノ酸残 基の欠失、付加または置換を含んでいてもよく、それらによって機能的に等価の コラーゲンになる。 本発明の核酸配列は、コラーゲンコード配列を種々の末端について改変するた めに操作し得るが、それには、限定するものではないが、プロセッシングおよび 遺伝子産物の発現を変更する改変が含まれる。例えば、天然ヒト分泌シグナルを 代替の分泌シグナルで置き換えてもよく、および／または、新たな制限部位の挿 入や、グリコシル化パターン、リン酸化等の変更のために、当技術分野で周知の 技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異を生じさせてもよい。さ らに、非ヒト細胞において発現させる場合、特定の宿主生物のコドンの利用頻度 (codon preference)により適合するように、本発明のコラーゲンをコードするポ リヌクレオチドは、あらゆるトリプレットアミノ酸コドンのサイレント位置にお いて改変し得る。 本発明の核酸配列は、さらに、すでに記載されているコラーゲンおよび断片の 変異体をコードする配列に関する。天然コラーゲンおよびコラーゲン断片のこれ らのアミノ酸配列変異体は、当技術分野で公知の方法により、適当なヌクレオチ ド変更を、天然または変異体コラーゲンをコードするポリヌクレオチドに導入す ることによって調製され得る。アミノ酸配列変異体の構築物には２つの変動要素 (variables)、すなわち突然変異の位置および突然変異の種類がある。コラーゲ ンのアミノ酸配列変異体は、好ましくは、天然では生じないアミノ酸配列が得ら れるようにポリヌクレオチドを突然変異させることによって構築される。これら のアミノ酸改変は、異なる種由来のコラーゲンで異なる部位（可変位置）で、ま たは高度保存領域（定常領域）において行うことができる。そのような位置にあ る部位は、典型的には、例えば、まず保存的選択で置換し（例えば疎水性アミノ 酸を異なる疎水性アミノ酸に置換する）、次いでより遠縁の選択で置換する（例 えば疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸に置換する）ことによって連続して変更され 、その後標的部位に欠失または挿入が行なわれ得る。 アミノ酸は、その側鎖の特性（極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および ／または両親媒性）に基づいてグループ分けされる：（１）疎水性（leu、met、 ala、ile）、（２）中性疎水性（cys、ser、thr）、（３）酸性（asp、glu）、 （４）弱塩基性（asn、gln、his）、（５）強塩基性（lys、arg）、（６）鎖の 配向に影響を及ぼす残基（gly、pro）、および（７）芳香族（trp、tyr、phe） 。保存的変化には、「本来の」アミノ酸と同じグループ内にあるアミノ酸位置の 変異体が包含される。適度に保存的な変化には、「本来の」アミノ酸に密接に関 連したグループ内にあるアミノ酸位置の変異体（例えば、中性疎水性のものを弱 塩基性のものにする）が包含される。非保存的変化には、「本来の」アミノ酸と は遠縁にあるグループ内にあるアミノ酸位置の変異体（疎水性アミノ酸を強塩基 性または酸性アミノ酸にする）が包含される。 アミノ酸配列の欠失は、一般的に約１〜30残基の範囲であり、好ましくは約１ 〜10の範囲であり、典型的には連続している。アミノ酸の挿入としては、１残基 から100残基以上の長さのアミノ−および／またはカルボキシ−末端の融合、な らびに１個のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる 。配列内挿入は、一般的に約１〜10アミノ酸残基、好ましくは１〜５残基の範囲 であり得る。末端挿入としては、例えば、異なる宿主細胞における分泌または細 胞内ターゲティングに必要な異種シグナル配列が挙げられる。 好ましい方法においては、コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを、部位 特異的突然変異誘発によって変化させる。この方法は、所望のアミノ酸変異体の ポリヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、ならびに変更され る部位のいずれか一方の側に安定な二重鎖を形成するのに十分な変更されたアミ ノ酸の両側にある隣接ヌクレオチドを使用する。一般に、部位特異的突然変異誘 発の技術は当業者には周知であり、かかる技術はEdelmanら，DNA 2:183(1983)な どの刊行物に例示されている。ポリヌクレオチド配列中に部位特異的変化を生じ させるための融通のきく有効な方法は、ZollerおよびSmith，Nucleic Acids Res ．10:6487-6500(1982)に公表されている。 コラーゲンのアミノ酸配列変異体を作製するのにＰＣＲも使用し得る。少量の 鋳型ＤＮＡを出発原料として用いる場合、鋳型ＤＮＡの対応領域とは配列がわず かに異なるプライマーによって所望のアミノ酸変異体を作製することができる。 ＰＣＲ増幅によって、コラーゲンをコードするポリヌクレオチド鋳型とはプライ マーによって特定された位置において異なっている産物ＤＮＡ断片群が得られる 。産物ＤＮＡ断片がプラスミド内の対応領域に取って代わり、これが所望のアミ ノ酸変異体を生じさせる。 アミノ酸変異体を作製するための更なる技術は、Wellsら，Gene 34:315(1985) に記載されたカセット突然変異誘発技術;ならびに、例えばSambrookら（上述） およびCurrent Protocols in Molecular Biology，Ausubelら（上述）に記載さ れた技術などの当技術分野で周知のその他の突然変異誘発技術である。 本発明の別の実施態様においては、融合タンパク質をコードするようにコラー ゲン配列を異種配列に連結してもよい。例えば、（３（IX）コラーゲンが異種部 分から切断され得るように、融合タンパク質を操作して（３（IX）コラーゲン配 列と異種タンパク質配列の間に位置する切断部位を含ませてもよい。 遺伝暗号の固有の縮重により、本発明の実施においては、実質的に同一または 機能的に等価のアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を、クローニング およびこれらのコラーゲンタンパク質の発現に用いてもよい。そのようなＤＮＡ 配列としては、ストリンジェントな条件下で適切なヒトコラーゲン配列にハイブ リダイズすることができるものが挙げられる。 Ｃ．コラーゲン修飾ポリペプチドおよび対応する核酸配列 天然で産生される場合、コラーゲンは、共同して少なくとも１つの三重らせん ドメインを形成する１以上のコラーゲンサブユニットからなる構造タンパク質で ある。コラーゲンサブユニットをプロコラーゲンまたはその他の前駆体分子に変 換し、次いで成熟コラーゲンに変換するために、種々の酵素が利用される。その ような酵素としては、プロリル4-ヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、Ｎ− プロテイナーゼ、リシルオキシダーゼおよびリシルヒドロキシラーゼが挙げられ る。 4-ヒドロキシプロリン残基は、新たに合成されたポリペプチド鎖の三重らせん 分子への折りたたみを安定化するので、プロリル4-ヒドロキシラーゼは全コラー ゲンの生合成において中心的な役割を果たす。Prockopら，Annu．Rev．Biochem ．64:403-434(1995);Kivirikkoら，「タンパク質の翻訳後修飾(Post-Translatio nal Modifications of Proteins)」，pp.1-51(1992);Kivirikkoら，FASEB J．3: 1609-1617(1989)を参照されたい。例えば、組換えプロリル4-ヒドロキシラーゼ の不存在下でIII型プロコラーゲンのプロα１鎖を昆虫細胞中で発現させた場合 、かなりの量のプロコラーゲンがその細胞中に作られ、22℃におけるプロテアー ゼ分解に対するコラーゲンのコラーゲン性ドメインの抵抗性によって示されるよ うに、プロα鎖は三重らせん分子を形成した。しかしながら、かかる分子の三重 らせんのTmは、組換えプロリル4-ヒドロキシラーゼの存在下で産生させたプロコ ラーゲンよりも約６℃低かった。また、III型コラーゲンの発現レベルは、組換 えプロリル4-ヒドロキシラーゼの存在下よりもその不存在下のほうが低かった。 α２ホモ二量体であるリシルヒドロキシラーゼは、コラーゲンの翻訳後修飾を 触媒してコラーゲン中にヒドロキシリシンを形成させる。一般的に、Kivlrikko ら，「タンパク質の翻訳後修飾」，Harding，J.J.およびCrabbe，M.J.C.編集，C RC Press，ボッカレートン(Boca Raton)，フロリダ州(1992);Kivirikko，Princi ples of Medical Biology，第３巻，Cellular Organelles and the Extracellul ar Matrix，Bittar，E.E.およびBittar，N.,編集，JAI Press，グリーンウィッ チ(Greenwich)，グレートブリテン(1995)を参照されたい。 Ｃ−プロテイナーゼは、コラーゲン分子の三重らせんの組み立てを助けるが、 その三重らせんの一部ではないプロコラーゲンのＣ−末端を切除することによっ て組み立てプロコラーゲンを切断する。一般的に、Kadlerら，J．Biol．Chem．2 62:15969-15701(1987)，Kedlerら，Ann．NY Acad．Sci．580:214-224(1990)を参 照されたい。 Ｎ−プロテイナーゼは、コラーゲン三重らせんの組み立てを助けるが、その三 重らせんの一部ではないプロコラーゲンのＮ−末端を切除することによって組み 立てプロコラーゲンを切断する。一般的に、Hojinaら，J．Biol．Chem．269:113 81-11390(1994)を参照されたい。 リシルオキシダーゼは、特定のリシンおよびヒドロキシリシン残基のε−アミ ノ基の酸化的脱アミノ反応を触媒して反応性アルデヒドを形成する細胞外銅酵素 である。次いで、かかるアルデヒドは、アルドール縮合してアルドールを形成し 、コラーゲン原繊維を架橋する。リシルオキシダーゼのＤＮＡおよびタンパク質 配列についての情報は、Kivirikko，Principles ofM edical Biology，第３巻， Cellular Organelles and the Extracellular Matrix，Bittar，E.E.およびBitt ar，N.,編，JAI Press，グリーンウィッチ，グレートブリテン(1995)，Kagan，P ath．Res．Pract．190:910-919(1994)，Kenyonら，J．Biol．Chem．268(25):184 35-18437(1993)，Wuら，J．Biol．Chem．267(34):24199-24206(1992)，Marlani ら，Matrix 12(3):242-248(1992)，およびHamalainenら，Genomics 11(3):508-5 16(1991)などに見出すことができる。 これらのいくつかの翻訳後酵素をコードする核酸配列が報告されている。Vuor iら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA89:7467-7470(1992);Kesslerら，Science 271 :360-362(1996)を参照されたい。また、種々の翻訳後酵素をコードする核酸配 列は、一般的に上記したような方法にしたがって決定してもよく、適当なプロー ブおよび核酸ライブラリーの使用が含まれる。 Ｄ．組換え体コラーゲンの発現のための宿主ベクター系 本発明のコラーゲンおよび関連するコラーゲン翻訳後酵素を発現させるために 、コラーゲンまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現 ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント 、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には複製および翻訳に必要なエレメント を含有するベクターに挿入する。 当業者に周知の方法を用いて、本発明のコラーゲンについてのコラーゲンコー ド配列および適切な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築すること ができる。そのような方法としては、in vitro組換えＤＮＡ法、合成法、および in vivo組換え／遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら，Molecular C loning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク( 1989)およびAusubelら，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub lishing Associates and Wiley Intersciece，ニューヨーク(1990)を参照された い。 種々の宿主−発現ベクター系を利用してコラーゲンコード配列を発現させ得る 。かかるベクター系としては、限定するものではないが、プロコラーゲンまたは コラーゲンコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミド ＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物； プロコラーゲンまたはコラーゲンコード配列を含有する組換え酵母または菌類発 現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌；本発明のプロコラーゲンまたは コラーゲンをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバ キュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；プロコラーゲンまたはコラーゲンコ ード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイ クウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染させた植物細胞系 または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換され た植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。これらの系の発現エレメントは 、その強さおよび特異性の点で相違する。用いる宿主／ベクター系に依存して、 構成的および誘導プロモーターを含む多数の適当な転写および翻訳エレメントの い ずれもがその発現ベクターに用いられ得る。例えば、細菌系においてクローニン グする場合、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリ ッドプロモーター）などの誘導プロモーターを用いることができ；昆虫細胞系に おいてクローニングする場合、バキュロウイルス多角体プロモーターなどのプロ モーターを用いることができ；植物細胞系においてクローニングする場合、植物 細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば熱ショックプロモーター、ＲＵＢＩＳ ＣＯの小サブユニット用のプロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用 のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えばＣａＭＶの３ ５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を用いる ことができ；哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲ ノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動 物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワク シニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を用いることができ；コラーゲンＤＮＡ の複数コピーを含有する細胞系を作製する場合、ＳＶ４０、ＢＰＶおよびＥＢＶ に基づくベクターを適切な選択マーカーとともに用いることができる。 細菌系においては、発現するコラーゲンに対して使用目的に応じて、多数の発 現ベクターが有利に選択され得る。例えば、抗体の産生のために本発明のコラー ゲンを大量に産生させたい場合、容易に精製される融合タンパク質産物を高レベ ルに発現することを指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては 、限定するものではないが、Ｅ．コリ発現ベクターpUR278(Rutherら，EMBO J．2 :1791(1983)）（ここで、コラーゲンコード配列は、ハイブリッドAS-lac Zタン パク質が産生されるように、そのベクターに、lac Zコード領域と読み枠を合わ せて連結され得る。）；pINベクター(Inouyeら，Nucleic Acids Res．13:3101-3 109(1985);Van Heekeら，J．Biol．Chem．264:5503-5509(1989)）などが挙げら れる。また、pGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トラ ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一般的 に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビー ズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出を行うことによって溶解 細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンまたはＸａ 因子プロ テアーゼ切断部位を含み、そのことによって目的のクローン化ポリペプチドをＧ ＳＴ部分から放出するように設計される。 好ましい発現系は酵母発現系である。酵母においては、構成的または誘導プロ モーターを含有する多くのベクターが用いられ得る。概説として、Current Prot ocols in Molecular Biology，第２巻，Ausubelら編集，Greene Publish．Assoc ．& Wiley Interscience，第１３章(1988);Grantら，Expression and Secretion Vector for Yeast，in Methods in Enzymology，Wu & Grossman編集，Acad Pre ss，ニューヨーク153:516-544(1987);Glover，DNA Cloning，第１１巻，IRL Pre ss，ワシントンD.C.，第３章(1986);Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger & Kimmel編集，Acad．Press，ニュー ヨーク 152:673-684(1987);およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccha romyces，Strathernら編集，Cold Spring Harbor Press，第ＩおよびＩＩ巻(198 2)を参照されたい。 本発明のコラーゲンタンパク質のクローニングおよび発現に有用な特に好まし い系では、ピキア属(Pichia)酵母由来の宿主細胞が用いられる。ピキア・パスト リス(Pichia Pastoris)などの非サッカロミセス属酵母種は、スケールアップし た手順で組換えタンパク質を高収量で産生させることにおいて特別な利点を有す るようである。さらに、ピキア属発現キットは、Invitrogen Corporation（サン ディエゴ、カリフォルニア州）から市販されている。 ピキア・パストリスなどのメチロトローフ酵母には、多数のメタノール応答遺 伝子が存在し、各々の発現はメタノール応答調節領域（プロモーターともいう） によって制御されている。そのようなメタノール応答プロモーターのいずれもが 、本発明の実施における使用に適している。特異的な調節領域の例としては、ピ キア・パストリス由来の第一級アルコールオキシダーゼ遺伝子AOX1のプロモータ ー、P.パストリス由来の第二級アルコールオキシダーゼ遺伝子AX02のプロモータ ー、P.パストリス由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DAS)のプロモ ーター、P.パストリス由来のP40遺伝子のプロモーター、P.パストリス由来のカ タラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。 ピキア・パストリスにおける典型的な発現は、厳重に調節されたAOX1遺伝子由 来のプロモーターによって得られる（Ellisら，Mol．Cell Biol．5:1111(1985) および米国特許第4,855,231号参照）。培養物にメタノールを添加した後、この プロモーターを誘導して、組換えタンパク質を高レベルで産生させることができ る。続いて、同一の細胞を操作することによって、組換えタンパク質がプロリル ４−ヒドロキシラーゼによって十分にヒドロキシル化され、したがって原繊維形 成におけるそのタンパク質の正常な生物学的機能に必要な安定なヘリックスに折 りたたまれることが可能な条件下で、本明細書に記載された本発明のコラーゲン に対する遺伝子の発現を行う。 別の特に好ましい酵母発現系は、メチロトローフ酵母であるハンセヌラ・ポリ モルファ(Hansenula polymorpha)を使用する。メタノール上での増殖の結果、メ タノール代謝の重要な酵素、すなわちＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）、ＤＡ Ｓ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）およびＦＭＨＤ（ホルメートデヒドロゲ ナーゼ）が誘導されることになる。これらの酵素は、全細胞タンパク質の最大３ ０〜４０％を構成することができる。ＭＯＸ、ＤＡＳおよびＦＭＤＨ産生をコー ドする遺伝子は、メタノール上での増殖によって誘導され、かつグルコース上で の増殖によって抑制される、非常に強力なプロモーターによって制御される。こ れらの３つのプロモーターのいずれかまたは全部を用いてH.ポリモルファにおけ る高レベルの異種遺伝子の発現が得られ得る。本発明のコラーゲンをコードする 遺伝子は、誘導H.ポリモルファ・プロモーターの制御下で発現ベクターにクロー ニングされる。産物の分泌が望ましい場合、S.セレビシエ(S.cerevisiae)プレプ ロ交配α１因子などの、酵母における分泌についてのシグナル配列をコードする ポリヌクレオチドを、本発明のコラーゲンのコード配列と同じ読み枠で融合させ る。発現ベクターは、好ましくは、URA3またはLEU２などの栄養要求性マーカー 遺伝子を含有し、この遺伝子は、栄養要求性宿主の栄養不足を補うために用いら れ得る。 次いで、発現ベクターを用い、当業者に公知の技術を用いてH.ポリモルファ宿 主細胞を形質転換する。H.ポリモルファ形質転換の興味深い有用な特徴は、最大 １００コピーの発現ベクターのゲノムへの自発的な組込みである。大部分の場合 、組み込まれたＤＮＡは、頭−尾配置を示す多量体を形成する。組み込まれた外 来 ＤＮＡは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株において有糸分裂的に安 定であることがわかっている。この高コピー組込みの現象が、その系の高生産力 にさらに加わる。 また、糸状菌を用いることによって本発明のコラーゲンを産生することも可能 である。糸状菌中で組換えタンパク質を発現および/または分泌させるためのベ クターは周知であり、当業者は、これらのベクターを用いて組換えコラーゲンを 発現させることができるであろう。 植物発現ベクターを用いる場合、本発明のコラーゲンをコードする配列の発現 は、多数のプロモーターの何れかによって誘導され得る。例えば、ＣａＭＶの３ ５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター(Bri ssonら，Nature 310:511-514(1984)またはＴＭＶのコートタンパク質プロモータ ー（Takamatsuら，EMBO J．6:307-311(1987)）を用いることができ；あるいは、 ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットなどの植物プロモーター(Coruzziら，EMBO J．3:1671-1680(1984));Broglieら，Science 224:838-843(1984);または熱ショ ックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell Biol．6:559-565(1986)を用いることができる。これらの構築物は、Tiプラスミ ド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロイン ジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて植物細胞内に導入すること ができる。そのような技術の概説として、例えば、Weissbach & Weissbach，Met hods for Plant Molecular Biology，Academic Press，ニューヨーク，第VIII節 ，pp.421-463(1988);およびGrierson & Corey，Plant Molecular Biology，第２ 版，Blackie，ロンドン，第７−９章(1988)を参照されたい。 本発明のコラーゲンを発現させるのに用いることができる別の発現系は、昆虫 系である。１つのそのような系においては、オートグラファ・カリフォルニカ(A utographa californica)核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用 いて外来遺伝子を発現させる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spo doptera frugiperda)細胞中で増殖する。本発明のコラーゲンのコード配列は、 ウイルスの非必須領域（例えば多角体遺伝子）にクローニングすることができ、 ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多角体プロモーター）の制御下に置かれ得る。 コラ ーゲンコード配列の挿入が成功した場合、多角体遺伝子が不活性化され、非閉塞 性(non-occluded)組換えウイルス（すなわち多角体遺伝子によってコードされる タンパク様の外皮がないウイルス）が産生される。次いで、これらの組換えウイ ルスを用いてスボドプテラ・フルギペルダ細胞に感染させ、そこにおいて挿入さ れた遺伝子が発現する（例えば、Smithら，J．Virol．46:584(1983);Smith，米 国特許第4,215,051号参照）。この発現系のさらなる例は、Current Protocols i n Molecular Biology，第２巻，Ausubelら編集，Greene Publish．Assoc．& Wil ey Interscienceに見出すことができる。 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づいた発現系が利用され得 る。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、本発明のコラーゲン についてのコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プ ロモーターおよび三文節リーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝 子はin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得 る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）における挿入の 結果、感染宿主において生存可能且つコラーゲンを発現することが可能な組換え ウイルスになる（例えばLogan & Shenk，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3655- 3659(1984)）。一方、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを用いてもよい（例えば Mackettら，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415-7419(1982);Mackettら，J .Virol.49:857-864(1984);Panicaliら，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 79:4927-49 31(1982)参照）。 挿入されたコラーゲンコード配列の効率のよい翻訳には、特異的な開始シグナ ルも必要であり得る。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接 配列が挙げられる。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含むコラーゲン遺伝 子全体を適切な発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要 ではない。しかしながら、コラーゲンコード配列の一部分のみを挿入する場合、 ATG開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを付与しなければならない。さら に、確実に挿入断片全体を翻訳するために、開始コドンはコラーゲンコード配列 の読み枠を有する相内に存在しなければならない。これらの外因性翻訳調節シグ ナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源由来のものであり得 る。 発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを 含ませることによって高められ得る（Bittnerら，Methods in Enzymol．153:516 -544(1987)参照）。 好ましくは、本発明のコラーゲンは分泌タンパク質として発現する。タンパク質 の発現に用いる操作された細胞が非ヒト宿主細胞である場合、コラーゲンタンパ ク質のヒト分泌シグナルペプチドを、宿主細胞の分泌ターゲティング機構によっ てより効率的に認識される別の分泌シグナルペプチドで置換するのが都合がよい ことが多い。その適切な分泌シグナル配列は、哺乳動物遺伝子の最適な菌類発現 を得ることにおいて特に重要である。例えば、メチロトローフ酵母においては、 読み枠内S.cerevisiaeα−交配因子プレプロ配列をコードするＤＮＡ配列は、コ ード配列のアミノ末端に挿入され得る。ａＭＦプレプロ配列は、ａＭＦ前駆体分 子に含まれるリーダー配列であり、タンパク質分解プロセッシング及び分泌に必 要なlys-argコード配列を含む（Brakeら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，81:46 42(1984)参照）。原核細胞、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞 についてのその他のシグナル配列は当技術分野では周知であり、当業者は宿主細 胞に適したえり抜きのシグナル配列を容易に選択することができるであろう。 本発明のベクターは宿主細胞中で自律的に複製し得るか、宿主染色体に組み込 まれ得る。自律的複製配列（「ars」）を有する適当なベクターは、種々の細菌 （pBR322由来のarsは、グラム陰性菌の大部分において機能する）、酵母（２μ プラスミドars）、および原核生物および真核生物の両方に対する種々のウイル ス複製配列（原核生物：λ、Ｔ偶数系ファージ、M13など：真核生物：アデノウ イルス、SV40、ポリオーマ、VSVまたはBPV、ワクシニアなど）に対して周知であ る。ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡに見出される配列と相同であるＤＮＡ配 列を有する場合、そのベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。 本発明のベクターは、一定の条件下での宿主細胞の増殖および生存に必要な産 物をコードする、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子もコードする。典型的な 選択遺伝子としては、（１）抗性物質およびその他の毒素（例えば、テトラサイ クリン、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を 付与するタンパク質、および（２）宿主細胞の栄養要求性を補うタンパク質をコ ードする遺伝子などが挙げられる。選択遺伝子のその他の例としては、単純ヘル ペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，Cell 11:223(1977)）、ヒポキサン チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalskaら，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 48:2026(1962))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ(Lowyら，Cell 22:817(1980))遺伝子が挙げられ、それぞれ、tk-、hgprt-ま たはaprt-細胞中で用いることができる。また、dhfr（メトトレキセートに対す る耐性を付与する）（Wiglerら，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567(1980);O'Hara ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527(1981)）；gpt（ミコフェノール酸に 対する耐性を付与する）(Mulliganら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072(19 81))；neo（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Colberre- Garapinら，J．Mol．Biol．150:1(1981)）：およびhygro（ハイグロマイシンに 対する耐性を付与する）(Santerreら，Gene30:147(1984))についての選択の基礎 としてアンチメタボライト抵抗性も用いることができる。最近、さらなる選択遺 伝子、すなわちtrpB（細胞にトリプトフアンの代わりにインドールを利用させる ）；hisD（細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させる）(Hartmanら ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047(1988))；およびＯＤＣ（オルニチンデ カルボキシラーゼ）(オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフル オロメチル）−DL-オルニチンＤＦＭＯに対する耐性を付与する）(McConlogue L .，In:Current Communicationin Molecular Biology)，Cold Spring Harb or La boratory編(1987))が記載されている。 さらに、本発明の発現ベクターに必要な調節エレメントとしては、例えばプロ モーターおよびエンハンサーなどの転写を開始するための配列が挙げられる。プ ロモーターは構造遺伝子の開始コドンの上流に位置する非翻訳配列であり、その プロモーターの調節下で核酸の転写は調節される。誘導プロモーターは、例えば 栄養素が存在する、存在しないなどの培養条件の変化に応じて転写開始のそれら のレベルを変更するプロモーターである。当業者は、本発明に適した宿主細胞に おいて認識される多数のプロモーターについて知っているであろう。これらのプ ロモーターは、その天然遺伝子からプロモーターを取り出し、そのプロモーター 配列の3'にコラーゲンをコードするＤＮＡを配置することによってコラーゲンを コードするＤＮＡに作動可能なように連結される。本発明において有用なプロモ ーターとしては、限定するものではないが下記のものが挙げられる：（原核生物 ）（１）ラクトースプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、トリ プトファンプロモーター、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモー ター、（酵母）（２）3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、その他の 解糖酵素プロモーター（ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス ホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼなど）、アルコールデ ヒドロゲナーゼのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、マルトースプ ロモーター、およびガラクトースプロモーター、（真核生物）（３）実質的に全 ての真核性遺伝子は転写が開始される部位の約25〜30塩基上流に位置するAT-富 化領域を有しており、適当な真核性プロモーターとしては、例えば、ウイルスポ リオーマ、鶏痘、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイ トメガロウイルス、レトロウイルス、SV40由来のプロモーター、ならびにアスペ ルギルス(Aspergillus)由来のグルコアミラーゼプロモーター、哺乳類由来のア クチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターおよび天然コラーゲンプ ロモーターなどの標的の真核生物由来のプロモーターが挙げられる。例えば、de Boerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:21-25(1983),Hitzemanら，J．Biol． Chem．255:2073(1980)，Fiersら，Nature 273:113(1978)，MulliganおよびBerg ，Science 209:1422-1427(1980)，Pavlakisら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78 :7398-7402(1981)，Greenwayら，Gene 18:355-360(1982)，Grayら，Nature 295: 503-508(1982),Reyesら，Nature 297:598-601(1982)，CanaaniおよびBerg，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 79:5166-5170(1982)，Gormanら，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 79:6777-6781(1982)，Nunbergら，Mol．and Cell．Biol．11(4):2306-2 315(1984)を参照されたい。 プロモーターからのコラーゲンコードＤＮＡの転写は、しばしばそのベクター 内にエンハンサー配列を挿入することによって増大される。エンハンサーは、通 常、約10〜300bpのcis-作用性エレメントであり、プロモーターで転写開始速度 を増大させるように作用する。真核生物および原核生物の両方に対して多数のエ ンハンサーが知られており、当業者は興味の対象である宿主細胞に適当なエンハ ンサーを選択することができるであろう。真核性エンハンサーについてはYaniv ，Nature 297:17-18(1982)を参照されたい。 さらに、挿入された配列の発現をモジュレートし、または所望の特定の様式で 遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択してもよい。その ようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例 えば切断）は、そのタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞 は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的で特異的な機 構を有している。発現した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを 確保するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的 のために、一次転写産物の適当なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子 産物のリン酸化についての細胞機構を有する真核宿主細胞が用いられ得る。その ような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ 、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等が挙げられる。さ らに、コラーゲン分子の正確なプロセッシングを確保するために、宿主細胞は、 種々の酵素を発現するように操作され得る。例えば、プロリル−４−ヒドロキシ ラーゼの遺伝子が、宿主細胞においてコラーゲン遺伝子とともに共発現され得る 。 組換えタンパク質を長期にわたって高収量で産生させるには、安定な発現が好 ましい。例えば、本発明のコラーゲンを安定に発現する細胞株が操作され得る。 ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現調節 エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、 ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって調節されるコラーゲンを コードするＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの 導入後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させて、次いで選択培地 に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を付 与するものであり、細胞におけるその染色体へのプラスミドの安定な組み込みを 可能にし、増殖して、その後細胞系にクローニングされ、拡大され得るフォーカ スを形成する。この方法は、所望のコラーゲンを発現する細胞株の操作に都合よ く用いられ得る。 Ｅ．感染、形質転換およびトランスフェクション 上記の発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクト、または好ましくは 感染もしくは形質転換し、コラーゲンをコードするベクターを含む形質導入体ま たは形質転換体の選択に適した栄養培地中で培養する。 コード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少な くとも４つの一般的なアプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ ハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無：（ｃ）宿主細 胞におけるコラーゲンｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写のレベルの 評価；および（ｄ）イムノアッセイまたはその生物学的活性によって測定される 遺伝子産物の検出、によって同定され得る。 第１のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入されたコラーゲンコード配 列の存在を、コラーゲンコード配列、またはその一部若しくは誘導体に相同のヌ クレオチド配列を含むプローブを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ ハイブリダイゼーションによって検出することができる。 第２のアプローチにおいては、組換え発現ベクター／宿主系を、ある「マーカ ー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メト トレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体 形成(occlusion body formation)など）の有無に基づいて同定し、選択すること ができる。例えば、コラーゲンコード配列がそのベクターのマーカー遺伝子配列 内に挿入されている場合、コラーゲンコード配列を含有する組換え細胞は、その マーカー遺伝子機能が無いことによって同定することができる。あるいは、マー カー遺伝子は、コラーゲンコード配列の発現を制御するために用いられる同一ま たは異なるプロモーターの制御下でコラーゲン配列とタンデムに置くことができ る。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、コラーゲンコード配列の発現 を示すものである。 第３のアプローチにおいては、コラーゲンコード領域の転写活性をハイブリダ イゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡを単離し てコラーゲンコード配列またはその特定の部分に相同のプローブを用いてノザン ブロットによって分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し てかかるプローブへのハイブリダイゼーションをアッセイしてもよい。 第４のアプローチにおいては、例えば、ウェスタンブロット、放射性免疫沈降 、酵素結合イムノアッセイなどのイムノアッセイなどによってコラーゲンタンパ ク質産物の発現を免疫学的に評価することができる。 Ｆ．コラーゲンの精製 発現した本発明のコラーゲンは、好ましくは培養培地に分泌されるが、例えば クロマトグラフィーによって均一に精製される。１つの実施態様においては、組 換えコラーゲンタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製され る。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィ ーを含む当該分野で公知のその他の精製技術も用いることができる。例えば、Ma niatisら，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratory，N.Y．(1989)，Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)，およびS copes，Protein Purification:Principles and Practice，Springer-Verlag New York，Inc.，NY(1994)を参照されたい。 本発明をさらに下記の実施例によって説明するが、それらの実施例はいかなる 点においても本発明を限定するものではない。 VI．実施例 Ａ．実施例１：ヒトII型プロコラーゲンの合成 本発明において使用された組換えＣＯＬ１Ａ１遺伝子作製体は、ＣＯＬ２Ａ１ 遺伝子のエキソン３〜５４に融合した、プロモーター、エキソン１およびイント ロン１を有するＣＯＬ１Ａ１の５’末端の断片からなっていた。このハイブリッ ド作製体を、ＨＴ−１０８０細胞中にトランスフェクションした。これらの細胞 は、ネオマイシン耐性遺伝子で同時トランスフェクションして、ネオマイシン類 似体のＧ４１８の存在下で培養した。このハイブリッド作製体を使用してトラン スフェクション細胞を作製した。 ヒトII型プロコラーゲンのｍＲＮＡを合成する一連のクローンを得た。合成さ れたタンパク質を分析するために、細胞を［¹⁴Ｃ］プロリンと共にインキュベー トして、培地タンパク質をオートラジオグラフィー（蓄積リン光フィルム分析器 （storage phosphor film analyzer））により分析できるようにした。 図１に示されるように、レーン１は、未精製培地タンパク質が３つの主要なポ リペプチド鎖からなることを示している。具体的には、培地タンパク質は、ｐｒ ｏａｌ（II）鎖からなる目的のII型プロコラーゲンを、細胞により通常合成され るIV型コラーゲンのｐｒｏα１（IV）およびプロα２（IV）鎖と共に含有してい た。上の２つは、作製体によりトランスフェクションされなかった細胞により合 成されたIV型コラーゲンのｐｒｏａｌ（IV）およびｐｒｏα２（IV）鎖である。 第３のバンドは、作製体から合成されたヒトII型プロコラーゲンのｐｒｏａｌ（ II）鎖である。レーン２および３は、培地をイオン交換カラムでクロマトグラフ ィー後の同じ培地タンパク質である。レーン２および３に示されるように、II型 プロコラーゲンは、単一工程のイオン交換クロマトグラフィーにより容易に精製 された。 培地中に分泌されたII型プロコラーゲンは、プロテアーゼ−熱安定性試験によ り正しく折り畳まれた。図２に示されるように、培地タンパク質は、正しく折り 畳まれた三重らせんプロコラーゲンまたはコラーゲンは消化に抵抗するが、折り 畳まれていないかまたは不適当に折り畳まれたプロコラーゲンまたはコラーゲン は小断片に消化される条件下で、高濃度のトリプシンとキモトリプシンによリ 表示温度で消化された。次に消化の生成物を、ＳＤＳ中のポリアクリルアミドゲ ル電気泳動および蛍光間接撮影法により分析した。結果は、II型プロコラーゲン が、４３℃（II型プロコラーゲンがほどける通常温度である）まで消化に抵抗し たことを示している。したがって、II型プロコラーゲンは、正しく折り畳まれて おり、コラーゲン線維を作製するために使用することができる。 Ｂ．実施例２：ヒトＩ型プロコラーゲンの合成 第２の実施例として、ＨＴ−１０８０細胞をＣＯＬ１Ａ１遺伝子とＣＯＬ１Ａ ２遺伝子により同時トランスフェクションした。両方の遺伝子は、完全長ｃＤＮ Ａに結合したサイトメガロウイルスプロモーターからなっていた。ＣＯＬ１Ａ２ 遺伝子作製体は、ネオマイシン耐性遺伝子を含有したが、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子作 製体は含有していなかった。細胞は、ネオマイシン類似体のＧ４１８の存在下で の増殖により、ＣＯＬ１Ａ２−ネオマイシン耐性遺伝子作製体の発現に関して選 択した。次に培地を、ヒトｐｒｏａ１（Ｉ）鎖に特異的なポリクローナル抗体に よりＣＯＬ１Ａ１の発現について試験した。 さらに詳しくは、ＣＯＬ１Ａ２は、活性なネオマイシン耐性遺伝子に結合した が、ＣＯＬ１Ａ１は結合しなかった。細胞を、ネオマイシン類似体のＧ４１８１ を用いて、ＣＯＬ１Ａ２−ネオマイシン耐性遺伝子作製体の発現についてスクリ −ニングした。培地は、ヒトｐｒｏａ１（Ｉ）鎖に特異的なポリクローナル抗体 を用いるウェスタンブロッティングによりＣＯＬ１Ａ１の発現について分析した 。図３に示されるように、レーン１は、培地タンパク質が、ｐｒｏα（Ｉ）鎖（ α１（Ｉ）とα２（Ｉ））を含有していたことを示している。レーン２は、ｐｒ ｏα（Ｉ）およびｐｒｏα２（Ｉ）鎖および部分的に処理されたｐＣａ１（Ｉ） 鎖を含有するＩ型プロコラーゲンの真正の標準品である。結果は、この細胞が、 恐らく２つのｐｒｏα（Ｉ）鎖と１つのｐｒｏα２（Ｉ）鎖との通常のヘテロト リマーの形態で、ｐｒｏα（Ｉ）鎖を含有するヒト型プロコラーゲンを合成した ことを証明している。 これらの結果は、この細胞が、恐らく２つのｐｒｏα１（Ｉ）鎖と１つのｐｒ ｏα２（Ｉ）鎖の通常のヘテロトリマー構造よりなる、ヒトＩ型プロコラーゲン を合成したことを証明した。 表Ｉは、ヒトプロコラーゲン遺伝子を含有するいくつかのＤＮＡ作製体の一覧 を示す。作製体は、遺伝子の別々の断片または遺伝子からのｃＤＮＡを、適切な プロモーター断片と一緒にして構築した。Ｃ．実施例３：細胞トランスフェクション 細胞トランスフェクション実験のために、遺伝子作製体を含有するコスミドプ ラスミドクローンを、制限エンドヌクレアーゼで切断してベクターから作製体を 放出させた。ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター（Law et al.，Mol ．Cell Biol. ，3:2110-2115(1983)）を、ＢａｍＨＩで切断して線状にした。 ２つの試料は、約１０：１の遺伝子作製体対ネオマイシン耐性遺伝子を混合し、 次に混合物を、リン酸カルシウム共沈法（Sambrook et al.，Molecular Cloning .A Laboratory Manual ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、第２版(1989)）によりＨＴ−１０８０細 胞の同時トランスフェクションに使用した。リン酸カルシウム溶液中のＤＮＡを 、１００mlプレートのコンフルエンス前の細胞当たり１０μgのキメラ細胞作製 体なしに培養細胞上に積層した。細胞は、１０％ウシ新生児血清を含有するＤＭ ＥＭ中で１０時間インキュベートした。試料は、１５％グリセロール溶液を加え ることにより３分間グリセロールショックに付した。次に細胞を、ウシ新生児血 清を含有するＤＭＥＭ培地に移して２４時間、次に４５０μg/mlのＧ４１８を含 有する同じ培地に移した。Ｇ４１８を含有する培地中でのインキュベーションを 、３日毎に培地を交換しながら約４週間続けた。Ｇ４１８耐性細胞はプールした が、またはプラスチックのシリンダーで細胞増殖巣を単離することにより得られ る別々のクローンのいずれかであり、継代した。 Ｄ．実施例４：ウェスタンブロッティング ＣＯＬ２Ａ１遺伝子発現の測定のために、II型コラーゲンのＣＯＯＨ末端テロ ペプチドに見い出されるアミノ酸配列を有する２３残基の合成ペプチドを使用し て、ポリクローナル抗体をウサギで調製した。一般的には、Cheah et al.，Proc .Natl ．Acad．Sci．USA 82:2555-2559(1985)を参照。この抗体は、ウェスタンブ ロット分析によりヒトＩ型プロコラーゲンまたはコラーゲン、ヒトII型プロコラ ーゲンまたはコラーゲン、またはマウスＩ型プロコラーゲンのｐｒｏα鎖とは反 応しなかった。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現の測定のために、ｐｒｏα（Ｉ）鎖のＣ ＯＯＨ末端ポリペプチドと反応したポリクローナル抗体を使用した。一般的 には、Olsen et al.，J ．Biol．Chem. 266:1117-1121(1991)を参照。 プールしたクローンまたは個別クローンからの培地を取り出し、３０％の飽和 度まで固体硫酸アンモニウムを添加して別々に沈殿させ、沈殿物を１４，０００ ×ｇで遠心分離して回収し、次に０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５mM ＥＤＴＡ、 ０．５mM Ｎ−エチルマレイミド、０．１mM ｐ−アミノベンズアミジン、およ び５０mMトリス−ＨＣｌ（４℃でｐＨ７．４）を含有する緩衝液に対して透析し た。試料のアリコートを１％ＳＤＳ、５０mM ＤＴＴおよび１０％（ｖ／ｖ）グ リセロール中で５分間１０℃に加熱し、１２５Ｖでミニーゲル装置（ホルフォー ド(Holford)ＳＥ２５０、ホルフォード・サイエンティフィック（Holford Scien tific））を使用して６％ポリアクリルアミドゲルで９０分間電気泳動して分離 した。分離タンパク質をポリアクリルアミドゲルから４０Ｖで９０分間、支持さ れたニトロセルロース膜上に電気ブロッティングした（シュレイチャーとシュエ ル(Schleicher and Schuell)）。転写したタンパク質を１：５００（ｖ／ｖ）希 釈で３０分間ポリクローナル抗体と反応させた。抗体と反応するタンパク質は、 アルカリホスファターゼ（プロメガ・バイオテク（Promega Biotech））に結合 した二次抗ウサギＩｇＧ抗体で３０分間検出した。アルカリホスファターゼは、 製造業者の指示どおりにＮＢＴ／ＢＣＩＰ（プロメガ・バイオテク（Promega Bi otech））で視覚化した。 Ｅ．実施例５：組換えコラーゲンのインビトロ分析。 １．組換えコラーゲンの構築：プロテアーゼ消化。 トランスフェクション細胞により合成され培地に分泌されたプロコラーゲンが 正しく折り畳まれたことを証明するために、正しく折り畳まれたプロコラーゲン とコラーゲンのみが消化に抵抗する条件下で、培地タンパク質を高濃度のプロテ アーゼで消化した。トリプシンとキモトリプシンの組合せで消化するために、２ ５cmフラスコからの細胞層を削り取って、１０mM ＥＤＴＡおよび０．１％ノニ デット（Nonidet）Ｐ−４０（シグマ（Sigma））を含有する０．５mlの改変クレ ブス（Krebs）II培地中に入れた。ボルテックスミキサーで１分間細胞を激しく 撹拌し、直ちに４℃に冷却した。上清を新しいチューブに移した。試料を表示温 度で１０分間プレインキュベートして、同じ温度で２分間消化を行った。消化の ために、１mg/mlトリプシンおよび２．５mg/mlα−キモトリプシン（ベーリンガ ー・マンハイム（Boehringer Mannheim））を含有する０．１容量の改変クレブ ス（Krebs）II培地を加えた。消化は、０．１容量の５mg/mlダイズトリプシンイ ンヒビター（シグマ（Sigma））を加えることにより停止した。消化産物の分析 のために、試料を２分間沸騰水に急速に浸漬して、同時に０．６２５Ｍトリス− ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）中の１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール、および０ ．０１２％ブロモフェノールブルーからなる０．２容量の５×電気泳動試料緩衝 液を加えた。試料は、２％ ２−メルカプトエタノールの添加後沸騰水中で３分 間インキュベートすることにより前もって還元してＳＤＳゲルに適用した。電気 泳動は、Wet et al.，J ．Biol．Chem. 258:7721-7728(1983)により記載された軽 い改変を加えたLaemli，Nature 227:680-685(1979)の不連続システムを使用して 実施した。 ２．Ｓｆ９細胞の二重免疫染色。 Ｓｆ９細胞をガラススライド上で増殖させ、１００％エタノールで−２０℃で 固定した。あるいは、単層の細胞を分離し、０．１５Ｍ ＮａＣｌと０．０２Ｍ リン酸（ｐＨ７．４）（洗浄液）の溶液で２回洗浄し、冷エタノールに懸濁し、 シラン化（Maples，J.A.，(1985)，Am ．J．Clin．Pathol. 83:356-363）ガラス スライドに塗布した。細胞は、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２Ｍリン酸（ ｐＨ７．４）中の１％ウシ血清アルブミンと共に１５分間インキュベートし、次 に上記ウシ血清アルブミン含有溶液中の、βサブユニットに対するマウスモノク ローナル抗体（５Ｂ５、ダコ（Dako））とヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼの αサブユニットに対するウサギポリクローナル抗体の１：５０希釈液中で３０分 間インキュベートした。細胞を、２０分間洗浄液で４回洗浄して、ウシ血清アル ブミン含有溶液中のヒツジ抗マウスＩｇ−ローダミンＦ（ａｂ）２断片（ベーリ ンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））とヒツジ抗ウサギＩｇＧフルオ レセインＦ（ａｂ）２断片（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim ））の１：１０希釈液中で３０分間インキュベートして、洗浄液で洗浄し、蒸留 水で濯ぎ、グリセルゲル（Glycergel）（ダコ（Dako））を使用してマウントし た。試料は、ｅｐ−反射鏡、およびイソチオシアン酸フルオレセインとイソチ オシアン酸テトラメチルローダミンＢの蛍光用のフィルターを取り付けたライツ ・アリストプラン（Leitz Aristoplan）顕微鏡を使用して撮影した。 多重バキュロウイルス感染の効率を試験するために、昆虫細胞の免疫組織化学 染色法を使用した。Ｓｆ９細胞は、プロリル４−ヒドロキシラーゼの（および（ サブユニットをコードする２つの組換えウイルスで同時感染させ、これら２つの サブユニットに対する抗体で免疫染色した（図３）。感染の４８時間後に分析を 実施するとき、全細胞の８７％が２つの型のサブユニットの少なくとも１つを発 現し、１つの型のサブユニットを発現する細胞の９０％はまたもう一方の型も発 現することが見い出された。 ３．プロリル４−ヒドロキシラーゼ活性測定法。 細胞ホモジエネートの０．２％トリトンＸ−１００抽出物を、２−オキソ［１ −１４Ｃ］グルタル酸の水酸化共役脱カルボキシル化に基づく測定法により、プ ロリル４−ヒドロキシラーゼ活性について分析した（Kivirikko et al.，Method s Enzymol. 82:245-304(1982)）。以前報告された（Veijola et al.，J ．Biol. Chem. 269:26746-26753(1994)）ように、有意なレベルのプロリル４−ヒドロキ シラーゼ活性がＳｆ９およびハイファイブ（High Five）細胞の両方で見い出さ れ、ハイファイブ細胞中の活性は、Ｓｆ９細胞中の活性よりも明らかに高かった （表Ｉ）。ｐｒｏａ１（III）鎖をコードするウイルスによる細胞の感染は、こ の活性に小さな影響を及ぼすだけであったが、ヒトプロリル４−ヒドロキシラー ゼの２つの型のサブユニットをコードするウイルスと一緒に、ｐｒｏａ１（III ）鎖をコードするウイルスで感染した細胞の活性は顕著に高かった（表Ｉ）。 ４．コラーゲンの測定法。 精製III型コラーゲンの量は、シルコール（Sircol）コラーゲン測定法（バイ オカラー（Biocolor））により測定した。精製III型コラーゲンのアミノ酸分析 は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４２１アミノ酸分析 機で実施した。 Ｆ．実施例６：特異的に作成したプロコラーゲンおよびコラーゲン 図４に示すように、いくつかのゲノムＤＮＡおよびヒトＩ型プロコラーゲンの ｐｒｏａ１（Ｉ）鎖のいくつかのｃＤＮＡからなるハイブリッド遺伝子を出発物 質とした。ハイブリッド遺伝子のＤＮＡ配列を分析し、反復Ｄ−ピリオド間の結 合部を形成するアミノ酸のコドンを、コードされるアミノ酸を変化させないが制 限エンドヌクレアーゼによるハイブリッド遺伝子の切断のためのユニークな部位 を作成する方法で、改変した。 １．組換えプロコラーゲンまたはコラーゲン ｐｒｏα１（Ｉ）のＤ３−ピリオドはＳｒｆＩおよびＮａｅＩ制限ヌクレアー ゼを使用して切り出す。Ｄ３ピリオドに存在するコラゲナーゼ認識部位に見い出 されるアミノ酸をコードする塩基は、異なるアミノ酸配列をコードするように改 変する。このカセットを増幅し、遺伝子に再挿入する。適切な宿主細胞中で遺伝 子を発現させると、コラゲナーゼにより切断することができないＩ型コラゲナー ゼが得られる。 ２．プロコラーゲンまたはコラーゲンの欠失突然変異体 （ｐｒｏα１（Ｉ）鎖の）Ｄ２ピリオドカセットを、Ｓｍａ１で消化して前記 の遺伝子から切り出す。この遺伝子を再構築して、Ｄ−２ピリオドのコドンの特 異的な５つのフレーム内欠失を有する遺伝子を得る。 ３．プロコラーゲンまたはコラーゲンの付加突然変異体 １つまたはそれ以上のＤ−カセットの多重コピーは、作成された部位に挿入し て、プロコラーゲンまたはコラーゲンの所望領域の多重コピーを得ることができ る。 Ｇ．実施例７：組換えＤＮＡ系におけるヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼの発 現 昆虫細胞中でプロリル４−ヒドロキシラーゼの２つの遺伝子を発現させるため に、下記の操作を実施した。ＳｍａＩ部位にヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼ のαサブユニットの完全長ｃＤＮＡのＰα−５８（Helaakoski et al.，Proc ．N atl．Acad．Sci．USA 86，4392-4396(1989)）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ（ストラタジーン（Stratagene））を、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ（ＳｍａＩ 部位に密接に隣接する切断部位）で消化することにより、バキュロウイルス転移 ベクターｐＶ１α５８を作成した。６１塩基対の５’非翻訳配列、全コード領域 、および５５１塩基対の３’非翻訳配列を含有する、生じたＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ お よびＰｓｔ−ＢａｍＨＩ断片を、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２ （Luckow et al.，Virology 170:31-39(1989)）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位に クローン化した。バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬα５９は、ｐＶＬ１３９ ２と、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットをコードする別のｃ ＤＮＡクローンのＰα−５９（Helaakoskiら、上記文献）から同様に作成した。 ｃＤＮＡクローンのＰα−５８とＰα−５９は、６４塩基対のストレッチだけ異 なる。 ｐＶＬβベクターは、４４塩基対の５’非翻訳配列、全コード領域、および２ ０７塩基対の３’非翻訳配列を含有するヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのβ サブユニットの完全長ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片のＳ−１３８（Pi hlajaniemi et al.，EMBO J. 6:643-649(1987)）の、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消 化ｐＶＬ１３９２へ連結して作成した。組換えバキュロウイルス転移ベクターは 、野生型オートグラフア・カリフォルニカ（Autographa californica）の核多角 体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡと共にリン酸カルシウムトランスフェクショ ン法により、Ｓｆ９細胞（Summaers et al.，Tex ．Agric．Exp．St．Bull. 1555 :1-56(1987)）中に同時トランスフェクションした。トランスフェクション細胞 の上清中の生じたウイルスプールを４日後に回収し、プラーク測定法に使用した 。組換え閉塞（occlusion）−陰性プラークは、３ラウンドのプラーク精製に付 して、混入する野生型ウイルスを全く含まない組換えウイルスを作製した。スク リーニング方法および組換えウイルスの単離は、本質的にSummersとSmith、上記 文献の方法にしたがった。ｐＶＬα５８、ｐＶＬα５９、およびｐＶＬβからの 生じた組換えウイルスは、それぞれα５８ウイルス、α５９ウイルスおよびβウ イルスと命名した。 Ｓｆ９細胞は、２７℃で１０％胎児牛血清を補足したＴＮＭ−ＦＨ培地（シグ マ（Sigma））で、スピナーフラスコ（テクネ（Techne））中で単層としてまた は懸濁液中のいずれかで培養した。組換えタンパク質を作製するために、Ｓｆ９ 細胞は、１ml当たり１０６細胞の密度で接種して、α５８、α５９、またはβウ イルスを単独で使用するときには５〜１０の感染多重度で組換えウイルスを注入 した。αおよびβウイルスを１：１０〜１０：１の比で感染のために使用して、 プロリル４−ヒドロキシラーゼテトラマーを作製した。感染の７２時間後に細胞 を回収し、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．８）／０．１Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍグ リシン／１０μMジチオスレイトール／０．１％トリトンＸ−１００中でホモジ ェナイズして、遠心分離した。生じた上清は、ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥまたは未 変性７．５％ＰＡＧＥにより分析して、酵素活性に関して測定した。細胞ペレッ トをさらに１％ＳＤＳに可溶化し、ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥにより分析した。感 染の２４〜９６時間後の細胞培地をＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥにより分析して、生 じたタンパク質の培地中への分泌を同定した。これらの実験における細胞は、血 清を含まないＴＮＭ−ＦＨ培地で増殖させた。 タンパク質発現の経時変化を検討するときに、組換えウイルスで感染したＳｆ ９細胞は、感染の２４〜５０時間後の間の種々の時点で［³⁵Ｓ］メチオニン（１ ０μCi/μl；アマーシャム（Amersham）；１Ci＝３７CBq）で２時間標識して、 ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥによる分析のために回収した。組換えタンパク質の最大 蓄積量を測定するために、細胞を感染の２４〜９６時間後の種々の時点で回収し て、ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥにより分析した。細胞の０．１％トリトンＸ−１０ ０−および１％ＳＤＳ−可溶性画分の両方を分析した。プロリル４−ヒドロキシ ラーゼ活性は、２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸の脱カルボキシル化に基づ く方法（Kivirikko et al.，Methods in Enzymology 82:245-304(1982)）により 測定した。Ｋｍ値は、固定濃度の第２の基質の存在下で１つの基質の濃度を変化 させることにより測定したが、他の基質の濃度は一定に保持した（Myllyla et a l.，Eur ．J．Biochem. 80:349-357(1977)）。βサブユニットのタンパク質ジス ルフィドーイソメラーゼ活性は、グルタチオン；インスリントランスヒドロゲナ ーゼ測定法（Carmichael et al.，J ．Biol．Chem. 252:7163-7167（1977)）によ り測定した。ウェスタンブロット分析は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼの βサブユニットに対するモノクローナル抗体の５Ｂ５を使用して実施した（Hoyh tya et al.，Eur ．J．Biochem. 141:477-482(1984)）。プロリル４−ヒドロキシ ラーゼは、ポリ（Ｌ−プロリン）親和性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロ ースクロマトグラフィー、およびゲル濾過からなる方法により精製した(Kivirik ko et al.，Methods in Enzymology 144:96-114(1987))。 図５は、親和性カラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製後の昆虫細 胞により合成されたプロリル４−ヒドロキシラーゼの分析を示す。非変性ゲル中 のポリアクリルアミドゲル電気泳動により試験すると、組換え酵素は、ニワトリ 胚から精製した正常酵素のテトラマーおよび活性型と同時に泳動した。精製した 組換え酵素を還元後、（−および（−サブユニットを検出した。図５に示すよう に、レーン１〜３は、非変性条件下で分離されたタンパク質であり、２種のサブ ユニットのテトラマーを示している。レーン４〜６は、２つのサブユニットが別 々のバンドとして現れるような変性条件下で分離した同じ試料である。 表IIでは、組換え酵素の酵素活性に関するデータを示した。Ｋｍ値は、固定濃 度の第２の基質の存在下で１つの基質の濃度を変化させることにより測定したが 、他の基質の濃度は一定に保持した。 示されるように、組換え酵素のミカエリス−メンテン（Ｋｍ）値は、ニワトリ 胚からの真正の正常酵素と基本的に同じであった。 トランスフェクションした昆虫細胞は大量の活性プロリル４−ヒドロキシラー ゼを合成するため、これらは、プロコラーゲンおよびコラーゲンをコードする本 発明の遺伝子でトランスフェクションして大量のプロコラーゲンおよびコラーゲ ンを合成するのに適切な細胞である。本発明の遺伝子による細胞のトランスフェ クションは、実施例３に記載したように実施される。 Ｈ．実施例８：プロリル４−ヒドロキシラーゼの組換え遺伝子を発現するサッカ ロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）酵母における組換えコラ ーゲン遺伝子の発現 酵母のサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevosiae）は、任意 の多数の発現ベクターとともに使用することができる。最も一般的に使用される 発現ベクターの１つは、酵母と大腸菌（E．coli）の両方での増殖のための配列 、外来遺伝子の効率的な伝染のための酵母のプロモーターおよびターミネーター を含有するマルチ−コピー２μプラスミドである。２μプラスミドに基づくこの ようなベクターの典型的な例は、２μ ＯＲＩ−ＳＴＢエレメント、ＧＡＬＩプ ロモーター、および２μ Ｄ遺伝子ターミネーターを有するｐＷＹＧ４である。 このベクターではＮｃｏＩクローニング部位を使用してプロリル４−ヒドロキシ ラーゼの（または（サブユニットのいずれかの遺伝子を挿入し、αまたはβサブ ユニットのいずれかのＡＴＧ開始コドンを与える。別の例として、この発現ベク ターは、完全な２μ ＯＲＩ、ＳＴＢ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２、ＧＡＬ７プロ モーターを含み、そしてＦＬＰターミネーターを使用するｐＷＹＧ７Ｌであって もよい。このベクターでは、プロリル４−ヒドロキシラーゼの（または（サブユ ニットのいずれかの遺伝子を、その５’末端を含むポリリンカー中にＢａｍＨＩ またはＮｃｏＩ部位で挿入する。ＤＮＡを取り込むスフェロプラストを作成する ために細胞壁の除去後、カルシウムおよびＰＥＧで処理後、または完全な細胞を リチウムイオンで処理後、サッカロミセス・セレビッシェ（S．cerevisiae）中 に、プロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するベクターを形質転換する。 あるいは、ＤＮＡは電気穿孔法により導入することができる。形質転換体は、Ｌ ＥＵ２、ＴＲＯ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３またはＬＥＵ２−Ｄのような選択マーカ ー遺伝子と共に、ロイシン、トリプトファン、ウラシルまたはヒスチジンについ て栄養要求性である宿主酵母細胞を使用することにより選択することができる。 ガラクトースプロモーターにより推進されるプロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝 子の発現は、ガラクトースの添加により非常に急速な誘導が起きるように非抑制 性、非誘導性糖で培養物を増殖させる；グルコース培地で培養物を増殖させ、次 に遠心分離によるグルコースの除去、および細胞の洗浄と次のラクトース培地へ の再懸濁により；およびガラクトース−誘導が起こる前にグルコースが選択的に 代謝されるようにグルコースとガラクトースの両方を含有する培地で増殖させて 、誘導することができる。形質転換細胞を上述のようにさらに操作して、プロリ ル４ −ヒドロキシラーゼの両方のサブユニットの遺伝子および目的のコラーゲンまた はプロコラーゲン遺伝子を細胞中に組み込んで、コラーゲンとプロコラーゲンを 発現させ、これはプロリル４−ヒドロキシラーゼにより適切に水酸化されて、安 定な３重らせんコンホメーションに折り畳まれ、したがって正常な生物学的機能 と関連する必須の折りたたみが起きる。 Ｉ．実施例９：プロリル４−ヒドロキシラーゼの組換え遺伝子を発現するピヒア ・パストリス（Pichia pastoris）酵母における組換えコラーゲン遺伝子の発現 プロリル４−ヒドロキシラーゼおよびプロコラーゲンまたはコラーゲンの遺伝 子の発現はまた、大規模化法で高収量の組換えタンパク質を産生するのに特に有 利であると思われるピヒア・パストリス（Pichia pastoris）のような非サッカ ロミセス（Saccharomyces）酵母でも行うことができる。メチロトロフ（methylo troph）なピヒア・パストリス（P．pastoris）における典型的な発現は、アルコ ールオキシダーゼをコードする厳重に制御されたＡＯＸ１遺伝子からのプロモー ターにより得られ、培養物へのメタノールの添加後誘導されてプロモーターによ り推進される高レベルの組換えタンパク質を与えることができる。ピヒア・パス トリス（P．pastoris）は未変性のプラスミドを持たないため、この酵母は染色 体の組み込みのために設計された発現ベクターと共に使用され、ＨＩＳ４のよう な遺伝子が選択のために使用される。同じ細胞のその後の操作により、本明細書 に記載されるプロコラーゲンおよびコラーゲンの遺伝子の発現は、組換えタンパ ク質がプロリル４−ヒドロキシラーゼにより適切に水酸化され、したがって線維 の形成におけるタンパク質の正常な生物学的機能に必要な安定ならせんに折り畳 まれる条件下で達成される。 以下のベクターは、本明細書の開示により作成した： １．それ自体のシグナル配列のないヒトコラーゲンIII型。 コラーゲンＤＮＡの３’末端は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８を使用す るＰＣＲ（Ala-Kokko et al.，1989，Biochem J.，260:509-516;受け入れ番号Ｘ １４４２０７を参照）により、翻訳開始コドンの４１９５塩基対下流（ＥｃｏＲ Ｉ部位）から翻訳の終止コドン（４４０１塩基対）まで合成した。ＮｏｔＩお よびＸｂａＩ部位を断片の３’末端に作製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ ３８は、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化して、大きな断片（約７．２kb）を単離し た。この大きなＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（約７．２kb）と３’ コラーゲンＰ ＣＲ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をＴ４リガーゼで連結して、プラスミドｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８Ｂを得た。 コラーゲンＤＮＡの５’末端は、ＰＣＲ（配列については、Ala-Kokko et al. ，1989，Biochem J.，260:509-516を参照）により翻訳開始コドンの７３塩基対 下流から１７６塩基対（ＢａｍＨＩ部位）まで合成した。ＣｌａＩおよびＮｏｔ Ｉ部位を断片の５’末端に作製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８／Ｂは 、ＣｌａＩとＢａｍＨＩにより消化して、大きな断片（約６．３kb）および８６ ２塩基対のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩコラーゲン断片を単離した。５’ＰＣＲコラ ーゲン断片ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ、大きな断片ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ（約６．３ kb）および８６２塩基対ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をＴ４リガーゼで連結（三 重連結）して、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８／１１を得た。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８ １１を、ＮｏｔＩにより消化した。次に ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩコラーゲン断片（７３塩基対−４４０１塩基対）は、α−因 子シグナル配列のフレーム内に、ｐＰＩＣ９（インビトロゲン（Invitrogen）） 中にクローン化して、プラスミドｐＰＩＣ９ＣｏｌIII（クローン７）を得た。 ２．それ自体のシグナル配列を有するヒトコラーゲンIII型 コラーゲンの３’末端は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８を使用するＰＣ Ｒにより、翻訳開始コドンの４１９５塩基対下流（ＥｃｏＲＩ部位）から翻訳の 終止コドンまで合成した。ＸｂａＩ部位を断片の３’末端に作製した。得られる ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１プラスミドを、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化 して、大きな断片（約７．２kb）を単離し、この大きな断片（約７．２kb）と３ ’ ＰＣＲコラーゲン断片をＴ４で連結してプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ −Ｃ３Ａ１／１０を得た。ＢｇｌII部位を翻訳開始コドンの１６塩基対上流に作 製した（Lambergら、1996）。次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１／１０の ＢｇｌII−ＸｂａＩコラーゲン断片（−１６塩基対〜４４０１塩基対）を、ｐＨ ＩＬ−Ｄ２（インビトロゲン（Invitrogen））のＥｃｏＲＩ部位中に連結してプ ラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２／ｃｏｌIIIを得た。 ３．ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼ サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＡＲＧ４遺伝子 を含有するベクターｐＹＭ２５は、ＨｐａＩにより消化した。ＡＲＧ４遺伝子の ＨｐａＩ断片は、ｐＡＯ８１５（インビトロゲン（Invitrogen））のＥｃｏＲＶ 部位中に挿入してベクターｐＡＲＧ８１５を作製したが、これは、ＨＩＳ４遺伝 子の代わりにＡＲＧ４遺伝子を含有している。 プロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユニットｃＤＮＡ（Vuori et al.， 1992 PNAS.，89，7467-7470）は、ＰＣＲにより翻訳開始コドンから終止コドン まで合成した。ＥｃｏＲＩ制限部位を５’および３’末端に作成した。Ｃ−末端 ＥＲ保持ペプチド配列−ＫＤＥＬ−は、ＰＣＲにより酵母ＥＲ保持シグナル−Ｈ ＤＥＬ−（ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ）に改変した。ＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ ＲＩ 断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中に挿入して、プラスミドｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔＳＫβ／２０を得た。次にこのＥｃｏＲＩ断片をＰＡＯ８１５（ インビトロゲン（Invitrogen））のＥｃｏＲＩ部位中に挿入して単一発現カセッ トベクターを作成した。 α−サブユニットの５’末端は、ＰＣＲにより翻訳開始コドンから６８９塩基 対下流（ＨｉｎｄIII部位）まで合成した。ＨｉｎｄIIIおよびＳｍａＩ部位を断 片の５’末端に作成した。プラスミドｐＡ−５９（Vuoriらを参照）は、Ｈｉｎ ｄIIIにより消化して、大きな断片（約４．９kb）を単離した。この大きな断片 （約４．９kb）と５’ＰＣＲ断片をＴ４リガーゼで連結して、プラスミドｐＡ− ５９／１５を得た。 ３’末端は、翻訳開始の１３７３塩基対下流（ＰｓｔＩ部位）から翻訳終止コ ドンまで合成した。ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位を断片の３’末端に作成した 。プラスミドｐＡ−５９／１５は、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、大きな断片 （約３．９kb）を単離し、この大きな断片と３’ＰＣＲ断片をＴ４リガーゼで連 結して、プラスミドｐＡ−５９／３を得た。プラスミドｐＡ−５９は、ＳｍａＩ で消化し、ＳｍａＩ−ＳｍａＩ α−サブユニット断片（１塩基対−１６０５塩 基対）をｐＡＲＧ８１５のＥｃｏＲＩ部位中に連結した。 β単一カセットベクターは、ＢｇｌII−ＢａｍＨＩにより消化して、発現カセ ットを切り出し、この発現カセットをｐＡＲＧ８１５α発現ベクターのＢａｍＨ Ｉ部位の１つに再挿入した。その結果このベクターは、２つの発現カセット（１ つはα−サブユニット用で、１つはβ−サブユニット用）を含有する。 そのシグナル配列のないβ−サブユニットは、ＰＣＲにより翻訳開始コドンの ５２塩基対下流から翻訳終止コドンまで合成した。ＥｃｏＲＩ制限部位を５’お よび３’末端に作成した。このＰＣＲ断片は、ｐＳＰ７２（プロメガ（Promega ））のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。 Ｊ．実施例１０：プロリル４−ヒドロキシラーゼの組換え遺伝子を発現する昆虫 細胞における組換えコラーゲン遺伝子の発現 １．コラーゲン遺伝子を含有する組換えベクターの作製 ｐＶＬＣ１Ａ１：このバキュロウイルス転移ベクターは、真核生物発現ベクタ ーＣＭＶ−ＣＯＬ１Ａ１（Geddis et al.，Matrix 13:399-405(1993)）とポリへ ドリンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（Luckow et al. ，Virology 170:31-39(1989)）を使用して作成した。ＣＭＶ−ＣＯＬ１Ａ１は、 ヒトプロコラーゲンＩのα１鎖の完全長ｃＤＮＡ配列（ＣＯＬ１Ａ１）をコード する配列を含有する。 ＸｂａＩによるＣＭＶ−ＣＯＬ１Ａ１の消化により、６塩基対の５’非翻訳、 および２２２塩基対の３’非翻訳を含むＣＯＬ１Ａ１の完全長ｃＤＮＡを作成し 、そしてこの断片をｐＶＬ１３９２のＸｂａＩ部位中にクローン化してプラスミ ドｐＶＬＣ１Ａ１を得た。 ｐＶＬＣ1Ａ２：このバキュロウイルス転移ベクターは、ベクターｐＵＣ−Ｈ Ｐ２０１０（Kuivaniem et al.，Biochem ．J. 252:633-640(1988)）とポリヘド リンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（Luckow et al.，V irology 170:31-39(1989)）を使用して作製した。ｐＵＣ−ＨＰ２０１０は、ｐ ＵＣ１９のＳｐｈＩ部位にヒトプロコラーゲンＩのα鎖の完全長ｃＤＮＡ配列（ ＣＯＬ１Ａ２）をコードする配列を含有する。 ｐＵＣ−ＨＰ２０１０は、ＳｐｈＩで消化し、ＧＴＡＣオーバーハングをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで除去し、この平滑末端化断片をｐＳＰ７２（プロメガ （Promega））のＥｃｏＲＶ部位中にクローン化する。ＢｇｌII部位はＰＣＲに より翻訳開始部位の６塩基対上流に作成して、プラスミドｐＳＰ７２−Ｃ１Ａ２ Ｔを得る。ＣＯＬ１Ａ２の完全長ｃＤＮＡは、ｐＳＰ７２−Ｃ１Ａ２ＴをＢｇｌ II−ＢａｍＨＩで切断することにより作成する。ｐＳＰ７２−Ｃ１Ａ２Ｔからの ＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断片は、完全長ＣＯＬ１Ａ２配列に加えて６塩基対の５’ 非翻訳、および２７８塩基対の３’非翻訳を有しており、この断片は、ｐＶＬ１ ３９２のＢｐｌII−ＢａｍＨＩ部位中にクローン化してｐＶＬＣ１Ａ２を得る。 ｐＶＬＣ３Ａ１：プラスミドｐＢＳ−ＳＭ３８（Ala-Kokko et al.，Biochem. J. 260:509-516(1989)に記載の配列から得られる、ジーンバンク（GenBank）受 け入れ番号Ｘ１４４２０）中にヒトIII型プロコラーゲンのｐｒｏα１鎖の、９ ２塩基対の５’非翻訳領域および７１５塩基対の３’非翻訳領域を含む完全長ｃ ＤＮＡに、ＢｇｌII部位をＰＣＲにより翻訳開始コドンの１６塩基対上流に作成 して、プラスミドｐＢＳ−Ｃ３Ａ１を得た。ｐＢＳ−Ｃ３Ａ１は、ＢｇｌIIおよ びＸｂａＩ制限酵素で消化して、１６塩基対の５’非翻訳領域、および７１５塩 基対の３’非翻訳領域を含むヒトIII型プロコラーゲンのｐｒｏα１鎖の完全長 ｃＤＮＡを含有するＢｇｌII／ＸｂａＩ断片を、次にｐＶＬ１３９２（Luckow e t al.，Virology 170:31-39）に連結してプラスミドｐＶＬＣ３Ａ１を得た。 ｐＶＬＣ３Ａ１ ５’ＵＴ／Ｃ２Ａ１：バキュロウイルス転移ベクターは、Ba ldwin et al.，Biochem ．J. 262:521-528(1989)に記載の配列を使用して作成し 、ｐＧＥＭＣ２Ａ１およびポリヘドリンベースのバキュロウイルス転移ベクター ｐＶＬ１３９２（Luckow et al.，Virology 170:31-39(1989)）を得た。ｐＧＥ ＭＣ２Ａ１は、Ｉ型コラーゲンからのエキソンＩをコードする配列を含有し、II 型コラーゲンはエキソン２Ｂから開始する。 ｐＧＥＭＣ２Ａ１をＸｂａＩ−ＤｒａＩで消化して、完全長ｃＤＮＡ融合配列 、および６塩基対の５’非翻訳領域および３９６塩基対の３’非翻訳領域を含む 断片を作成し、この断片をｐＶＬ１３９２のＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位中にクロー ン化して、プラスミドｐＶＬＣ１Ａ１／Ｃ２Ａ１を得る。次にＣＯＬIIベクター のＢｇｌII−ＸｂａＩ部位中にオリゴヌクレオチドをクローン化することにより 、５’非翻訳領域をGATCTGATATTに変更した。 ｐＶＬＣ３ＡｌＮＰ／Ｃ２Ａ１：ｐＧＥＭＣ２Ａ１を、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ で消化し、完全長ｃＤＮＡ融合配列を、ｐＢＳ（ＳＫ−）のＸｂａＩ−ＢａｍＨ Ｉ部位にクローン化してプラスミドｐＢＳＣ１Ａ１／Ｃ２Ａ１を得る。ｐＢＳＣ １Ａ１／Ｃ２Ａ１をＢｇ１II−ＮａｒＩで消化して、Ｎ−プロペプチドを含まな い完全長ｃＤＮＡを作成し、III型コラーゲンからの１６塩基対の５’非翻訳を 含むＮ−プロペプチドは、鋳型としてプラスミドｐＢＳ−Ｃ３Ａ１を使用するＰ ＣＲにより合成した。III型Ｎ−プロペプチドを合成するのに使用したオリゴヌ クレオチドは、以下の通りであった：５’オリゴ（5'-TACTCTAGACTCAGATCTGATAT T-3'）および３’オリゴ(5'-GGGAGAATAGTTCTGAGGACCAGT-3'）。II型コラーゲン からのテロペプチドの３５塩基対断片は、オリゴヌクレオチドにより合成した（ 化学合成）。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：5'-CAGATGGCTGGAGGATTTGAT GAAAAGG CT GGTGG-3'；および5'-CGCCACCAGCCTTTTCATCAAATCCTCCAGCCATCTG-3'。 これらの断片をＢｇ１II−ＮａｒＩで消化したｐＢＳＣ１Ａ１／Ｃ２Ａ１中に連 結した。このハイブリッド完全長ｃＤＮＡをＢｇ１II−ＤｒａＩで切り出して、 ｐＶＬ１３９２のＢｇｌII−ＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ部位はクレノウおよびｄＮＴＰ でオーバーハングを充填することにより平滑末端化される）部位中にクローン化 して、プラスミドｐＶＬＣ３Ａ１ＮＰ／Ｃ２Ａ１を得た。 ｐＶＬＣ４Ａ１：R．Niecht K*lnにより作製したベクターα１ＣＭＶＣ（Braz el et al.，Eur ．J．Biochem. 168:529-536(1987)、およびSoininen et al.，FE BS Lett．225:188-194(1987)に発表された配列に基づく）およびポリヘドリンベ ースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（Luckow et al.，Virolog y 170:31-39(1989)）を使用して、バキュロウイルス転移ベクターを作成した。 α１ＣＭＶＣをＣｌａＩで消化して、１８塩基対の５’非翻訳および２０３塩 基対の３’非翻訳を含む完全長ｃＤＮＡを作成し、この断片を、クレノーポリメ ラーゼ（ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech））とｄＮＴＰの混合 物を使用して平滑末端化して、ｐＶＬ１３９２のＳｍａＩ部位中にクローン化し て、プラスミドｐＶＬＣ４Ａ１を得た。 ｐＶＬＥ２６：ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）（Pihlajaniemi et al.，J ．Biol．Chem. 265:16922-16928(1990)）中のｃＤＮＡクローンＥ−２ ６とポリヘドリンベースの転移ベクターｐＶＬ１３９２（Luckow et al.，Virol ogy 170:31-39(1989)）を使用して、バキュロウイルス転移ベクターを作成した 。ｃＤＮＡクローンＥ−２６は、ヒトXIII型コラーゲンのα１鎖をコードするが 、これをｐＢＳ（ＳＫ−）のＥｃｏＲＩ部位中に連結する（クローンＥ−２６と 命名された作製体）。Ｅ−２６クローンは、例えば、Pihlajaniemi et al.，J ． Biol．Chem. 265:16922-16928(1990)に記載されている。ｃＤＮＡ Ｅ−２６は 、ヒト臍帯静脈上皮細胞から得られるλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（クロ ーンテク（Clontech））から得て、この挿入配列をＥｃｏＲＩで消化して放出さ せた。このＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位中に連結して、クロ ーンＥ−２６を得た。クローンＥ−２６をＥｃｏＲＩで消化して、XIII型コード 配列をカバーするＥ−２６ ｃＤＮＡを作成する。１２３塩基対の５’非翻訳領 域および１１７塩基対の３’非翻訳領域も含まれており、この断片をｐＶＬ１３ ９２のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化してプラスミドｐＶＬＥ２６を得る。 ｐＶＬｈｕXIII:本バキュロウイルス転移ベクターを、クローンＥ−２６(Pihl ajaniemi et al.，J ．Biol．Chem. 265:16922-16928(1990))、ゲノムヒトXIII型 コラーゲン配列（Tikka et al.，J ．Biol．Chem. 266:17713-17719(1991)）およ びポリヘドリンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１９３２（Luckow et al.，Virology 170:31-39(1989))を使用して構築した。ｐＢＳｈｕXIIIと呼 ばれるクローンを構築したが、これは、ｐＢＳ（ＳＫ−）のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲ Ｉ部位に、ＰＣＲにより作製されたXIII型コラーゲン遺伝子からのヌクレオチド １〜２７２をカバーするゲノムヒトXIII型コラーゲンの５’末端と共に、ヒトXI II型コラーゲンのα１鎖のクローンＥ−２６を含有しており、XIII型コラーゲン の完全長ｃＤＮＡを与える(Tikka et al.，J ．Biol．Chem. 266:17713-17719(19 91))。ゲノムヒトXIII型コラーゲンの５’末端を、鋳型としてＣＬ４１２（ヒト ゲノムライブラリー（Clontech）から単離されたラムダクローン）を、およびＰ ＣＲプライマー：５’プライマー(5'-ATGCGGCCGCACGCGAGAGGATGGTAGC-3')、およ び３’プライマー(5'-TAGCTGTCTCCATTTGCTGCTC-3')を使用して作製した。５’− ＰＣＲ−プライマーは、XIII型配列に先行する新規なＮｏｔＩ制限部位を含んで おり、これをヌクレオチド２１６と２１７の間のＰｓｔＩ部位（Tikka et al.，J ．Biol．Chem. 266:17713-17719(1991)）と同様に、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで 消化したクローンＥ−２６中に５’−ＰＣＲ−産物をクローン化するために、使 用した（Pihlajaniemi et al.，J ．Biol．Chem. 265:16922-16928(1990))。ｐＢ ＳｈｕXIIIをＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩで消化して、１０塩基対の５’非翻訳領域と １１７塩基対の３’非翻訳領域を有する完全長ｃＤＮＡを作製し、この断片をｐ ＶＬ１３９２のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化してプラスミドｐＶＬ ｈｕXIIIを得る。 ｐＶＬｍｏXIII:本バキュロウイルス転移ベクターを、ベクターｐＢＳｍｏXII Iとポリヘドリンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（これ はLuckow et al.，Virology 170:31-39(1989)に記載されている）を使用して構 築した。ｐＢＳｍｏXIIIは、マウスXIII型コラーゲンの α１鎖をコードするｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のｃＤＮＡクローン６８９（ここ で、５’末端はＰＣＲにより作製し、３’末端はプラスミドｍｏＣ−２からの断 片の連結により作製した）からなる。クローン６８９は、以下のようにマウス牌 臓ＲＮＡから得られたｃＤＮＡである：全マウス牌臓ＲＮＡを逆転写酵素および プライマー5'-ACACACACAGGCCAGT-3'と反応させる。次にこの逆転写酵素産物を、 プライマー：５’プライマー(5'-ATGAATTCGCCAGTCCCAGGTTAGAGGCA-3')、および ３’プライマー（5'-ATGAATTCAAGTTCTACTCGCGTAGGCGC-3'）を用いる１回目のＰ ＣＲ反応の鋳型として使用し、これらの産物をプライマー：５’プライマー(5'- ATGAATTCGTTCCAGCAGCCTTGGACTGGTAAGC-3')、および３’プライマー（5'-ATGAATT CCCGAAGATGTCTCCAGGATGT-3'）との２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。 このＰＣＲ断片は、マウスXIII型コラーゲンのα１鎖のｃＤＮＡ配列からのヌク レオチド４６６〜９６９をカバーする。ｃＤＮＡクローンＧＵＴ２１９．２．４ は鋳型として、ＰＣＲプライマー：５’プライマー(5'-ATAAGCTTGAATTCCGAGGGCA TGGTGGCGG-3')、および３’プライマー(5'-CGAGGCCCGACGATGGACAT-3')と共に使 用した。ＧＵＴ２１９．２．４は、新生児マウス消化管ＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ イブラリーから、プライマーとしてランダムヘキサマー、およびユー−プライム −ｃＤＮＡ（You-Prime-cDNA）合成キット（ファルマシア(Pharmacia)）を使用 して、逆転写酵素−マウスXIII型コラーゲンのＮＣ１〜ＮＣ４ドメインのＰＣＲ クローンでプローブ結合することにより得られた。これらのＲＴ−ＰＣＲクロー ンは以下のようにして得た：新生児マウス消化管ＤＮＡを鋳型として、プライマ ー：５’プライマー(5’-ACCTTTGGCCCTGGGGGCGCAGGGAGC-3’)、および３’プラ イマー(5’-AGGGAGAGAAAGGCGATGCTGGCA-3’)と共に使用して、M91断片を産生し た。このM91断片を使用して、マウスおよびヒト由来のプライマーの組合せを使 用する、5’および3’の両方向の以後のRT-PCR反応のプライマーを設計した。ク ローン689をEcoRIとBamHIで消化して、この557塩基対のEcoRI-BamHI断片をpBlue scrlptのEcoRIおよびBamHI部位中に連結してプラスミドＰ４０−５を得た。プラ スミドＰ４０−５をＨｉｎｄIIIとＢｂｖIIで消化して、ＨｉｎｄIIIとＢｂｖII で消化した５’−ＰＣＲ断片と連結して、プラスミドＰ４０−１を得た。プラス ミドＰ４０−１は、翻訳開始領域とヌクレオチド１４１９のＢａｍＨＩ部位まで のコード配列を含むクローンを含有する。 マウスXIII型コラーゲンの３’末端を、以下のようにプラスミドＰ４０−１に 付加した。マウスのXIII型コラーゲンのｃＤＮＡであるＭＯＡＢＣＤ．５を使用 して、５９０塩基対のＳｔｕＩ−ＳａｃＩ断片を得た。交互に(alternatively) スプライスされるエキソン４Ａ、４Ｂ、１２、１３、および３３を除いてマウス XIII型コラーゲンのコード配列をカバーするために、ｃＤＮＡクローンＧＵＴ２ ２９Ａ、ＧＵＴ２１９．１．４、ＲＧ．６、および１８からＭＯＡＢＣＤ．５を 作製した。プライマーとしてランダムヘキサマーを使用し、ユウ−プライム−ｃ ＤＮＡ合成キット（You-Prime-cDNA synthesis kit）(ファルマシア(Pharmacia) )を使用して、マウスXIII型コラーゲンのＮＣ１〜ＮＣ４ドメインの逆転写酵素 −ＰＣＲクローンでプローブ結合して、新生児マウスの消化管ＲＮＡから作製し たｃＤＮＡライブラリーから、クローンＧＵＴ２２９ＡとＧＵＴ２ｌ９．１．４ を得る。これらのＲＴ−ＰＣＲクローンを以下のようにして得た：新生児マウス 消化管ＤＮＡを鋳型として使用して、プライマー：５’プライマー（5'-ACCTTTG GCCCTGGGGGCGCAGGGAGC-3'）と３’プライマー（5'-AGGGAGAGAAAGGCGATGCTGGCA-3 ’）を使用して、Ｍ９１断片を作製した。Ｍ９１断片を使用して、マウスおよび ヒト起源のプライマーの組合せを使用する５’および３’方向の以後のＲＴ−Ｐ ＣＲ反応のためのプライマーを設計した。マウス消化管ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを鋳 型として、そしてプライマー（5'-GACTGC AGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3'） を使用し、次にプライマー：ＭＲ−１５（5'-GCCTCCAGGAATGAAGGGAGAAGT-3'）と プライマーテイル(primer Tail)（5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'）を使用する第１回 目のＰＣＲ、およびプライマー：ＭＲ−１（5’-GGGGGAGAGGGGGAAGAA-3'）とプ ライマーテイル(5'-GACTCGAGTCGACATCG-3')を使用する第２回目のＰＣＲにより 、逆転写酵素反応を行った。これらの生成物を、ベクターｐＣＲII（インビトロ ゲン(InVitrogen)）に連結し、マウスXIII型コラーゲンのＮＣ１〜ＮＣ４ドメイ ンのＰＣＲクローンをプロ ーブとして使用して、このライブラリーからクローンＲＧ．６を単離した。ＲＴ −ＰＣＲを使用してクローン１８を得た。逆転写反応は，鋳型として新生児マウ スＧＵＴ ＲＮＡ、そしてプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１７を使用し、次に プライマー：Ｍ−１１（5'-ATGCCATCGGAGGAGGCAG-3'）とＭＲ−１３（5'-GTTCCA GCAGCCTTGGACTGGTAAGC-3'）を使用する第１回目のＰＣＲ、およびプライマー： ＭＲ−１５（5'-GCCTCCAGGAATGAAGGGAGAAGT-3'）とＭＲ−１３（5'-GTTCCAGCAGC CTTGGACTGGTAAGC-3'）を使用する第２回目のＰＣＲにより、行った。これらの生 成物をｐＣＲ１０００（インビトロゲン（InVitrogen)）に連結し、Ｍ９１断片 とプローブ結合することによりクローンＩ８を得た。ＮｏｔＩを使用して各ライ ブラリーベクターから、ＧＵＴ２２９Ａ、ＧＵＴ２１９．２．４、ＲＧ．６、お よび１８挿入体を放出させた。これらのＮｏｔＩ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に連結して、ＧＵＴ２２９Ａ、ＧＵＴ２１９．１．４ 、およびＲＧ．６を得た。 ＭＯＡＢＣＤ．５は、以下のようにして構築した：クローンｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ−ＧＵＴ２１９．１．４を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、得られた ９６０塩基対断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＵ Ｔ２２９Ａに連結して、クローンＭＯＡＢ．３を得た。プラスミドｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ−１８をＳｔｕＩとＨｉｎｄIIIで消化し、得られた３１０塩基対断 片を、ＳｔｕＩ／ＨｉｎｄIII消化ＭＯＡＢ．３に連結して、クローンＭＯＡＢ Ｃ．５を得た。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＲＧ．６をＸｂａＩとＨｉ ｎｄIIIで消化し、得られた２５０塩基対断片をＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII消化ＭＯ ＡＢＣ．５に連結して、クローンＭＯＡＢＣＤ．５を得た。 ＭＯＡＢＣＤ．５をＳｔｕＩとＳａｃＩで消化し、得られた６７３塩基対のＳ ｔｕＩ−ＳａｃＩ断片を、クローン６８９（プラスミドＰ４０）のｓｔｕＩおよ びＳａｃＩ部位に連結して、プラスミドｍｏＣ−２を得た。プラスミドｍｏＣ− ２をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化し、この１５０４塩基対のＢａｍＨＩ−Ｓａｃ Ｉ断片を、プラスミドＰ４０−１のＢａｍＨＩおよびＳａ ｃＩ部位に連結してプラスミドｐＢＳｍｏXIIIを得た。ｐＢＳｍｏXIIIをＥｃｏ ＲＩで消化して、７塩基対の５’非翻訳と２８８塩基対の３’非翻訳を有する、 完全長XIII型コラーゲン変異種(variant)を作製し、この断片をｐＶＬ１３９２ のＥｃｏＲＩ部位にクローン化してプラスミドｐＶＬｍｏＸIIIを得た。マウス のXIII型コラーゲンの＿１鎖の別の交互にスプライスされた完全長ｃＤＮＡ変異 種を構築し、ｐＶＬｍｏXIII（−Ｅ１２／−Ｅ１３）と名付けた。この構築物は 、エキソン１２をコードする配列を欠く以外は、ｐＶＬｍｏXIIIと同じである。 ｐＶＬＣ１５Ａ１：本バキュロウイルス転移ベクターを、XV型プロコラーゲン ｃＤＮＡ(Kivirikko et al.，J ．Biol．Chem. 269:4773-4779(1994))のヌクレオ チド１４〜１３７４をカバーするＰＣＲ断片を使用して構築した。XV型プロコラ ーゲンのｃＤＮＡは、例えば、Maniatis et al.，Molecular Cloning A Laborat ory Manual ，Cold Spring Harbor、ニューヨーク州（1989）とAusubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology ，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨーク州（1989）に記載の方法を使用して、ヒト 臍帯血ＲＮＡから作製した。このｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲプライ マー：５’プライマー（5'-GATATCACCCTTCGTCCTCCGCTAAGCTC-3')，および３’プ ライマー（5'-GAATTCTGGCCTCCACTTCCCCAGGCAT-3'）を用いて、XV型プロコラーゲ ンのヌクレオチド１４〜１３７４をカバーするＰＣＲ断片を作製した。このＰＣ Ｒ断片は、５’末端にＥｃｏＲＶリンカー配列を有し、３’末端にＥｃｏＲＩリ ンカー配列を有する。このＰＣＲ断片をＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ部位に連結した。この 構築物をＳｐｈ１（Kivirikko et al.，J ．Biol．Chem. 269:4773-4779（1994） に記載の配列のヌクレオチド１３５５に対応する配列でＰＣＲ断片を切断する） とＥｃｏＲＩ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカー位で消化する）で消化し た。Kivirikko et al.，J ．Biol．Chem. 269:4773-4779（1994）のヌクレオチド １３５５〜４３３０をカバーするクローンＳＫ５−３のＳｐｈ１−ＥｃｏＲＩ断 片を、上記のＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで消化した 構築物で連結して、構築物ｐＢＳｈｕXVを得た。クローンＳＫ５−３は、ヒトの 胎盤（Clontech）由来のλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーから単離し、ＳＫ５ −３挿入体は、ＥｃｏＲＩで消化して放出され、この挿入体を、ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ（ＳＫ−）のＥｃｏＲＩ部位に連結してＳＫ５−３を得た。ｐＢＳｈｕ XVをＥｃｏＲＶ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー位で切断）とＨｉｎｃII （ＸＶ型コラーゲンのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド４３０９で切断）で消化して 、７６塩基対の５’非翻訳領域と５３塩基対の３’非翻訳領域を有する、ＣＯＬ XVの完全長ｃＤＮＡを作製し、この断片をｐＶ１１３９２（Luckow et al.，Vir ology 170:31-39(1989)）のＳｍａ１部位にクローン化してプラスミドｐＶＬＣ Ｌ５Ａ１を得る。 Ｍ１８Ｋ：本バキュロウイルス転移ベクターを、ポリヘドロンベースのバキュ ロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３（インビトロゲン（InVitrogen)）とｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ Ｍ１８ｋｏｋ．１１（ｐＢｓＭ１８ｋｏｋ．１１ ）（これは、クローンＳＸＴ−５Ｂ５、ＭＭ−１０３（Rehn et al.，J ．Biol． Chem. 269:13929-13953(1994))、およびＭＭ２１．３から作製される）を使用し て構築した。 ｃＤＮＡ ＳＸＴ−５Ｂ５を同定し、以下のようにしてマウス胚（クロンテク (Clontech)）から作製したλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーからクローン化し た。マウスのXIII型コラーゲンのプローブＧ２を使用してライブラリーをスクリ ーニングして、クローンＭＥ−ｌを同定した。Ｇ２は、鋳型として新生児マウス の消化管ＲＮＡと、プライマー：５’プライマーＭＲ−６(5'-CCGGTGAGCCTGCTTG TCCT-3')、および３’プライマーＭＲ−１１（5'-ATGCCATCGGAGGAGGCAG-3'）を 使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより作製した。このＰＣＲ生成物をベクターＰＣＲ− １０００（インビトロゲン（InVitrogen)）に連結し、構築物をさらにＥｃｏＲ Ｉ−ＨｉｎｄIIIで消化してプローブＧ２を得た。ＭＥ−１は、マウスα１（XVI II）ｍＲＮＡ(Rehn et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:4234-4238(1994) に記載されている)の２．３kbをカバーし、これを使用してマウス胚ライブラリ ーを再スクリーニングし、クローンＳＸＴ−５Ｂ５をクローン化し、ＥｃｏＲＩ で消化して これを単離し、ＳＸＴ−５Ｂ５挿入体をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＥｃｏＲ Ｉ部位に連結して、マウスα１（XVIII）鎖クローンＳＸＴ−５（ＳＸＴ−５は 、Rehn et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:4234-4238（1994）に記載され ている）の５４０塩基対の末端５’配列を含有するプラスミドｐＢｓ（ＳＫ）Ｓ ＸＴ−５Ｂ５を得た。 ｃＤＮＡクローンＭＭ−１０３は、チオシアン酸グアニジウム法（Chomczynsk l et al.，Anal．Biochem．162:156-159(1987)）により単離した成体マウス肝（ ＢＡＬＰ／ｃ株）からのポリ（Ａ）ＲＮＡのλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリー から、次にオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーを２回行って、得た 。オリゴ（ｄＴ）プライマーとタイムーセーバー−ｃＤＮＡ合成キット(Time-Sa ver-cDNA synthesis kit)(ファルマシア(Pharmacia))を使用して、このＲＮＡか らｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーをＭＥ−ｌからのプロー ブでスクリーニングし、ＮｏｔＩで消化してクローンＭＭ−１０３を単離した。 挿入体ＭＭ−１０３をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＮｏｔＩ部位に連結して、 ｐＢｓ（ＳＫ）ＭＭ−１０３を得た。(Rehn et al.，J ．Biol．Chem. 269:13953 (1994))。 ｃＤＮＡクローンＭＭ−２１．３を同定し、オリゴ（ｄＴ）法（前述、Rehn e t al.，J ．Biol．Chem. 269:13924-13935(1994))を使用して成体マウス肝（ＢＡ ＬＢ／ｃ株）ポリ（Ａ）ＲＮＡから作製してあったλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブ ラリーから、このライブラリーをプローブＳＸＴ−５Ｂ５とＭＥ−１でスクリー ニングしてクローン化した。このクローンをＮｏｔＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔＳＫのＮｏｔＩ部位に連結して、プラスミドｐＢｓ（ＳＫ）ＭＭ−２１ ．３を得て、これは、マウスα１（XVIII）鎖（Rehn et al.，Proc ．Natl．Acad ．Sci．USA 91:4234-4238(1994))のヌクレオチド３６０〜２５７２をカバーする 。 プラスミドｐＢｓ（ＳＫ）ＳＸＴ−５Ｂ５をＥｃｏＲＩで消化し、得られた５ ４０塩基対断片を、プラスミドｐＢｓ（ＳＫ）ＭＭ−２１．３のＥｃｏＲＩ消化 した５kb断片（挿入体＋Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にさらにクローン化して、プラ スミドｐＢｓＭ１８ｋｃ．ＡＢを得た。ｐＢｓＭ１８ｋｃ． ＡＢをＥｃｏＲＶとＮｓｉＩで消化して２．５kb断片を得て、プラスミドｐＢｓ ＭＭＩ０３をＮｓｉＩとＮｏｔＩで消化してｌ．５kb断片を得た。これらの２つ の断片を、ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連 結して、プラスミドｐＢｓＭ１８ｋｏｋ．１１を得て、これは、２２塩基対の５ ’非翻訳領域と１８０塩基対の３’非翻訳領域を有する、マウスXVIII型コラー ゲンのα１鎖（１３１５のアミノ酸残基）の最も短い変異種の完全長ｃＤＮＡを 含有する。ｐＢｓＭ１８ｋｏｋ．１１をＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩで消化し、この断 片をｐＶ１．１３９３のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化してプラスミドＭ １８Ｋを得た。 Ｍ１８ＶＡ２Ｋ:ポリヘドロンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ １３９３（インビトロゲン(InVitrogen)）と、ｐＢｓｖ２．５（これは、クロー ンＰＥ１７．２４（Rehn et al.，J ．Biol．Chem. 269:13929-13953(1994)）と ＰＸ４．３（Rehn et al.，J ．Biol．Chem. 269:13929-13953(1994)）から作製 される)、およびプラスミドｐＢｓＭ１８ｋｏｋ．１１（前述、構築物Ｍ１８Ｋ を参照）を使用してｐＢｓＭ１８ＶＡ２Ｋを作製して、本バキュロウイルス転移 ベクターを構築した。 １８．５日令のマウス胚ポリ（Ａ）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡプールから、 プライマー(5'-GATGGCAAATAGCACCC-3')を使用して、ｃＤＮＡクローンＰＥ１７ ．２４を単離する。この合成からのｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターに連結し、生 成物を、ＭＥ−１からのプローブを使用してスクリーニングする。こうしてクロ ーンＰＥ１７．２４を同定し、挿入体をＮｏｔＩで消化して単離し、ｐｅ１７． ２４挿入体をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＮｏｔＩ部位に連結して、ｐＢｓ（ ＳＫ）ＰＥ１７．２４を得た。 ｐＢｓＰＥ１７．２４をＥｃｏＲＩで消化し、XVIII型コラーゲンＮＣＩドメ インの長い７６４残基型をカバーするために、得られた４．８kb断片（挿入体＋ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にＰＸ４．３のＥｃｏＲＩ消化した９０塩基対断片を連 結することにより、クローンＰＥ１７．２４とＰＸ４．３からプラスミドｖ２． ５を作製した。 ３塩基対の５’非翻訳領域と１８０塩基対の３’非翻訳領域を含む、最も 長い変異種α１（XVIII）鎖（１７７４のアミノ酸残基）をコードする完全長ｃ ＤＮＡを構築するために、プラスミドｖ２．５をＣｌａ１で消化し、得られた１ ．５kb断片を、ｐＢｓＭ１８ｋｏｋ．１１（前述したプラスミド、構築物Ｍ１８ Ｋを参照）のＣｌａ１消化した７．３kb断片（挿入体＋Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の他のＣｌａ１部位）に連結して、クローンｐＢｓＭ１ ８ＶＡ２Ｋを得た。ｐＢｓＭ１８ＶＡ２Ｋを、ＥｃｏＲＶとＮｏｔＩでさらに消 化して、得られた断片を、ｐＶＬ１３９３のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン 化してＭ１８ＶＡ２Ｋを得た。 Ｍ１８ＮＣ１：ｃＤＮＡクローンＳＸＴ−５ＢＴ（前述、構築物Ｍ１８Ｋを参 照）とＭＥ−１（Rehn et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91.:4234-4238(19 94))、およびポリヘドロンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９ ３（インビトロゲン(InVitrogen)）を使用して、本バキュロウイルス転移ベクタ ーを構築した。ＳＸＴ−５Ｂ５を同定し、前述のようにクローン化した（構築物 Ｍ１８Ｋを参照）。ＭＥ−１は、マウスα（XVIII）ｍＲＮＡ（Rehn et al.，Pr oc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:4234-4238（1994)に記載されている）の２．３kb をカバーし、これは、マウスXVIII型コラーゲンα１鎖の最も短い変異種のＮ− 末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）をコードする（クローンＭＥ−ｌの性状 解析と単離は前述、構築物Ｍ１８Ｋを参照)。 ＭＥ−１を鋳型として、プライマー：５’プライマー−Ｔ７、１７量体プライ マー(5'-AATACGACTCACTATAG-3')、および３’プライマーＭ１８Ｂａｃｌ(5'-GAA GGGGCTTGATAAATGAGGATCCAT-3')（フレーム内終結コドンとＢａｍＨＩ消化部位を 含む）を使用して、ＰＣＲによりＮＣ１ドメインの３’末端に、終結コドンを作 製する。この４００塩基対のＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、 ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫに連結して、プラ スミドｐＢｓＮＣIIを作製し、ｐＢｓＳＸＴ−５Ｂ５をＥｃｏＲＩで消化し、得 られた５４０塩基対断片をさらに、ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｓＮＣＩＬにクロー ン化して、プラスミドｐＢｓＭ１８ＮＣ１（ＮＣ１ドメインと２２塩基対の５’ 非翻訳配列をコードする）を得 た。ｐＢｓＭ１８ＮＣ１をＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩで消化し、得られた断片をｐＶ Ｉ１３９３のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化して、プラスミドＭ１８ＮＣ １を得る。 Ｍ１８ＶＡ２Ｎ：ポリヘドロンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ １３９３（インビトロゲン(InVitrogen)）と、プラスミドｐＢｓＭ１８ＮＣ１（ 前述、構築物Ｍ１８ＮＣ１を参照）、およびプラスミドｐＢｓＶ２．５（構築物 Ｍ１８ＶＡ２Ｋを参照）を使用して、本バキュロウイルス転移ベクターを構築し た。プラスミドｐＢｓＶ２．５をＣｌａＩで消化し、得られた１．５kb断片を、 ｐＢｓＭ１８ＮＣｌのＣｌａＩ消化した４． ８kb断片にクローン化して、プラ スミドｐＢｓＭ１８ＶＡ２．３（XVIII型コラーゲンのα１鎖の最も長い変異種 アミノ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣＩ−７６４）をコードする）を得た。 ｐＢｓＭ１８ＶＡ２．３をＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩで消化し、得られる断片を、 ｐＶＬ１３９３のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化して、プラスミドＭ１８ ＶＡ２Ｎを得る。 Ｍ１８Ｃ：ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ）ＭＭ−１０３（前述、構 築物Ｍ１８Ｋを参照）とポリヘドロンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐ ＶＬ１３９３（インビトロゲン(InVitrogen)）を使用して、バキュロウイルス転 移ベクターを構築した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ）ＭＭ−１０３は、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＮｏｔＩ部位でマウスXVIII型コラーゲンのａ１鎖の Ｃ−末端のためのｃＤＮＡをコードする。ｐＢｓ（ＳＫ）ＭＭ−１０３をＥｃｏ ＲＩ−ＮｏｔＩで消化して、１８０塩基対の３’非翻訳領域を有するＣ−末端非 コラーゲン性ドメイン（アミノ酸残基９９７〜１３１５）に対応する、ヌクレオ チド３０１０〜３０１２に翻訳開始コドンを有するヌクレオチド２８０２〜４０ ８０（Rehn et al.，J ．Biol. Chem. 269:13929-13953(1994)を参照）をカバー するｃＤＮＡ断片を得た。この断片を、ｐＶＬ１３９３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ 部位にクローン化して、プラスミドＭ１８Ｃを得る。 ２．コラーゲン修飾酵素を含有する組換えベクターの構築 ｐＶＬβ:ポリヘドロンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１ ３９２と、ＥｃｏＲＩ部位にヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユ ニットについての完全長ｃＤＮＡを含有するベクターｐＢｓ（ＳＫ−）Ｓ１３８ （Pihalajaniemi et al.，EMBO ．J. 6:643(1987)）を使用して、本バキュロウイ ルス転移ベクターを構築した。ヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼに対する精 製抗体でスクリーニングしたヒト肝臓癌λｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーか ら、β−サブユニットクローンＨＢ−９５を得た。ヒト・プロリル４−ヒドロキ シラーゼのβ−サブユニットのプローブとしてＨＢ−９５を使用して、ヒト胎盤 （クロンテク(Clontech)）由来のλｇｔ１１ライブラリーから、クローンＳ１３ ８（ヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼβ−サブユニット）を同定し、同定さ れたλｇｔ１１クローンからＥｃｏＲＩで挿入体を放出させて、ＥｃｏＲＩ断片 をｐＢＳ（ＳＫ−）（ストラタジーン(Stratagene)）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し てベクターｐＢｓ（ＳＫ−）Ｓｌ３８を構築した。 ｐＢｓ（ＳＫ−）Ｓ１３８をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化して、完全長ｃＤ ＮＡ＋４４塩基対の５’非翻訳および２０７塩基対の３’非翻訳領域をを作製し 、この断片をｐＶＬ１３９２（Vuori et al.，Proc ．Natl．Acad. Sci．USA 89: 7467-7470(1992)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化して、プラスミ ドｐＶＬβを得た。 ｐＶＬα：ＳｍａＩ部位にヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼα−サブユニ ット（Helakoski et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:4392-439６(1989)） の完全長ｃＤＮＡを含有するベクターｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９と、ポリヘドロ ンベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２を使用して、本バキュ ロウイルス転移ベクターを構築した。クローンＰＡ５９（ヒト・プロリル４−ヒ ドロキシラーゼβ−サブユニット）を以下のようにして得た。プロリル４−ヒド ロキシラーゼのα−サブユニットからのペプチド（Gln-Val-Ala-Asn-Tyr-Gly） をコードするオリゴヌクレオチド混合物を使用して、ＨＴ１０８０細胞からのｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１つの陽性クローンＨＴＡ−２を得 て、ＨＴＡ−２配列由来の３６量体オリゴヌクレオチド（α−サブユニットのヌ クレオチド１４３０〜１４６ ５）を使用して、ヒト胎盤λｇｔ１１ライブラリー（クロンテク（Clontech)） をスクリーニングした。２つの陽性クローンＰＡ−１１とＰＡ−１５を単離し、 これらのクローンで胎盤ライブラリーを再スクリーニングして完全長クローンＰ Ａ５９を得た。 クローンＰＡ５９をＨｉｎＰ１とＡｃｃＩで消化してλｇｔ１１挿入体を放出 させ、ＰＡ５９断片をクレノウ（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech) ）で平滑末端にし、平滑末端(blunt ended)ＰＡ５９断片をｐＢＳ（ＳＫ−）（ ストラタジーン(Stratagene)）のＳｍａＩ部位にクローン化して、ベクターｐＢ Ｓ（ＳＫ−）ＰＡ５９を構築した。 ｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９をＰｓｔＩとＢ ａｍＨＩで消化して、完全長ｃＤＮＡ＋６１塩基対の５’非翻訳領域および５５ １塩基対の３’非翻訳領域を含有するＰｓｔＩ−ＰｓｔＩおよびＰｓｔＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片を作製し、これらの断片をｐＶＬｌ３９２(Vuori et al.，Proc ．Nat l．Acad．Sci．USA 89:7467-7470(1992)）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位にクロー ン化して、プラスミドｐＶＬαを得た。 ｐ２Ｂａｃβ：ｐＢＳ（ＳＫ−）Ｓ１３８をＥｃｏＲＩで消化してＳ１３８ク ローンを放出させ、次にＳ１３８断片をｐＢＳ（ＫＳ−）Ｓ１３８のＥｃｏＲＩ 部位に挿入して、ｐＢＳ（ＫＳ−）Ｓ１３８を構築した。ｐＢＳ（ＫＳ−）Ｓ１ ３８をＢａｍＨＩで消化して、４４塩基対の５’非翻訳領域と２０７塩基対の３ ’非翻訳領域を含有するヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼの完全長β−サブ ユニットを得た。この断片をｐ２ＢａｃのＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐ ２Ｂａｃβを得た。 ｐＢｓ（ＳＫ−）ＰＡ５９をＰＣＲにより突然変異させて、ＮｏｔＩ部位をプ ロリル４−ヒドロキシラーゼのα−サブユニットの開始コドンの４６塩基対上流 に置いて、以下のようにプラスミドｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９／５’ＵＴＮｏｔ Ｉを得た。このプラスミドｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９とプライマー：５’プライ マー(5'-GCCCTCGCGGCCGCCTTTCCAGGT-3')、および３’プライマー(5'-TGACATATCC TTAAGGACCAGTTC-3')を、第１回目のＰＣＲ反応で使用し、ｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ ５９とプライマー：５’プライマー（5'- CGAGGTATCGATAAGCTTG-3')、および３’プライマー（第１回目のＰＣＲ反応から の断片）を使用して、第２回目のＰＣＲ反応を行う。第２回目のＰＣＲ生成物を ＣｌａＩとＡｆ１IIで消化し、ｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９に連結して、ｐＢＳ（ ＳＫ−）ＰＡ５９／５’ＵＴＮｏｔＩを得る。ｐＢＳ（ＳＫ−）ＰＡ５９／５’ ＵＴＮｏｔＩをＮｏｔＩで消化して、４６塩基対の５’非翻訳領域と５５１塩基 対の３’非翻訳領域を含有するプロリル４−ヒドロキシラーゼの完全長α−サブ ユニットを有する断片を得る。この断片をｐ２ＢａｃβのＮｏｔＩ部位にクロー ン化して、プラスミドｐ２Ｂａｃβを得る。３.プロリル４−ヒドロキシラーゼ を有する昆虫細胞中での組換えコラーゲン遺伝子の発現 組換えヒト・コラーゲンＩ、II、III、IV、XIII、XV、およびXVIIIは、バキュ ロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞で発現されている。 III 型コラーゲンの発現。ｐＶＬＣ３Ａ１は、ヒトIII型コラーゲンの完全なｐ ｒｏα１鎖をコードする組換え発現ベクターである。昆虫細胞でのヒト・プロリ ル４−ヒドロキシラーゼの発現のために、同様のバキュロウイルス発現ベクター ｐＶＬα、ｐＶＬβ、およびｐ２Ｂａｃβを作製した。これらの構築物を、バキ ュロゴールド（Baculo Gold^a）トランスフェクションキット（ファルミゲン(Pha rmigen)）を使用して、昆虫細胞に種々の組合せでトランスフェクトした。 昆虫細胞（Ｓｆ９またはハイファイブ(High Five)、インビトロゲン（InVitro gen)）を、１０％胎児牛血清（バイオクリア(BioClear)）を補足したＴＮＭ−Ｆ Ｈ培地（シグマ(Sigma)）または無血清ＨｙＱ ＣＣＭ３培地（ハイクローン(Hy Clone)）中で、単層としてまたはシエーカーフラスコ中の懸濁液として２７℃で 培養した。組換えタンパク質を産生するために、５〜６×１０５／mlの密度で接 種した昆虫細胞を、組換えウイルスで感染多重度５〜１０で、そしてヒト・プロ リル４−ヒドロキシラーゼの（サブユニットおよび（サブユニット（Vuori et a l.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:7467-7470(1992))）についてのウイルスで 感染多重度(multiplicity)１で感染させた。培地に毎日アスコルビン酸（８０μ g/ml）を加えた。感染 の４８〜１２０時間後細胞を回収し、０．１５Ｍ ＮａＣｌと０．０２Ｍリン酸 塩（ｐＨ７．４）で洗浄し、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．２％トリトンＸ−１００ および０．０７Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）でホモジナイズし、１０，０００ ｇで２０分間遠心分離した。ホモジナイズ化緩衝液に不溶性の残存細胞ペレット を、１％ＳＤＳでさらに可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１で解析した。細胞培養培 地を、限外ろ過セル（Cmicon）でＰＭ−１００膜を使用して１０倍濃縮した。細 胞ホモジネートの上清のアリコートと濃縮した細胞培養培地を、変性性ＳＤＳ− ＰＡＧＥで解析し、次にクーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはヒ トIII型プロコラーゲンのＮ−プロペプチドに対する抗体を用いるウェスタンブ ロッティング法で解析した。 さらに詳しくは、Ｓｆ９およびハイファイブ(High Five)細胞を、ｐｒ０α１ （III）鎖をコードする組換えバキュロウイルスで感染させ、感染の７２時間後 に回収し、０．２％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液でホモジナイズし、遠 心分離した。次に、トリトンＸ−１００可溶性タンパク質画分と濃縮した細胞培 養培地のアリコートを、ペプシン処理無しまたは２２℃で１時間ペプシン処理後 解析した。試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、Ａでクーマシー染色およ びＢでヒトIII型プロコラーゲンのＮ−プロペプチドに対する抗体を使用するウ ェスタンブロッティングにより解析した。図６に示すように、レーン１は分子量 マーカー：レーン２〜３は、細胞抽出物；レーン４〜５は、Ｓｆ９細胞培養物か らの培地；レーン６〜７は、細胞抽出物；そしてレーン８〜９は、ハイファイブ （High Five）細胞培養物からの培地である。奇数番号レーンの試料は、ペプシ ンで消化した。ウェスタンブロッティングで使用した抗体は、III型プロコラー ゲンのＮ−プロペプチドとのみ反応するため、ペプシン消化試料を認識しない。 矢印は、ｐｒｏα１（III）とα１α１（III）鎖を示す。 他のアリコートは、ヒトIII型プロコラーゲン（Farmos Diagnostica）のトリ マー性Ｎ−プロペプチドについてラジオイムノアッセイ、および４−ヒドロキシ プロリン（Kivirikko et al.，Anal ．Biochem. 19:249-255（1967)）についての 比色法により試験した。さらに別のアリコートを、ペプシン で２２℃で1時間（Bruckneret al.，Anal ．Biochem. 110:360-368（198l)）消化 し、トリプシンとキモトリプシンの混合物による迅速消化により、ペプシン耐性 組換えIII型コラーゲンの熱安定性を測定した。 Ｓｆ９とハイファイブ（High Five）細胞中のトリトンＸ−１００可溶性タン パク質（図６Ｂ、レーン２と６）および細胞培養培地（図６Ｂ、レーン４と８） の試料中で、ウェスタンブロッティングにより、ｐｒｏα１（III）の発現レベ ルが見られた。ペプシン消化後、クーマシー染色ゲル中のハイファイブ（High F ive）細胞でIII型コラーゲンの（１鎖が見られた（図６Ａ、レーン７)。使用し た抗体はｐｒｏα１（III）鎖のＮ−プロペプチドとのみ反応し、これはおそら くペプシンで消化されたため、ペプシン耐性（１（III）鎖は、ウェスタンブロ ット中に検出されなかった（図６Ｂ、レーン３、５、７、および９)。 Ｓｆ９とハイファイブ（High Five）細胞を、プロリル４−ヒドロキシラーゼ の２つの型のサブユニットをコードするウイルス有りまたは無しで、ｐｒｏα１ （III）鎖をコードするウイルスで感染させた(表III)。総III型プロコラーゲン の発現レベルは、トリマー性Ｎ−プロペプチドについてのラジオイムノアッセイ で測定し、細胞中で生成した４−ヒドロキシプロリンの量は、比色法で測定した 。両方の値を使用して、すべてのｐｒｏα１（III）鎖が３重らせん分子を形成 し、ｐｒｏα１（III）鎖中のすべてのヒドロキシル化可能なプロリン残基が４ −ヒドロキシプロリンに変換されると仮定して、産生されたIII型コラーゲンの 量を計算した。III型プロコラーゲンの既知の構造とIII型コラーゲン中の４−ヒ ドロキシプロリンの量に基づき、試料中のIII型コラーゲンの量を、得られたＮ −プロペプチド値に７を掛け、４−ヒドロキシプロリン値に８を掛けて計算した 。すべての測定は、感染の７２時間後に行った。 表IIに示すように、異なる実験で得られた値にかなりの変動が見られた。この 変動にもかかわらず、表IIは：まず、生成した４−ヒドロキシプロリンの量は、 すべての実験でプロリル４−ヒドロキシラーゼをコードするウイルスで感染した 細胞中では、これがない場合より顕著に高かった。第２に、 ハイファイブ（High Five）細胞で得られた発現レベルは、Ｓｆ９細胞で得られ たレベルより常に高かった。第３に、プロリル４−ヒドロキシラーゼをコードす るウイルスで同時感染した細胞では、産生されたIII型コラーゲンのレベルは、 ラジオイムノアッセイ値より４−ヒドロキシプロリン値から計算した時に常に高 く、III型プロコラーゲンのＮ−プロペプチドの一部が分解されているか、また は完全に４−ヒドロキシル化ｐｒｏα１（III）鎖の一部が３重らせんでないま ま残ったことを示唆していた。最も高いIII型コラーゲン発現値は、ハイファイ ブ（High Five）細胞中であり、これはまたプロリル４−ヒドロキシラーゼを発 現し、これらの細胞中の細胞性III型コラーゲンの量は、約４１〜８１μｇ／５ ×１０６細胞であった(表111)。ラジオイムノアッセイで測定した時の、培養培 地中に分泌されたIII型コラーゲンの量は、Ｓｆ９細胞中の総量の約２５〜５０ ％であり、ハイファイブ（High Five）細胞中の総量の約１０〜３０％であった 。 ハイファイブ（High Five）細胞をシェーカーフラスコ中で懸濁液で増殖させ た実験も行った。上記と同様にこれらの実験で、プロリル４−ヒドロキシラーゼ をコードするウイルスの同様の作用が見られた。この実験で見られた最も高い発 現レベルは、７２時間で培養物１リットル当たり約４０mgまでのIII型コラーゲ ンが産生され、産生されたコラーゲンの約８０〜９０％は細胞ペレット中に乱さ れ、１０〜２０％は培地中にあった。 表III プロリル４−ヒドロキシラーゼのＡおよびＢサブユニット有りおよび無しの、ヒ トIII型プロコラーゲンのｐｒｏα１鎖を発現する昆虫細胞からのトリトンＸ− １００抽出物のプロリル４−ヒドロキシラーゼ活性 細胞は、組換えポリペプチドを発現しないか、またはｐｒｏα１（III）鎖の みを発現するか、または後者＋プロリル４−ヒドロキシラーゼのαおよびβサブ ユニットを発現した。解析は、感染の７２時間後に行った。 値は、dpm／１０μｌのトリトン抽出物、ハイファイブ（High Five）細胞につ いての３つの実験で得られた二重測定値の平均、およびＳｆ９細胞の１つの実験 の二重測定値の平均として示す。 Ｉ型コラーゲンおよびII型コラーゲンの発現 ヒト・コラーゲンＩのｐｒｏα １およびｐｒｏα２鎖の発現のために、バキュロウイルス発現ベクタ−ｐＶＬＣ １Ａ１とｐＶＬＣ１Ａ２を作製し、ヒト・コラーゲンIIのｐｒ０α１鎖の発現の ために、ｐＶＬＣ３Ａ１５’ＵＴ／Ｃ２Ａ１を作製した。 特に明記しない場合は、昆虫細胞は培養し、前述した方法に従って組換えコラ ーゲンを産生した。 プロリル４−ヒドロキシラーゼの存在下で、および細胞ホモジネートの上清の ペプシン消化後の、ｐｒｏα１（Ｉ）、およびｐｒｏα１（Ｉ）とｐｒｏα２（ Ｉ）の発現レベルが、銀染色した５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見られた。図７、レー ン（ＤＩＡＩ）を参照。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、これらの細胞中の３重 らせんプロコラーゲンＩの形成を証明した。ｐｒｏα２鎖のＣ−末端ドメインに 対してヒスチジン標識を使用して、金属キレート親和性カラムでヘテロトリマー コラーゲンＩから、ホモトリマーコラーゲンが分離できる。 クーマシー染色した５％ＳＤＳ ＰＡＧＥで、プロリル４−ヒドロキシラ ーゼの存在下でｐｒｏα１（II）の発現レベルが見られた。図８を参照(図中、 レーン１は、Ｉ型コラーゲンのホモトリマーの発現を示し：レーン２は、II型プ ロコラーゲンの標準試料であり；レーン６は、III型プロコラーゲンの標準試料 であり；レーン３〜５は、種々の量のヒトIII型プロコラーゲンを含有するヒトI I型プロコラーゲンの３つの異なる構築物を比較している。レーン３は、III型プ ロコラーゲンのＣ−末端を有するII型プロコラーゲンである；レーン４は、III 型プロコラーゲンからのＮ−末端非コラーゲン性領域を有するII型プロコラーゲ ンである：そしてレーン５は、III型プロコラーゲンのＮ−末端およびＣ−末端 領域を有するII型プロコラーゲンである)。 ヒトII型コラーゲンの発現のためのいくつかのバキュロウイルスベクターを構 築した。これらのベクターの１つにおいて、ヒトII型コラーゲンの５’非翻訳領 域を、ヒトIII型コラーゲンの５’非翻訳領域で置換した。別のベクターでは、 全ヒトII型コラーゲン遺伝子を発現した。別の昆虫発現ベクターでは、II型コラ ーゲンのＮ−プロペプチドを、III型コラーゲンのＮ−プロペプチドで置換した 。これらのベクターの３つすべては、異なるレベルでヒトII型コラーゲンを発現 することがわかった。発現は、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェス タンブロット解析により検出した。 IV 型、XIII型、およびXVIII型コラーゲンの発現 ｐＶＬＣ４Ａ１は、ヒト・ コラーゲンIVのｐｒｏα１鎖をコードする組換えバキュロウイルス発現ベクター である。ｐＶＬｈｕXIIIは、ヒト・コラーゲンXIIIのｐｒｏα１鎖をコードする 組換えバキュロウイルスベクターである。ｐＶＬＣ１５Ａ１は、ヒト・コラーゲ ンXVのｐｒｏα１鎖をコードする組換え発現ベクターである。Ｍ１８ＫとＭ１８ ＶＡ２Ｋは、ヒトXVIII型コラーゲンのｐｒｏα１鎖の２つの変異種をコードす る組換え発現ベクターである。 特に明記しない場合は、昆虫細胞は培養し、前述方法に従って組換えコラーゲ ンを産生した。ｐＶＬＣ４Ａ１、ｐＶＬｈｕXIII、ｐＶＬＣ１５Ａ１、Ｍ１８Ｋ 、およびＭ１８ＶＡ２Ｋは、昆虫細胞中に形質転換され、組換えコラーゲンはう まく発現されている。 ４．組換えコラーゲンの精製と解析 組換えIII型コラーゲンの精製 昆虫細胞中で産生された精製ヒトIII型コラー ゲンの性質は、種々の組織から抽出されたIII型コラーゲンの性質に非常によく 似ていた(Kielty et al.，Connective Tissue and Its Heritable Disorders:Mo lecular ，Genetic and Medical Aspects, pp．E103-147(1993);Kivirikko et al .，Ann ．Med. 25:113-125(1993);van der Rest et al.，Adv ．Mol．Cell Biol. 6 :1-67（1993）；Brewton et al.，Extracellular Matrix Assembly and Struct ure pp.129-170(1994);Pihlajaniemi et al.，Prog ．Nucleic Acid Res．Mol．B iol. 50:225-262(1995);Prockop et al.，Annu ．Rev．Biochem. 64:403-434(199 5))。特に、ＣＤスペクトルで測定した時、４−ヒドロキシプロリンの含量と３ 重らせんのＴｍは、真正のIII型コラーゲンとほとんど同じであった。組換えコ ラーゲン中のヒドロキシリジンの含量は、種々の組織から抽出したIII型コラー ゲンの約半分であり、昆虫細胞は高いレベルのリジルヒドロキシラーゼ活性を有 するはずであることを示している。 組換えIII型プロコラーゲンを発現する昆虫細胞を、０．１５Ｍ ＮａＣｌと ０．０２Ｍリン酸塩（ｐＨ７．４）の溶液で洗浄し、冷０．２Ｍ ＮａＣｌ、０ ．１％トリトンＸ−１００および０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）でホモ ジナイズし(２０×１０６細胞／ｍｌ)、氷上で３０分インキュベートし、１６， ０００×ｇで３０分間遠心分離した。特に明記しない場合は、以下のすべての工 程は４℃で行った。上清を、平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ−５２ 、Whatman）でクロマトグラフィーを行い、０．２Ｍ ＮａＣｌと０．０５Ｍト リス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、ボイド容積を集めた。試料のｐＨを２．０ 〜２．５に下げ、試料を最終濃度１５０μｇ/mlのペプシンで２２℃で１時間消 化した。試料を中和して、次に氷上で一晩インキュベートしてペプシンを不可逆 的に不活性化した。最終濃度２Ｍになるように固体ＮａＣｌを加えて、１６，０ ００×ｇで１時間遠心分離して、組換えIII型コラーゲンを沈殿させた。ペレッ トを０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ尿素および０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７ ．４）で１日溶解し、試料 を上記のようにペプシンで２回目の消化を行った。次に試料を、セファクリルＨ Ｒ−５００ゲルろ過カラム（ファルマシア(Pharmacia)）でクロマトグラフィー を行い、０．２Ｍ ＮａＣｌと０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）の溶液で溶出し 、０．１Ｍ酢酸に対して透析して凍結乾燥した。 III型プロコラーゲンは、単層としてまたはシェーカーフラスコ中の懸濁液中 で培養したハイファイブ（High Five）細胞中で発現された。感染の７２時間後 細胞を回収し、０．１％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液中でホモジナイズ して遠心分離し、細胞ホモジネートの上清をＤＥＡＥセルロースカラムに通して 核酸を除去した。III型プロコラーゲンを含有するフロースルー画分をプールし ペプシンで消化した。これによりIII型プロコラーゲンがIII型コラーゲンに変換 され、非コラーゲン性タンパク質のほとんどが消化された。次にIII型コラーゲ ンを塩沈殿で濃縮し、可溶化し、上記のようにペプシンで処理した。最後にセフ ァクリルＳＨＲ−５００カラムでゲルろ過して、III型コラーゲンをペプシンお よび他の残存する混入物質から分離した。III型コラーゲンを含有する画分をプ ールし、透析し、凍結乾燥した。 精製したIII型コラーゲンを、還元条件下（図９、レーン２）および非還元条 件下（図９、レーン３）で５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。クーマシー染 色ゲルで混入物質は見られず、III型コラーゲン（１鎖はジスルフィド結合して いた。精製したIII型コラーゲンについてアミノ酸とＣＤスペクトル解析を行っ た。得られた組換えIII型のアミノ酸組成は、ヒトIII型コラーゲンについて報告 されているアミノ酸組成によく対応した。唯一の例外はヒドロキシリジンの量で あり、これは、真正ヒトIII型コラーゲン中の５残基／１０００アミノ酸ではな く、組換えIII型コラーゲン中では３残基／１０００アミノ酸であった。ＣＤス ペクトル解析で測定した組換えIII型コラーゲンの融解温度は、４０℃であった 。 ハイファイブ（High Five）細胞は、Ｓｆ９細胞より常に高い産生速度を与え 、最も高い産生速度は、単層で培養したハイファイブ（High Five）細胞で見ら れた最高約８０μｇの細胞性組換えヒトIII型コラーゲン／５× １０６細胞の範囲であり、これは約１２０μｇのIII型プロコラーゲンに対応す る。ハイファイブ（High Five）細胞をシェーカーフラスコ中の懸濁液で培養し た時、産生される細胞性III型コラーゲンの最大量は、約４０mg/１までの範囲で あり、約６０mg/lのIII型プロコラーゲンに対応する。 組換えIII型コラーゲンのコンフォメーションの完全性(Conformational Integ rity） トリマーへのｐｒｏα１（III）の会合を、非還元条件下でＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ解析を使用して調べた。ハイファイブ（High Five）細胞を、ｐｒｏα１ （III）とヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼの（および（サブユニットをコ ードするウイルスで同時感染させた。感染の７２時間後、細胞を回収し、０．２ ％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液中でホモジナイズし、残存する細胞ペレ ットを１％ＳＤＳ中でさらに可溶化した。トリトン可溶性タンパク質のアリコー トを、ペプシンで２２℃で１時間処理した。合成された基本的にすべてのｐｒｏ α１（III）鎖は、高分子量タンパク質バンドの消失に基づくジスルフィド結合 したトリマーであることがわかった（図１０、レーン２）。ペプシン消化後、組 換えIII型プロコラーゲンに対応するバンドを、III型コラーゲンに対応するバン ドに変換し、タンパク質はトリマーの形で残り、（１（III）鎖の間のジスルフ ィド結合の存在を示していた（図１０、レーン３）。発現された実質的にすべて のIII型プロコラーゲンは、トリトンＸ−１００含有緩衝液に可溶性であり、ト リトンＸ−１００不溶性でＳＤＳ可溶性画分中にはIII型プロコラーゲンに対応 するバンドは見られなかった（図１０、レーン４）。 異なる細胞培養条件下で発現したIII型コラーゲンの熱安定性を、種々の温度 に加熱した後、トリプシンとキモトリプシンの混合物で消化して調べた(Bruckne r et al.，Anal ．Biochem. 110:360-368(1981))。ハイファイブ（High Five）細 胞を、ｐｒｏα１（III）鎖とヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼの（および （サブユニットをコードするウイルスで感染させた。感染の７２時間後、細胞を 回収し、０．２％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液でホモジナイズし、遠心 分離した。これらの実験において、通常通り感染中に培地に毎日アスコルビン酸 を加えるかまたは省略した。トリトンＸ− １００可溶性タンパク質をまず、ペプシンで２２℃で１時間消化して、III型プ ロコラーゲンをIII型コラーゲンに変換し(Pihlajanieml et al.，EMBO J. 6:643 -649(1987))、次にペプシン処理試料のアリコートについて、トリプシン／キモ トリプシン消化を行った。次に試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、クー マシー染色で解析した。図１１Ａ〜１１Ｄは、多くのコラーゲン生成物について 、この熱安定性の結果を示す。パネルＡに示すように、細胞を、ｐｒｏα１（II I）鎖をコードするウイルスでのみ感染させて、培地からアスコルビン酸を除い た；パネルＢ、細胞を、ｐｒｏα１（III)鎖をコードするウイルスでのみ感染さ せて、通常通り培地にアスコルビン酸が存在した：パネルＣ、細胞を、ｐｒｏα １（III）鎖とプロリル４−ヒドロキシラーゼの（および（サブユニットをコー ドするウイルスで同時感染させたが、培地からアスコルビン酸を除いた；パネル Ｄ、細胞を３つのウイルスで感染させて、培地中にはアスコルビン酸が存在した 。レーンＰは、以後のトリプシン／キモトリプシン消化のないペプシンで消化し た試料であり、レーン２７〜４２は、記載の温度でトリプシン／キモトリプシン 混合物で処理した試料を示す。矢印は、（１（III）鎖の位置を示す。これらの 結果により証明されるように、プロリル４−ヒドロキシラーゼとアスコルビン酸 の存在無しでｐｒｏα１（III）鎖が発現される時、III型コラーゲンのＴｍは約 ３２〜３４℃であった(図１１Ａ)。アスコルビン酸とプロリル４−ヒドロキシラ ーゼのいずれかが存在して他方が存在しないと、熱安定性に対する作用は実質的 に増加しなかった(図１１Ｂと１１Ｃ)。これに対して、プロリル４−ヒドロキシ ラーゼとアスコルビン酸の存在下でｐｒｏα１（III）鎖を産生すると、III型コ ラーゲンのＴｍは顕著に上昇し、約３８〜４０℃であった（図１１Ｄ）。 Ｉ型コラーゲンおよびII型コラーゲンの精製と解析 Ｉ型コラーゲンとII型コ ラーゲンを、前述のように精製した。組換え昆虫細胞から発現された組換えヒト II型コラーゲンは、トリプシンおよびキモトリプシン消化に対して耐性を示した 。これらのプロテアーゼ消化実験は、３重らせんII型ヒト・コラーゲンが組換え 昆虫細胞中で生成されることを示した。 組換え昆虫細胞から発現された組換えヒトII型コラーゲンの熱安定性を測定し 、未変性のヒトＩ型コラーゲンと比較した。これらの結果は、組換えII型コラー ゲンは３重らせん構造を有することを示した。組換えII型コラーゲンのＴｍは最 大約４０℃であった。 Ａ．実施例１１：プロリル４−ヒドロキシラーゼの組換え遺伝子を発現する酵母 細胞中の組換えコラーゲン遺伝子の発現 １．コラーゲン遺伝子を含有する組換えベクターの構築 ｐＰＩＣ９ＣｏｌIII：このプラスミドは、α−接合因子(α−mating factor) 分泌シグナル（α−ＭＦＳＳ）に結合したヒトＣｏｌIII遺伝子を含有する（お よび、未変性のヒト分泌シグナルの欠失を含有する）。 ＣＯＬIII遺伝子の３’末端を、翻訳開始コドンの４１９５塩基対下流（Ｅｃ ｏＲＩ部位）から終結コドン（４４０１塩基対）まで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＭ３８を鋳型として使用し、ＰＣＲプライマー：５’プライマー（5'-GAAGGTG AATTCAAGGCTGA-3')、および３’プライマー（5'-GCGTCTAGAGCGGCCGCTTATAAAAAGC AAACAGGGCC-3'）を使用してＰＣＲにより合成した。ＰＣＲ断片の３’末端に、 ＮｏｔＩとＸｂａＩ部位を作製した。ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化 して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ部位にクロー ン化(ｐＢＳ−ＳＭ３８は、Ala-Kokko et al．Biochem ．J. 260:509-516(1989) に記載の配列に由来する)、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｘ１ ４４２０）して、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８／Ｂを得た。 ＣｏｌIII遺伝子の５’末端を、翻訳開始コドンの７３塩基対下流から１７６ 塩基対（ＢａｍＨＩ部位）まで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＭ３８を鋳型として 使用して、ＰＣＲプライマー：５’プライマー（5'-GCGATCGATGCGGCCGCGCAGGAAG CTGTTGAAGGAGG-3')、および３’プライマー（5'-GAGAACGGATCCTGAGTCAC-3'）を 使用してＰＣＲ(配列については、Ala-Kokko et al．Biochem ．J．260:509-516( 1989)を参照)により合成した。ＰＣＲ断片の５’末端に、ＣｌａＩとＮｏｔＩ部 位を作製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８／ＢをＣｌａＩとＢａｍＨＩ で消化して、この消化物からの断片と ５’ＰＣＲ断片をＴ４ リガーゼで連結して、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ−ＳＭ３８／１１を得た。 プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８／１１をＮｏｔＩにより消化し 、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩコラーゲン断片（７３〜４４０１塩基対）を酵母発現ベク ターｐＰＩＣ９（インビトロゲン(InVitrogen)）中のα−因子シグナル配列でフ レーム内にクローン化して、プラスミドｐＰＩＣ９ＣＯＬIIIを得た。 ｐＨＩＬ−Ｄ２／ｃｏｌIII。ＣｏｌIII遺伝子の３’末端を、翻訳開始コドン の４１９５塩基対下流（ＥｃｏＲＩ部位）から終結コドン（４４０１塩基対）ま で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＭ３８を鋳型ＤＮＡとして使用して、プライマ ー：５’プライマー(5'-GAAGGTGAATTCAAGGCTGA-3')、および３’プライマー(5'- GCGTCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCC-3')を使用してＰＣＲにより合成した。ｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化して、大きな断片を 単離し、３’ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化する。これらの２つの断 片と消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１ベクターをＴ４ リガーゼで連 結して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１／１０を得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ−Ｃ３Ａ１／１０の翻訳開始コドンの１６塩基対上流にＢｇ１II部位を作製 し、（ヌクレオチド−１６〜４４０１）からのコラーゲン配列を含有する、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｃ３Ａ１／１０からのＢｇｌII−ＸｂａＩ断片をｐＨＩＬ −Ｄ２（インビトロゲン(InVitrogen)）のＥｃｏＲＩ部位に連結して、プラスミ ドＰＨＩＩ−Ｄ２／ｃｏｌIIを得る。 ｐＡＯ８１５β。ｐＹＭ２５をＨｐａＩで消化し、サッカロミセス・セレビッ シェ（Saccharomyces cerevisiae）のＡＲＧ４遺伝子を含有する断片を単離し、 ｐＡＯ８１５（インビトロゲン(InVitrogen)）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化し てＨＩＳ４遺伝子をＡＲＧ４で置換して、プラスミドｐＡＲＧ８１５を得た。 ヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼ（Vuori et al.，Proc ．Natl．Acad．Sc i．USA 89:7467-7470(1992)）のβ−サブユニットのｃＤＮＡを、翻 訳開始コドンから終結コドンまでＰＣＲにより合成し、ＰＣＲ断片の５’末端と ３’末端にＥｃｏＲＩ部位を作製した。ｐＶＬ１３８２／＿ＨＤＥＬ（Vuorl et al.，1992，EMBO J. 11:4213-4217)を鋳型ＤＮＡとして使用して、プライマー ：５’プライマー(5'-GGCGAATTCATGCTGCGCCGCGCTCTGCT-3')、および３’プライ マー(5'-GCGGAATTCTTACAGTTCATCGTGCACAGC-3')を使用した。このＰＣＲ断片をＥ ｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫにクローン化して、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＳＫβ／２０を得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫβ／２０をＥｃ ｏＲＩで消化し、この断片をｐＡＯ８１５（インビトロゲン(InVitrogen)）のＥ ｃｏＲＩ部位にクローン化して、プロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユニ ットの単一の発現カセットを有するプラスミドｐＡＯ８１５βを得た。 ｐＡＲＧ８１５α。プロリル４−ヒドロキシラーゼのα−サブユニットの５’ 末端を、翻訳開始コドンから６８９塩基対下流（ＨｉｎｄIII部位）までＰＣＲ により合成し、断片の５’末端にＨｉｎｄIIIとＳｍａＩ部位を作製した。ｐＢ ｓ（ＳＫ−）ＰＡ５９を鋳型ＤＮＡとして使用して、プライマー：５’プライマ ー(5'-GCGAAGCTTCCCGGGATGATCTGGTATATATTA-3')、および３’プライマー(5'-GGA TCTAGTTCAAGAAGCTT-3')を使用した。ｐＡ−５９（Vuorl et al.，Proc ．Natl．A cad．Sci．USA 89:7467-7470(1992)）をＨｉｎｄIIIで消化し、大きい断片を単 離し、５’ＰＣＲ断片と連結してｐＡ−５９／１５を得た。 α−サブユニットの３’末端を、ＰＣＲにより翻訳開始コドンの１３７３塩基 対（ｐｓｔＩ部位）下流から翻訳終結コドンまで合成し、断片の３’末端にＳｍ ａＩとＢａｍＨＩ部位を作製した。ｐＢｓ（ＳＫ−）ＰＡ５９を鋳型ＤＮＡとし て使用して、プライマー：５’プライマー（5'-AGTGATGTGTCTGCAGGAGGAGC-3')、 および３’プライマー（5'-GCGGGATCCCCCGGGTCATTCCAATTCTGACAACG-3'）を使用 した。ｐＡ−５９／１５をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、大きい断片を単離し 、３’ＰＣＲ断片と連結してｐＡ−５９／３を得た。ｐＡ−５９／３をＳｍａＩ で消化し、ＳｍａＩ−ＳｍａＩ α−サブユニットをｐＡＲＧ８１５のＥｃｏＲ Ｉ部位にクローン化して、ｐＡＲＧ８ １５αを得た。 ｐＡＲＧ８１５αβ。ｐＡＯ８１５βをＢｇｌIIとＢａｍＨＩで消化して発現 カセットを切り出し、この発現カセットをｐＡＲＧ８１５αのＢａｍＨＩ部位に クローン化してベクターｐＡＲＧ８ｌ５αβを得た。 ｐＡＯ８１５ββ−ｐＡＯ８１５αβに類似しているが、ヒト・プロリル４− ヒドロキシラーゼ遺伝子のβ−サブユニットの２つのカセットを含有する。ｐＡ Ｏ８ｌ５βをＢｇｌIIとＢａｍＨＩで消化して発現カセットを切り出し、この発 現カセットをｐＡＲＧ８１５αβのＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ベクター ｐＡＲＧ８１５αββを得た。 そのシグナル配列のないβ−サブユニットを、ＰＣＲにより翻訳開始コドンの ５２塩基対下流から翻訳終結コドンまで合成した。５’末端と３’末端にＥｃｏ ＲＩ制限部位を作製した。このＰＣＲ断片を、ｐＳＰ７２（プロメガ(Promega) ）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。 ２.プロリル４−ヒドロキシラーゼを有する酵母細胞中での組換えコラーゲン遺 伝子の発現 ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）宿主株ＧＳ２００ ｈｉｓ４ａｒｇ ４を、上記プラスミドおよび関連するプラスミドの組合せとともに安定に形質転 換して、以下の組換え株を産生した。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）ＣｏｌIIIαβ−α−ＭＦＳＳと、ヒト・ プロリル４−ヒドロキシラーゼの両方のサブユニットを有するヒトＣｏｌIII遺 伝子を有する。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）ｎＣｏｌIII−ピヒア・パストリス（P．p astoris）ｎＣＯＬIIIαβに似ているが、未変性のＣｏｌIIIシグナル配列を使 用する。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）αβ−ヒト・プロリル４−ヒドロキシラ ーゼの両方のサブユニットを有する。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）αββは、ヒト・プロリル４−ヒドロキ シラーゼを有し、α：β遺伝子比は１：２である。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）αは、ヒト・プロリル４−ヒドロキシラ ーゼα遺伝子を含有する。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）βは、ヒト・プロリル４−ヒドロキシラ ーゼβ遺伝子を含有する。 第５パラグラフに記載したピヒア・パストリス（P．pastoris）株を、ロータ リーシェーカー中で、ＯＤ６００が５．０になるまで増殖させた。試料を採取し 、ＰＡＧＥゲル上に流した。ウェスタンブロット解析を行い、ｐｒｏＣｏｌIII Ｎ−末端ペプチド、ヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼのα−サブユニット とヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユニットに対する抗体で解析 した。 第６パラグラフで記載したウェスタンブロット解析は、ヒト・コラーゲンIII とヒト・プロリル４−ヒドロキシラーゼの両方が、ピヒア・パストリス（P．pas toris）中で産生されていることを証明した。 ピヒア・パストリス（P．pastoris）中で産生されたヒト・コラーゲンの３重 らせん構造について試験するために、ペプシン消化実験を行った。ほとんどのタ ンパク質はタンパク質分解酵素であるペプシンにより分解されるが、コラーゲン の３重らせん領域はペプシン耐性である。ピヒア・パストリス（P．pastoris） ＣｏｌIIIαβの細胞溶解物からのコラーゲンをペプシンで消化し、消化産物を ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。これらの実験の結果は、３重らせんのヒト・コラ ーゲンIIIが組換えピヒア・パストリス（P．pastoris）細胞中で産生されること を示した。 上記のピヒア・パストリス（P．pastoris）株中のヒト・プロリル４−ヒドロ キシラーゼ活性を測定するために、実験を行った。ピヒア・パストリス（P．pas toris）は、内因性のプロリル４−ヒドロキシラーゼ活性は持たない。測定は、 基本的にKivirikko，Methods in Enzmology，Volume 82，pgs．245-302、Acade mic Press、サンディエゴ、カリフォルニア州に記載の１４Ｃ標識プロリンを用 いて行った。組換え細胞中でプロリル４−ヒドロキシラーゼが見いだされた。 Ｂ．実施例１２：プロリル４−ヒドロキシラーゼの組換え遺伝子を発現する哺乳 動物細胞中の組換えコラーゲン遺伝子の発現 １．コラーゲン遺伝子を含有する組換えセムリキ森林熱ウイルス（SemlikiFores t Virus）ベクターの構築 ｐＳＦＶｍｏXIII：前記ｐＶＬｍｏXIII（Rehn et al.、投稿中；Peltonen et al.、投稿中）について記載したクローンと配列に基づき作製したｐＢＳｍｏXI II、および真核生物発現ベクターｐＳＦＶ−１（Liljestrom et al.，Bio/Tech nology 9:1356-1361(1991)）を使用して、セムリキ森林熱（Semliki Forest）発 現ベクターを構築した。ｐＢＳｍｏXIIIをＥｃｏＲＩで消化して、７塩基対の５ ’非翻訳領域と２８８塩基対の３’非翻訳領域を有する完全長XIII型コラーゲン 変異種を作製し、この断片をクレノウで平滑末端にし、ｐＳＦＶ−１のＳｍａＩ 部位にクローン化して、プラスミドｐＳＦＶｍｏXIIIを得た。アンビオン（Ambi on）のメガスクリプト（MEGAscripta）インビトロ転写キットを使用してインビ トロ転写により、ｐＳＦＶｍｏXIIIプラスミドを用いてＲＮＡを産生した。べビ ーハムスター腎（ＢＮＫ）細胞を、Lilegestrom et al.，Current Protocols in Molecular Biology 2:16-20(1991)に記載のように、前記ＲＮＡでトランスフェ クトした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画した細胞抽出物のウェスタン ブロット解析により、ＢＨＫ細胞中で、マウスXIII型コラーゲンの完全長鎖の合 成を観察した。 高等真核生物の細胞中の他のコラーゲン遺伝子の効率的な発現は、上記セムリ キ森林熱ウイルス（Semliki Forest virus）ベクターに基づくであろう。セムリ キ森林熱ウイルス（Semliki Forest virus）は、広い宿主範囲を有し、上記の哺 乳動物細胞株の感染も可能であるため、ウイルスとして好適である。さらに詳し くは、この系は染色体組込みをベースとしないため、セムリキ森林熱ウイルス（ Semliki Forestvirus）は広範囲の宿主に使用でき、従って構造−機能相関の解 明および種々のハイブリッド分子の影響の試験を目的とする研究において、組換 えコラーゲンの修飾物を得るための迅速な方法であろう。さらに、セムリキ森林 熱ウイルス（Semlikl Forest virus）は、高 い組換え発現レベル（１０μｇ／１×１０⁶細胞を超える）を与えると予測され る。 ＨｅＬａ細胞およびワクシニアウイルス（vaccinla virus）ベースの発現系も また、哺乳動物細胞中のコラーゲンの発現に使用でき、好ましくは６つのIV型コ ラーゲン鎖のホモ−およびヘテロ−トリマーアイソフォームとして、IV型コラー ゲンを発現するのに使用されるであろう。 引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は、参考のため本明細書に組 み込まれる。 明細書の前記説明は、当業者が本発明を実施することを可能にするものである と考えられる。免疫学、生化学、または関連分野の当業者には明白な、本発明の 実施のための上記方法の種々の改変は、以下の請求の範囲に包含されるものであ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ピーラジャニエミ，タイナ フィンランド国 エフアイエヌ―90460 オウルンサロ ナウリスクジャ ルンコテ ィー １ビー３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラーゲンIV型、Ｖ型、VI型、VII型、VIII型、IX型、Ｘ型、XI型、XII型、 XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型およびXIX型からなる群から選択 されるコラーゲンのポリペプチドの産生方法であって、 ａ．（ｉ）コラーゲンサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレ オチド分子を含む第１の発現ベクターおよび（ii）少なくとも１種のコラーゲン 翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレオ チド分子を含む第２の発現ベクターで感染、トランスフェクト、または形質転換 された宿主細胞を培養し、ならびに、 ｂ．前記コラーゲンのポリペプチドを精製する ことを含む、前記方法。 ２．宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群 から選択される、請求項１に記載の方法。 ３．宿主細胞が、さらに、第２のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配列 を有するポリヌクレオチド分子を含む第３の発現ベクターで感染、トランスフェ クト、または形質転換されている、請求項１に記載の方法。 ４．宿主細胞が、さらに、第３のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配列 を有するポリヌクレオチド分子を含む第４の発現ベクターで感染、トランスフェ クト、または形質転換されている、請求項３に記載の方法。 ５．前記コラーゲン翻訳後酵素が、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、リシルオキ シダーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、およびＮ−プロテイ ナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 ６．コラーゲン翻訳後酵素サブユニットが、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα サブユニットおよびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットからなる群 から選択される、請求項１に記載の方法。 ７．コラーゲンIV型、Ｖ型、VI型、VII型、VIII型、IX型、Ｘ型、XI型、XII型、 XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型およびXIX型からなる群から選択 されるプロコラーゲンのポリペプチドの産生方法であって、 ａ．（ｉ）コラーゲンサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレ オチド分子を含む第１の発現ベクターおよび（ii）少なくとも１種のコラーゲン 翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレオ チド分子を含む第２の発現ベクターで感染、トランスフェクト、または形質転換 された宿主細胞を培養し、ならびに、 ｂ．前記プロコラーゲンのポリペプチドを精製する ことを含む、前記方法。 ８．宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群 から選択される、請求項７に記載の方法。 ９．宿主細胞が、さらに、第２のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配列 を有するポリヌクレオチド分子を含む第３の発現ベクターで感染、トランスフェ クト、または形質転換されている、請求項７に記載の方法。 １０．宿主細胞が、さらに、第３のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配 列を有するポリヌクレオチド分子を含む第４の発現ベクターで感染、トランスフ ェクト、または形質転換されている、請求項９に記載の方法。 １１．前記コラーゲン翻訳後酵素が、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、リシルオ キシダーゼおよびリシルヒドロキシラーゼからなる群から選択される、請求項７ に記載の方法。 １２．コラーゲン翻訳後酵素サブユニットが、プロリル-4-ヒドロキシラーゼの αサブユニットおよびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットからなる 群から選択される、請求項７に記載の方法。 １３． ａ．（ｉ）コラーゲンサブユニットをコードする核酸配列を有するポリ ヌクレオチド分子を含む第１の発現ベクターおよび（ii）少なくとも１種のコラ ーゲン翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌ クレオチド分子を含む第２の発現ベクターで感染、トランスフェクト、または形 質転換された宿主細胞を培養し、ならびに、 ｂ．コラーゲンポリペプチドを精製する ことを含む方法にしたがって製造された、コラーゲンIV型、Ｖ型、VI型、VII型 、VIII型、IX型、Ｘ型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、X VIII型およびXIX型からなる群から選択されるコラーゲンのポリペプチド。 １４．宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる 群から選択される、請求項１３に記載のコラーゲンのポリペプチド。 １５．宿主細胞が、さらに、第２のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配 列を有するポリヌクレオチド分子を含む第３の発現ベクターで感染、トランスフ ェクト、または形質転換されている、請求項１３に記載のコラーゲンのポリペプ チド。 １６．宿主細胞が、さらに、第３のコラーゲンサブユニットをコードする核酸配 列を有するポリヌクレオチド分子を含む第４の発現ベクターで感染、トランスフ ェクト、または形質転換されている、請求項１５に記載のコラーゲンのポリペプ チド。 １７．前記コラーゲン翻訳後酵素が、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、リシルオ キシダーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、およびＮ−プロテ イナーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載のコラーゲンのポリペプ チド。 １８．コラーゲン翻訳後酵素サブユニットが、プロリル-4-ヒドロキシラーゼの αサブユニットおよびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットからなる 群から選択される、請求項１３に記載のコラーゲンのポリペプチド。 １９．前記ポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項１３に記載のコラ ーゲンのポリペプチド。 ２０．前記ポリペプチドが部分的に脱グリコシル化されている、請求項１３に記 載のコラーゲンのポリペプチド。 ２１．（ｉ）コラーゲンサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレ オチド分子を含む第１の発現ベクターおよび（ii）少なくとも１種のコラーゲン 翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする核酸配列を有するポリヌクレオ チド分子を含む第２の発現ベクターで感染、トランスフェクト、または形質転換 されている宿主細胞。 ２２．前記宿主細胞が、さらに、第２のコラーゲンサブユニットを含む第３の発 現ベクターで感染、トランスフェクト、または形質転換されている、請求項２１ に記載の宿主細胞。 ２３．前記宿主細胞が、さらに、第３のコラーゲンサブユニットを含む第４の発 現ベクターで感染、トランスフェクト、または形質転換されている、請求項２２ に記載の宿主細胞。