WO2006106970A1 - ３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 - Google Patents

３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2006106970A1
WO2006106970A1 PCT/JP2006/306941 JP2006306941W WO2006106970A1 WO 2006106970 A1 WO2006106970 A1 WO 2006106970A1 JP 2006306941 W JP2006306941 W JP 2006306941W WO 2006106970 A1 WO2006106970 A1 WO 2006106970A1
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collagen
human
dna
type
protein
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PCT/JP2006/306941
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Tetsuo Kase
Akio Kimura
Hiroshi Kisaki
Hiroyuki Keshi
Hiroshi Ueyama
Mizuki Nishihara
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Osaka Prefectural Government
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein having a triple helical structure. More specifically, the present invention relates to a method for producing human 'collagen or a partial peptide of human' collagen.
  • An object of the present invention is to provide a partial peptide of human 'collagen and human' collagen which is safe for a living body and easy to obtain and a method for producing the same.
  • the present invention relates to human 'collagen and human ⁇ by stable transduction of mammalian expression vectors obtained by inserting human' collagen cDNA into Chiyazuno, Muster ovary (CHO) cells. It is in providing the manufacturing method of the partial peptide of collagen.
  • Collagen is a protein distributed in almost all tissues of the body, including skin 'bone' cartilage, and plays an important role such as maintaining the structure of tissues' organs as a scaffold for cells. Is well known.
  • collagen is a bioabsorbable material that is decomposed by collagenase secreted from fibroblasts and collagenase present in phagocytes. In this way, collagen is considered to be useful as a biological material because it is biocompatible and is a bioabsorbable material. So far, collagen has been used as a covering material for skin damage sites as a biological material, and healing improvements have been reported (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 1 Surg. Forum, 10, 303 (1960)
  • Non-Patent Document 2 J. Surg. Res., 10, 485-491 (1970)
  • Non-Patent Document 3 Lancet, 342, 799 (1993)
  • Non-Patent Document 4 Science, 261, 1727-1730 (1993)
  • Patent Document 1 JP-A-10-179169
  • collagen is a useful material as a biological material or medicine for regenerative medicine and living transplantation.
  • Conventionally used collagen is derived from tissues of large animals other than humans such as butterfly. is there.
  • Collagen is originally a protein with low immunogenicity, but it has been reported that when a heterogeneous animal's collagen is transplanted, implanted or administered into a human body as a biological material, an immune reaction is induced with a low frequency. (J. Im munol, 136, 877-882 (1986), Biomaterials, 11, 176-180 (1990)).
  • the use of collagen derived from ushi has become impossible due to the problem of prion contamination in ushi.
  • yeast Japanese Patent Publication No. 7-501939
  • insect cells Japanese Patent Laid-Open No. 8-2397
  • the present inventors are able to highly express a foreign gene using, as a host, a cell with a low expression level of collagen molecules among various mammalian cells.
  • the host By introducing the collagen gene construct into the vector, the host The present inventors have found that human 'collagen can be produced in large quantities with almost no cell-derived collagen mixed therein, and have completed the present invention.
  • Such a collagen production method has not been reported so far when a large amount of the introduced collagen gene is expressed and human collagen is preferentially produced in a host cell.
  • the present inventors have developed a vector capable of highly expressing a foreign gene using a mammal having a low expression level of collagen, which is one of proteins having a triple helical structure, as a host.
  • a construct obtained by introducing a collagen gene we have succeeded in developing a large-scale production method for human'collagen without requiring a complicated purification process, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [15].
  • a method for producing a protein having a triple helical structure comprising the following steps (a)
  • the DNA force is at least one DNA selected from the DNA cartridges described in (a) or (b) below.
  • [12] Human 'collagen produced according to the method of any one of [1] to [11].
  • [13] A vector into which at least one DNA selected from the DNAs described in (a) or (b) below is introduced.
  • a kit for producing a protein having a triple helical structure comprising the vector according to [13] or the mammalian cell according to [14].
  • FIG. 1 is a diagram showing a human type I a 1 chain collagen expression construct.
  • HColIal H-type ⁇ 1 chain collagen cDNA
  • PCMV Cytomegalovirus promoter
  • BGHPA Cushion signal with GH growth hormone gene poly A
  • PSVd Simian virus 40 promoter without enhancer
  • DHFR Mouse Dihydrofolate reductase cDNA
  • SVpA Simian virus 40 poly A addition signal
  • ColElori Origin of replication in E. coli
  • Neor Selectable marker in mammalian cells (G418 resistance) and Selective marker in E. coli (kanamycin resistance) ).
  • FIG. 2 is a diagram showing a human type I ⁇ 2-chain collagen expression construct.
  • HColIa2 H-type ⁇ 2 chain collagen cDNA
  • PCMV Cytomegalovirus promoter
  • BGHPA Cushion signal with ushi growth hormone gene poly A
  • PSVd Simian virus 40 promoter without enhancer
  • DHFR Mouse Dihydrofolate reductase cDNA
  • SVpA Simian Viral 40 poly A addition signal
  • ColElori origin of replication in E. coli
  • Neor selection marker in mammalian cells (G418 resistance) and selection marker in E. coli (kanamycin resistance).
  • FIG. 3 is a diagram showing a human type II ⁇ 1 chain collagen expression construct.
  • HColIIal human type II a 1-chain collagen cDNA
  • PCMV cytomegalovirus promoter
  • BGHPA moss growth hormone gene poly
  • PSVd simian virus 40 promoter without enhancer
  • DHFR Mouse dihydrofolate reductase cDNA
  • SVpA Simian virus 40 poly
  • ColElori Origin of replication in E. coli
  • Neor Selectable marker in mammalian cells (G418 resistance) and Selective marker in E. coli ( (Kanamycin resistance).
  • FIG. 4 is a diagram showing a human type III ⁇ 1 chain collagen expression construct.
  • HColIIIal Human type III a 1 chain collagen cDNA
  • PCMV Cytomegalovirus promoter
  • BGHPA Cushion signal with ushi growth hormone gene poly A
  • PSVd Simian virus 40 promoter without enhancer
  • DHFR Mouse dihydrofolate reductase cDNA
  • SVpA simian virus 40 poly A addition signal
  • ColElori origin of replication in E. coli
  • Neor selectable marker in mammalian cells (G418 resistance) and selectable marker in E. coli ( (Kanamycin resistance).
  • FIG. 5 is a photograph showing analysis of recombinant human collagen type I in culture supernatant by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Lane 1: Human type I collagen (100 g / mL), Lane 2: Recombinant type I collagen.
  • FIG. 6 is a photograph showing analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of pepsin degradation products of thread-replaceable human type I collagen in the culture supernatant.
  • Lane 1 Recombinant human type I collagen (185 g / mL)
  • Lane 2 Recombinant type I collagen (20-fold concentrated).
  • FIG. 7 is a photograph showing detection of purified recombinant human type I collagen and its pepsin degradation product by Western plotting.
  • FIG. 8 is a photograph showing analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant human type II collagen in the culture supernatant.
  • Lane 1 human type II collagen (100 g / mL)
  • lane 2 recombinant type II collagen.
  • FIG. 9 is a photograph showing analysis by Western blotting of recombinant human type II collagen in the culture supernatant.
  • Lane 1 human type II collagen (10 g / mL)
  • lane 2 recombinant type II collagen (diluted 10-fold).
  • FIG. 10 is a photograph showing analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of pepsin degradation products of thread-replaceable human type II collagen in the culture supernatant.
  • Lane 1 Human type II collagen (100 g / mL)
  • Lane 2 Recombinant type II collagen (5-fold concentrated).
  • FIG. 11 is a photograph showing an analysis by Western blotting of a pepsin degradation product of recombinant human type II collagen in the culture supernatant.
  • Lane 1 human wrinkle type collagen (10 g / mL)
  • lane 2 thread changeable type II collagen.
  • FIG. 12 is a photograph showing analysis of recombinant human type III collagen in the culture supernatant by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Lane 1: Human type III collagen (100 g / mL), Lane 2: Recombinant type III collagen.
  • FIG. 13 is a photograph showing an analysis by Western blotting of recombinant human type III collagen and its pepsin degradation product in the culture supernatant.
  • Lane 1 human type III collagen (10 g / mL)
  • lane 2 recombinant type III collagen (10-fold dilution)
  • lane 3 recombinant type III collagen pepsin degradation product.
  • FIG. 14 is a photograph showing analysis of purified recombinant human type III collagen in culture supernatant by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the present invention relates to a protein having a triple helical structure comprising the following steps (a) to (c): It relates to a manufacturing method.
  • the "protein having a triple helix structure" of the present invention is not particularly limited as long as it has a triple helix structure, preferably collagen or collectin, more preferably collagen.
  • a protein having a triple helix structure may be a protein in which a triple helix is constructed in the culture production stage, or a protein having a triple helix structure formed by purification or the like after the culture production. Also good.
  • a force that is a protein capable of forming a triple helical structure may be produced in a large amount in the state of a single-stranded structure.
  • the origin of the collagen of the present invention is not particularly limited, and preferred examples include collagen derived from mammals, and more preferably derived from humans.
  • the collagen of the present invention includes those obtained by modifying a part of the amino sequence of collagen by substitution or deletion, and those having an amino acid sequence not derived from collagen.
  • a method for obtaining a transduced cell obtained by introducing a vector into a host mammalian cell and expressing a protein molecule is known, and the same method can be applied to the present invention.
  • Collagen is synthesized as a recombinant protein in a cell into which the above foreign gene high expression vector has been introduced, and can be examined as follows. I.e. Using a commercially available antibody that specifically binds to human collagen, it can be confirmed to be a collagen peptide by an immunochemical method such as Western blotting. Usually, collagen is not migrated according to the molecular weight in SDS polyacrylamide gel electrophoresis (Nature, 227, 680-685 (1970)), and therefore, after electrophoresis with collagen as a marker, the method of Matsudaira et al. (J.
  • Biol Chem., 261, 10035-10038 (1987)) can be transferred to a nylon membrane or a -trocellulose membrane, and the reactivity with an anti-collagen antibody can be investigated. Furthermore, the presence of a molecule having a triple helical structure in the recombinant collagen product produced by the expression vector can be examined as follows.
  • Normal fibrous collagen is a triple-stranded molecule formed from three subunits (a chain), and has a triple helical structure in the molecule.
  • Collagen having a triple helical structure is known to be resistant to pepsin digestion. Therefore, the protein supernatant was digested with pepsin under acidic conditions and examined for its pepsin-resistant structure by examining the culture supernatant of the cells into which the above foreign gene high expression vector was introduced. Can be shown to exist.
  • the expression vector of the present invention has the same characteristics as those found in vivo in host cells, that is, the ability to synthesize pepsin-resistant collagen.
  • Mammalian cells used for culturing as host cells in the present invention are not particularly limited, but preferred examples include CHO cells and HEK293 cells.
  • the CHO cells or HEK293 cells used in the present invention can be cultured in a large amount by suspension culture.
  • weakened neomycin phosphate transferase gene, mouse dihydrofolate reductase gene, human 'collagen or partial peptide of human' collagen 1 x 10 8 to 1 x 10 9 recombinant CHO cells obtained by transduction with a human collagen expression vector that has both the cDNA to be loaded in a shaker flask or spinner flask in 100 mL to lL culture medium Can be cultured. After culturing this for an appropriate time, the culture supernatant can be collected to extract a large amount of protein.
  • a human collagen expression vector having both a weakened neomycin phosphotransferase gene, a mouse dihydrofolate reductase gene, human collagen or a cDNA encoding a partial peptide of human collagen In the CHO cell culture supernatant, there is also a strong collagen that forms a normal triple chain molecule at the same time as a triple chain collagen molecule having a triple helix structure.
  • collagen molecules that do not have a triple helix structure are digested by pepsin. Therefore, collagen molecules that do not have a triple helix structure can be decomposed and removed by pepsin.
  • proteins in the culture supernatant other than collagen can also be decomposed and removed.
  • a human 'collagen expression vector having a weak neomycin phosphate transferase gene, a mouse dihydrofolate reductase gene, and a cDNA encoding a human' collagen or a partial peptide of human 'collagen can be transformed. All the proteins present in the culture supernatant of the recombinant CHO cells obtained by the introduction can be directly treated with pepsin to decompose and remove non-collagenous proteins, as well as to decompose and remove collagen that does not have a triple helix structure. it can.
  • Human 'collagen to be used in the present invention is currently known! / All human' collagens including types I to XXI collagen, and partial peptides of these collagens are also included. Include.
  • the type of collagen of the present invention is not particularly limited, but representative examples include type I, type II, type III, type IV, type V, type VII, type IX, type XI, type XII, type XVII, or type XVIII. This includes, for example, type I, type II, type III.
  • Types I, IV, V, IX, and XI each consist of two or three types of ⁇ chain, and types II, III, VII, XII, XVII, and XVIII each consist of one type of ⁇ chain. These are:-. I a l (I)] o; 20), Type II: [H 1 (11)]
  • the molecular structure of bright collagen is not particularly limited.
  • the molecular structure of the collagen of the present invention is not limited to the molecular structure derived from natural collagen, and three kinds of ⁇ chains different from the above may be artificially combined.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the a 1 chain of type I collagen of the present invention is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of the DNA encoding type I collagen (X2 chain is expressed in SEQ ID NO: 4; II
  • the base sequence of the DNA encoding the type 1 collagen a 1 chain is shown in SEQ ID NO: 7, and the base sequence of the DNA encoding the type III collagen a 1 chain is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the DNA encoding the collagen of the present invention is preferably an oligonucleotide having a base sequence ability described in any one of SEQ ID NOs: 1, 4, 7, and 10, preferably SEQ ID NOs: 1, 4, 7,
  • the oligonucleotide having a base sequence ability described in any one of 10 may include an oligonucleotide that selectively hybridizes. Selectively hybridizing is a properly stringent hybridizer when present in a sample of DNA or RNA that has a pre-determined sequence (ie, a second polypeptide). Nucleic acid molecules that hybridize, become double-stranded, or bind only essentially to each other under the conditions of Chillon.
  • the stringent conditions are, for example, usually 42 ° C, 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C, 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and more preferably 65 ° C. .
  • Forces that are conditions of C, 0.1 X SSC and 0.1% SDS There are no particular restrictions on these conditions. Multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of a hybridization, and those skilled in the art will realize the optimal stringency by selecting these factors as appropriate. Is possible.
  • the collagen produced may be in the form of a procollagen molecule in which a propeptide is bonded to the N-terminus and C-terminus, or in a state in which the propeptide is removed. There may be.
  • partial peptide of collagen means a polypeptide encoded by a polynucleotide of 20% or more (eg, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%) of cDNA encoding collagen. Say. Also included are those obtained by modifying a part of the amino acid sequence of these collagens and those having a non-collagen amino acid sequence added.
  • mammalian cells with a small amount of collagen expression means 1 X 10 6 cells Z Examples of cells having a collagen production amount of 50 ngZmL or less when cultured in mL are preferable !, CHO, and more preferably CHO cells and HEK293 cells.
  • “high expression” means collagen expression of 10 gZmL or more, preferably collagen expression of 50 ⁇ gZmL or more.
  • a vector capable of highly expressing a foreign gene means, for example, a mammalian cell chromosome because the function of a drug selection marker gene in a mammalian cell contained in the vector is weak.
  • the pNOWZCMV-AA vector can be mentioned as a vector characterized by being selectively inserted into the above active region of transcription.
  • the pNOWZCMV-AA vector is known from JP-A-10-179169.
  • the culture method may be either floating or adherent culture.
  • the gene for human type I ⁇ 1 chain collagen has already been cloned and its nucleotide sequence has been reported (EMBL gene database registration name ⁇ 000088) ⁇ The sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Human type I alcDNA was amplified from human testis-derived cDNA by the polymerase 'chain' reaction (PCR) method ("PCR Technology", published by Stockton Press (1989)). In other words, the human testis-derived cDNA (Betaton's Dickinson) is used as the cocoon type and SEQ ID NO: 2.
  • the full length sequence of SEQ ID NO: 1 was amplified by PCR as a lymer. That is, using a commercially available PCR amplification kit (TaKaRa LA Taq with GC Buffer: Takara Bio Inc.), After heat treatment for 5 minutes, three steps of denaturation (94 ° C, 20 seconds), primer annealing (60 ° C, 30 seconds), amplification (72 ° C, 3 minutes 30 seconds) are repeated 35 times, and then 72 ° C. The reaction was completed after 7 minutes of treatment. Thereafter, all PCR reactions described in this example were carried out in the same reaction cycle.
  • PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and ligated using a PCR product cloning vector (pT7Blue kits: Novagen) and a ligation kit (DNA ligation kit ver. 2: Takarabio).
  • a PCR product cloning vector pT7Blue kits: Novagen
  • a ligation kit DNA ligation kit ver. 2: Takarabio
  • plasmid DNA was obtained by culturing a colony having ampicillin-resistant properties that appeared on LB agar medium (Difco).
  • a DNA fragment encoding human type I a 1-chain collagen excised from this plasmid DNA and the foreign gene high expression vector pNOWZCMV—AA Not I and Xba I digestion product prepared in Example 1 was used as a DNA ligation kit ver.2.
  • Plasmid DNA (pNOW-hColIal, Fig. 1) was obtained by culturing one colony with ampicillin-resistant properties that appeared on LB agar medium after introducing DNA linked to E. coli XL-I Blue strain. .
  • the full length sequence of SEQ ID NO: 4 was amplified by PCR.
  • the obtained PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and ligated using a PCR product cloning vector (pT7Blue kits: Novagen) and a ligation kit (DNA ligation kit ver.2: Takara Bio Inc.).
  • a PCR product cloning vector pT7Blue kits: Novagen
  • DNA ligation kit ver.2 Takara Bio Inc.
  • plasmid DNA was obtained by culturing 4 colonies having ampicillin resistant properties that appeared on LB agar medium (Difco). Using a DNA ligation kit ver.
  • the gene for human type II a 1 chain collagen has already been cloned and its nucleotide sequence has been reported (EMBL gene database registration name NM 001844.1) o The sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • Human type II ⁇ lcDNA was amplified by PCR from cDNA derived from human testis. That is, human testis-derived cDNA (Betaton's Dickinson) is used as a saddle type and SEQ ID NO: 8
  • the full-length sequence of SEQ ID NO: 7 was amplified by PCR.
  • the obtained PCR products are separated by agarose gel electrophoresis and ligated using a PCR product cloning vector (pT7Blue kits: Novagen) and a ligation kit (DNA ligation kit ver.2: Takara Bio Inc.). It was.
  • pT7Blue kits Novagen
  • DNA ligation kit ver.2 Takara Bio Inc.
  • plasmid DNA was obtained by culturing 4 colonies with ampicillin-resistant properties that appeared on LB agar medium (Difco). DNA fragment encoding human type II ⁇ 1 chain collagen excised from this plasmid DNA and foreign gene high expression vector pNOWZCMV—V Not I and Xba
  • Plasmid DNA (pNOW-hColIIal, Fig. 3) was obtained by culturing one colony with ampicillin-resistant properties that appeared on LB agar after introducing DNA linked to E. coli XL-I Blue strain.
  • human type III a 1 chain collagen has already been cloned and its nucleotide sequence has been reported (EMBL gene database registration name X14420). The sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • Human type III ⁇ lcDNA was amplified by PCR from cDNA derived from human liver. In other words, human liver-derived cDNA (Wako Pure Chemical Industries) is used as a cage type and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 is used.
  • the full-length sequence of SEQ ID NO: 10 was amplified by PCR. Obtain the PCR product They were separated by galose gel electrophoresis and ligated using a PCR product cloning vector (pT7Blue kits: Novagen) and a ligation kit (DNA ligation kit ver. 2: Takara Bio Inc.). After introducing DNA linked to E. coli XL-I Blue strain, plasmid DNA was obtained by culturing 4 colonies having ampicillin resistance property that appeared on LB agar medium (Difco).
  • Plasmid DNA (pNOW-hColIIIal, Fig. 4) was obtained by culturing one colony with ampicillin resistance that appeared on the LB agar medium after introducing DNA linked to E. coli XL-I Blue strain.
  • the cells were detached by trypsin treatment, and after counting the number of cells, 500,000 cells were added with 10% dialyzed fetal serum containing lOOmL of 0.8mgZmL of G418 Iscove's Modified Dalbecco's Medium medium After diluting in 10 wells of 96-well microtiter plates (960 uels), incubate at 37 ° C for 5 weeks in the presence of 5% carbon dioxide, and subculture the viable cells in 197 uels in 1 mL of 0.8 mgZmL.
  • Example 7 Assay of HI H-type collagen production using pNOW—hColIal and pNOW—hColIa2 transduced cell clones The production amount was assayed by SDS polyacrylamide electrophoresis. 12.5 L of the culture supernatant and an equal volume of Tris SDS jS-ME sample treatment solution (Daiichi Kagaku) were mixed and heat-treated at 95 ° C for 5 minutes. This was layered on SDS polyacrylamide gel (PAGEL, ATTO) and developed by electrophoresis. After completion of electrophoresis, the polyacrylamide gel was treated with Coomassie Brilliant Blue stain (Amersham Bioscience) to detect and quantify human type I collagen in the polyacrylamide gel. As a comparative control, human type 1 collagen (Cosmova) having a concentration of 12.5 to 100 8 .11 was treated in the same manner and used.
  • Tris SDS jS-ME sample treatment solution Tris SDS jS-ME sample treatment solution (Dai
  • Cell clones producing large amounts of human type I collagen obtained by gene amplification become 1 X 10 6 cells / mL in a 25 cm 2 culture flask using cell culture medium IS CHO-CD (IS Japan) It was prepared as follows. This was cultured at 37 ° C for 96 hours in the presence of 5% carbon dioxide gas, and then the culture solution was collected, and the cells were removed by centrifugation to obtain a culture supernatant. The culture supernatant (12.5 ⁇ L) and an equal volume of Tris SDS ⁇ ME sample treatment solution (Daiichi Kagaku) were mixed and heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes. This was layered on SDS polyacrylamide gel (PAGEL, ATTO) and developed by electrophoresis.
  • SDS polyacrylamide gel PAGEL, ATTO
  • Fig. 5 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the culture supernatant obtained from human type I collagen-producing cell clones.
  • polypeptide at the position of 150 kDa, 170 kDa which is considered to be a recombinant H type 1 collagen chain, and a recombinant human type I collagen ⁇ 2 chain.
  • Polypeptides at positions of 130 kDa and 150 kDa were detected.
  • Example 10 Degradation of recombinant human collagen type I in culture supernatant by pepsin and analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Pepsin degradation of the culture supernatant obtained from human type I collagen-producing cell clones was performed by adding 99.7% acetic acid to the culture supernatant to a final concentration of 0.5M and adding pepsin (Sigma) to the final concentration 24 After adding to unit ZmL, it was carried out at 20 ° C for 2 hours. The following pepsin degradation was carried out in the same manner. Samples obtained by pepsin degradation were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a comparative control, 185 ⁇ g ZmL of commercially available recombinant human collagen type I (Betaton Dickinson) was used.
  • Figure 6 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of pepsin degradation products.
  • the recombinant H-type collagen in the culture supernatant is a polypeptide at the position of 130 kDa considered to be a 1 chain and 120 kDa considered to be a 2 chain in the same manner as commercially available human type I atelocollagen. It was detected as a polypeptide at position. This indicates that the culture supernatant obtained from a human type I collagen-producing cell clone contains recombinant human type I collagen having pepsin resistance substantially equivalent to that of the natural type. It was.
  • the polyacrylamide gel was immersed in a transfer buffer, and human type I collagen in the polyacrylamide gel was transferred to a PVDF membrane according to a conventional method.
  • an anti-human type I collagen ex 1 chain antibody at a concentration of 2 g / mL was reacted with a horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-goat IgG antibody.
  • HRP horseradish peroxidase
  • a comparative control 50 gZmL of recombinant human type I collagen (Betaton Dickinson) was used. Detection of human type I collagen ⁇ 2 chain was carried out using an antihuman type I collagen ⁇ 2 chain antibody instead of the antihuman type I collagen ⁇ 1 chain antibody. As a comparative control, 10 gZmL human type I collagen was used.
  • Fig. 7 shows the results of Western blot analysis.
  • the purified collagen solution finally obtained in lOOmL of the original culture supernatant was concentrated to about 300 ⁇ L and electrophoresed by SDS-PAGE to confirm the purity.
  • Human type II collagen production test gene transfer of human type 1 collagen with expression vector pNOW—hColIIal and establishment of G418 resistant initial clone
  • 1 ⁇ g of pNOW—hColIIal was introduced into 1.5 million CHO cells, strain DG44, in a 25 cm 2 culture flask using the lipofectin method. The introduction method followed the manufacturer's instructions. 48 hours later, the cells were detached by trypsin treatment, and after counting the number of cells, 500,000 cells were added with 10% dialyzed fetal serum containing lOOmL of 0.8mgZmL of G418.
  • Isc After dilution with ove's Modified Dalbecco's Medium medium, seed in 10 96-well microtiter plates (960 uels), incubate at 37 ° C for about 3 weeks in the presence of 5% CO2, 126 uels The viable cells in the medium were transferred to a 24-well plate with Iscove's Modified Dalbecco's Medium medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum containing ImL of 0.8mgZmL of G418 and cultured until confluent. After discarding the culture supernatant, 1 mL of PBS (manufactured by Invitrogen) was added to each well, and the culture supernatant was discarded again.
  • PBS manufactured by Invitrogen
  • CHO cell-free serum-free medium cell CD medium ProCH04 (Takara Bio Inc.) was added and cultured in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C for 96 hours. Subsequently, the production amount of human type II collagen in the culture supernatant was examined.
  • the production amount was assayed by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • 7.5 ⁇ L of the culture supernatant and an equal volume of Tris SDS ⁇ -ME sample treatment solution (Daiichi Chemical Co., Ltd.) were mixed and heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes. This was layered on SDS-polyacrylamide gel (PAGEL, ATTO) and developed by electrophoresis. After electrophoresis, the polyacrylamide gel was treated with Coomassie Brilliant Blue staining solution (Amersham Biosciences) to detect and quantify human type II collagen in the polyacrylamide gel.
  • human type II collagen Cosmo Bio
  • clones with the highest human type II collagen production were subcultured and stabilized, and then gene amplification with MTX was performed. Initially 1 week in medium containing 5 nM MTX, 1 week in medium containing 25 nM MTX, 1 week in medium containing 50 nM MTX, 3 weeks in medium containing 250 nM MTX, medium containing 1 M MTX After further amplification for 3 weeks, the level of human type II collagen production increased to gZmL (4 days) per medium at 25 nM MTX.
  • the concentration of MTX used for gene amplification is generally multi-step between ⁇ and L0 ⁇ ⁇ , and 10 ⁇ is often used as the final concentration.
  • Cell clones producing a large amount of human type II collagen obtained by gene amplification become 1 X 10 6 cells / mL in a 25 cm 2 culture flask using cell culture medium IS CHO-CD (IS Japan) It was prepared as follows. This was cultured at 37 ° C for 96 hours in the presence of 5% carbon dioxide gas, and then the culture solution was collected, and the cells were removed by centrifugation to obtain a culture supernatant. 7.5 ⁇ L of the culture supernatant and an equal volume of Tris SDS ⁇ -ME sample treatment solution (Daiichi Kagaku) were mixed and heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • SDS-polyacrylamide gel PAGEL, ATTO
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was carried out in the same manner. After the electrophoresis was completed, the polyacrylamide gel was treated with Kumashi Precious Blue Staining Solution (Amersham Biosciences) to detect human type II collagen in the polyatarylamide gel. As a comparative control, human type II collagen (Cosmono) having a concentration of 100 / z gZ mL was similarly treated.
  • Fig. 8 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of culture supernatants obtained from human type IV collagen-producing cell clones. Polypeptides at 170 kDa and 200 kDa, which are considered to be recombinant HI type collagen, were detected in the culture supernatant.
  • Example 17 Analysis of recombinant human type II collagen in culture supernatant by Western blotting
  • the polyacrylamide gel was immersed in a transfer buffer, and human type II collagen in the polyacrylamide gel was transferred to a PVDF membrane according to a conventional method.
  • an anti-human type II collagen chain antibody (Cosmono) at a concentration of 1 ⁇ g / mL was reacted with a horseradish superoxidase (HRP) -labeled anti-rabbit IgG antibody.
  • HRP horseradish superoxidase
  • Example 18 Decomposition of recombinant human collagen type II in culture supernatant by pepsin and analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting
  • Example 19 Production test of human type III collagen.
  • Expression vector pNOW gene transfer of human type III collagen with hColIIIal and establishment of G418 resistant initial clone
  • CHO cells in a 25 cm 2 culture flask were transfected into the DG44 strain using the lipofectin method. The introduction method followed the manufacturer's instructions. After 48 hours, the cells were detached by trypsin treatment, and after counting the number of cells, 300,000 cells were added to Iscove's Modified Dalbecco's Medium medium supplemented with 10% dialyzed fetal blood serum containing lOOmL 0.8mgZmL G418. After dilution, the cells were plated in 10 96-well microtiter plates (960 uels) and cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for approximately 3 weeks. (G418 resistant strain).
  • Viable cells were transferred to a 24 well plate with Iscove's Modified Dalbecco's Medium medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum containing ImL of 0.8 mg / mL G418 and cultured until confluent. After discarding the culture supernatant, PBS (Invitrogen) ImL was added to each well, and the culture supernatant was again discarded. Add 0.5mL serum-free medium for CHO cells. CHO- S- SFM Saga (Invitrogen) was added and cultured in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C for 72 hours. Subsequently, the production amount of human type III collagen in the culture supernatant was examined.
  • Iscove's Modified Dalbecco's Medium medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum containing ImL of 0.8 mg / mL G418 and cultured until confluent. After discarding the culture supernatant, PBS (Invitrogen) ImL was added to
  • the production amount was tested by the dot plot method. Cultured for 72 hours on nylon membrane 1 ⁇ L of supernatant and commercially available human type III collagen (Betaton's Dickinson) in serum-free medium for CHO cells CHO-S-SFM II 2-fold dilution series (0.125 to 8 gZmL) ) And CHO-S-SFM II each with 1 ⁇ L, air-dried for 1 hour, blocked with Block Ace, and then blocked with anti-human type III collagen antibody (Cosmono) at a concentration of 1 ⁇ g ZmL. HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody was reacted. Reacted antibodies were detected using luminocapture with a method of detecting HRP activity with SuperSignal West Pico reagent o
  • clones with the highest human type III collagen production were subcultured and stabilized, and then gene amplification with MTX was performed. First, it was amplified for 2 weeks in a medium containing 15 nM MTX, 2 weeks in a medium containing 60 nM MTX, 2 weeks in a medium containing 250 nM MTX, and further amplified for 4 weeks in a medium containing 1 ⁇ M MTX.
  • the production level of human type III collagen increased to 225 ⁇ g / mL (3 days) per medium.
  • Example 22 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of recombinant human type III collagen in culture supernatant
  • Cell clones producing a large amount of human type III collagen obtained by gene amplification become 1 X 10 6 cells / mL in a 25 cm 2 culture flask using cell culture medium IS CHO-CD (IS Japan) It was prepared as follows. This was cultured for 96 hours at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide gas, and then the culture solution was collected, and the cells were removed by centrifugation to obtain a culture supernatant. 6 ⁇ L of the culture supernatant and an equal volume of Tris SDS ⁇ -ME sample treatment solution (Daiichi Chemical Co., Ltd.) were mixed and heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • SDS-polyacrylamide gel PAGEL, ATTO
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was carried out in the same manner. After completion of electrophoresis, remove polyacrylamide gel. Human III type collagen was detected in polyatyramide gel by treatment with Liant Blue staining solution (Amersham Biosciences). As a comparative control, human type III collagen (Betaton's Dickinson) at a concentration of 100 ZmL was similarly treated.
  • Fig. 12 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of culture supernatants obtained from human type III collagen-producing cell clones. Polypeptides at 140 kDa and 170 kDa, which are considered to be recombinant rabbit collagens, were detected in the culture supernatant.
  • the polyacrylamide gel was immersed in a transfer buffer, and human type III collagen in the polyacrylamide gel was transferred to a PVDF membrane according to a conventional method.
  • Block Ace react with anti-human type III collagen chain antibody (Cosmo Bio) at a concentration of 1 ⁇ g / mL, followed by a bow I and anti-rabbit IgG antibody labeled with horseradish superoxidase (HRP). I let you.
  • the reacted antibody was detected using a TMB peroxidase reagent (Funakoshi Co., Ltd.) by a method for detecting HRP activity.
  • the production method of the present invention can be applied not only to collagen but also to proteins such as collectin having a triple helical structure.

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Abstract

　本発明は、コラーゲン遺伝子を導入した宿主細胞において、外来遺伝子高発現ベクターへ導入した遺伝子に由来するヒト・コラーゲンタンパク質が大量に合成され単離精製が容易で、かつ天然型コラーゲン分子と実質的に同等な構造を有するヒト・コラーゲン分子の製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、該製造方法によって製造されたコラーゲン分子を提供することも課題とする。 　上記課題を解決するために、種々の哺乳動物細胞のうちでもコラーゲン分子の発現量の少ない細胞を宿主として外来遺伝子を高発現可能なベクターにコラーゲン遺伝子コンストラクトを導入することにより、宿主細胞由来のコラーゲンの混在がほとんど見られないヒト・コラーゲンを大量に製造できることを見出した。

Description

明 細 書
3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。より具体的には 、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドの製造方法に関する。本発明 の課題は生体にとって安全であり、精製取得の容易なヒト 'コラーゲンおよびヒト 'コラ 一ゲンの部分ペプチドおよびその製造方法を提供することにある。さらに詳しくは、本 発明は、ヒト 'コラーゲン cDNAを挿入して得られる哺乳動物発現ベクターをチヤィ- 一ズノ、ムスター卵巣 (CHO)細胞に安定形質導入することによるヒト 'コラーゲンおよ びヒト ·コラーゲンの部分ペプチドの製造方法を提供することにある。
背景技術
[0002] コラーゲンは皮膚 '骨'軟骨をはじめ、ほぼ生体中の全組織に分布するタンパク質 であり、細胞の足場となって組織'器官の構造を維持するなど、重要な機能を担って いることはよく知られている。一方コラーゲンは、繊維芽細胞から分泌されるコラゲナ ーゼおよび食細胞中に存在するコラゲナーゼにより分解される生体吸収性材料であ る。この様にコラーゲンは生体適合性があり、また、生体吸収性材料であるため生物 素材として有用なものであると考えられている。これまでにコラーゲンは、生物素材と して皮膚損傷部位の被覆材として用いられ、治癒改善が報告されて 、る (非特許文 献 1および 2)。
[0003] 全コラーゲンのうち 40%が皮膚に存在し、皮膚 ·腱では乾燥重量の 70%以上がコ ラーゲンである。従ってコラーゲンは人工皮膚の開発において重要である。また、細 胞ゃ器官の培養技術にぉ 、ても有用な素材として利用されて 、る。このことは現在 進歩の著しい再生医療分野での応用も大いに期待できるものである。また、経口摂 取することにより関節リューマチが抑制されるという用途への可能性 (II型コラーゲン） なども指摘されている（非特許文献 3および 4)。このようなコラーゲンの原材料として はこれまでは主にブタゃゥシなどヒト以外の大型動物の糸且織由来のものが用いられて [0004] 非特許文献 1 : Surg. Forum, 10, 303 (1960)
非特許文献 2 : J. Surg. Res., 10, 485-491 (1970)
非特許文献 3 : Lancet, 342, 799 (1993)
非特許文献 4: Science, 261, 1727-1730 (1993)
特許文献 1 :特開平 10— 179169
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] このようにコラーゲンは再生医療や生体移植用の生物素材あるいは医薬品として 有用な物質である力 従来力 用いられてきたコラーゲンはブタゃゥシなどヒト以外の 大型動物の組織由来のものである。コラーゲンはもともと免疫原性の低いタンパク質 ではあるが、異種動物のコラーゲンを生物素材としてヒト生体内に移植、埋入あるい は投与した場合には免疫反応が低頻度ながら惹起されることが報告されている (J. Im munol, 136, 877-882 (1986)、 Biomaterials, 11, 176-180 (1990))。また、ゥシにおけ るプリオン汚染の問題が発生するに至って、ゥシ由来のコラーゲンの使用が不可能と なっている。さらにブタ等、現在コラーゲンの抽出に用いられている動物においてプリ オン汚染と同様な問題が生じな 、と 、う保証はな 、。以上の点にぉ 、て人体に直接 適用する生物素材としては、ヒト由来コラーゲンの使用が望ましい。し力しながら、ヒト 組織力もコラーゲンを抽出、精製することは倫理的な問題や技術的な問題があるば 力りでなぐ得られたコラーゲンが不特定の架橋を形成するため、精製が困難になる という質的な問題点もある。
[0006] 抗原性がなぐ病原体混入の危険性を排除し、さらに単離精製の容易なコラーゲン を得るために、遺伝子組換えの技術を応用したコラーゲンの製造が検討されてきた（ Biochem. Soc, 28, 350-353 (2000))。しかしながら、分子量 10万以上のコラーゲン 分子をコードする cDNAを宿主細胞に導入するための発現ベクターの作製は非常に 煩雑なものとなる。また従来の方法では生産量も低く実用化には程遠いものであった 。さらにコラーゲンは 3本のポリペプチド鎖が会合して 3重螺旋構造をとる分子である ことが知られており、このような構造は遺伝子力 翻訳された一次産物がさらに複数 の修飾を受けることによって形成されるが（N. Engl. J. Med., 311, 376-386 (1984))、 特定の細胞のみがこのような修飾能力を保有しているものと考えられている。
[0007] これまでにマウス線維芽細胞、ハムスター肺細胞等を宿主とした組換えヒト ·コラー ゲンの生産が試みられている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 764-768 (1987)、 J. Biol. Chem., 264, 20683-20687 (1989))。しかしこれらの例において得られるコラー ゲンは分子構造としては正常であるが、ヒトと宿主細胞それぞれのコラーゲン遺伝子 産物からなる混成コラーゲン分子であった。また、ヒト II型コラーゲンを発現させた例（ Biochem. J., 298, 31-37 (1994))では、その生産量が培養液 1Lあたり 0. 5〜： Lmgと 低いものに過ぎず、さらに cDNA導入により発現させた II型コラーゲンに相当量の宿 主由来 IV型コラーゲンの混入が認められた。そのため、導入遺伝子由来の II型コラー ゲンと内在性の II型コラーゲンと分離する必要があった。
[0008] また、以上の他に酵母 (特表平 7— 501939号公報）、昆虫細胞 (特開平 8— 2397
9号公報）、バシルス'ブレビス (特開平 11— 178574号公報）、大腸菌（特開 2002 325584公報）を用いてヒト ·コラーゲンを発現させた例も見られる力 コラーゲンぺ プチド発現後の修飾に動物細胞におけるそれとの差異のある危険性が考えられた。 以上の如くこれまでに、示されてきたいかなる方法もヒト'コラーゲンを遺伝子組換え で製造する手段としては、量的、質的ともに満足できるものではな力つた。また、これ までにコラーゲンのように 3重螺旋構造を有するタンパク質を大量に製造する方法は 検討されていな力つた。
[0009] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 3重螺旋構造 を有するタンパク質の製造方法を提供することにある。より具体的には、コラーゲン遺 伝子を導入した宿主細胞にぉ ヽて、外来遺伝子高発現ベクターへ導入した遺伝子 に由来するヒト 'コラーゲンタンパク質が大量に合成され単離精製が容易で、かつ天 然型コラーゲン分子と実質的に同等な構造を有するヒト 'コラーゲン分子の製造方法 を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために種々の検討を行った結果、種々の哺乳 動物細胞のうちでもコラーゲン分子の発現量の少ない細胞を宿主として外来遺伝子 を高発現可能なベクターにコラーゲン遺伝子コンストラクトを導入することにより、宿主 細胞由来のコラーゲンの混在がほとんど見られないヒト 'コラーゲンを大量に製造でき ることを見出し、本発明を完成するに至った。このような、導入したコラーゲン遺伝子 を大量に発現させ、宿主細胞にぉ 、て優先的にヒト ·コラーゲンを生産させると 、ぅコ ラーゲンの製造方法にっ 、てはこれまでに報告がな 、。
[0011] 即ち、本発明者らは、 3重螺旋構造を有するタンパク質の一つであるコラーゲンの 発現量の少ない哺乳動物を宿主として外来遺伝子を高発現することが可能なベクタ 一に、ヒト 'コラーゲン遺伝子を導入して得られたコンストラクトを導入することによって 、ヒト 'コラーゲンを複雑な精製工程を必要とせず大量に製造方法を開発することに 成功し、これにより本発明を完成するに至った。
[0012] 即ち、本発明は、以下の〔1〕〜〔15〕を提供するものである。
〔1〕以下の（a)カゝら (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法
(a) 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清カゝら 3重螺旋構 造を有するタンパク質を回収する工程
〔2〕 3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト'コラーゲンまたはその部分ペプチドで ある〔1〕に記載の方法。
〔3〕ヒト 'コラーゲンが少なくとも 1種類以上の α鎖力もなるヒト 'コラーゲンである、〔2〕 に記載の方法。
〔4〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト ·Ι型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔5〕ヒト ·Ι型コラーゲンが α 1鎖と α 2鎖の複合体である〔4〕に記載の方法。
〔6〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト · II型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔7〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト · III型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔8〕 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNA力 以下の（a)または (b)に 記載の DNAカゝら選択される少なくとも 1つの DNAである、〔1〕に記載の方法。
(a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA
(b)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA
〔9〕哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞である、〔1〕〜〔8〕の いずれかに記載の方法。
〔10〕哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞 (HEK293)である、〔1〕〜〔8〕の 、ずれ力ゝ に記載の方法。
〔11〕 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが導入されるベクター力 p NOWZCMV— AAである、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト 'コラーゲン。 〔13〕以下の（a)または (b)に記載の DNAから選択される少なくとも 1つの DNAが導 入されたベクター。
(a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA
(b)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA
〔14〕〔13〕に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。
〔15〕〔13〕に記載のベクター、または〔14〕に記載の哺乳動物細胞を含む、 3重螺旋 構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
図面の簡単な説明
[図 1]ヒト I型 a 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIal：ヒ H型 α 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥシ 成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd：ェンハンサーを欠失させたシミアン ウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアン ウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori：大腸菌中での複製起点、 Neor：哺乳動物 細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイ シン耐性)を示す。
[図 2]ヒト I型《2鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIa2 :ヒ H型 α 2鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥシ 成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd：ェンハンサーを欠失させたシミアン ウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアン ウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori：大腸菌中での複製起点、 Neor：哺乳動物 細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイ シン耐性)を示す。
[図 3]ヒト II型 α 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIIal: ヒト II型 a 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥ シ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd:ェンハンサーを欠失させたシミア ンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミア ンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori:大腸菌中での複製起点、 Neor:哺乳動 物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマ イシン耐性)を示す。
[図 4]ヒト III型 α 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIIIal ：ヒト III型 a 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA: ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd:ェンハンサーを欠失させたシミ アンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミ アンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori:大腸菌中での複製起点、 Neor:哺乳動 物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマ イシン耐性)を示す。
[図 5]培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト I型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2 :組 換え I型コラーゲンを示す。
[図 6]培養上清中の糸且換えヒト I型コラーゲンのペプシンによる分解産物の SDS—ポリ アクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1：組換えヒト I型コラ 一ゲン（185 g/mL)、レーン 2：組換え I型コラーゲン (20倍濃縮)を示す。
[図 7]精製組換えヒト I型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウェスタンプロッティ ングによる検出を示す写真である。 A.抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体による検出、レ ーン 1 :ヒト I型コラーゲン（50 /z g/mL)、レーン 2 :組換え I型コラーゲン、レーン 3 :組換 え I型コラーゲンのペプシン分解物を示す。 B.抗ヒト I型コラーゲン α 2鎖抗体による 検出、レーン 1 :ヒト I型コラーゲン（10 g/mL)、レーン 2 :糸且換え I型コラーゲン、レー ン 3：組換え I型コラーゲンのペプシン分解物を示す。
[図 8]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳 動による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト II型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2 : 組換え II型コラーゲンを示す。
[図 9]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる分析を 示す写真である。レーン 1 :ヒト II型コラーゲン（10 g/mL)、レーン 2 :組換え II型コラ 一ゲン（10倍希釈)を示す。
[図 10]培養上清中の糸且換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解産物の SDS—ポ リアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1：ヒト II型コラーゲ ン（100 g/mL)、レーン 2：組換え II型コラーゲン (5倍濃縮)を示す。
[図 11]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解物のウェスタン ブロッテイングによる分析を示す写真である。レーン 1：ヒト Π型コラーゲン（10 g/mL) 、レーン 2 :糸且換え II型コラーゲンを示す。
[図 12]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト III型コラーゲン（100 g/mL)、レー ン 2：組換え III型コラーゲンを示す。
[図 13]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウェスタ ンブロッテイングによる分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト III型コラーゲン（10 g/m L)、レーン 2 :組換え III型コラーゲン（10倍希釈）、レーン 3 :組換え III型コラーゲンぺ プシン分解物を示す。
[図 14]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲン精製物の SDS—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動による分析を示す写真である。 A. I型コラーゲン、レーン 1 :ヒト I型コラー ゲン、レーン 2 :糸且換え I型コラーゲンを示す。 B. III型コラーゲン、レーン 1 :ヒト III型コ ラーゲン、レーン 2 :組換え III型コラーゲンを示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施するための最良の形態を示し、本発明についてさらに詳しく説 明する。
本発明は、以下の（a)から (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の 製造方法に関する。
(a) 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清カゝら 3重螺旋構 造を有するタンパク質を回収する工程。
[0015] 本発明の「3重螺旋構造を有するタンパク質」とは、 3重螺旋構造を有する限り特に 限定されないが、好ましくはコラーゲンまたはコレクチンを、より好ましくはコラーゲン を挙げることが出来る。 3重螺旋構造を有するタンパク質とは、培養製造段階で 3重 螺旋が構築されるタンパク質であってもよいし、培養製造後の精製等の操作により 3 重螺旋構造が構成されるものであってもよい。 3重螺旋構造を取りうるタンパク質であ る力 1本鎖構造の状態で大量に製造させてもよい。
[0016] コラーゲンには 20数種類の異なった型、またそれらを構成する約 25種類の a鎖が 存在することが知られており、それらをコードする遺伝子はそれぞれクローニングされ 、塩基配列が解明されている（"Connective Tissue and Its Heritable Disorders", ppl 45-165, Weily-Liss Inc.発行（1992))。そして、これらの遺伝子はいずれも、当業者 に公知の遺伝子組換え技術（例えば〃 Molecular Cloning"第 2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press発行（1989))によって本発明において用いられる外来遺伝子を高 発現することの可能なベクターに導入することが可能である。本発明で用いるヒト 'コ ラーゲン cDNAはこれらのクローニングされたコラーゲン cDNAのどれであってもよく 、またこれらコラーゲンの部分ペプチドも含む。
[0017] 本発明のコラーゲンの由来は特に限定をされないが、好ましくは哺乳動物由来、よ り好ましくはヒト由来のコラーゲンを挙げることが出来る。
さらにコラーゲンのァミノ配列の一部を置換'欠失等改変したものや、コラーゲン由 来でないアミノ酸配列を付加したものも本発明のコラーゲンに含まれる。また、ベクタ 一を宿主哺乳動物細胞に導入し、タンパク分子を発現して ヽる形質導入細胞を得る 方法は公知であり、本発明にお 、ても同様の方法を適用することができる。
[0018] 上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞にぉ 、てコラーゲンが組換え タンパク質として合成されて 、ることは以下によって調べることができる。すなわち巿 販のヒト 'コラーゲンに特異的に結合する抗体を用いてウェスタンブロッテイング等の 免疫化学的な方法によりコラーゲンペプチドであることを確認することができる。通常 コラーゲンは SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Nature, 227, 680-685 (1970)) においては、分子量通りには泳動されないため、コラーゲンをマーカーとして同時に 電気泳動後、 Matsudairaらの方法 (J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987))に従つ てナイロン膜あるいは-トロセルロース膜に転写し、抗コラーゲン抗体との反応性を調 ベることができる。さらに発現ベクターによって生産された組換えコラーゲン産物の中 に、 3重螺旋構造を有する分子が存在することは次のようにして調べることができる。
[0019] 通常の繊維性コラーゲンは、 3つのサブユニット ( a鎖）から形成される 3本鎖の分 子で、分子内に 3重螺旋構造を有している。そして、 3重螺旋構造を有するコラーゲ ンはペプシン消化に対して耐性を有することが知られている。そこで、上記の外来遺 伝子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清を酸性条件下にてペプシン消化 し、ペプシン耐性な構造を有するかを調べることにより、このタンパク質試料に 3本鎖 分子が存在して ヽることを示すことができる。
[0020] 即ち、本発明にお 、ては、ペプシン処理を施したタンパク質試料を、還元条件下の SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、得られた組換えコラーゲン は天然コラーゲンと同様のペプシン耐性を示すことが明らかになり、上記の外来遺伝 子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清中にはペプシン処理に対して耐性 の性質を有するコラーゲンペプチドが含まれると推察された。以上の結果から、本発 明の発現ベクターは、宿主細胞において生体内に見られるのと同等な特性即ち、ぺ プシン耐性なコラーゲンを合成させる能力を持つことが示される。
[0021] 本発明の 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法および精製方法を以下に示 す力 これらの方法に限定されるものではない。
本発明で宿主細胞として培養に用いられる哺乳動物細胞は特に限定されないが、 好ましくは、 CHO細胞または HEK293細胞を挙げることが出来る。
[0022] 本発明で用いられる CHO細胞または HEK293細胞は、懸濁培養することにより大 量培養化が可能である。例えば、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジ ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドをコ ードする cDNAを共に有するヒト ·コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組 換え CHO細胞 1 X 108〜1 X 109個を 100mL〜lLの培養液でシェーカーフラスコま たはスピナ一フラスコで培養することが可能である。これを適当な時間培養した後、 培養上清を集めタンパク質を大量に抽出することができる。
[0023] 弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト •コラーゲンまたはヒト.コラーゲンの部分ペプチドをコードする cDNAを共に有するヒ ト 'コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換え CHO細胞の培養上清に おいては、 3重螺旋構造を有する 3本鎖コラーゲン分子と同時に正常な 3本鎖分子を 形成しな力つたコラーゲンも存在する。前述のように、 3重螺旋構造を有しないコラー ゲン分子はペプシンによって消化される。このため、 3重螺旋構造を有しないコラー ゲン分子はペプシンによって分解除去することができる。この処理によって同時にコ ラーゲン以外の培養上清中のタンパク質も分解除去することができる。以上の性質を 利用して、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺 伝子、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドをコードする cDNAを共 に有するヒト 'コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換え CHO細胞の培 養上清中に存在する全タンパク質を直接ペプシン処理し非コラーゲン性タンパク質 を分解除去するとともに、 3重螺旋構造を有しないコラーゲンも分解除去することがで きる。
[0024] 本発明にお 、て対象とするヒト 'コラーゲンは、現在知られて!/、る I型から XXI型コラ 一ゲンを含むすべてのヒト 'コラーゲンであり、これらのコラーゲンの部分ペプチドも含 む。本発明のコラーゲンの型は特に制限をされないが、代表例として、 I型、 II型、 III 型、 IV型、 V型、 VII型、 IX型、 XI型、 XII型、 XVII型、または XVIII型等を挙げることが 出来、このましくは、 I型、 II型、 III型を挙げることが出来る。 I、 IV、 V、 IX、 XI型はそれ ぞれ 2,3種類の α鎖からなり、 II、 III、 VII、 XII、 XVII、 XVIII型はそれぞれ 1種類の α鎖 からなる。これらはそれぞれ、 -. i a l (I)] o; 20)、 II型： [ひ 1(11)]
2 3、 III型： [ α 1(ΙΠ)]
3、 IV i 1 (IV)] a 2(IV)、 V型： [ α ΐ (V)] a 2(V)と α 1 (V) a 2 (V) a 3 (V)、 VII型： [ a 1(VII
2 2
)]、 IX型： 1 (IX) 2 (IX) 3 (IX), XI型： 1 (XI) 2 (XI) 3 (XI), ΧΠ型： [ l(XII)]
3
、 XVII型： [ a 1 (XVII)]、または XVIII型： [ a 1 (XVIII)]という分子構成を持つ力 本発 明のコラーゲンの分子構成は特に限定されるものではない。また、本発明のコラーゲ ンの分子構成は、天然のコラーゲン由来の分子構成に限定されるものでなぐ種類 のことなる 3種類の α鎖を人為的に複合させてもよい。
[0025] 本発明の I型コラーゲンの a 1鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 1に、 I型 コラーゲンの (X 2鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 4に、 II型コラーゲンの a 1鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 7に、 III型コラーゲンの a 1鎖をコー ドする DNAの塩基配列を配列番号： 10にそれぞれ示す。
[0026] 本発明のコラーゲンをコードする DNAとして、好ましくは配列番号： 1、 4、 7、 10のい ずれかに記載の塩基配列力 なるオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号： 1、 4、 7、 10のいずれかに記載の塩基配列力 なるオリゴヌクレオチドに、選択的にハイブリダ ィズするオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。選択的にノ、イブリダィズするとは、 あら力じめ定められた配列をもつ分子（すなわち第 2のポリペプチド）力 DNAまたは RN Aの試料中に存在する場合、適切にストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件の 下で、ハイブリダィズする、二本鎖になる、または本質的に互いにのみ結合する核酸 分子を指す。ストリンジェントな条件とは、例えば、通常、 42°C、 2 X SSC、 0.1%SDSの 条件であり、好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、さらに好ましくは、 65 。C、 0.1 X SSCおよび 0.1%SDSの条件である力 これらの条件に特に制限されない。 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度な ど複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適な ストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0027] 本発明にお 、て製造されるコラーゲンは、 N末端および C末端にプロペプチドが結 合している、プロコラーゲン分子の状態であってもよいし、プロペプチドが除去された 状態であってもよい。
本発明において、「コラーゲンの部分ペプチド」とは、コラーゲンをコードする cDNA の 20%以上（例えば 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90%)のポリヌクレオチドにより コードされるポリペプチドをいう。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改 変したものや、非コラーゲンアミノ酸配列を付加したものも含む。
[0028] 本発明にお 、て「コラーゲン発現量の少な 、哺乳動物細胞」とは、 1 X 106細胞 Z mLで培養した場合に 50ngZmL以下のコラーゲン生産量である細胞のことを!、 、、 より好ましくは、 CHO細胞、 HEK293細胞を好適に挙げることができる。本発明にお V、て「高発現」とは、 10 gZmL以上のコラーゲン発現、好ましくは 50 μ gZmL以 上のコラーゲン発現をいう。
[0029] 本発明にお 、て「外来遺伝子を高発現することの可能なベクター」とは、例えば該 ベクターに含まれる哺乳動物細胞における薬剤選択マーカー遺伝子の働きが微弱 であるため哺乳動物細胞染色体上の転写の盛んな領域に選択的に挿入されることを 特徴とするベクターであることを 、 、、好ましくは pNOWZCMV— AAベクターを挙 げることができる。 pNOWZCMV— AAベクターは特開平 10— 179169号公報に 公知である。本発明において、培養方法は浮遊、付着培養いずれでもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0030] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 l〕pNOWZCMV— AAベクターの調製
?^01\^7じ1^¥—^べクターは公知の方法（特開平10—179169号公報）により 調製したものを使用した。
[0031] 〔実施例 2〕コラーゲン発現ベクターの作製（1)：ヒ H型 α 1鎖 cDNAの単離
ヒト I型 α 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされ、その塩基配列が報告さ れている（EMBL遺伝子データベース登録名 ΝΜ 000088) οその配列を配列番号： 1 に示す。ヒト I型 a lcDNAはヒト精巣由来 cDNAよりポリメラーゼ'チェーン 'リアクショ ン（PCR)法（"PCR Technology", Stockton Press発行（1989))により増幅された。す なわち、ヒト精巣由来 cDNA (ベタトン'ディッキンソン社)を铸型として配列番号： 2の
ライマーとして配列番号：1の全長の配列を PCR法により増幅した。すなわち、市販 の PCR増幅キット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer:タカラバイオ社）を用い、 94°C、 5分間の加熱処理後、変性（94°C、 20秒）、プライマーアニーリング（60°C、 30秒）、 増幅（72°C、 3分 30秒）の 3ステップを 35回繰り返し、更に 72°C、 7分間の処理をして 反応を終了した。以後、本実施例に記載の PCR反応はすべて同様の反応サイクル にて実施した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産 物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novagen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligati on kit ver.2：タカラバィォ社)を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結され た DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質 を有するコロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DN Aより切り出したヒト I型 a 1鎖コラーゲンをコードする DNA断片と実施例 1で調製した 外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— AAの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導 入後、 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コロニーを培養 することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIal、図 1)が得られた。
〔実施例 3〕コラーゲン発現ベクターの作製 (2)：ヒト I型 (X 2鎖 cDNAの単離 ヒト I型 a 2鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告され ている（EMBL遺伝子データベース登録名 NM 000089) oその配列を配列番号： 4に 示す。ヒト I型 a 2cDNAはヒト肝臓由来 cDNAより PCR法により増幅された。すなわ ち、ヒト肝臓由来 cDNA (和光純薬工業)を铸型として配列番号： 5のオリゴヌクレオチ
て配列番号： 4の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァガロー スゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novage n社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した 。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社)上 に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト I型 (X 2鎖コラーゲンをコード する DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— AAの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結 された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コ 口-一を培養することによりプラスミド DNA (pNOW— hColIa2、図 2)が得られた。
[0033] 〔実施例 4〕コラーゲン発現ベクターの作製 (3)：ヒト II型 (X 1鎖 cDNAの単離
ヒト II型 a 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告され ている（EMBL遺伝子データベース登録名 NM 001844.1) oその配列を配列番号： 7 に示す。ヒト II型 α lcDNAはヒト精巣由来 cDNAより PCR法により増幅された。すな わち、ヒト精巣由来 cDNA (ベタトン'ディッキンソン社)を铸型として配列番号： 8のォ
して配列番号： 7の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァガロ ースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Nova gen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結し た。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社） 上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することによりプラスミ ド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト II型 α 1鎖コラーゲンをコー ドする DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— ΑΑの Not Iと Xba
I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連 結された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コロニーを培養することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIIal、図 3)が得られた
[0034] 〔実施例 5〕コラーゲン発現ベクターの作製 (4)：ヒト III型 α 1鎖 cDNAの単離
ヒト III型 a 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告さ れている（EMBL遺伝子データベース登録名 X14420)。その配列を配列番号： 10に 示す。ヒト III型 α lcDNAはヒト肝臓由来 cDNAより PCR法により増幅された。すなわ ち、ヒト肝臓由来 cDNA (和光純薬工業)を铸型として配列番号： 11のオリゴヌクレオ
として配列番号： 10の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァ ガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novagen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて 連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフ コ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することにより プラスミド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト III型 α 1鎖コラーゲ ンをコードする DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— ΑΑの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue 株に連結された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を 有する 1コロニーを培養することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIIIal、図 4)が 得られた。
[0035] 〔実施例 6〕ヒト I型コラーゲンの生産：発現ベクター pNOW— hColIalと pNOW— hC olIa2によるヒト I型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立
実施例 2および 3で得られた pNOW—hColIalと pNOW—hColIa2の各々 1 gを リポフエクチン法 (キアゲン社製エフエタテントランスフエクシヨン試薬)を用いて、 25c m2の培養フラスコ中の 150万個の DHFR欠損 CHO細胞（CHO細胞 DG44株； Dr. Gail Urlaubから譲受）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従つ た。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後、 50万個の細 胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタイタ一プレート 10 枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培養し、 197ゥエル 中の生存細胞を lmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Is cove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコンフルェ ントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社） lmLを各 ゥエルに加え再び培養上清を廃棄した。これ〖こ 0. 5mLの CHO細胞用 CD培地 Pro CH04 (タカラノィォ社)をカ卩えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 96時間培養した。続 いて培養上清中のヒト I型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
[0036] 〔実施例 7〕pNOW— hColIalと pNOW— hColIa2形質導入細胞クローンによるヒ H 型コラーゲンの生産量の検定 生産量の検定は SDS ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の 1 2. 5 Lと等量のトリス SDS jS— MEサンプル処理液（第一化学）を混合し、 95°C、 5 分間の熱処理を行なった。これを SDS ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 ATTO社 )に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマ シーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理することにより ポリアクリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照として は、 12. 5〜100 8 !11しの濃度のヒト1型コラーゲン（コスモバィォ社）を同様に処 理して用いた。
[0037] 〔実施例 8〕ヒト I型コラーゲンの生産
G418耐性細胞株のうち、ヒト I型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培 養し安定ィ匕させた。ヒト I型コラーゲンの産生レベルは、培地当たり 85 gZmL (4日 間）であった。
[0038] 〔実施例 9〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンの SDS ポリアクリルアミドゲル電 気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒト I型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを 細胞培養液 IS CHO-CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm2培養フラスコ中で 1 X 106個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間 培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養 上清の 12. 5 μ Lと等量のトリス SDS β MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合 し、 95°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS ポリアクリルアミドゲル（PAGEL 、 ATTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS ポリアクリルアミドゲル 電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシ一 ブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリア クリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 g ZmLの濃度のヒト I型コラーゲンを同様に処理して用いた。図 5にヒト I型コラーゲン生 産細胞クローンより得られた培養上清の SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ る分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ H型コラーゲンひ 1鎖と考えられる 150k Da、 170kDaの位置のポリペプチドおよび組換えヒト I型コラーゲン α 2鎖と考えられ る 130kDa、 150kDaの位置のポリペプチドが検出された。
[0039] 〔実施例 10〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンのペプシンによる分解と SDS-ポ リアクリルアミドゲル電気泳動による分析
ヒト I型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のペプシン分解は 99. 7 %酢酸を培養上清に最終濃度 0. 5Mになるように加え、これにペプシン (シグマ社） を最終濃度 24ユニット ZmLとなるように添加した後 20°C、 2時間で実施した。以下 のペプシン分解は同様にして実施した。ペプシンによる分解によって得られたサンプ ルは SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては 185 μ gZmLの市販の組換えヒト I型コラーゲン（ベタトン'ディッキンソン社）を用いた 。図 6にペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分 析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒ H型コラーゲン は巿販のヒト I型ァテロコラーゲンと同様に a 1鎖と考えられる 130kDaの位置のポリ ペプチドおよび a 2鎖と考えられる 120kDaの位置のポリペプチドとして検出された。 このことはヒト I型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と 実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト I型コラーゲンが含まれて 、る ことを示していた。
[0040] 〔実施例 11〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる 分析
SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスフ ァー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後、 2 g/mLの 濃度の抗ヒト I型コラーゲン ex 1鎖抗体とそれに引き続いてホースラッデイシュペルォ キシダーゼ (HRP)標識抗ャギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性 を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて行なった。比 較対照としては、 50 gZmLの組換えヒト I型コラーゲン (ベタトン'ディッキンソン社） を用いた。ヒト I型コラーゲン α 2鎖の検出は抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体のかわりに 抗ヒト I型コラーゲン α 2鎖抗体を用いて実施した。比較対照としては、 10 gZmLの ヒト I型コラーゲンを用いた。図 7にウェスタンブロッテイングによる分析結果を示す。培 養上清中に抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体が結合できる組換えヒト I型コラーゲン α 1 鎖と考えられる 170kDaの位置のポリペプチドおよび抗ヒト I型コラーゲン (X 2鎖抗体 が結合できる組換えヒト I型コラーゲン α 2鎖と考えられる 130kDa、 150kDaの位置 のポリペプチドが検出された。
[0041] 〔実施例 12〕培養上清中のヒト I型コラーゲンの精製
ヒ H型コラーゲンを含む培養上清 lOOmLを用いて以下の様に精製を行った。 遠心濃縮フィルター（VIVASPIN20(MWCO 10,000：ザルトリウス社)〖こて 4°Cで 3,000 rpmの遠心分離により 0. 45 μ mのメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した 100 mLの培養上清を 30mLに濃縮した。
4°Cで 30mLの 90%硫酸アンモ-ゥム溶液を上記濃縮培養上清中に攪拌しながら 徐々に加えて塩析し、全ての硫酸アンモ-ゥムをカ卩えてから 1時間攪拌した。その後 、氷中にて 1時間静置した後、高速冷却遠心器にて 4°Cで 18,OOOrpm X 30分間遠 心分離を行った。塩析によって不溶化した溶液中のコラーゲンは溶液上に浮くので それを回収し、 5mLの D— PBS (シグマ社）で完全に溶解させた。これを 0. 45 m のメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した後に D— PBSで平衡化した Superose 6 (アマシャムバイオサイエンス社)を用いたゲルろ過により精製し、最初に出現するピ 一クを分取した。集めたピークのフラクションを VIVASPIN6(MWCO100,000)で約 20倍 に濃縮し、濃縮したコラーゲン溶液に D— PBSを適量加えてさらに濃縮し、低分子フ ラグメントを除去した。この D— PBSを加える操作を少なくとも 3回以上行った。
元の培養上清 lOOmLにっき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約 300 μ L になるように濃縮したものを SDS— PAGEにより電気泳動して精製度の確認を行つ た。
[0042] 〔実施例 13〕ヒト II型コラーゲンの生産試験：発現ベクター pNOW— hColIIalによるヒ ト1型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立
1 μ gの pNOW— hColIIalを 25cm2の培養フラスコ中の 150万個の CHO細胞 DG 44株にリポフエクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明 書に従った。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後 50万 個の細胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Isc ove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタイタープレ ート 10枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培養し、 126 ゥエル中の生存細胞を ImLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清 添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコン フルェントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社製） 1 mLを各ゥエルに加え再び培養上清を廃棄した。これに 0. 5mLの CHO細胞用無血 清培地細胞用 CD培地 ProCH04 (タカラバイオ社)を加えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 96時間培養した。続いて培養上清中のヒト II型コラーゲンの生産量の検討を 行なった。
[0043] 〔実施例 14〕pNOW— hColIIal形質導入細胞クローンによるヒト II型コラーゲンの生 産量の検定
生産量の検定は SDS—ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の 7 . 5 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合し、 95°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 ATTO 社）に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマ シーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポ リアクリルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照として は、 12. 5〜100 gZmLの濃度のヒト II型コラーゲン（コスモバイオ社）を同様に処 理して用いた。
[0044] 〔実施例 15〕 G418耐性細胞株の遺伝子増幅
G418耐性細胞株のうち、ヒト II型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培 養し安定ィ匕させた後に、 MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに 5nMの MTXを含 む培地で 1週間、 25nMの MTXを含む培地で 1週間、 50nMの MTXを含む培地で 1週間、 250nMの MTXを含む培地で 3週間、 1 Mの MTXを含む培地でさらに 3 週間増幅させたところ、 25nMの MTXの時点でヒト II型コラーゲンの産生レベルは培 地当たり gZmL (4日間）に上昇した。遺伝子増幅に用いる MTX濃度は一般に ΙΟηΜ〜： L0 μ Μの間の多段階とされ、最終濃度としては 10 μ Μがよく用いられるが 、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の榭立には問題が ある。このため低濃度 MTXで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本 実験では 1 μ Μまでとした。また通常セレクションを含めた ΜΤΧ暴露期間は 6〜 12ケ 月とされるのに対して、本実験では約 9週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず 有効なヒト II型コラーゲンの産生量増加がみられた。以下の G418耐性細胞株の遺伝 子増幅も同様にして実施した。
[0045] 〔実施例 16〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル 電気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒト II型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを 細胞培養液 IS CHO-CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm2培養フラスコ中で 1 X 106個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間 培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養 上清の 7. 5 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学）を混合し、 9 5°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 A TTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS—ポリアクリルアミドゲル電 気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシ一プリ リアントブルー染色液 (アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアタリ ルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 /z gZ mLの濃度のヒト II型コラーゲン (コスモノィォ社)を同様に処理して用いた。図 8にヒト Π型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清の SDS—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ HI型コラーゲンと考えら れる 170kDa、 200kDaの位置のポリペプチドが検出された。
[0046] 〔実施例 17〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる 分析
SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスフ ァー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後 1 μ g/mLの濃 度の抗ヒト II型コラーゲン鎖抗体 (コスモノィォ社)とそれに引き続いてホースラッディ シュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて 行なった。比較対照としては、 10 /z g/mLのヒト II型コラーゲン（コスモバイオ社)を用 いた。培養上清中に抗ヒト II型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒト II型コラーゲ ンと考えられる 170kDaのポリペプチドが検出された（図 9)。
[0047] 〔実施例 18〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解と SDS— ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウェスタンブロッテイングによる分析
ペプシンによる分解によって得られたサンプルは SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により分析を行なった。比較対照としては、 100 gZmLのヒト II型コラーゲン (コ スモバイオ社）を用いた。図 10にペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組 換えヒト II型コラーゲンは市販のヒト II型ァテロコラーゲンと同様に 130kDaのポリぺプ チドとして検出された。このことはヒト II型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培 養上清中には実質的に天然型と同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト II型コ ラーゲンが含まれて！/、ることを示して！/、た。ウェスタンブロッテイングによる分析にお!ヽ ても同様の結果が得られた（図 11)。
[0048] 〔実施例 19〕ヒト III型コラーゲンの生産試験。発現ベクター pNOW— hColIIIalによる ヒト III型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立
1 gの pNOW— hColIIIalを用いて 25cm2の培養フラスコ中の 150万個の CHO 細胞 DG44株にリポフエクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の 使用説明書に従った。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測 の後 30万個の細胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血 清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタ イタ一プレート 10枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培 養したところ、 117ゥエルにのみ細胞の生存が見られた (G418耐性株)。生存細胞を ImLの 0. 8mg/mLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコンフルェントになるまで培 養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社） ImLを各ゥエルに加え再び 培養上清を廃棄した。これに 0. 5mLの CHO細胞用無血清培地 CHO— S— SFM Π (インビトロジェン社)を加えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 72時間培養した。続い て培養上清中のヒト III型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
[0049] 〔実施例 20〕 pNOW—hColIIIal形質導入細胞クローンによるヒト III型コラーゲンの 生産量の検定
生産量の検定はドットプロット法にて実施した。ナイロンメンブレン上に 72時間培養 上清 1 μ Lと市販のヒト III型コラーゲン（ベタトン'ディッキンソン社）の CHO細胞用無 血清培地 CHO— S— SFM IIによる 2倍希釈系列（0. 125〜8 gZmL)と CHO— S - SFM IIそれぞれ 1 μ Lをドットし、 1時間の風乾、ブロックエースによるブロッキン グの後 1 μ gZmLの濃度の抗ヒト III型コラーゲン抗体 (コスモノィォ社)とそれに引き 続 ヽて HRP標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体はスーパーシグナル ウェストピコ試薬にて HRPの活性を検出する方法でルミノキヤプチヤーを用いて行な つた o
[0050] 〔実施例 21〕 G418耐性細胞株の遺伝子増幅
G418耐性細胞株のうち、ヒト III型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培 養し安定ィ匕させた後に、 MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに 15nMの MTXを 含む培地で 2週間、 60nMの MTXを含む培地で 2週間、 250nMの MTXを含む培 地で 2週間、 1 μ Μの MTXを含む培地でさらに 4週間増幅させたところ、ヒト III型コラ 一ゲンの産生レベルは培地当たり 225 μ g/mL (3日間）に上昇した。
[0051] 〔実施例 22〕培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル 電気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒト III型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを 細胞培養液 IS CHO - CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm2培養フラスコ中で 1 X 106個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間 培養した後、培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養 上清の 6 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合し、 9 5°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 A TTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS—ポリアクリルアミドゲル電 気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシ一プリ リアントブルー染色液 (アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポリアタリ ルアミドゲル中のヒト III型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 ZmLの濃度のヒト III型コラーゲン (ベタトン'ディッキンソン社)を同様に処理して用い た。図 12にヒト III型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清の SDS—ポリ アクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ ΗΠ型コラ 一ゲンと考えられる 140kDa、 170kDaの位置のポリペプチドが検出された。
[0052] 〔実施例 23〕培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによ る分析
SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスフ ァー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト III型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後 1 μ g/mLの濃 度の抗ヒト III型コラーゲン鎖抗体 (コスモバイオ社)とそれに弓 Iき続 、てホースラッディ シュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて 行なった。比較対照としては、 100 gZmLのヒト III型コラーゲン（ベタトン'ディツキ ンソン社)を用いた。培養上清中に抗ヒト III型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒ ト III型コラーゲンと考えられる 140kDa、 170kDaの位置のポリペプチドが検出された (図 13)。
ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンは市販のヒト III 型ァテロコラーゲン（ベタトン.ディッキンソン社）と同様に 130kDaの位置のポリぺプ チドとして検出された。このことはヒト III型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培 養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト III型コ ラーゲンが含まれて 、ることを示して 、た。
[0053] 〔実施例 24〕培養上清中のヒト I型および III型コラーゲンの精製
ヒト I型または III型コラーゲンを含む培養上清 lOOmLを用いて実施例 12と同様に 操作して精製を行った。元の培養上清 lOOmLにっき最終的に得られた精製コラー ゲン溶液が約 300 Lになるように濃縮したものを SDS— PAGEにより電気泳動して 精製度の確認を行った (図 14)。 産業上の利用可能性
[0054] 本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準かつ天然型により近い組換えヒト · コラーゲンの生産を可能にする発現ベクターおよびヒト 'コラーゲン生産細胞を提供 することができる。また、ヘテロトリマーのヒト 'コラーゲン生産細胞を提供することもで きる。
[0055] 本発明の製造方法は、コラーゲンのみならず、 3重螺旋構造を持つコレクチン等の タンパク質にも適用することが可能である。
さらに、本発明のコラーゲンの製造方法において、種類の異なる α鎖を同時に発 現させることで、天然では本来製造されることのな 、（これまでに発見されて 、な 、） 新規な分子構成の 3重螺旋構造を持つコラーゲンを大量に製造できる可能性がある 。これらの新規な分子構成の 3重螺旋構造を持つコラーゲンは、既知のコラーゲンと は異なった性質を持っていることが考えられ、新規の材料としての応用が期待される

Claims

請求の範囲
[I] 以下の（a)から (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法。
(a) 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清カゝら 3重螺旋構 造を有するタンパク質を回収する工程
[2] 3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト 'コラーゲンまたはその部分ペプチドである 請求項 1に記載の方法。
[3] ヒト 'コラーゲンが少なくとも 1種類以上の α鎖力もなるヒト 'コラーゲンである、請求項 2 に記載の方法。
[4] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · Ι型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。
[5] ヒト · Ι型コラーゲンが oc 1鎖と oc 2鎖の複合体である請求項 4に記載の方法。
[6] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · II型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。
[7] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · III型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。
[8] 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが、以下の（a)または (b)に記載 の DNAカゝら選択される少なくとも 1つの DNAである、請求項 1に記載の方法。
(a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA
(b)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA
[9] 哺乳動物細胞がチャイニーズノ、ムスター卵巣 (CHO)細胞である、請求項 1〜8のい ずれかに記載の方法。
[10] 哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞 (HEK293)である、請求項 1〜8のいずれかに記 載の方法。
[I I] 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが導入されるベクターが、 pNO WZCMV— AAである、請求項 1〜10のいずれかに記載の方法。
[12] 請求項 1〜1 1のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト 'コラーゲン。
[13] 以下の（a)または (b)に記載の DNA力も選択される少なくとも 1つの DNAが導入され たベクター。 (a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA
(b)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA
[14] 請求項 13に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。
[15] 請求項 13に記載のベクター、または請求項 14に記載の哺乳動物細胞を含む、 3重 螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
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