WO2011115070A1 - グリシン繰り返し配列タンパク質を産生する形質転換体 - Google Patents

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昌一 西尾
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住友化学株式会社
大日本住友製薬株式会社
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    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11002—Procollagen-proline dioxygenase (1.14.11.2), i.e. proline-hydroxylase
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    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11004—Procollagen-lysine 5-dioxygenase (1.14.11.4), i.e. lysine-hydroxylase

Definitions

  • the present invention relates to a transformant that produces a glycine repeat sequence protein and a method for obtaining a glycine repeat sequence protein.
  • a group of proteins having a glycine repeat sequence exists in the living body and plays an important role in maintaining the tissue structure of the living body, cell-cell adhesion, wound treatment, and the like. These groups of proteins are characterized by a high content of imino acids (specifically, for example, proline or hydroxyproline) and a specific triple helix structure, collectively called collagen.
  • Collagen is contained in various living tissues represented by skin, tendon, cartilage, ligament, blood vessel and bone. Collagen has a high tensile strength, and thus a living tissue containing collagen has a high strength against mechanical stress.
  • Natural or artificial glycine repeat sequence protein represented by collagen has excellent physical properties and various physiological activities. Therefore, it has utility for pharmaceuticals, industrial products, cosmetics or foods. It is a versatile material that is commercially valuable.
  • Commercially produced glycine repeat sequence protein is mainly natural collagen, which is produced by purification from animal skin, tendon, bone and the like.
  • Collagen is present in almost all multicellular animals, and in higher animals, it accounts for about 30% of the proteins present in the body. It is known that more than 20 types of collagen exist in higher animals. Examples of collagen having a large amount in vivo include Type I collagen, Type II collagen, and Type III collagen.
  • Type I collagen is a major fibrous collagen contained in bones, tendons and skin, and is a heterotrimeric molecule composed of two ⁇ 1 (I) chains and one ⁇ 2 (I) chain.
  • Type II collagen is a collagen contained in cartilage and vitreous body, and is a homotrimeric molecule composed of three identical ⁇ 1 (II) chains.
  • Type III collagen is a collagen contained in skin and blood vessels, and is a homotrimeric molecule composed of three identical ⁇ 1 (III) chains. Note that Type I collagen, Type II collagen, and Type III collagen are purified from living tissue by the methods described in Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 4, and Non-Patent Document 5, for example.
  • Patent Document 2 discloses a technique for producing a triple helical polymer using self-assembly of chemically synthesized peptides. It is disclosed. However, since the method using chemical synthesis is expensive in raw materials and requires a multi-step process, a simple manufacturing method using inexpensive raw materials has been demanded.
  • Non-Patent Document 6 Type I collagen precursor and proline hydroxylase are produced in yeast cells to produce Type I collagen in which the proline residue is hydroxylated.
  • Patent Document 1 Type I collagen precursor or Type III collagen precursor and proline hydroxylase are produced in yeast cells to produce Type I collagen or Type III collagen in which the proline residue is hydroxylated.
  • Patent Document 3 discloses a method for producing an artificial glycine repeat sequence protein that does not exist in nature using genetically modified cells. However, a method for more efficiently producing a highly functional glycine repeat sequence protein has been demanded.
  • Glycine repetitive sequence protein which is a high-performance and versatile material that is commercially more valuable as pharmaceuticals, industrial products, cosmetics, foods, etc., does not impair the original physical properties (specifically, for example, glycine repetitive sequence)
  • glycine repetitive sequence We found a transformant that reduces the change in the physical properties of the protein and reduces the change in the physical properties of the protein, and is produced in a more lipophilic state (similar to the properties inherent in the glycine repeat sequence protein). Development of a method for obtaining a glycine repeat sequence protein by using it has been demanded.
  • the present invention 1. Transformants in which any of the following polynucleotides (1), (2) and (3) are introduced into microbial cells: (1) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of proline hydroxylase; and (3) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B): Polynucleotide: ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-Xaa-Yaa repeat sequence; and ⁇ Characteristic (B)> An imino acid (specifically, for example, proline or hydroxyproline) is included in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in which
  • the transformant according to any one of items 1 to 4 above, wherein the polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the FK506 binding protein is linked downstream of a yeast-derived promoter; 6). 6.
  • the lysine hydroxylase is at least one lysine hydroxylase selected from lysyl hydroxylase 1 or lysyl hydroxylase 3; 8). 6. The transformant according to any one of 1 to 5 above, which further produces Hsp47 in the cell; 9. 9. The transformant according to any one of items 1 to 8, wherein the proline hydroxylase is prolyl-4-hydroxylase; 10. 9. The transformant according to any one of 1 to 8 above, wherein the proline hydroxylase is an enzyme comprising an ⁇ subunit of prolyl-4-hydroxylase and a ⁇ subunit of prolyl-4-hydroxylase; 11. 11.
  • transformant according to item 10 above wherein a prepro sequence of yeast ⁇ -factor is fused to the amino terminus of the ⁇ -subunit of prolyl-4-hydroxylase; 12
  • the transformant according to item 17 above, wherein the yeast cell is a methanol-assimilating yeast cell; 19. 19. The transformant according to item 18 above, wherein the methanol-assimilating yeast cell is Komagataella pastoris; 20.
  • a method for producing a glycine repeat sequence protein comprising: (1) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of proline hydroxylase; and (3) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B): Polynucleotide: ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-X
  • a glycine repeat sequence protein that becomes a high-performance versatile material that is commercially more valuable as a pharmaceutical, an industrial product, a cosmetic, a food, etc., does not impair the original physical properties (specifically, for example, A transformant produced by reducing the change in physical properties related to hydrophilicity possessed by the glycine repeat sequence protein and producing a state of higher lipophilicity, which is close to the nature inherently possessed by the glycine repeat sequence protein, and the transformant It is possible to provide a method for producing a glycine repeat sequence protein.
  • FIG. 1 is a flowchart of a process for preparing a prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette and a prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 2 is a flowchart of a process for preparing an FK506 binding protein (FKBP) expression cassette introduced plasmid.
  • FIG. 3 is a flowchart of a process for preparing an FK506 binding protein (FKBP) expression cassette introduced plasmid.
  • FIG. 4 is a flowchart of a process for preparing an FK506 binding protein (FKBP) expression cassette introduced plasmid.
  • FIG. 1 is a flowchart of a process for preparing a prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette and a prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 2 is a flowchart of a process for preparing an FK506 binding protein (FKBP)
  • FIG. 5 is a flowchart of a process for preparing a human collagen Type I ⁇ 1 expression cassette and a human collagen Type I ⁇ 2 expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 6 shows a fusion polypeptide expression cassette consisting of an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region, and A process for preparing a plasmid for introducing a fusion polypeptide expression cassette comprising an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region It is a flowchart of.
  • FIG. 7 shows human collagen TypeI ⁇ 1 N-terminal non-helix region, N-terminal helix region 27 residues, helix region central 522 residue dimer, C-terminal helix region 15 residues, and C-terminal non-helix.
  • a fusion polypeptide expression cassette consisting of a region, and an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 27 residues, a helix region central 522 residue dimer, a C-terminal helix region of 15 residues, And it is a flowchart of the preparation process of the fusion polypeptide expression cassette introduction plasmid which consists of a C terminal non-helix region.
  • FIG. 8 is a flowchart of a production process of a human collagen Type III expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 9 is a flowchart of a production process of a human collagen Type II expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette and a prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of an FKBP expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 12 is a schematic diagram of an FKBP expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of an FKBP expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 14 is a schematic diagram of an FKBP expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 15 is a schematic diagram of a human collagen Type I expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 16 shows a fusion polypeptide expression cassette consisting of an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region, and Schematic diagram of a fusion polypeptide expression cassette introduction plasmid comprising an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region It is.
  • FIG. 16 shows a fusion polypeptide expression cassette consisting of an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region It is.
  • FIG. 17 shows an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 27 residues, a helix region central 522 residue dimer, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix.
  • a fusion polypeptide expression cassette consisting of a region, and an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 27 residues, a helix region central 522 residue dimer, a C-terminal helix region of 15 residues
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a plasmid for introducing a fusion polypeptide expression cassette comprising a C-terminal non-helix region.
  • FIG. 18 is a schematic diagram of a human collagen Type III expression cassette introduction plasmid.
  • FIG. 19 is a schematic diagram of a human collagen Type II expression cassette introduction plasmid.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing any of the following polynucleotides (1), (2) and (3) into microbial cells: (1) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of proline hydroxylase; and (3) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B): Polynucleotide: ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-Xaa-Yaa repeat sequence; and ⁇ characteristic (B)> An imino acid (specifically, for example, proline or hydroxyproline) is included in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in which the
  • FK506 binding protein is a general term for proteins having an amino acid sequence of the FKBP domain found from a protein that forms a complex with the immunosuppressant FK506.
  • the polynucleotide having the base sequence encoding the amino acid sequence of the FK506 binding protein used for the preparation of the transformant of the present invention includes a base sequence encoding the amino acid sequence of the FK506 binding protein having a molecular weight of 15,000 to 60,000. Can be mentioned.
  • FK506 binding protein Preferably FKBP23 or FKBP19, More preferably, FKBP23 can be mentioned.
  • the biological species from which the FK506-binding protein is derived is not particularly limited, but FK506-binding protein derived from animals, preferably FK506-binding protein derived from homeothermic animals, more preferably FK506-binding protein derived from mammals, and more preferably Can include human-derived FK506 binding protein.
  • the FK506 binding protein examples include human FKBP23 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74, human FKBP19 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, or deletion of amino acids in these amino acid sequences. And FK506 binding proteins with substitutions or additions. Further, it may be an FK506 binding protein having homology with these amino acid sequences, for example, a protein having an amino acid sequence derived from an ortholog gene derived from a heterologous organism.
  • amino acid sequences derived from the orthologous gene of human FKBP23 canine FKBP23 (NCBI accession: XP — 545546), chimpanzee FKBP23 (NCBI accession: XP — 515842), bovine FKBP23 (NCBI accession: XP_871835), rat FKBP58
  • An amino acid sequence such as FKBP23 (NCBI accession: NP — 034552) or chicken FKBP23 (NCBI accession: XP — 421981) can be mentioned, and an amino acid sequence derived from the ortholog gene of human FKBP19 is canine FKBP19 (NCBI accession: P 51205), chimpanzees FKBP19 (NCBI accession: XP_001159891), bovine FKBP19 (NCBI accession: NP_001039397), rat FKBP19 (NCBI accession: NP_001013123) or mouse FKBP19 (NCBI accession: NP_
  • the polynucleotide having the base sequence encoding the amino acid sequence of the FK506 binding protein specifically includes, for example, a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 76 and a base sequence represented by SEQ ID NO: 77
  • examples thereof include a polynucleotide, a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 78, or a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 79, and more preferably a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 76.
  • examples thereof include a nucleotide or a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 78.
  • a polynucleotide in which deletion, substitution or addition of a part of the base sequence of these polynucleotides is introduced, or a polynucleotide having a partial base sequence of these polynucleotides can be mentioned.
  • it may be a polynucleotide having a base sequence having homology with the base sequence of these polynucleotides, for example, a polynucleotide having a base sequence derived from a coding sequence (CDS) of an ortholog gene derived from a heterologous organism. .
  • CDS coding sequence
  • CDS of the orthologous gene of human FKBP23 canine FKBP23CDS (NCBI accession: XM_545546), chimpanzee FKBP23CDS (NCBI accession: XM_51594), bovine FKBP23CDS (NCBI acsion: XM_866B) : NM — 010222), or chicken FKBP23CDS (NCBI accession: XM — 421981).
  • CDS of the ortholog gene of human FKBP19 canine FKBP19CDS (NCBI accession: XM_846112), chimpanzee FKBP19CDS (NCBI accession: XM_001159891), bovine FKBP19CDS (NCBI CBS13NC19N) accession: NM — 024169).
  • Examples of the polynucleotide having a base sequence encoding proline hydroxylase used for producing the transformant of the present invention include a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of prolyl-4-hydroxylase. it can.
  • Prolyl-4-hydroxylase is an enzyme that catalyzes the reaction of hydroxylating the 4-position of a proline residue in the Yaa site of the Gly-Xaa-Yaa repeat sequence to convert it to 4-hydroxyproline.
  • Glycine repeat sequence proteins form a characteristic triple helix structure. By hydroxylating the proline residue at the Yaa site, the stability of the triple helical structure of the glycine repeat sequence protein is improved.
  • the origin of the prolyl-4-hydroxylase is not particularly limited, but animal-derived prolyl-4-hydroxylase, preferably higher-animal prolyl-4-hydroxylase, more preferably human-derived prolyl-4-hydroxylase Can be mentioned.
  • the prolyl-4-hydroxylase include an ⁇ subunit and a proline hydroxylase containing a ⁇ subunit.
  • the ⁇ subunit include an ⁇ 1 subunit, an ⁇ 2 subunit, and an ⁇ 3 subunit.
  • the ⁇ 1 subunit can be mentioned.
  • examples of the prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit include a human prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit (P4H ⁇ 1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 80 and the amino acid represented by SEQ ID NO: 81 And human prolyl-4-hydroxylase ⁇ 2 subunit (P4H ⁇ 2) having the sequence, or human prolyl-4-hydroxylase ⁇ 3 subunit (P4H ⁇ 3) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82, and prolyl-4-hydroxy Examples of the ase ⁇ subunit (P4H ⁇ ) include human P4H ⁇ having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83.
  • proteins in which amino acid deletions, substitutions or additions have been made in these amino acid sequences, and proteins having homology with these amino acid sequences for example, proteins having amino acid sequences derived from orthologous genes derived from heterologous organisms. There may be.
  • Amino acid sequences derived from the ortholog gene of human P4H ⁇ 1 include dog P4H ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 862257), chimpanzee P4H ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 001141043), bovine P4H ⁇ 1 (NCBI accession: NP_001069N1), rat P4H591
  • An amino acid sequence of P4H ⁇ 1 NCBI accession: NP — 035160
  • chicken P4H ⁇ 1 NCBI accession: XP — 421583
  • the amino acid sequences derived from the ortholog gene of human P4H ⁇ 2 include dog P4H ⁇ 2 (NCBIBaccession: XP_860637), chimpanzee P4H ⁇ 2 (NCBI accession: XP_001162222), bovine P4H ⁇ 2 (NCBI accession: NP_001029H2), rat P40H3s4
  • the amino acid sequence of P4H ⁇ 2 NCBI accession: NP_0356161) or chicken P4H ⁇ 2 (NCBI accession: NP_001006155) can be mentioned.
  • the amino acid sequences derived from the ortholog gene of human P4H ⁇ 3 include canine P4H ⁇ 3 (NCBI accession: XP — 8571818), chimpanzee P4H ⁇ 3 (NCBI accession: XP — 001174896), bovine P4H ⁇ 3 (NCBI accession: NP_001001H), 94P
  • the amino acid sequence of P4H ⁇ 3 NCBI accession: NP_7996135) or chicken P4H ⁇ 3 (NCBI accession: XP_417248) can be mentioned.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human P4H ⁇ include canine P4H ⁇ (NCBI : accession: XP — 540488), chimpanzee P4H ⁇ (NCBI accession: XP — 001164396), bovine P4H ⁇ (NCBI accession: NP — 766560), rat P4Hce (37: BsN
  • An amino acid sequence of P4H ⁇ (NCBI accession: NP — 035162) or chicken P4H ⁇ (NCBI accession: XP — 420095) can be exemplified. Further, it may be prolyl-4-hydroxylase in which amino acid deletion, substitution or addition is made in the amino acid sequence derived from these orthologous genes.
  • the polynucleotide having the base sequence encoding the amino acid sequence of prolyl-4-hydroxylase is specifically the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 84 having the base sequence encoding the amino acid sequence of human P4H ⁇ 1.
  • a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 87 having a base sequence to be encoded can be exemplified, and more preferably, a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 84 or a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 87 can be exemplified.
  • a polynucleotide in which a deletion, substitution or addition of a part of the base sequence of these polynucleotides is introduced, or a polynucleotide having a partial base sequence of these polynucleotides can be mentioned, Furthermore, it may be a polynucleotide having a base sequence having homology with the base sequence of these polynucleotides, for example, a polynucleotide having a base sequence derived from a coding sequence (CDS) of an orthologous gene derived from a heterologous organism.
  • CDS coding sequence
  • Base sequences derived from the orthologous gene of human P4H ⁇ 2 include dog P4HA2CDS (NCBIBaccession: XM — 855544), chimpanzee P4HA2CDS (NCBI : accession: XM — 001162222), bovine P4HA2CDS (NCBI ces3N4C4034033 P4HA2CDS (NCBI accession: NM — 011031) or chicken P4HA2CDS (NCBI accession: NM — 001006155) can be used.
  • CDS of the ortholog gene of human P4H ⁇ canine P4HBCDS (NCBI accession: XM_540488), chimpanzee P4HBCDS (NCBIBaccession: XM_001164396), bovine P4HBCDS (NCBI accession: NM_174135), rat P4HBCDS accession: NM — 011032) or chicken P4HBCDS (NCBI accession: XM — 420095).
  • a polynucleotide obtained by introducing a deletion, substitution or addition into a part of the base sequence of a polynucleotide having a base sequence derived from these CDS, or a polynucleotide having a base sequence derived from these CDS A polynucleotide having a partial base sequence of
  • the protein having a glycine repeat sequence in the present invention is not particularly limited as long as it is a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B).
  • it is selected from Type I collagen to TypeXXIX collagen.
  • At least one type of collagen can be mentioned, and preferably, fiber-forming collagen (Type I collagen, Type II collagen, Type III collagen, Type V collagen, Type XI collagen, Type XXIV collagen, Type XXVII collagen). More preferable examples include Type I collagen, Type II collagen, and Type III collagen.
  • the glycine repeat sequence protein etc. which consist of a partial area
  • the origin of collagen is not particularly limited, and examples thereof include animal-derived collagen, preferably higher animal-derived collagen, and more preferably human-derived collagen.
  • Xaa and Yaa each represent an arbitrary amino acid.
  • Examples of the number of repeating sequences of Gly-Xaa-Yaa in the characteristic (A) include 25 times or more and 362 times or less.
  • Examples of the content of imino acid contained in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in the characteristic (B) include 19.8% or more and 38.7% or less.
  • Type I collagen for example, a human Type I ⁇ 1 collagen precursor (HsTypeI ⁇ 1) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 and a human Type I ⁇ 2 collagen precursor (HsTypeI ⁇ 2) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 89 are used.
  • Specific examples of the Type II collagen include human Type II ⁇ 1 collagen precursor (HsType II ⁇ 1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 90
  • specific examples of the Type III collagen include:
  • human Type III ⁇ 1 collagen precursor (HsTypeIII ⁇ 1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 91 can be mentioned.
  • proteins in which amino acid deletions, substitutions or additions have been made in these amino acid sequences can be mentioned, and proteins having homology with these amino acid sequences, for example, amino acid sequences derived from orthologs derived from heterologous organisms It may be a protein having The amino acid sequences derived from the orthologous gene of human Type I ⁇ 1 include canine Type I ⁇ 1 (NCBI accession: NP_001003090), chimpanzee Type I ⁇ 1 (NCBI accession: XP_001169320), bovine TypeI ⁇ 1 (NCBI accession: NBI2 An amino acid sequence of mouse Type I ⁇ 1 (NCBI accession: NP — 031768) can be exemplified.
  • the amino acid sequence derived from the orthologous gene of human Type I ⁇ 2 includes canine Type I ⁇ 2 (NCBI accession: NP — 00103187), chimpanzee Type I ⁇ 2 (NCBI accession: XP — 519207), bovine Type I ⁇ 2 (NCBI accession: NBI45 An amino acid sequence of mouse Type I ⁇ 2 (NCBI accession: NP — 031769) can be exemplified.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human Type II ⁇ 1 include dog Type II ⁇ 1 (NCBI accession: NP — 001006952), chimpanzee Type II ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 501126), rat Type II ⁇ 1 (NCBI accession: NBI401) (NCBI accession: N40 An amino acid sequence of chicken Type II ⁇ 1 (NCBI accession: NP — 997757) can be exemplified.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human Type III ⁇ 1 include canine Type III ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 851009), chimpanzee Type III ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 001163665), bovine Type III ⁇ 1 (NCBI accession: NCBI accession: NCBI accession: NBI
  • the amino acid sequence of TypeIII ⁇ 1 NCBI accession: NP — 034060) or chicken TypeIII ⁇ 1 (NCBI accession: XP — 421847) can be mentioned.
  • it may be a protein in which amino acid deletion, substitution or addition is made in the amino acid sequence derived from these orthologous genes.
  • the glycine repeat sequence protein When the glycine repeat sequence protein is expressed in yeast and the proline hydroxylase produced in the yeast is present, the glycine repeat in which the proline residue in the glycine repeat sequence protein is hydroxylated by the enzyme A sequence protein is produced.
  • the hydroxylation rate of the proline residue in the glycine repeat sequence protein can be measured by a known amino acid composition analysis method.
  • the fibril formation ability of a glycine repeat sequence protein can be measured by the following method, for example. Specifically, for example, the purified glycine repeat sequence protein is readjusted to a salt concentration of 1 ⁇ D-PBS ( ⁇ ), pH 7.3 to 7.4, and then kept at 37 ° C. The molecules reorient and the solution becomes cloudy.
  • the cloudiness phenomenon can be regarded as the fibril formation ability of the glycine repeat sequence protein. Therefore, utilizing this property, a glycine repeat sequence protein solution having a concentration of 0.05% is kept at 37 ° C. at a salt concentration of 1 ⁇ D-PBS ( ⁇ ), pH 7.3 to 7.4. By measuring the absorbance over time, the ability to form fibers can be measured.
  • the glycine repeat sequence protein consisting of a partial region of collagen specifically includes, for example, the N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, the N-terminal helix having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 92
  • a fusion polypeptide (HsTypeI ⁇ 1N60C15) precursor consisting of a region 60 residues, a C-terminal helix region 15 residues, and a C-terminal non-helix region, the N-terminus of human collagen Type I ⁇ 2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 93
  • a fusion polypeptide (HsTypeI ⁇ 2N60-C15) precursor consisting of a non-helix region, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region, represented by SEQ ID NO: 94 Having an amino acid sequence, A fusion polypeptide comprising an N-terminal non-helix
  • polynucleotide having a base sequence encoding a glycine repeat sequence protein used for the production of the transformant of the present invention specifically, for example, the amino acid sequence of the human Type I ⁇ 1 collagen precursor represented by SEQ ID NO: 98 is encoded.
  • a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the precursor, a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the human Type II ⁇ 1 collagen precursor represented by SEQ ID NO: 102, or the human represented by SEQ ID NO: 104 Mention may be made of a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of Type III ⁇ 1 collagen precursor.
  • a polynucleotide in which a deletion, substitution or addition of a part of the base sequence of these polynucleotides is introduced, or a polynucleotide having a partial base sequence of these polynucleotides can be mentioned, Furthermore, it may be a polynucleotide having a base sequence having homology with the base sequence of these polynucleotides, for example, a polynucleotide having a base sequence derived from a coding sequence (CDS) of an orthologous gene derived from a heterologous organism.
  • CDS coding sequence
  • CDS of the orthologous gene of human Type I ⁇ canine Type I ⁇ 1CDS (NCBI accession: NM_001003090), chimpanzee TypeI ⁇ 1sCDS (NCBIceCsIS140S), bovine TypeI ⁇ 1CDS (NCBI accession: NM_007742) and the like.
  • CDS of the orthologous gene of human Type I ⁇ 2CDS NCBI accession: NM_001003187
  • chimpanzee TypeI ⁇ 2CDS NCBI ⁇ ss05: NCM NeScession
  • Type II ⁇ 1CDS NCBI accession: NM_001006951
  • chimpanzee TypeII ⁇ 1CDS NCBI AcSion: XM_ceI3S29
  • rat TypeII ⁇ lCDS NCBI accession: NM_204426
  • the CDS of ortholog of human TypeIIIarufa1, dog TypeIII ⁇ 1CDS (NCBI accession: XM_845916), chimpanzees TypeIII ⁇ 1CDS (NCBI accession: XM_001163665), cow TypeIII ⁇ 1CDS (NCBI accession: NM_001076831), rat TypeIII ⁇ 1CDS (NCBI accession: NM_032085), mouse TypeIII ⁇ 1CDS (NCBI accession: NP_009930), or Chicken Type III ⁇ 1 CDS (NCBI accession: XM — 421847).
  • a polynucleotide in which a part of the base sequence of a polynucleotide having a base sequence derived from these CDS is deleted, substituted or added, or a polynucleotide having a base sequence derived from these CDS A polynucleotide having a partial base sequence of
  • a polynucleotide having a base sequence encoding a glycine repeat sequence protein consisting of a partial region of collagen specifically, for example, a base sequence encoding the amino acid sequence of the HsTypeI ⁇ 1N60C15 precursor represented by SEQ ID NO: 106
  • transformant of the present invention is obtained by additionally introducing a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of “lysine hydroxylase”, that is, the following (1) to (4 It may be a transformant that produces all of the protein (1).
  • FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) proline hydroxylase; (3) a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B); and (4) lysine hydroxylase:
  • ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-Xaa-Yaa repeat sequence; and ⁇ characteristic (B)>
  • An imino acid is included in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in which the polypeptide chain in the glycine repeating sequence protein is continuous:
  • Xaa and Yaa each represent an arbitrary amino acid.
  • Such a transformant has an ability to efficiently produce a glycine repeat sequence protein in which a lysine residue in the amino acid sequence is hydroxylated.
  • Such a transformant can produce a glycine repeat sequence protein having high fiber shape performance and high stability. Specifically, for example, in the transformant producing all the proteins (1) to (4) above, 20% or more of all lysine residues located in Yaa of the Gly-Xaa-Yaa repeat sequence are hydroxylated. It is possible to produce a glycine repeat sequence protein in which 40% or more of all lysine residues are hydroxylated.
  • a glycine repeat sequence protein in which lysine residues are hydroxylated is a glycine repeat sequence protein having a high fiber shape performance and a more stable triple helix structure. For this reason, pharmaceuticals, industrial products, cosmetics, foods It can be said that the protein is a glycine repetitive sequence protein that becomes a high-performance versatile material that is more commercially valuable.
  • lysine hydroxylase examples include lysyl hydroxylase 1, lysyl hydroxylase 3 and the like. Further, the origin of “lysine hydroxylase” is not particularly limited, but for example, it is preferably derived from a higher animal, and more preferably derived from a human. Lysyl hydroxylase 1 and lysyl hydroxylase 3 are enzymes that form homodimers, and the ⁇ position of lysine located in Yaa of the Gly-Xaa-Yaa repeat sequence present in the helical structure portion of the glycine repeat sequence protein is water. Oxidize.
  • lysine hydroxylase examples include human lysyl hydroxylase (LH1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116, or human lysyl hydroxylase 3 (LH3) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 118. ).
  • LH1 human lysyl hydroxylase
  • LH3 human lysyl hydroxylase 3
  • proteins in which amino acid deletions, substitutions or additions have been made in these amino acid sequences can be mentioned, and proteins having homology with these amino acid sequences, for example, amino acids derived from orthologous genes derived from heterologous organisms It may be a protein having a sequence.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human LH1 include dog LH1 (NCBI accession: XP — 865470), chimpanzee LH1 (NCBI accession: XP — 001142937), bovine LH1 (NCBI accession: NP — 766573), rat LH1 (NCBI accession: 79: NCBI accession: NCBI accession: 79).
  • An amino acid sequence of LH1 (NCBI accession: NP — 035252) or chicken LH1 (NCBI accession: NP — 001005618) can be exemplified.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human LH3 include canine LH3 (NCBI accession: XP — 858413), chimpanzee LH3 (NCBI accession: XP — 001153979), bovine LH3 (NCBI accession: XP — 877254), rat LH3 (NCBI: 35: NCBI accession)
  • An amino acid sequence such as mouse LH3 (NCBI accession: NP — 036092) can be mentioned.
  • it may be a lysine hydroxylase in which amino acid deletion, substitution or addition is made in the amino acid sequence derived from these orthologous genes.
  • polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of “lysine hydroxylase” that can be used for the production of the transformant of the present invention include, for example, a polynucleotide having a base sequence encoding lysyl hydroxylase 1 (LH1).
  • LH1 lysyl hydroxylase 1
  • LH3 polynucleotide having a base sequence encoding lysyl hydroxylase 3
  • polynucleotide having the base sequence encoding lysyl hydroxylase 1 include, for example, a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of human LH1 represented by SEQ ID NO: 117, or SEQ ID NO: 119. And a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of human LH3.
  • a polynucleotide obtained by introducing a deletion, substitution or addition into a part of the base sequence of these polynucleotides, or a polynucleotide having a partial base sequence of these polynucleotides may be a polynucleotide having a base sequence having homology with the base sequence of these polynucleotides, for example, a polynucleotide having a base sequence derived from a coding sequence (CDS) of an orthologous gene derived from a heterologous organism.
  • CDS coding sequence
  • CDS of the orthologous gene of human LH1 canine PLOD1CDS (NCBI accession: XM — 860377), chimpanzee PLOD1CDS (NCBI accession: XM — 001142937), bovine PLOD1CDS (NCBI Accession: NM — 174148), rat PLOD1CDS05 accession: NM — 0112122) or chicken PLOD1CDS (NCBI accession: NM — 001005618).
  • CDS of the orthologous gene of human LH3 canine PLOD3CDS (NCBI : accession: XM — 833320), chimpanzee PLOD3CDS (NCBI accession: XM — 001153979), bovine PLOD3CDS (NCBI accession: XM_882216), rat PLOD3CDSs: 8 NCBI accession: NM_011962).
  • the polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of lysine hydroxylase is linked downstream of, for example, a yeast-derived promoter, specifically, for example, the promoter of alcohol oxidase 1 gene. Is preferred.
  • transformant of the present invention is obtained by additionally introducing a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of “Hsp47”, that is, the following (1) to (3), and Or a transformant producing all the proteins of (5).
  • FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) proline hydroxylase; (3) a glycine repeat sequence protein having the following properties (A) and (B); and (5) Hsp47:
  • ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-Xaa-Yaa repeat sequence, and ⁇ Characteristic (B)>
  • An imino acid is included in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in which the polypeptide chain in the glycine repeating sequence protein is continuous:
  • Xaa and Yaa each represent an arbitrary amino acid.
  • Such a transformant has an ability to efficiently produce a neutral sugar-modified protein having a lower neutral sugar content.
  • Such yeast reduces the change in hydrophilic properties of glycine repeat sequence proteins derived from neutral sugars, and produces glycine repeat sequence proteins that are more lipophilic and close to the properties of glycine repeat sequence proteins. can do.
  • Such a glycine repeat sequence protein is a glycine repeat sequence protein in which the triple helix structure is more stabilized. Therefore, it is a high-performance protein that is commercially more valuable as a pharmaceutical, industrial product, cosmetic, food, etc. It can be referred to as a glycine repeat sequence protein that can be used as a material for use.
  • Hsp47 is a stress response protein localized in the lumen of the endoplasmic reticulum, generally called heat shock protein 47.
  • the origin of “Hsp47” in the present invention is not particularly limited. For example, it is preferably derived from a higher animal, and more preferably derived from a human. Specific examples include human Hsp47 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 120. Moreover, proteins in which amino acid sequences have been deleted, substituted or added to these amino acid sequences can be mentioned, and proteins having homology with these amino acid sequences, for example, amino acid sequences derived from orthologs derived from heterologous organisms. It may be a protein.
  • the amino acid sequences derived from the orthologous gene of human Hsp47 include dog Hsp47 (NCBI accession: XP — 542305), chimpanzee Hsp47 (NCBI accession: XP — 001177979), bovine Hsp47 (NCBI accession: NP — 001039528), rat Hsp47 (NCBI 69: NCBI accession).
  • An amino acid sequence such as Hsp47 (NCBI accession: NP — 033955) or chicken Hsp47 (NCBI accession: NP — 990622) can be exemplified.
  • it may be a protein in which the amino acid sequence is deleted, substituted or added to the amino acid sequence derived from these orthologous genes.
  • polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of “Hsp47” that can be used for producing the transformant of the present invention include, for example, a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 121, etc. Can be mentioned. Further, it may be a polynucleotide in which deletion, substitution or addition of a part of the base sequence of this polynucleotide is artificially introduced, and deletion, substitution or addition is added to the amino acid sequence of Hsp47. It may be a polynucleotide having a base sequence encoding the made amino acid sequence.
  • polynucleotide having homology with these polynucleotides for example, a polynucleotide having a base sequence derived from a coding sequence (CDS) of an ortholog gene derived from a heterologous organism.
  • CDS coding sequence
  • Hsp47CDS canine Hsp47CDS (NCBI accession: XM_542305), chimpanzee Hsp47CDS (NCBI accession: XM_00117479), bovine Hsp47CDS (NCBI accession: NM_001046063), rat Hsp47CDSs71 : NM_009825), or chicken Hsp47CDS (NCBI accession: NM_205291).
  • a polynucleotide in which a part of the base sequence of a polynucleotide having a base sequence derived from the CDS of these ortholog genes is introduced, a substitution, or an addition, or the CDS of these ortholog genes A polynucleotide having a partial base sequence of the base sequence may be used.
  • the polynucleotide having the base sequence encoding the amino acid sequence of Hsp47 is preferably linked downstream of, for example, a yeast-derived promoter, specifically, for example, the promoter of alcohol oxidase 1 gene.
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the following polynucleotides (1), (2) and (3) into a host cell.
  • the polynucleotide can be prepared by cloning cDNA, assembly PCR using chemically synthesized oligonucleotides, or genetic engineering techniques.
  • commercially available clones such as cDNA can be obtained and used.
  • Xaa and Yaa each represent an arbitrary amino acid.
  • the polynucleotide is linked to, for example, a promoter, terminator, or polynucleotide encoding a signal sequence having a function of efficiently expressing the polynucleotide in a cell to form an expression cassette, and the constructed expression cassette is a host cell.
  • a transformant that efficiently expresses the polynucleotide can be prepared.
  • the expression cassette is constructed by linking the polynucleotide downstream of the promoter and upstream of the terminator and replacing the polynucleotide encoding the amino terminal signal sequence, if necessary, using ordinary genetic engineering techniques. be able to.
  • the host / vector system used for constructing the expression cassette is not particularly limited.
  • the host is a bacterium (for example, Escherichia genus, Bacillus genus, Pseudomonas genus), the vector is a bacteriophage, a plasmid, or a cosmid.
  • the host / vector system or host to be used include yeast (for example, Saccharomyces genus), and examples of the vector include episomal plasmids and host / vector systems using ARS-CEN type plasmids. Examples include Eschericha, and vectors include plasmids.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in the host cell used for the production of the transformant of the present invention. It can be used suitably.
  • Specific examples of the promoter include galactose metabolic enzyme genes (GAL1, GAL10), inhibitory acid phosphatase gene (PHO5), glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene (TD), and phosphoglycerate kinase gene (PGK).
  • Alcohol oxidase gene (ADH1, AOX1, AOX2, MOX, AOD1), formate dehydrogenase gene (FDH1, FMD1), dihydroxyacetone synthase gene (DAS), peroxisome membrane protein synthesis gene (PER3), formaldehyde dehydrogenase gene (FLD1), etc. Mention may be made of gene promoters. Further, as the terminator, any terminator that functions in the host cell used for producing the transformant of the present invention can be used effectively. For example, alcohol oxidase gene (AOX1), formaldehyde dehydrogenase (FLD1) The terminator can be mentioned. Examples of the signal sequence include a yeast ⁇ -factor prepro sequence, a yeast invertase signal sequence, and a yeast acid phosphatase signal sequence.
  • the transformant of the present invention can be prepared by transforming a host cell with a plasmid having the polynucleotide.
  • a plasmid having the polynucleotide as an expression cassette, a transformant that efficiently expresses the polynucleotide can be produced.
  • the host / vector system used for the production of the transformant of the present invention include, for example, a bacterium (eg, Escherichia, Bacillus, or Pseudomonas) as a host, and a bacteriophage, plasmid, or cosmid host as a vector.
  • yeast for example, Saccharomyces genus
  • vector as episomal plasmid
  • host using ARS-CEN type plasmid for example, Komagataella genus, Saccharomyces genus, Hansenula genus, Pichia genus, Candida genus, Ogataea genus
  • yeast for example, Komagataella genus, Saccharomyces genus, Hansenula genus, Pichia genus, Candida genus, Ogataea genus
  • a host / vector system using a chromosomally integrated plasmid as a host, as a filamentous fungus (Aspergillus genus, Trichoderma genus), as a vector, as a chromosomally integrated plasmid
  • a host / vector system using, preferably, a host and Te can be mentioned eukaryotic microorganisms (yeast, filamentous fungi).
  • yeast can be mentioned more preferably.
  • Saccharomyces cerevisiae Komagataella pastoris, Hansenula polymorpha (Hansenula) polymorpha), Pichia methanolica, Candida Boidini, Ogataea minuta.
  • the vectors include a chromosomally integrated plasmid (YIp type), a plasmid having a yeast endogenous plasmid 2 ⁇ m DNA replication initiation region (YEp type), and a chromosome-derived plasmid.
  • Plasmids having a self-replicating region can be mentioned, and plasmids in which the polynucleotide is incorporated by using a plasmid that is a shuttle vector in which a replication origin capable of replicating in E. coli is incorporated into these plasmids. Can be easily constructed.
  • the vector examples of the plasmid include a chromosomal integration plasmid, and a plasmid into which the polynucleotide is integrated can be easily constructed by using a plasmid that has become a shuttle vector by integrating an origin of replication that can be replicated in E. coli. .
  • Komagataella pastoris can be preferably used as a host.
  • the vector include commercially available plasmids such as pAO815 and pPIC9K, and homologous recombination regions and markers that are constituent elements of the vector.
  • a plasmid prepared by incorporating a promoter, terminator, etc. can be preferably used.
  • the chromosomal integration plasmid has a homologous recombination region having a base sequence homologous to that of the host chromosome on the plasmid. Since this region is integrated into the host chromosome, Is held stably. Although it does not specifically limit as a homologous recombination area
  • examples of the marker include a gene that causes a change in trait when introduced into a host cell, and examples thereof include an amino acid synthesis gene, a nucleic acid synthesis gene, and an antibiotic resistance gene.
  • examples of the amino acid synthesis gene include LEU2, HIS4, ARG4 and TRP1
  • examples of the nucleic acid synthesis gene include URA3 and ADE2.
  • antibiotic resistance genes include genes that confer resistance to antibiotics such as zeocin, blasticidin S, geneticin, G418, chloramphenicol, and bleomycin.
  • amino acid synthesis gene and the nucleic acid synthesis gene are selected from the transformants by complementing the host deletion mutation in combination with a host lacking the amino acid synthesis gene, nucleic acid synthesis gene, etc. Can be used as a marker.
  • a marker can be used as a marker for selecting a transformant in which a chromosome integration type plasmid is integrated into a host chromosome.
  • the method for introducing the plasmid into which the polynucleotide is incorporated into the host cell is not particularly limited, but when a bacterium (eg, Escherichia, Bacillus, or Pseudomonas) is used as the host, for example, chloride Examples thereof include a calcium method, a spheroplast method, a protoplast method, and an electroporation method.
  • yeast for example, Komagataella genus, Saccharomyces genus, Hansenula genus, Candida genus, Ogataea genus
  • filamentous fungi genus Aspergillus, Trichoderma
  • protoplast-PEG method protoplast-electroporation method and the like can be mentioned.
  • the transformant of the present invention is characterized by producing all the proteins (1), (2) and (3) below in the cells.
  • the polypeptide chain in the glycine repeat sequence protein has a continuous Gly-Xaa-Yaa repeat sequence; and ⁇ characteristic (B)>
  • An imino acid (specifically, for example, proline or hydroxyproline) is included in the repeating sequence of Gly-Xaa-Yaa in which the polypeptide chain in the glycine repeating sequence protein is continuous:
  • Xaa and Yaa each represent an arbitrary amino acid.
  • All the proteins (1) to (3) above can be produced by culturing the transformant of the present invention according to a normal microbiological technique.
  • a medium used for culturing the transformant of the present invention a medium known in the art can be used, and the culturing can be carried out by a method according to a usual microbiological technique.
  • the medium is not particularly limited, and any medium of a synthetic medium and a natural medium can be used.
  • a carbon source for example, various sugars, glycerol, methanol
  • a nitrogen source for example, , Urea, aqueous ammonia, ammonium salt or nitrate
  • inorganic salts eg, inorganic salts such as Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Mo, B, Zn, I or Cu
  • micronutrients for example, various vitamins, various amino acids, or nucleotides
  • the natural medium include a medium containing yeast extract, peptone, casein and the like in addition to the components of the synthetic medium as a medium component.
  • an inducible promoter when used in the expression cassette used for the preparation of the transformant of the present invention, a nutrient source, a substrate, etc. that activates the inducible promoter (for example, galactose, lactose, sucrose, The promoter can be activated by adding methanol, IPTG, etc.) to the medium.
  • a nutrient source, a substrate, etc. that activates the inducible promoter for example, galactose, lactose, sucrose.
  • the promoter can be activated by adding methanol, IPTG, etc.
  • MM medium 1.34% Yeast Nitrogen Base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 0.5% methanol
  • BMM medium 100 mM potassium phosphate buffer pH 6.0, 1.34% Yeast Nitrogen Base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 0.5% methanol
  • BasalSalt medium Pichia Protocol, ISBN: 0-89603-421-6 Humana Press
  • FM22 medium Pichia Protocol, ISBN: 0-89603-421-6 Humana Press
  • Etc As the pH of the medium, a medium adjusted to neutral, weakly basic, or weakly acidic, specifically, pH 3 to 8 can be used, and more preferably, a medium adjusted to pH 4 to 7 can be used.
  • the culture format is preferably liquid culture, and the culture temperature is preferably 15 ° C to 40 ° C.
  • the culture time is preferably 1 hour to 1000 hours, and the culture is preferably performed under shaking or stirring conditions, and can be performed under aeration of air and oxygen.
  • the culture method is preferably carried out by a batch culture method, a semi-batch culture method or a continuous culture method, and a high concentration medium component can be fed as needed during the culture period. . If necessary, pre-culture can be performed prior to the culture (main culture).
  • the medium for pre-culture is not particularly limited.
  • YNB medium 0.67% Yeast Nitrogen Base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose
  • BMGY medium 1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer pH 6.0, 1.34% Yeast Nitrogen Base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 1% methanol
  • the culture conditions for the preculture are not particularly limited, but the culture time is preferably 10 hours to 100 hours, and the culture temperature is preferably 15 ° C to 40 ° C.
  • Pre-culture is preferably performed under shaking or stirring conditions, and can be performed under aeration of air and oxygen.
  • a batch culture method is preferable as the culture operation method.
  • the expression of all the proteins (1), (2) and (3) can be detected by ordinary biochemical techniques and protein engineering techniques, and examples thereof include an immunoassay method. Specifically, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunobead capture assay, Western blotting and the like can be mentioned, and preferably Western blotting can be mentioned.
  • the present invention includes a glycine repeat sequence protein (the protein of the present invention), which can be obtained by producing the transformant of the present invention.
  • a glycine repeat sequence protein having a low neutral sugar content can be obtained.
  • the protein of the present invention is commercially more valuable as pharmaceuticals, industrial products, cosmetics, foods, etc. (specifically, for example, it reduces the change in physical properties related to hydrophilicity of glycine repeat sequence proteins derived from neutral sugars) It is a high-performance versatile material that is more lipophilic and is close to the nature of glycine repeat sequence protein.
  • the neutral sugar contained in the glycine repeat sequence protein can be quantified by a normal biochemical technique. Specifically, neutral sugars can be quantified by conducting a monosaccharide composition analysis by the phenol-sulfuric acid method, liquid chromatography, or the like. Moreover, the fibril formation ability of a glycine repeat sequence protein can be measured by the following method, for example. Specifically, for example, the purified glycine repeat sequence protein is readjusted to a salt concentration of 1 ⁇ D-PBS ( ⁇ ), pH 7.3 or 7.4, and then kept at 37 ° C. The molecules reorient and the solution becomes cloudy. The cloudiness phenomenon can be regarded as the fibril formation ability of the glycine repeat sequence protein.
  • a glycine repeat sequence protein solution having a concentration of 0.05% is kept at 37 ° C. at a salt concentration of 1 ⁇ D-PBS ( ⁇ ), pH 7.3 or 7.4.
  • the present invention provides a first step of introducing any of the following polynucleotides (1), (2) and (3) into a microbial cell: A second step of producing a glycine repeat sequence protein by culturing the transformant obtained in the first step, and a third step of recovering the glycine repeat sequence protein produced in the second step; A method for obtaining a glycine repeat sequence protein (the method for obtaining the present invention), comprising: (1) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of FK506 binding protein having binding ability to FK506 and having a molecular weight of 15,000 or more and 60,000 or less; (2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of proline hydroxylase; and (3) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a glycine repeat sequence protein having the following characteristics (A) and (B): Polynucleotide: ⁇ Characteristic (A)> The polypeptide
  • the first step can be carried out by the method described for the transformant of the present invention.
  • the second step can be carried out by the same method as the method for producing the protein encoded by the polynucleotide (1), (2) and (3) using the transformant of the present invention.
  • the third step can be performed according to a normal biochemical technique. Specifically, it can be carried out by purifying the glycine repeat sequence protein produced in the second step from the bacterial cells and the culture supernatant.
  • the crushing / solubilizing step for example, a method of physically crushing with ultrasonic waves, glass beads, etc., a method of solubilization using an enzyme, acid, alkali, surfactant, etc., an organic solvent And a solvent extraction method using a buffer or the like.
  • the fractionation / purification step includes, for example, precipitation method such as salting out, solvent precipitation, isoelectric precipitation, ion exchange, gel filtration, hydrophobic interaction, column chromatography such as affinity, ultrafiltration, Examples include lyophilization, crystallization, and dialysis. More specifically, for example, a method having the following steps (a) to (e) can be mentioned.
  • A a step of crushing bacterial cells using glass beads
  • B a step of degrading protein by adding a proteolytic enzyme to the obtained crushed liquid
  • C recovering the supernatant by centrifuging the decomposed crushing liquid
  • D A step of salting out the collected supernatant under various pH conditions to purify it
  • e a step of dissolving the precipitate recovered by salting out and desalting and removing particles.
  • the glycine repeat sequence protein obtained by the acquisition method of the present invention is a high-performance (specifically, for example, glycine repeat sequence protein derived from a neutral sugar, which is commercially more valuable as a pharmaceutical, industrial product, cosmetic, food, etc. It is a versatile material that lowers the change in physical properties related to hydrophilicity and has higher lipophilicity and is close to the properties inherently possessed by glycine repeat sequence proteins. Such a glycine repeat sequence protein would be preferred, for example, due to the potential for immunologically low antigenicity induction.
  • Oligonucleotide 1 GATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA (SEQ ID NO: 1)
  • Oligonucleotide 2 TAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACG (SEQ ID NO: 2) The composition of the reaction solution is shown below.
  • the cycle was repeated 35 times, and then the reaction solution was further maintained at 68 ° C. for 5 minutes.
  • About 2.6 kb of DNA obtained as a result of the PCR was separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the about 2.6 kb DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of the pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and the resulting ligation solution was used for Escherichia coli (One Shot TOP10F 'Chemically Competent E. coli, Invitorgen). Were transformed.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • the plasmid hereinafter sometimes referred to as pHIS4-TOPO
  • pHIS4-TOPO pHIS4-TOPO
  • Oligonucleotide 3 ACGAAAATATGGTACCTGCCCTCAC (SEQ ID NO: 3)
  • Oligonucleotide 4 GTTCTATCTACCCGAGGAAACCGATACATA (SEQ ID NO: 4)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • the cycle was repeated 35 times, and then the reaction solution was further maintained at 68 ° C. for 5 minutes.
  • the DNA of about 2.2 kb obtained as a result of the PCR was separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the DNA of about 2.2 kb was ligated to the “PCR Product insertion site” of pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and Escherichia coli (One Shot TOP10F ′ Chemically Competent E. coli, Invitrogen) was used with the obtained ligation solution.
  • pCR-BluntII-TOPO plasmid Invitrogen
  • Escherichia coli One Shot TOP10F ′ Chemically Competent E. coli, Invitrogen
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • Oligonucleotide 5 AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTT (SEQ ID NO: 5)
  • Oligonucleotide 6 ATCCACCACCTAGAACTAGGATATCAAAC (SEQ ID NO: 6)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • a Zero-Blunt TOPO PCR cloning (Invitrogen) kit was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • the plasmid in which the AOX1 promoter is inserted (hereinafter sometimes referred to as pAOX1Pro + 15aa-TOPO) is purified from the cultured cells, thereby pAOX1Pro + 15aa-TOPO.
  • pAOX1Pro + 15aa-TOPO the plasmid in which the AOX1 promoter is inserted
  • peroxisome matrix protein promoter Construction of pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I (+)
  • the following oligonucleotides 7 and 8 were synthesized.
  • the peroxisome matrix protein (PER3) promoter was amplified by PCR using the following oligonucleotides 7 and 8 as primers and the genomic DNA of ATCC76273 (see Example 1-1 (1-1)) as a template.
  • the genomic DNA was prepared using Genomic-tip 100 / G (QIAGEN) and Genomic DNA Buffer Set (QIAGEN).
  • Oligonucleotide 7 CTAAGGGTCTCACTGGTGTTTCAGC (SEQ ID NO: 7)
  • Oligonucleotide 8 AGTTCCTTGCAACTGTAGTGGTCG (SEQ ID NO: 8) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Genomic DNA solution (15 ng / ⁇ l) 1 ⁇ l
  • PCR after heating the reaction solution at 94 ° C. for 2 minutes, a cycle consisting of a denaturation reaction at 94 ° C.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • pCR-BII-PER3 Pro (+) may be purified from the cultured cells by purifying a plasmid into which the PER3 promoter has been inserted.
  • -BII-PER3 Pro (+) was obtained.
  • the following oligonucleotides 9 and 10 were synthesized. By performing PCR using the following oligonucleotides 9 and 10 as primers and pCR-BII-PER3 Pro (+) plasmid as a template, DNA in which a restriction enzyme recognition sequence was added to both ends of the PER3 promoter was amplified.
  • Oligonucleotide 9 AACCGCGGCTCGTCACTATCGTCGTTG (SEQ ID NO: 9)
  • Oligonucleotide 10 CGAACGTTACCTGAAGATAGGTAAAAAAAAATTGC (SEQ ID NO: 10) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • the plasmid in which the PER3 promoter is inserted (hereinafter sometimes referred to as pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I (+)) is purified from the cultured cells.
  • pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I (+) was obtained.
  • Oligonucleotide 11 AACCGCGGCTAGTAGAACTTTGACATCTGCTA (SEQ ID NO: 11)
  • Oligonucleotide 12 CGAACGTTTTGATTTGTTTGTGGGGATTTAG (SEQ ID NO: 12) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Genomic DNA solution (15 ng / ⁇ l) 1 ⁇ l
  • 33 ⁇ l of sterile distilled water PCR is a cycle consisting of heating the reaction solution at 94 ° C. for 2 minutes, followed by a denaturation reaction at 94 ° C.
  • the about 1.1 kb DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of the pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • E. coli Competent high DH5 ⁇ , Toyobo
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), the plasmid in which the AOX2 promoter is inserted (hereinafter sometimes referred to as pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I (-)) is purified from the cultured cells. As a result, pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I (-) was obtained.
  • Oligonucleotide 13 GCAGTGTTGGCTAACGTCTATTCG (SEQ ID NO: 13)
  • Oligonucleotide 14 ACTTCATGGGCTCTTGGAGGAAG (SEQ ID NO: 14) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Genomic DNA solution (15 ng / ⁇ l) 1 ⁇ l
  • PCR after heating the reaction solution at 94 ° C. for 2 minutes, a cycle consisting of a denaturation reaction at 94 ° C.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • pCR-BII-FLD1 Pro (+) may be purified from the cultured cells by purifying a plasmid in which the FLD1 promoter has been inserted.
  • -BII-FLD1 Pro (+) was obtained.
  • the following oligonucleotides 15 and 16 were synthesized. By performing PCR using the following oligonucleotides 15 and 16 as primers and pCR-BII-FLD1 Pro (+) plasmid as a template, DNA with restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the FLD1 promoter was amplified.
  • Oligonucleotide 15 AACCGCGGCCTGAATACCGTAACATAGTGAC (SEQ ID NO: 15)
  • Oligonucleotide 16 CGAACGTTTCAAGAATTGTATGAACAAGCAAAG (SEQ ID NO: 16)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • the plasmid in which the FLD1 promoter is inserted (hereinafter sometimes referred to as pCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I (-)) is purified from the cultured cells. As a result, pCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I (-) was obtained.
  • Oligonucleotide 17 CCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTC (SEQ ID NO: 17)
  • Oligonucleotide 18 GCACAAACGAACGTCTCACTTAAT (SEQ ID NO: 18)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • pAOX1 term-TOPO is obtained by purifying the plasmid (hereinafter also referred to as pAOX1 term-TOPO) in which AOX1 terminator is inserted from cultured cells. It was.
  • Oligonucleotide 19 TCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAAT (SEQ ID NO: 19)
  • Oligonucleotide 20 GATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAAATC (SEQ ID NO: 20) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), the plasmid (hereinafter sometimes referred to as pAOX1-3′-TOPO) in which the AOX1 3 ′ downstream noncoding region has been inserted is purified from the cultured cells. As a result, pAOX1-3′-TOPO was obtained.
  • Oligonucleotide 21 TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA (SEQ ID NO: 21)
  • Oligonucleotide 22 GTACGAGCTAAAAGTACAGTGGGAACAAA (SEQ ID NO: 22) The composition of the reaction solution is shown below.
  • Genomic DNA solution (15 ng / ⁇ l) 1 ⁇ l
  • 33 ⁇ l of sterile distilled water PCR is a cycle consisting of heating the reaction solution at 94 ° C for 3 minutes, followed by a denaturation reaction at 94 ° C for 15 seconds, an annealing reaction at 60 ° C for 30 seconds, and an extension reaction at 68 ° C for 1 minute.
  • About 0.6 kb of DNA obtained as a result of the PCR was separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 0.6 kb DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and E. coli (One Shot TOP10F ′ Chemically Cometent E.
  • the plasmid (hereinafter, also referred to as p ⁇ factor-TOPO) into which the DNA encoding the ⁇ factor has been inserted is purified from the cultured cells, thereby p ⁇ factor-TOPO is purified.
  • Oligonucleotide 23 CAGCCACAAAGAGTCTACATGTCTAGG (SEQ ID NO: 23)
  • Oligonucleotide 24 AGGTTGGGATGGAGGGAGTT (SEQ ID NO: 24) The composition of the reaction solution is shown below.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using MagExtractor plasmid (Toyobo), pBlue-HsCOL1A1 is obtained by purifying a plasmid (hereinafter, also referred to as pBlue-HsCOL1A1) into which DNA encoding human collagen TypeI ⁇ 1 has been inserted from cultured cells. It was.
  • MagExtractor plasmid Toyobo
  • Oligonucleotide 25 GCCAAGCTTGCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGAC (SEQ ID NO: 25)
  • Oligonucleotide 26 CGGTACCCGGGGATCCTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTCC (SEQ ID NO: 26) The composition of the reaction solution is shown below.
  • the amplified DNA of about 4.1 kb was separated by agarose gel electrophoresis, and then extracted and purified from the gel using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo).
  • the obtained DNA was cleaved with restriction enzymes SphI and BamHI, and then purified using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo).
  • the pUC18 plasmid (Toyobo) was digested with restriction enzymes SphI and BamHI and then purified using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo).
  • E. coli Competent high DH5 ⁇ , Toyobo
  • Ligation high Toyobo
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pUC18-HsCOL1A2 is obtained by purifying the plasmid inserted with DNA encoding human collagen TypeI ⁇ 2 (hereinafter sometimes referred to as pUC18-HsCOL1A2) from cultured cells. It was.
  • Oligonucleotide 27 GGCTGAGTTTTATGACGGGC (SEQ ID NO: 27)
  • Oligonucleotide 28 GACAAGATTAGAACAAGAGG (SEQ ID NO: 28) The composition of the reaction solution is shown below.
  • zeocin resistance cassette construction of pUC57-ZeoR
  • SEQ ID NO: 112 was prepared by an assembly PCR method. The prepared DNA was cloned into the EcoRV site of the pUC57 plasmid. This plasmid is referred to as pUC57-ZeoR.
  • the reaction solution was further maintained at 68 ° C. for 5 minutes.
  • the approximately 0.3 kb DNA obtained as a result of the PCR was cleaved with restriction enzymes SpeI and PstI, separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the pBluescriptII SK (+) plasmid (Stratagene) was cleaved with restriction enzymes SpeI and PstI, then separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • E. coli Competent high DH5 ⁇ , Toyobo
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pSN003 a plasmid in which DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the AOX1 terminator is inserted from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pSN003) is purified. As a result, pSN003 was obtained.
  • E. coli Competent high DH5 ⁇ , Toyobo
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • the plasmid (hereinafter, also referred to as pSN004) into which about 1.0 kb of DNA containing the AOX1 promoter is inserted is purified from the cultured cells, thereby pSN004.
  • pSN004 the plasmid into which about 1.0 kb of DNA containing the AOX1 promoter is inserted is purified from the cultured cells, thereby pSN004.
  • Oligonucleotide 31 TATTCGAAACGCATATGTGACCGGCAGACTAGTGG (SEQ ID NO: 31)
  • Oligonucleotide 32 CCACTAGTCTGCCGGTCACATATGGGTTTCGAATA (SEQ ID NO: 32)
  • a solution having the following composition was prepared, and the solution was held at 98 ° C. for 5 minutes, 50 ° C. for 50 minutes, and 37 ° C. for 1 hour.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pSN005 was obtained by purifying a plasmid (hereinafter, also referred to as pSN005) into which DNA (linker 1) was inserted from the cultured cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 33 GGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT (SEQ ID NO: 33)
  • Oligonucleotide 34 TCGACTAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC (SEQ ID NO: 34) The composition of the reaction solution is shown below.
  • pSN005 After a plasmid named pSN005 (see Example (2-1-3)) was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, about 4.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used to extract and purify from the gel. The about 0.3 kb DNA and the about 4.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter, referred to as a plasmid in which a restriction enzyme recognition sequence is added to both ends of the DNA encoding the signal sequence and pro-sequence of the ⁇ -factor gene from the cultured cells.
  • pSN015 was obtained by purifying pSN015.
  • Oligonucleotide 35 TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA (SEQ ID NO: 35)
  • Oligonucleotide 36 TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG (SEQ ID NO: 36)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • the about 1.5 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high JM109, manufactured by Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pSN020 a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of DNA encoding P4H ⁇ without a signal sequence was inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pSN020). PSN020 was obtained by purification.
  • Oligonucleotide 37 AACCGCGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA (SEQ ID NO: 37)
  • Oligonucleotide 38 AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT (SEQ ID NO: 38) The composition of the reaction solution is shown below.
  • the about 3.0 kb DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and Escherichia coli (Competent high JM109, manufactured by Toyobo) was transformed with the obtained ligation solution. .
  • Escherichia coli Competent high JM109, manufactured by Toyobo
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), DNA in which a restriction enzyme recognition sequence is added to both ends of the expression cassette of prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit having ⁇ -factor signal and pro-sequence from cultured cells is obtained.
  • the inserted plasmid hereinafter sometimes referred to as pP4HBsig (-) rev-TOPO
  • pP4HBsig (-) rev-TOPO was purified to obtain pP4HBsig (-) rev-TOPO.
  • Oligonucleotide 39 TATTCGAAACGACGCGTGTCAGCTAGCACTAGTGC (SEQ ID NO: 39)
  • Oligonucleotide 40 GCACTAGTGCTAGCTGACACGCGTCGTTTCGAATA (SEQ ID NO: 40)
  • a solution having the following composition was prepared, and the solution was held at 98 ° C. for 5 minutes, 50 ° C. for 50 minutes, and 37 ° C. for 1 hour.
  • the mixed solution was extracted with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), followed by ethanol precipitation to purify DNA (linker 3).
  • a plasmid named pSN004 (see Example (2-1-2)) was cleaved with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and about 4.2 kb DNA was separated and purified by agarose gel electrophoresis.
  • the DNA (linker 3) and the 4.2-kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pSN007 was obtained by purifying a plasmid into which the DNA (linker 3) was inserted (hereinafter also referred to as pSN007) from the cultured cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 41 TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA (SEQ ID NO: 41)
  • Oligonucleotide 42 TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG (SEQ ID NO: 42) The composition of the reaction solution is shown below.
  • pSN007 After a plasmid named pSN007 (see Example (2-1-7)) was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, about 4.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used for extraction and purification from the gel. The about 1.6 kb DNA and the about 4.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , manufactured by Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of DNA encoding P4H ⁇ 1 is inserted from cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pSN017). Was purified to obtain pSN017.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 43 AACCCGGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA (SEQ ID NO: 43)
  • Oligonucleotide 38 AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT (SEQ ID NO: 38) The composition of the reaction solution is shown below.
  • the DNA of about 2.8 kb was ligated to the “PCR Product insertion site” of pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and Escherichia coli (Competent high JM109, manufactured by Toyobo) was transformed with the obtained ligation solution. .
  • Escherichia coli Competent high JM109, manufactured by Toyobo
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter referred to as “hereinafter”) in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of a prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette is inserted from cultured cells.
  • PP4HA1-SmaI-TOPO was obtained by purification.
  • the pBluescriptII SK (+) (Stratagene) plasmid was cleaved with restriction enzymes XhoI and ClaI, separated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 2.2 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , manufactured by Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of DNA encoding ARG4 is inserted from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pSN023). was purified to obtain pSN023.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • pSN023 After a plasmid named pSN023 (see Example (2-1-10)) was digested with restriction enzymes SacI and Cfr9I, about 5.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used for extraction and purification from the gel. The about 3.0 kb DNA and the about 5.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high JM109, Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), DNA in which a restriction enzyme recognition sequence is added to both ends of the expression cassette of prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit having ⁇ -factor signal and pro-sequence from cultured cells is obtained.
  • PEXP-A-P4Hbsig (-) rev was obtained by purifying the inserted plasmid (hereinafter sometimes referred to as pEXP-A-P4Hbsig (-) rev).
  • a plasmid named pEXP-A-P4Hbsig (-) rev was cleaved with the restriction enzyme Cfr9I, dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then MinElute Reaction Cleanup Kit Purified using (QIAGEN). The about 3.0 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high JM109, Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter referred to as pEXP-) in which DNA having restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette was inserted from the cultured cells.
  • pEXP- plasmid in which DNA having restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette was inserted from the cultured cells.
  • PEXP-A-P4Hbsig (-) A1rev was obtained by purifying A-P4Hbsig (-) A1rev).
  • Oligonucleotide 46 TATTCGAAACGATGCGCTCCCTCCTGCTTCTC (SEQ ID NO: 46)
  • Oligonucleotide 47 TTACTAGTTATAACTCGTCTCGCATCTTGTCACC (SEQ ID NO: 47) The composition of the reaction solution is shown below.
  • pSN005 After a plasmid named pSN005 (see Example (2-1-3)) was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, about 4.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used to extract and purify from the gel. The about 1.3 kb DNA and about 4.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of DNA encoding HSP47 is inserted from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pTS011). Was purified to obtain pTS011.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-P4Hbsig (-) rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.3 kb was obtained by agarose gel electrophoresis. It isolate
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the DNA encoding HSP47 is inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pEXP-A-HSP47native signal). In some cases, pEXP-A-HSP47 native signal was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 48 TTATCGATCCCACACACCATAGCTTCA (SEQ ID NO: 48)
  • Oligonucleotide 49 TGATCGATAGCTTGCAAATTAAAGCCTTC (SEQ ID NO: 49) The composition of the reaction solution is shown below.
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47 native signal was cleaved with the restriction enzyme ClaI, dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then subjected to MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN ). The about 1.2 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed Escherichia coli was inoculated and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and 25 ⁇ g / ml zeocin. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA with a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of a zeocin resistance cassette was inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev). PEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.4 kb was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 0.4 kb DNA and the about 6.4 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, by using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pEXP is purified by purifying a plasmid inserted with DNA encoding FKBP13A from the cultured cells (hereinafter also referred to as pEXP-A-FKBP13A ZeoR). -Obtained A-FKBP13A ZeoR.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.4 kb was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 0.6 kb DNA and the about 6.4 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, by using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pEXP is purified by purifying a plasmid inserted with DNA encoding FKBP19 from the cultured cells (hereinafter also referred to as pEXP-A-FKBP19 ZeoR). -Obtained A-FKBP19 ZeoR.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.4 kb was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 0.7 kb DNA and the about 6.4 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pEXP is purified by purifying a plasmid inserted with DNA encoding FKBP23 from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pEXP-A-FKBP23 ZeoR). -A-FKBP23 Obtained ZeoR.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.4 kb was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 1.7 kb DNA and the about 6.4 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, by using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pEXP is purified by purifying a plasmid inserted with DNA encoding FKBP63 from the cultured cells (hereinafter also referred to as pEXP-A-FKBP63 ZeoR). -A-FKBP63 Obtained ZeoR.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, and then a DNA of about 6.4 kb was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 1.8 kb DNA and the about 6.4 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, by using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), pEXP is purified by purifying a plasmid inserted with DNA encoding FKBP65 from the cultured cells (hereinafter also referred to as pEXP-A-FKBP65 ZeoR). -Obtained A-FKBP65 ZeoR.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-FKBP23 ZeoR was cleaved with restriction enzymes BspT104I and SacII, and about 7.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 1.0 kb DNA and the about 7.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which DNA with restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the PER3 promoter was inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR) PEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-FKBP23 ZeoR was cleaved with restriction enzymes BspT104I and SacII, and about 7.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 1.1-kb DNA and the about 7.2-kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA with a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the AOX2 promoter was inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR) PEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR was obtained by purification.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid named pEXP-A-FKBP23 ZeoR was cleaved with restriction enzymes BspT104I and SacII, and about 7.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using the MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 0.9 kb DNA and the about 7.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the FLD1 promoter is inserted from the cultured cells (hereinafter referred to as pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR). PEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter also referred to as pSN001) in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of HIS4 is inserted is purified from the cultured cells. As a result, pSN001 was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 52 GCATCGATTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGG (SEQ ID NO: 52)
  • Oligonucleotide 53 AAGGGGCCCGATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAA (SEQ ID NO: 53) The composition of the reaction solution is shown below.
  • pSN001 After a plasmid named pSN001 (see Example (2-3-1)) was digested with restriction enzymes ClaI and ApaI, about 5.6 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and the MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used to extract and purify from the gel. The about 0.8 kb DNA and the about 5.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , manufactured by Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the AOX1 3 ′ downstream noncoding region is inserted from the cultured cells (hereinafter also referred to as pSN002). PSN002 was obtained by purification.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • Oligonucleotide 54 TATTCGAAACGCATATGGTACCGGCAGACTAGTGG (SEQ ID NO: 54)
  • Oligonucleotide 55 CCACTAGTCGCCTAGGCGACATATGGTTTCGAATA (SEQ ID NO: 55)
  • a solution having the following composition was prepared, and the solution was held at 98 ° C. for 5 minutes, 50 ° C. for 50 minutes, and 37 ° C. for 1 hour.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, pSN006 was obtained by refine
  • MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN).
  • the about 1.3 kb DNA and the about 6.3 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pEXH002 is obtained by purifying a plasmid (hereinafter also referred to as pEXH002) into which DNA containing AOX1 promoter and AOX1 terminator has been inserted from cultured cells. It was.
  • E. coli Competent high DH5 ⁇ , Toyobo
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • PTS001 was obtained by purifying a plasmid into which DNA encoding human collagen TypeI ⁇ 1 was inserted (hereinafter also referred to as PTS001) from cultured cells. .
  • MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN). The approximately 5.3 kb DNA and the approximately 6.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pEXP-HA-YHsCOL1A1 a plasmid (hereinafter, sometimes referred to as pEXP-HA-YHsCOL1A1) in which DNA encoding AOX1 promoter and human collagen TypeI ⁇ 1 is inserted from cultured cells.
  • pEXP-HA-YHsCOL1A1 was obtained.
  • MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN).
  • the about 4.1 kb DNA and the about 4.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pTS002 was obtained by purifying a plasmid (hereinafter sometimes referred to as pTS002) into which DNA encoding human collagen TypeI ⁇ 2 was inserted from the cultured cells. .
  • Oligonucleotide 56 AACGGCCGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA (SEQ ID NO: 56)
  • Oligonucleotide 57 AACGGCCGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT (SEQ ID NO: 57)
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • the DNA of about 5.4 kb was ligated to the “PCR Product insertion site” of the pCR-BluntII-TOPO plasmid (Invitrogen), and Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , manufactured by Toyobo) was transformed with the obtained ligation solution. .
  • Escherichia coli Competent high DH5 ⁇ , manufactured by Toyobo
  • Zero-Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen) was used.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter referred to as pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I) in which a DNA having a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of a human collagen TypeI ⁇ 2 expression cassette was inserted from cultured cells. PYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I was obtained by purification.
  • a plasmid named pEXP-HA-YHsCOL1A1 was cleaved with restriction enzyme Eco52I, dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN) was used. And purified. The about 5.4 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid (hereinafter referred to as pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1) in which DNA with a restriction enzyme recognition sequence added to both ends of the human collagen TypeI ⁇ 2 expression cassette was inserted from the cultured cells. PEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 was obtained by purification.
  • a fusion polypeptide expression cassette comprising an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region; And a fusion polypeptide expression cassette introduction plasmid (pEXP) comprising an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region.
  • pEXP fusion polypeptide expression cassette introduction plasmid
  • E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • N-terminal non-helix region of collagen Type I ⁇ 1, 60-terminal N-terminal helix region, 15-residue C-terminal helix region, and C-terminal from cultured cells PAT021 was obtained by purifying a plasmid having a fusion polypeptide expression cassette consisting of a non-helix region (hereinafter sometimes referred to as pAT021).
  • a plasmid named pEXH002 was cleaved with restriction enzymes Eco52I and SpeI, and a DNA of about 6.6 kb was separated by agarose gel electrophoresis. MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN). The about 2.5 kb DNA and the about 6.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • the N-terminal non-helix region of human collagen TypeI ⁇ 2 60 residues of the N-terminal helix region, 15 residues of the C-terminal helix region, and C-terminus from the cultured cells.
  • a plasmid having a fusion polypeptide expression cassette consisting of a non-helix region hereinafter also referred to as pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52I
  • pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52I was obtained.
  • a plasmid named pEXH-HA-YHsCOL1A1 N60C15 was digested with restriction enzyme Eco52I, dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN) The product was purified using The approximately 2.3 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), the N-terminal non-helix region of collagen type I ⁇ 2, the N-terminal helix region 60 residues, the C-terminal helix region 15 residues, and the C-terminal non-helix from the cultured cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15 By purifying a plasmid (hereinafter, also referred to as pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15) in which DNA having restriction enzyme recognition sequences added is inserted at both ends of a fusion polypeptide expression cassette comprising a helix region. PEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15 was obtained.
  • PCR was performed using the following oligonucleotides 59 and 64 as primers and a plasmid named pTS001 (see Example (2-3-5)) as a template, and AOX1 promoter, human collagen TypeI ⁇ 1 N-terminal non-helix region and N A region consisting of DNA encoding the 27-terminal helix region residue, DNA encoding the C-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1 and 15 residues of the C-terminal helix region, an AOX1 terminator, and a vector plasmid region were amplified.
  • the about 1.6 kb DNA and the about 5.7 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pAT017 a plasmid (hereinafter sometimes referred to as pAT017) in which DNA encoding the central 522 residue of the human collagen TypeI ⁇ 1 helix region has been purified from cultured cells.
  • pAT017 was obtained.
  • E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pAT027 a plasmid inserted with DNA encoding the central 522 residue of human collagen TypeI ⁇ 1 helix region (hereinafter sometimes referred to as pAT027) is purified from cultured cells. As a result, pAT027 was obtained.
  • a plasmid named pEXH002 was cleaved with restriction enzymes Eco52I and SpeI, and a DNA of about 6.6 kb was separated by agarose gel electrophoresis.
  • MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN).
  • the about 5.6 kb DNA and the about 6.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pAT018 a plasmid inserted with DNA encoding the central 522 residue of human collagen Type I ⁇ 2 helix region (hereinafter sometimes referred to as “pAT018”) is purified from cultured cells. As a result, pAT018 was obtained.
  • a plasmid named pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I was cleaved with restriction enzymes AccIII and PmeI, and about 4.9 kb DNA was separated by agarose gel electrophoresis. The gel was extracted and purified using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). The about 2.6 kb DNA and the about 4.9 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pAT018-Eco52I was obtained by purifying a plasmid into which a DNA encoding the central 522 residue of human collagen TypeI ⁇ 2 helix region was inserted (hereinafter sometimes referred to as pAT018-Eco52I).
  • the about 1.6 kb DNA and the about 7.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pAT028-Eco52I a plasmid in which DNA encoding the central 522 residue of human collagen TypeI ⁇ 2 helix region is inserted from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pAT028-Eco52I).
  • pAT028-Eco52I a plasmid in which DNA encoding the central 522 residue of human collagen TypeI ⁇ 2 helix region is inserted from the cultured cells
  • a plasmid named pEXP-HA-HsCOL1A1 M500X2 was digested with restriction enzyme Eco52I, dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN) The product was purified using The approximately 5.6 kb DNA and the plasmid were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured.
  • Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Then, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), the dimer of the human collagen TypeI ⁇ 2 N-terminal non-helix region, the N-terminal helix region 27 residues, and the central 522 residue of the helix region from cultured cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • a plasmid into which a DNA having a fusion polypeptide expression cassette comprising a C-terminal helix region of 15 residues and a C-terminal non-helix region is inserted (hereinafter sometimes referred to as pEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2).
  • PEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2 was obtained.
  • Oligonucleotide 72 TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGG (SEQ ID NO: 72)
  • Oligonucleotide 73 TTACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAACGT (SEQ ID NO: 73) The composition of the reaction solution is shown below.
  • pSN006 After a plasmid named pSN006 (see Example (2-3-3)) was digested with restriction enzymes BspT104I and SpeI, about 4.2 kb of DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and MinElute Gel Extraction Kit ( QIAGEN) was used to extract and purify from the gel. The about 4.4 kb DNA and the about 4.2 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E.
  • coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours). Thereafter, using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), a plasmid in which DNA having a restriction enzyme recognition sequence added at both ends of DNA encoding human TypeIII ⁇ 1 (hereinafter sometimes referred to as pSN026) is purified. As a result, pSN026 was obtained.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • MinElute Gel Extraction Kit Extracted and purified from the gel using (QIAGEN). The approximately 5.3 kb DNA and the approximately 6.6 kb DNA were ligated, and the resulting ligation solution was used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo). In addition, Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) was used for the ligation reaction. The transformed E. coli was inoculated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium were inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pEXP-HA-HsCOL3A1 a plasmid in which DNA encoding AOX1 promoter and human collagen TypeIII ⁇ 1 is inserted from the cultured cells (hereinafter sometimes referred to as pEXP-HA-HsCOL3A1).
  • pEXP-HA-HsCOL3A1 a plasmid in which DNA encoding AOX1 promoter and human collagen TypeIII ⁇ 1 is inserted from the cultured cells.
  • the about 4.4 kb DNA and the about 4.2 kb DNA are ligated, and the resulting ligation solution is used to transform Escherichia coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) is used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli is inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium are inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pIM200 is obtained by purifying a plasmid (hereinafter also referred to as pIM200) into which a DNA encoding human collagen TypeII ⁇ 1 has been inserted from cultured cells.
  • the about 5.3 kb DNA and the about 6.6 kb DNA are ligated, and the resulting ligation solution is used to transform E. coli (Competent high DH5 ⁇ , Toyobo).
  • Ligation Kit ver2.1 (Takara Bio) is used for the ligation reaction.
  • the transformed E. coli is inoculated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured. Colonies formed on the agar medium are inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured with shaking (37 ° C., 17 hours).
  • pEXP-HA-YHsCOL2A1 a plasmid (hereinafter, sometimes referred to as pEXP-HA-YHsCOL2A1) into which DNA encoding AOX1 promoter and human collagen TypeII ⁇ 1 has been inserted from cultured cells.
  • pEXP-HA-YHsCOL2A1 is obtained.
  • Example 3 Production of yeast containing a prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette and a prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette
  • 10 ⁇ g of pEXP-A-P4Hbsig ( ⁇ ) A1rev (see Example (2-1-12)) was cleaved with the restriction enzyme AatII.
  • DNA was collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution. 100 ⁇ l of the bacterial cell suspension and 5 ⁇ l of the DNA solution were mixed to prepare a mixed solution.
  • the mixture was pulsed using a gene transfer device (ECM630, BTX) and then MD agar medium (1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 0.005% (Histidine, 2% agar) and cultured at 30 ° C. for 48 hours. A colony formed on the MD agar medium was isolated as a transformant. 050525-5-3 strain was obtained as a transformant.
  • ECM630 gene transfer device
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 0.005% (Histidine, 2% agar)
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting was performed using the obtained membrane to detect prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit. Blocking one (Nacalai Tesque) was used for blocking the membrane, and Can Get Signal (Toyobo) was used for the antibody reaction.
  • anti-mouse IgG-HRP Linked sheep antibody (NA-931, GE Healthcare Bioscience) was prepared at a 20000-fold dilution and used as a secondary antibody.
  • the secondary antibody was detected by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, a signal was detected at a molecular weight corresponding to prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit in 050525-5-3 strain, and thus prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit was produced. Was shown to do.
  • Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, a signal was detected at a molecular weight corresponding to prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit in 050525-5-3 strain, and thus prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit was produced. Was shown to do.
  • Example 2-3-9 Transformation of Yeast
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • ERICA-MP (DRC) was used as the electrophoresis apparatus, and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) was used as the electrophoresis gel, and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was stained with a CBB staining solution to detect a protein band. As a result, in the 070327-1-1 strain, a molecular weight band corresponding to collagen type I ⁇ 1 procollagen and a molecular weight band corresponding to collagen type I ⁇ 2 procollagen were detected, so human collagen TypeI ⁇ 1 and human collagen It was shown to produce TypeI ⁇ 2.
  • fusion polypeptide comprising an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 60 residues, a C-terminal helix region of 15 residues, and a C-terminal non-helix region;
  • expression study of fusion polypeptide comprising human collagen TypeI ⁇ 2 N-terminal non-helix region, N-terminal helix region 60 residues, C-terminal helix region 15 residues, and C-terminal non-helix region 080118-3 Strain-3 (see Example (3-3-1)) prepared in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask with 100 ml of BMGY medium [1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) ), 1.34% yeast nitrogen base (Difco), 4 ⁇ 10 -5 % biotin, was inoculated to 1% glycerol] And cultured with shaking for 24 hours at 30
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • ERICA-MP (DRC) was used as the electrophoresis apparatus, and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) was used as the electrophoresis gel, and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). The blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes.
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • ERICA-MP (DRC) was used as the electrophoresis apparatus, and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) was used as the electrophoresis gel, and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). The blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes.
  • the secondary antibody used was an anti-goat IgG-HRP Linked Lovaji antibody (SC-2033, Santa Cruz) prepared by diluting 2000 times. Secondary antibody was detected by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, the 080801-2-4 strain had an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, an N-terminal helix region of 27 residues, a helix region central 522 residue dimer, a C-terminal helix region.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane
  • Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction
  • the primary antibody is diluted with anti-human collagen Type I rabbit antibody (ab292, abcam) 5000 times
  • the secondary antibody is An anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody (NA-934, GE Healthcare Bioscience) was used by preparing a 10,000-fold dilution. Secondary antibody was detected by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film).
  • the 080801-2-4 strain had an N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, an N-terminal helix region of 27 residues, a helix region central 522 residue dimer, a C-terminal helix region.
  • YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% peptone, and 2% glucose
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC)
  • the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC)
  • electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes.
  • the obtained acrylamide gel was stained with a CBB staining solution to detect a protein band.
  • a band having a molecular weight corresponding to the collagen type III ⁇ 1 procollagen was detected in the 0800917-1-2 strain, indicating that human collagen TypeIII ⁇ 1 was produced.
  • DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution.
  • the mixture was pulsed using an electroporation apparatus (ECM630, BTX), and then MD agar medium (1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 2% agar) Spread on top and incubate at 30 ° C. for 48 hours. A colony formed on the MD agar medium is isolated as a transformant.
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel is stained with a CBB staining solution to detect a protein band. The detection of a band with a molecular weight corresponding to procollagen of collagen TypeII ⁇ 1 indicates that human collagen TypeII ⁇ 1 is produced.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting was performed using the obtained membrane to detect FK506 binding protein.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) was used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) was used for the antibody reaction, and anti-FKBP13A rabbit antibody (11700-1-AP, ProteinTech Group) was diluted 2000 times as the primary antibody.
  • an anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody (NA-934, GE Healthcare Bioscience) was prepared by diluting 10,000 times.
  • the detection of the secondary antibody was performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, a signal was detected at a molecular weight corresponding to FKBP13A in the 081022-2-1 strain, indicating that FKBP13A was produced.
  • prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette Preparation of prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette, prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette, human collagen Type I ⁇ 1 expression cassette, human collagen Type I ⁇ 2 expression cassette, and FKBP19 expression cassette-introduced yeast
  • Example (3-2-1) Transformation of Yeast
  • the pEXP-A obtained in Example 2-2-5 was transformed into 070327-1-11 strain (see Example (3-2-1)) by electroporation.
  • 100 ml of YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% peptone, and 2% glucose
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting was performed using the obtained membrane to detect FK506 binding protein.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP19 mouse antibody (H00051303-B01, Abnova) is diluted 2000 times as the primary antibody, and the secondary antibody.
  • the detection of the secondary antibody was performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, a signal was detected at a molecular weight corresponding to FKBP19 in the 081022-1-1 strain, indicating that FKBP19 was produced.
  • Example (3-2-1) Transformation of Yeast
  • the pEXP-A obtained in Example 2-2-6 was transformed into 070327-1-11 strain (see Example (3-2-1)) by electroporation.
  • 100 ml of YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% peptone, and 2% glucose
  • 070327-1-11 strain see Example (3-2-1)
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting was performed using the obtained membrane to detect FK506 binding protein.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) was used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) was used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) was diluted 2000 times as the primary antibody.
  • an anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody (NA-934, GE Healthcare Bioscience) was prepared by diluting 10,000 times.
  • the detection of the secondary antibody was performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). As a result of Western blotting, a signal was detected at a position of a molecular weight corresponding to FKBP23 in the 081044-3-1 strain, indicating that FKBP23 was produced.
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was stained with a CBB staining solution to detect a protein band. As a result, a band having a molecular weight corresponding to FKBP63 was detected in the 081024-2-1 strain, indicating that FKBP63 was produced.
  • prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette Production of prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette, prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette, human collagen Type I ⁇ 1 expression cassette, human collagen Type I ⁇ 2 expression cassette, and FKBP65 expression cassette-introduced yeast
  • the cells were crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) under yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid was centrifuged to collect the supernatant of the microbial cell crushed liquid to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction was mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on SDS polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis apparatus was ERICA-MP (DRC), and the electrophoresis gel was 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC), and electrophoresis was performed at 200 V for 20 minutes. After completion of electrophoresis, the obtained acrylamide gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus was MINICA-MP (DRC), and it was performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting was performed using the obtained membrane to detect FK506 binding protein.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) was used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) was used for the antibody reaction, and anti-FKBP65 rabbit antibody (12172-1-AP, ProteinTech Group) was diluted 2000 times as the primary antibody.
  • an anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody (NA-934, GE Healthcare Bioscience) was prepared by diluting 10,000 times.
  • the detection of the secondary antibody was performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence was detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film).
  • an image analyzer LAS-3000UVmini, Fuji Film
  • 10 ⁇ g of pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-9)), pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-10)), or pEXP -A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-11)) is cleaved with the restriction enzyme BglII. DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution.
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml. Spread on zeocin, 2% agar) and incubate at 30 ° C. for 48 hours. A colony formed on the MD agar medium is isolated as a transformant.
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the obtained acrylamide gel is electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the blotting apparatus uses MINICA-MP (DRC) and is performed at 40 V for 30 minutes. Western blotting is performed using the obtained membrane to detect FK506 binding protein.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) is diluted 2000 times as the primary antibody.
  • anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody NA-934, GE Healthcare Bioscience
  • Detection of secondary antibody is performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence is detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). Production of FKBP23 is indicated by detection of a signal at the position of the molecular weight corresponding to FKBP23.
  • Prolyl-4-hydroxylase ⁇ 1 subunit expression cassette prolyl-4-hydroxylase ⁇ subunit expression cassette, N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 1, N-terminal helix region 60 residues, C Fusion polypeptide expression cassette comprising 15-terminal helix region and C-terminal non-helix region, N-terminal non-helix region of human collagen Type I ⁇ 2, 60-terminal helix region, C-terminal helix region 15 Preparation of fusion polypeptide expression cassette consisting of residues and C-terminal non-helix region, and yeast introduced with FKBP23 expression cassette
  • 10 ⁇ g of pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-9)), pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-10)), or pEXP -A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-11)) is cleaved with the restriction enzyme BglII. DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution.
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml
  • zeocin 2% agar
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the obtained acrylamide gel is electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). Blotting is performed using MINICA-MP (DRC) at 40V for 30 minutes.
  • Western blotting is performed using the obtained membrane to detect FKBP23.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) is diluted 2000 times as the primary antibody.
  • anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody NA-934, GE Healthcare Bioscience
  • Detection of secondary antibody is performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence is detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). Production of FKBP23 is indicated by detection of a signal at the position of the molecular weight corresponding to FKBP23.
  • DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution.
  • the mixture was pulsed using an electroporation apparatus (ECM630, BTX) and then MD agar medium (1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml) Spread on zeocin, 2% agar, and incubate at 30 ° C. for 48 hours.
  • a colony formed on the MD agar medium is isolated as a transformant.
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the obtained acrylamide gel is electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). Blotting is performed using MINICA-MP (DRC) at 40V for 30 minutes.
  • Western blotting is performed using the obtained membrane to detect FKBP23.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) is diluted 2000 times as the primary antibody.
  • anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody NA-934, GE Healthcare Bioscience
  • Detection of secondary antibody is performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence is detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). Production of FKBP23 is indicated by detection of a signal at the position of the molecular weight corresponding to FKBP23.
  • 10 ⁇ g of pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-9)), pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-10)), or pEXP -A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR (see Example (2-2-11)) is cleaved with the restriction enzyme BglII. DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 5 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl to prepare a DNA solution.
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml
  • MD agar medium 1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml
  • zeocin 2% agar
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the obtained acrylamide gel is electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). Blotting is performed using MINICA-MP (DRC) at 40V for 30 minutes.
  • Western blotting is performed using the obtained membrane to detect FKBP23.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) is diluted 2000 times as the primary antibody.
  • anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody NA-934, GE Healthcare Bioscience
  • Detection of secondary antibody is performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence is detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). Production of FKBP23 is indicated by detection of a signal at the position of the molecular weight corresponding to FKBP23.
  • YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% peptone, and 2% glucose
  • the mixture was pulsed using an electroporation apparatus (ECM630, BTX) and then MD agar medium (1.34% yeast nitrogen base, 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % biotin, 2% glucose, 300 ⁇ g / ml) Spread on zeocin, 2% agar, and incubate at 30 ° C. for 48 hours. A colony formed on the MD agar medium is isolated as a transformant.
  • ECM630 electroporation apparatus
  • BTX electroporation apparatus
  • the cells After collecting the cells from the culture solution and removing the supernatant, the cells are crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai) under the yeast crushing conditions (glass beads diameter 0.5 mm, 2500 rpm, 40 minutes). .
  • the obtained crushed liquid is centrifuged to recover the supernatant of the microbial cell lysate to prepare a soluble fraction.
  • the soluble fraction is mixed with a sample buffer (Nacalai Tesque), incubated at 100 ° C. for 5 minutes, and then electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is performed at 200 V for 20 minutes using ERICA-MP (DRC) as the electrophoresis apparatus and 5-15% gradient gel (XV PANTERA MP gel, DRC) as the electrophoresis gel.
  • DRC ERICA-MP
  • XV PANTERA MP gel, DRC 5-15% gradient gel
  • the obtained acrylamide gel is electroblotted onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). Blotting is performed using MINICA-MP (DRC) at 40V for 30 minutes.
  • Western blotting is performed using the obtained membrane to detect FKBP23.
  • Blocking one (Nacalai Tesque) is used for blocking the membrane, Can Get Signal (Toyobo) is used for the antibody reaction, and anti-FKBP23 rabbit antibody (12092-1-AP, ProteinTech Group) is diluted 2000 times as the primary antibody.
  • anti-rabbit IgG-HRP Linked donkey antibody NA-934, GE Healthcare Bioscience
  • Detection of secondary antibody is performed by chemiluminescence using ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bioscience). Chemiluminescence is detected and quantified with an image analyzer (LAS-3000UVmini, Fuji Film). Production of FKBP23 is indicated by detection of a signal at the position of the molecular weight corresponding to FKBP23.
  • Example (3-11-1) Yeast culture and cell preparation (part 1) 070327-1-11 strain (see Example (3-2-1)), 081022-2-1 strain (see Example (3-7-1)), 081022-1-1 strain (Example (3- 8-1)), 081024-3-1 strain (see Example (3-9-1)), 081024-2-1 strain (see Example (3-10-1)), and 081024-1 -1 strain (see Example (3-11-1)) prepared in a 500-ml baffled Erlenmeyer flask with 100 ml of BMGY medium [1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) 1.34% East Nitrogen Base (Difco), 4 ⁇ 10 ⁇ 5 % Biotin, 1% Glycerol], cultured with shaking at 30 ° C., and pre-cultured for 24 hours.
  • BMGY medium 1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) 1.34% East Nitrogen Base (Difco), 4
  • a 0.8 L Basal salt medium was prepared in a 3 L fermenter (model: BMS-03P1, Able).
  • the main culture was started at a culture temperature of 30 ° C., a maximum aeration rate of 0.8 vvm (0.8 L), and a stirring speed of 800 pm.
  • methanol feed medium [98.6% (W / V) methanol, 1.2% PMT1 solution] was started, and methanol fed-batch culture was performed.
  • the culture temperature was changed to 32 ° C., and the amount of dissolved oxygen was controlled to be about 8 ppm.
  • the pH of the culture solution was controlled to a constant value of about 5.0 using 28% aqueous ammonia and 4M phosphoric acid throughout the culture period.
  • the culture solution of the 070327-1-11 strain was 1696 g
  • the culture solution of the 081022-2-1 strain was 1671 g
  • the culture solution of the 081022-1-1 strain was 1639 g
  • the culture of the 081024-3-1 strain 1590 g of the liquid, 1674 g of the culture solution of the 081024-2-1 strain, and 1599 g of the culture solution of the 081024-1-1 strain were obtained.
  • the composition of the medium used is shown below.
  • composition of PMT1 solution (A) CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 6.0g / L (B) KI 0.8g / L (C) MnSO 4 .H 2 O 3.0 g / L (D) Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2g / L (E) H 3 BO 3 0.2 g (F) CaSO 4 ⁇ 2H 2 O 0.5g / L (G) ZnCl 2 20 g / L (H) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 65g / L (I) Biotin 0.2 g / L (J) Concentrated sulfuric acid 5mL / L The culture was centrifuged at 5000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes to recover the cells.
  • the cells were suspended in potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0), and the suspension was centrifuged to collect the cells. This operation was repeated twice in total to prepare bacterial cells.
  • the microbial cells of the 070327-1-11 strain were 632.6 g
  • the microbial cells of the 081022-2-1 strain were 650.2 g
  • the microbial cells of the 081022-1-1 strain were 627.6 g
  • the microbial cells of the 081024-3-1 strain The body was 578.3 g
  • the cell body of the 081024-2-1 strain was 638.7 g
  • the cell body of the 081024-1-1 strain was obtained 614.3 g.
  • the cells were suspended in a potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) at a concentration of 40% (W / W) to prepare a suspension.
  • a potassium phosphate buffer 50 mM, pH 6.0
  • the suspension was fed into a dynomill set to the conditions for yeast at a rate of 4000 g / hour to break up the suspension.
  • Potassium phosphate buffer 50 mM, pH 6.0
  • the pH was adjusted to strongly acidic (pH 1.5 or less) using concentrated hydrochloric acid at a final concentration of 0.2N.
  • pepsin P7000, SIGMA
  • the cell disruption solution was kept at 4 ° C. with stirring.
  • the cell disruption solution was centrifuged at 9000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to prepare a supernatant.
  • 10N NaOH was added to the supernatant to adjust the pH to about 10 and then kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant was centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to prepare a supernatant.
  • Acetic acid was added to the supernatant to a final concentration of 0.5 M, the pH was adjusted to 3.0 using concentrated hydrochloric acid, and the mixture was kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant was centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to prepare a supernatant.
  • NaCl was dissolved in the supernatant at a final concentration of 1 M and then kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant was centrifuged at 9000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes, and an insoluble fraction was collected.
  • 0.1N HCl was added to the insoluble fraction, and the mixture was kept warm at 4 ° C. with stirring to prepare a solution.
  • the lysate was centrifuged at 9000 rpm and 4 ° C.
  • the insoluble fraction was removed to prepare a supernatant.
  • a 1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) was added to the supernatant to a final concentration of 0.05 M, and then the pH was adjusted to about 7.4 using 10 N NaOH. After dissolving NaCl at a final concentration of 4M, the mixture was kept at 4 ° C. with stirring. After about 16 hours, the insoluble fraction was collected by centrifugation at 9000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes. After adding 2.8 times the weight of 0.1N HCl to the weight of the insoluble fraction, the mixture was kept at 4 ° C. with stirring. After about 16 hours, the insoluble fraction was collected by centrifugation at 9000 rpm and 4 ° C.
  • 0.1N HCl was added to the insoluble fraction, and the mixture was kept warm at 4 ° C. with stirring to prepare a solution. After about 16 hours, the lysate was centrifuged at 9000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to prepare a supernatant. The supernatant was placed in a dialysis tube (Spectra / Por 132665, SPECTUM LABORATORIES), dialyzed against 10 volumes of 1 mM HCl solution three times, and then filtered using a 0.22 ⁇ m filter (Millex GP, Millipore). .
  • a dialysis tube Spectra / Por 132665, SPECTUM LABORATORIES
  • the collagen type I concentration of the purified collagen solution obtained from the cells of 070327-1-11 strain (see Example (4-1)) was 4.89 mg / ml, and 081022-2-1 strain (Example (4-1)
  • the collagen type I concentration of the purified collagen solution obtained from the cells of (see)) is 5.64 mg / ml
  • the purified collagen solution obtained from the cells of the 081022-1-1 strain (see Example (4-1)) Collagen Type I concentration was 4.88 mg / ml
  • the collagen type I concentration of the purified collagen solution obtained from the cells of 081024-3-1 strain (see Example (4-1)) was 3.72 mg / ml
  • the purified collagen solution obtained from the cells of the 2-1 strain (see Example (4-1)) had a collagen Type I concentration of 7.39 mg / ml
  • the collagen type I concentration of the purified collagen solution obtained from the cells of (ii) was 4.68 mg / ml
  • a calibration curve was prepared from the absorbance of the mannose solution, and the neutral sugar concentration of the purified collagen solution was calculated from the calibration curve as a value in terms of mannose. From the obtained value, the number of neutral sugars per molecule of collagen Type I was calculated. The calculation was performed assuming that the molecular weight of mannose was 180 and the molecular weight of collagen Type I was 318800.
  • the number of neutral sugars was 15.4, 081022-2-1 strain (Example (4-1)
  • the neutral sugar number is 18.1, in the purified collagen solution obtained from the cells of the strain 081022-1-1 (see Example (4-1)).
  • the number of neutral sugars is 8.7, 081024-2-1 strain.
  • the number of neutral sugars is 15.9 and the bacteria of 081024-1-1 strain (see Example (4-1))
  • the number of neutral sugars was 14.7.
  • a 0.8 L Basal salt medium is prepared in a 3 L volume fermenter (model: BMS-03P1, Able).
  • the main culture is started at a culture temperature of 30 ° C., a maximum aeration rate of 0.8 vvm (0.8 L), and a stirring speed of 800 pm.
  • the feeding of the glycerol feeding medium (50% glycerol, 1.2% PMT1 solution) is started at a rate of about 15 g / h. Glycerol feeding is stopped when OD 660 of the culture reaches approximately 130.
  • methanol feed medium [98.6% (W / V) methanol, 1.2% PMT1 solution] is started, and methanol fed-batch culture is performed.
  • the culture temperature is changed to 32 ° C. and the dissolved oxygen amount is controlled to be about 8 ppm.
  • the pH of the culture solution is controlled to a constant value of about 5.0 using 28% aqueous ammonia and 4M phosphoric acid.
  • a culture solution is obtained by culturing for about 136 hours. The composition of the medium used is shown below.
  • composition of PMT1 solution (A) CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 6.0g / L (B) KI 0.8g / L (C) MnSO 4 .H 2 O 3.0 g / L (D) Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2g / L (E) H 3 BO 3 0.2 g (F) CaSO 4 ⁇ 2H 2 O 0.5g / L (G) ZnCl 2 20 g / L (H) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 65g / L (I) Biotin 0.2 g / L (J) Concentrated sulfuric acid 5mL / L The culture is centrifuged at 5000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes to recover the cells. To remove the medium components, the cells are suspended in potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0), and the suspension is centrifuged to recover the cells. This operation is repeated a total of 2 times to prepare 050818-3-1 strain cells.
  • Potassium phosphate buffer solution (50 mM, pH 6.0) is added to dilute the concentration of the cell disruption solution to 1 ⁇ 2. Adjust the pH to strongly acidic (pH 1.5 or less) using concentrated hydrochloric acid at a final concentration of 0.2N. After adding pepsin (P7000, Sigma) to a final concentration of 5 mg / ml, the cell disruption solution is kept warm at 4 ° C. with stirring. After about 96 hours, the cell disruption solution is centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is removed to prepare a supernatant. 10N NaOH is added to the supernatant to adjust the pH to about 10, and then kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant is centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is removed to prepare a supernatant.
  • Acetic acid is added to the supernatant to a final concentration of 0.5 M, pH is adjusted to 3.0 using concentrated hydrochloric acid, and the mixture is kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant is centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is removed to prepare a supernatant.
  • NaCl is dissolved in the supernatant at a final concentration of 1 M, and then kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant is centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is collected. After adding 0.1 N HCl to the insoluble fraction, the solution is kept warm at 4 ° C. with stirring. After about 16 hours, the lysate is centrifuged at 9000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is removed to prepare a supernatant. 1M potassium phosphate buffer (pH 7.4) is added to the supernatant to a final concentration of 0.05M, and then the pH is adjusted to about 7.4 using 10N NaOH. After dissolving NaCl at a final concentration of 4M, it is kept at 4 ° C. with stirring.
  • the insoluble fraction is collected by centrifugation at 9000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. After adding 0.1 N HCl to the insoluble fraction, the solution is kept warm at 4 ° C. with stirring. After about 16 hours, the lysate is centrifuged at 9000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is removed to prepare a supernatant. Acetic acid is added to the supernatant to a final concentration of 0.5 M, and the pH is adjusted to about 3.0 using concentrated hydrochloric acid. After NaCl is dissolved in the supernatant at a final concentration of 2M, it is kept at 4 ° C. with stirring.
  • the supernatant is centrifuged at 9000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction is collected.
  • the solution is kept at 4 ° C. with stirring to prepare a solution.
  • the lysate is put in a dialysis tube (Spectra / Por 132665, SPECTUM LABORATORIE), dialyzed against 10 volumes of 1 mM HCl solution three times, and then filtered using a 0.22 ⁇ m filter (Millex GP, Millipore). To obtain a purified collagen solution.
  • the absorbance (OD 490 ) is measured.
  • a calibration curve is prepared from the absorbance of the mannose solution, and the neutral sugar concentration of the purified collagen solution is calculated from the calibration curve as a value in terms of mannose. From the obtained value, the number of neutral sugars per molecule of collagen is calculated.
  • a method for obtaining a glycine repeat sequence protein using the transformant and the like can be provided.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is the primer for cloning of his4, the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is the base sequence described in the primer SEQ ID NO: 3 for cloning his4, the cloning of arg4
  • the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 4 for primer is the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 5 for cloning of arg4 is the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 6 for cloning of the aox1 promoter
  • the nucleotide sequence described in the primer sequence number 7 for cloning of the aox1 promoter is the nucleotide sequence described in the primer sequence number 8 for cloning of the per3 promoter is the primer sequence number for cloning of the per3 promoter
  • the base sequence described in 9 is a per3 promoter with a restriction enzyme site added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 10 for cloning the primer is added with a restriction enzyme site in the nucleotide sequence set forth in primer sequence No. 11 for cloning of the per3 promoter.
  • the nucleotide sequence described in primer SEQ ID NO: 12 for cloning of aox2 promoter is the nucleotide sequence described in primer SEQ ID NO: 13 for cloning of aox2 promoter to which a restriction enzyme site has been added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 14 for the primer is the primer sequence for cloning the fld1 promoter and the nucleotide sequence set forth in primer sequence No.
  • primer sequence 15 is the primer sequence for cloning the fld1 promoter to which a restriction enzyme site has been added.
  • Base described in number 16 The column shows the nucleotide sequence described in primer SEQ ID NO: 17 for cloning of fld1 promoter to which a restriction enzyme site is added, the nucleotide sequence described in primer SEQ ID NO: 18 for cloning of aox1 terminator is the aox1 terminator
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 19 for cloning of the primer is the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 20 for cloning the aox1 3 ′ non-coding region.
  • the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 21 is the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 22 for cloning of the ⁇ factor is the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 23 for cloning of the ⁇ factor.
  • Primer arrangement for cloning of human col1a1 The nucleotide sequence described in column number 24 is the primer sequence for cloning human col1a1, the nucleotide sequence described in primer sequence number 25 is the nucleotide sequence described in primer sequence number 26 for cloning human col1a2, is the human sequence
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 27 for cloning col1a2 is the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 28 for cloning of human col3a1 is set forth in primer SEQ ID NO: 29 for cloning human col3a1
  • the nucleotide sequence described in the primer sequence number 30 for cloning of the aox1 terminator to which the restriction enzyme site is added is the primer sequence number 31 for cloning of the aox1 terminator to which the restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence described in is linker 1 for constructing psn005
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 32 is linker 1 for constructing psn005
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 is the nucleotide sequence set forth in the primer sequence number 34 for constructing an expression vector containing a signal sequence of an ⁇ gene to which a restriction enzyme site has been added and a DNA encoding a pro sequence.
  • the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 35 for constructing an expression vector containing DNA encoding the signal sequence of the ⁇ gene to which the restriction enzyme site was added and the pro sequence is the p4hb sequence to which the restriction enzyme site was added.
  • the nucleotide sequence described in the primer sequence number 36 for cloning is the expression unit to which the restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 40 is linker 3 for constructing psn007.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 is a primer for cloning p4ha1 to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 42 is a primer for cloning p4ha1 to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 43 is a primer for cloning of an expression unit to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 44 is for cloning of arg4 to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 45 is for cloning arg4 to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 46 is for cloning the hsp47 gene to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in the primer SEQ ID NO: 47 is an hsp47 gene to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence described in the primer sequence number 48 for cloning of the child is added with the restriction enzyme site in the base sequence described in primer sequence number 49 for cloning of the zeor gene to which the restriction enzyme site was added.
  • nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 50 for cloning of the zeor gene was added with the restriction enzyme site added to the nucleotide sequence set forth in primer sequence No.51 for cloning of his4 to which the restriction enzyme site was added.
  • the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 52 for cloning his4 was the nucleotide sequence described in the primer SEQ ID NO: 53 for cloning the aox1 3 ′ non-coding region to which the restriction enzyme site was added, Primer for cloning the aox1 3 'noncoding region with restriction sites
  • Nucleotide sequence described in sequence ID NO: 54, Psn006 linker 3 for construction The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 55 is linker 3 for constructing psn006
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 56 is a primer for cloning an expression unit to which a restriction enzyme site is added.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 57 is for cloning an expression unit to which a restriction enzyme site is added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 58 is the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 59 for subcloning human col1a1 is the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 60 for subcloning human col1a1
  • the base sequence described in the primer sequence number 61 for subcloning human col1a2 is the base sequence described in the primer sequence number 62 for subcloning human col1a2 is the primer sequence number 63 for subcloning human col1a1
  • the nucleotide sequence described in is a sub-chromosome of human col1a1.
  • the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 64 for primer is described in primer sequence number 65 for subcloning human col1a1 and the nucleotide sequence set forth in primer sequence number 66 for subcloning human col1a1
  • the base sequence described in the primer sequence number 67 for subcloning human col1a1 is the base sequence described in the primer sequence number 68 for subcloning human col1a2 is the primer for the subcloning of human col1a2
  • the base sequence set forth in SEQ ID NO: 69 is the primer for subcloning human col1a2
  • the base sequence set forth in SEQ ID NO: 70 is the base sequence described in primer SEQ ID NO: 71 for subcloning human col1a2 is the human sequence Primer for subcloning of col1a2
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 72 is a primer for subcloning of human col3a1 with a restriction enzyme site added.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 73 is for subcloning of human col3a1 with a restriction enzyme site added.
  • the nucleotide sequence set forth in primer SEQ ID NO: 76 is a synthetic DNA of ORF in human FKBP23 having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 78 is a synthetic DNA of ORF in human FKBP19 having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 98 is a synthetic DNA of ORF in human collagen having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 100 is a synthetic DNA of ORF in human collagen Type I ⁇ 2 precursor having a yeast optimized codon.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 102 is a synthetic DNA of ORF in human collagen Type II ⁇ 1 precursor having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 104 is a synthetic DNA of ORF in human collagen Type III ⁇ 1 precursor having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 112 is a synthetic DNA of ORF in human FKBP13A having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 113 is a synthetic DNA of ORF in human FKBP63 having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 114 is a synthetic DNA of ORF in human FKBP65 having a yeast optimized codon
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 115 is a synthetic DNA for a zeocin (TM) resistance cassette

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Abstract

　下記（１）～（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする形質転換体等。 （１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量１万５千以上、６万以下であるＦＫ５０６タンパク質 （２）プロリン水酸化酵素 （３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質 ＜特性（Ａ）＞ グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaa の繰り返し配列を有する。 ＜特性（Ｂ）＞ グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaa の繰り返し配列にイミノ酸が含まれている。

Description

グリシン繰り返し配列タンパク質を産生する形質転換体
　本発明は、グリシン繰り返し配列タンパク質を産生する形質転換体、及び、グリシン繰り返し配列タンパク質の取得方法に関する。
　グリシン繰り返し配列を有する一群のタンパク質が生体内に存在し、生体の組織構造維持、細胞間接着、創傷治療等で重要な役割を果たしていることが知られている。これらの一群のタンパク質はイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）の含量が高いこと、また、特異的な３重螺旋構造を有することで特徴づけられており、コラーゲンと総称されている。
　コラーゲンは、皮膚、腱、軟骨、靭帯、血管及び骨等に代表される様々な生体組織中に含まれている。コラーゲンは引っ張り強度が高く、それ故に、コラーゲンが含まれる生体組織は、機械的なストレスに対して高い強度を有している。
　コラーゲンに代表される天然または人工のグリシン繰り返し配列タンパク質は、優れた物理的性質を有すると共に様々な生理活性を有していることから、医薬品、工業製品、化粧品又は食品の利用性が存在しており、商業的に価値のある多用途素材である。
　商業的に製造されているグリシン繰り返し配列タンパク質は、主に天然型のコラーゲンであり、動物の皮、腱、骨等から精製して生産されている。
　コラーゲンは、ほぼ全ての多細胞動物中に存在しており、高等動物では、体内に存在するタンパク質のうちの約３０％を占めている。高等動物では２０種類以上のコラーゲンが存在することが知られている。生体内における存在量が多いコラーゲンとしては、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを挙げることができる。ＴｙｐｅＩコラーゲンは、骨、腱、及び、皮膚中に含まれる主要な線維状コラーゲンであり、２つのα１（Ｉ）鎖と１つのα２（Ｉ）鎖とからなるヘテロトリマー分子である。ＴｙｐｅＩＩコラーゲンは、軟骨、硝子体に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子である。ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、皮膚及び血管に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子である。尚、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、例えば、非特許文献１、非特許文献４、及び、非特許文献５に記載された方法によって、生体組織から精製される。
　物理的性質、生理活性が向上したグリシン繰り返し配列タンパク質を製造する技術として、自然界に存在しない人工のグリシン繰り返し配列を有するタンパク質を製造する技術が開発されており、非特許文献１では化学合成されたペプチドを３重螺旋構造化したのち、化学的に重合させるグリシン繰り返し配列タンパク質の製造方法、特許文献２では化学合成されたペプチドの自己集合を利用して３重螺旋化したポリマーを製造する技術が開示されている。しかしながら、化学合成を用いる方法は原料が高価であり、また、多段階の工程を要するため、安価な原料を用いる、簡易な製造方法が求められていた。
　グリシン繰り返し配列タンパク質を安価な原料を用いて製造する技術として、遺伝子組換え細胞を用いる製造方法が開発されている。非特許文献６では、酵母細胞内でＴｙｐｅＩコラーゲン前駆体とプロリン水酸化酵素とを産生させて、プロリン残基が水酸化されたＴｙｐｅＩコラーゲンを製造している。一方、特許文献１では、酵母細胞内でＴｙｐｅＩコラーゲン前駆体又はＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン前駆体とプロリン水酸化酵素とを産生させて、プロリン残基が水酸化されたＴｙｐｅＩコラーゲン又はＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを製造している。また、特許文献３では自然界に存在しない人工のグリシン繰り返し配列タンパク質を、遺伝子組換え細胞を用いて製造する方法が開示されている。しかしながら、より効率的に高機能なグリシン繰り返し配列タンパク質を生産する方法が求められていた。
国際公開第９７／３８７１０号 特開２００５－２６３７８４号公報 米国特許第５７１０２５２号
谷原雅夫監修、コラーゲンの製造と応用展開、ISBN：978-4-7813-0071-3、シーエムシー出版 Volume Editors: Brinckmann, J., Notbohm, H., Muller, P.K. Collagen primer in Structure, Processing and Assembly, Topics in Current Chemistry Vol. 247, 2005 Gelse, K., Poschl, E., Aigner, T., Collagens－structure, function, and biosynthesis, Advanced Drug Delivery Reviews 55:1531-1546（2003） Miller et al.， Methods In Enzymology, 82:33-64（1982），アカデミックプレス（Academic Press） Byers et al.， Biochemistry 13:5243-5248（1974） P.David Toman et al., J. Biol. Chem., Vol.275, No.30, July28, p23303-23309（2000）
　医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなグリシン繰り返し配列タンパク質を、本来の物性が損なわれない（具体的には例えば、グリシン繰り返し配列タンパク質が有する親水性に係る物性の変化を低下させ、より親油性の高い、本来グリシン繰り返し配列タンパク質が有する性質に近い）状態で生産する形質転換体を見出し、見出された新規形質転換体を用いてグリシン繰り返し配列タンパク質を取得する方法等の開発が求められていた。
　本発明は、
１．下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）のいずれもが微生物細胞内に導入された形質転換体：
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が1万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす；
２．前項１記載の形質転換体であって、前記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）にコードされるタンパク質をいずれもその細胞内に産生する形質転換体；
３．前記ＦＫ５０６結合タンパク質が、ＦＫＢＰ２３又はＦＫＢＰ１９である前項１又は２記載の形質転換体；
４．前記ＦＫ５０６結合タンパク質が、ＦＫＢＰ２３である前項１又は２記載の形質転換体；
５．前記ＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されている前項１から４のいずれかに記載の形質転換体；
６．前項１から５のいずれかに記載の形質転換体であって、更にリジン水酸化酵素をその細胞内に産生する形質転換体；
７．前記リジン水酸化酵素が、リジルヒドロキシラーゼ１又はリジルヒドロキシラーゼ３から選択される少なくとも１種類のリジン水酸化酵素である前項６記載の形質転換体；
８．前項１から５のいずれかに記載の形質転換体であって、更にＨｓｐ４７をその細胞内に産生する形質転換体；
９．前記プロリン水酸化酵素が、プロリル－４－ヒドロキシラーゼである前項１から８のいずれかに記載の形質転換体；
１０．前記プロリン水酸化酵素が、プロリル－４－ヒドロキシラーゼのαサブユニット及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼのβサブユニットを含む酵素である前項１から８のいずれかに記載の形質転換体；
１１．前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼのβサブユニットのアミノ末端に酵母αファクターのプレプロ配列が融合されている前項１０記載の形質転換体；
１２．前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼのαサブユニットが、α１サブユニット、α２サブユニット又はα３サブユニットである前項１０または１１記載の形質転換体；
１３．前記プロリン水酸化酵素のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１つが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されている前項１から１２のいずれかに記載の形質転換体；
１４．前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質が、コラーゲンＴｙｐｅＩからＴｙｐｅＸＸＩＸの中から選択される少なくとも１種類のコラーゲンである前項１から１３のいずれかに記載の形質転換体；
１５．前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質が、コラーゲンＴｙｐｅＩ、コラーゲンＴｙｐｅＩＩ及びコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩの中から選択される少なくとも１種類のコラーゲンである前項１から１３のいずれかに記載の形質転換体；
１６．前記微生物細胞が、真核生物細胞である前項１から１５のいずれかに記載の形質転換体；
１７．前記真核生物細胞が、酵母細胞である前項１６記載の形質転換体；
１８．前記酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞である前項１７記載の形質転換体；
１９．前記メタノール資化性酵母細胞が、Komagataella pastorisである前項１８記載の形質転換体；
２０．前項１から１９のいずれかに記載の形質転換体が産生して得られうる前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質；
２１．微生物細胞内に、下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）を導入する第一工程、
　第一工程により得られる形質転換体を培養することによりグリシン繰り返し配列タンパク質を産生させる第二工程、並びに
　第二工程で産生されたグリシン繰り返し配列タンパク質を回収する第三工程、
を含むグリシン繰り返し配列タンパク質の製造方法：
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が1万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす；及び
２２．前項２１記載の製造方法により製造されたグリシン繰り返し配列タンパク質；
等を提供するものである。
　本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなグリシン繰り返し配列タンパク質を、本来の物性が損なわれない（具体的には例えば、グリシン繰り返し配列タンパク質が有する親水性に係る物性の変化を低下させ、より親油性の高い、本来グリシン繰り返し配列タンパク質が有する性質に近い）状態で生産する形質転換体、及び、当該形質転換体を用いてグリシン繰り返し配列タンパク質を製造する方法等が提供可能となる。
図１は、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図２は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図３は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図４は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図５は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図６は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図７は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。
図８は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図９は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩ発現カセット導入プラスミドの作製工程のフローチャートである。 図１０は、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１１は、ＦＫＢＰ発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１２は、ＦＫＢＰ発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１３は、ＦＫＢＰ発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１４は、ＦＫＢＰ発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１５は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩ発現カセット導入プラスミドの模式図である。
図１６は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１７は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１８は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ発現カセット導入プラスミドの模式図である。 図１９は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩ発現カセット導入プラスミドの模式図である。
　本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコール、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いられる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
　特に断りの無い限り、本明細書で用いられる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
　本発明形質転換体は、下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）のいずれもが微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする：
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が１万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
すなわち、本発明形質転換体は、上記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）で形質転換された微生物細胞である。
　ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は、免疫抑制剤ＦＫ５０６と複合体を形成するタンパク質から見出されたＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を有するタンパク質の総称である。本発明形質転換体の作製に用いられるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、分子量が１万５千以上６万以下のＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。さらに、前記ＦＫ５０６結合タンパク質としては、好ましくはＦＫＢＰ２３又はＦＫＢＰ１９、より好ましくはＦＫＢＰ２３を挙げることができる。また、前記ＦＫ５０６結合系タンパク質が由来する生物種としては、特に限定されないが、動物由来のＦＫ５０６結合タンパク質、好ましくは恒温動物由来のＦＫ５０６結合タンパク質、より好ましくは哺乳動物由来のＦＫ５０６結合タンパク質、さらに好ましくはヒト由来のＦＫ５０６結合タンパク質を挙げることができる。
　前記ＦＫ５０６結合タンパク質としては、具体的には例えば、配列番号７４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＦＫＢＰ２３、配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するヒトＦＫＢＰ１９、または、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたＦＫ５０６結合タンパク質を挙げることができる。また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するＦＫ５０６結合タンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＦＫＢＰ２３のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５４５５４６）、チンパンジーＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５１５９４２）、ウシＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８７１８５８）、ラットＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿２１５７５８）、マウスＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３４３５２）、もしくはニワトリＦＫＢＰ２３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿４２１９８１）等のアミノ酸配列を挙げることができ、また、ヒトＦＫＢＰ１９のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＦＫＢＰ１９（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８５１２０５）、チンパンジーＦＫＢＰ１９（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１５９８９１）、ウシＦＫＢＰ１９（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０３９３９７）、ラットＦＫＢＰ１９（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０１３１２３）もしくはマウスＦＫＢＰ１９（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０７７１３１）等のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子由来のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたＦＫ５０６結合タンパク質であってもよい。
　また、前記ＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、配列番号７６で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号７７で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号７８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号７９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、より好ましくは配列番号７６で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号７８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、または、これらのポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、さらに、これらのポリヌクレオチドの塩基配列と相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子のコーディングシークエンス（CDS）に由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。ヒトＦＫＢＰ２３のオーソログ遺伝子のCDSとしてはイヌＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５４５５４６）、チンパンジーＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５１５９４２）、ウシＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８６６７６５）、ラットＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿２１５７５８）、マウスＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１０２２２）、またはニワトリＦＫＢＰ２３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿４２１９８１）等を挙げることができる。ヒトＦＫＢＰ１９のオーソログ遺伝子のCDSとしてはイヌＦＫＢＰ１９CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８４６１１２）、チンパンジーＦＫＢＰ１９CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１５９８９１）、ウシＦＫＢＰ１９CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０４５９３２）、ラットＦＫＢＰ１９CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０１３１０５）、またはマウスＦＫＢＰ１９CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０２４１６９）等を挙げることができる。さらに、これらのCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加されてなるポリヌクレオチド、または、これらのCDSに由来する塩基配列の部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明形質転換体の作製に用いられるプロリン水酸化酵素をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、プロリル－４－ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。プロリル－４－ヒドロキシラーゼは、Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｙａａ繰り返し配列のＹａａ部位にあるプロリン残基の４位を水酸化し、４－ヒドロキシプロリンに変換する反応を触媒する酵素である。グリシン繰り返し配列タンパク質は特徴的な３重螺旋構造を形成する。Ｙａａ部位にあるプロリン残基を水酸化することにより、グリシン繰り返し配列タンパク質の３重螺旋構造の安定性が向上する。前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼの由来は特に限定されないが、動物由来のプロリル－４－ヒドロキシラーゼ、好ましくは高等動物由来のプロリル－４－ヒドロキシラーゼ、より好ましくはヒト由来のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを挙げることができる。
　前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼとしては、αサブユニット、及び、βサブユニットを含むプロリン水酸化酵素を挙げることができ、αサブユニットとして、例えば、α１サブユニット、α２サブユニット、またはα３サブユニットを挙げることができ、好ましくは、α１サブユニットを挙げることができる。
　具体的には、前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼαサブユニットとしては、例えば、配列番号８０で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル-4-ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）、配列番号８１で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル－４－ヒドロキシラーゼα２サブユニット（Ｐ４Ｈα２）、または配列番号８２で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル－４－ヒドロキシラーゼα３サブユニット（Ｐ４Ｈα３）を挙げることができ、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４Ｈβ）としては、例えば、配列番号８３で示されるアミノ酸配列を有するヒトＰ４Ｈβを挙げることができる。さらに、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質、また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＰ４Ｈα１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８６２２５７）、チンパンジーＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１４１０４３）、ウシＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０６９２３８）、ラットＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７４２０５９）、マウスＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３５１６０）、またはニワトリＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿４２１５８３）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈα２のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８６０６３７）、チンパンジーＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１６２２２２）、ウシＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０２９４６５）、ラットＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿３４０７９９）、マウスＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３５１６１）、またはニワトリＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００６１５５）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈα３のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８５１７１８）、チンパンジーＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１７４８９６）、ウシＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００１５９８）、ラットＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿９４２０７０）、マウスＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７９６１３５）、またはニワトリＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿４１７２４８）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈβのオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５４０４８８）、チンパンジーＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１６４３９６）、ウシＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７７６５６０）、ラットＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３７１３０）、マウスＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３５１６２）、またはニワトリＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿４２００９５）のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子由来のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたプロリル－４－ヒドロキシラーゼであってもよい。
　また、前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、ヒトＰ４Ｈα１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する配列番号８４で示されるポリヌクレオチド、ヒトＰ４Ｈα２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する配列番号８５で示されるポリヌクレオチド、ヒトＰ４Ｈα３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する配列番号８６で示されるポリヌクレオチド、またはヒトＰ４Ｈβのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する配列番号８７で示されるポリヌクレオチドを挙げることができ、より好ましくは、配列番号８４で示されるポリヌクレオチド、または配列番号８７で示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、さらに、これらのポリヌクレオチドの塩基配列と相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子のコーディングシークエンス(CDS)に由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。ヒトＰ４Ｈα１のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８５７１６４）、チンパンジーＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１４１０４３）、ウシＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０７５７７０）、ラットＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７２０６２）、マウスＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１１０３０）、またはニワトリＰ４ＨＡ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿４２１５８３）等を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈα２のオーソログ遺伝子に由来する塩基配列としては、イヌＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８５５５４４）、チンパンジーＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１６２２２２）、ウシＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０３４２９３）、ラットＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿３４０７９８）、マウスＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１１０３１）、またはニワトリＰ４ＨＡ２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００６１５５）等を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈα３のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８４６６２５）、チンパンジーＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１７４８９６）、ウシＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００１５９８）、ラットＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１９８７７５）、マウスＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７７１６１）、またはニワトリＰ４ＨＡ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿４１７２４８）等を挙げることができる。ヒトＰ４Ｈβのオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５４０４８８）、チンパンジーＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１６４３９６）、ウシＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７４１３５）、ラットＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１２９９８）、マウスＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１１０３２）、またはニワトリＰ４ＨＢCDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿４２００９５）等を挙げることができる。さらに、これらのCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基に欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明におけるグリシン繰り返し配列を有するタンパク質としては、下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質であれば特に限定はないが、例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲンからＴｙｐｅＸＸＩＸコラーゲンの中から選択される少なくとも１種類のコラーゲン等を挙げることができ、好ましくは、線維形成型コラーゲン（Fibril-forming collagen：ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＩコラーゲン、またはＴｙｐｅＸＸＩＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＶＩＩコラーゲン）を挙げることができ、より好ましくは、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、またはＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを挙げることができる。また、これらのコラーゲンの部分的な領域からなるグリシン繰り返し配列タンパク質等も挙げることができる。また、コラーゲンの由来は特に限定されないが、例えば、動物由来のコラーゲン、好ましくは高等動物由来のコラーゲン、さらに好ましくはヒト由来のコラーゲンを挙げることができる。
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　特性（Ａ）におけるGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列の繰り返し数としては、例えば、２５回以上３６２回以下を挙げることができる。また、特性（Ｂ）におけるGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列に含まれるイミノ酸の含有率としては、例えば、１９．８％以上３８．７％以下を挙げることができる。
　前記ＴｙｐｅＩコラーゲンとしては、具体的には例えば、配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩα１）及び配列番号８９で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩα２）を挙げることができ、前記ＴｙｐｅＩＩコラーゲンとしては、具体的には例えば、配列番号９０で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩＩα１コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩＩα１）を挙げることができ、前記ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンとしては、具体的には例えば、配列番号９１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩＩＩα１）を挙げることができる。さらに、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質を挙げることができ、また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＴｙｐｅＩα１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００３０９０）、チンパンジーＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１６９３２０）、ウシＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０２９２１１）、ラットＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿２１３４４０）、またはマウスＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３１７６８）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩα２のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００３１８７）、チンパンジーＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５１９２０７）、ウシＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７７６９４５）、ラットＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿４４５８０８）、またはマウスＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３１７６９）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩＩα１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００６９５２）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５０９０２６）、ラットＴｙｐｅＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３７０６１）、マウスＴｙｐｅＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿１１２４４０）、またはニワトリＴｙｐｅＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿９８９７５７）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８５１００９）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１６３６６５）、ウシＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０７０２９９）、ラットＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿１１４４７４）、マウスＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３４０６０）、またはニワトリＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿４２１８４７）のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子由来のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質であってもよい。
　酵母内で前記グリシン繰り返し配列タンパク質が発現され、当該酵母内に産生されたプロリン水酸化酵素が存在する場合には、当該酵素によって、グリシン繰り返し配列タンパク質中のプロリン残基が水酸化されたグリシン繰り返し配列タンパク質が産生される。グリシン繰り返し配列タンパク質中のプロリン残基の水酸化率は、公知のアミノ酸組成分析法により測定することができる。また、グリシン繰り返し配列タンパク質の線維形成能は、例えば、以下のような方法により測定することができる。具体的には例えば、精製したグリシン繰り返し配列タンパク質を、塩濃度１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ｐＨ７．３から７．４に再調整した後、３７℃に保温することにより、グリシン繰り返し配列タンパク質分子が再配向して溶液が白濁する。当該白濁現象をグリシン繰り返し配列タンパク質の線維形成能とみなすことができる。従って、当該性質を利用して、濃度０．０５％のグリシン繰り返し配列タンパク質溶液を、塩濃度１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ｐＨ７．３から７．４で３７℃に保温し、そのときの吸光度を経時的に測定することにより、線維形成能を測定することができる。
　また、前記コラーゲンの部分的な領域からなるグリシン繰り返し配列タンパク質としては、具体的には例えば、配列番号９２で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ６０Ｃ１５）前駆体、配列番号９３で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ６０－Ｃ１５）前駆体、配列番号９４で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７－Ｍ５２２－Ｃ１５）前駆体、配列番号９５で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７－Ｍ５２２－Ｃ１５）前駆体、配列番号９６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７－Ｍ５２２Ｘ２－Ｃ１５）前駆体、または、配列番号９７で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７－Ｍ５２２ｘ２－Ｃ１５）前駆体を挙げることができる。
　本発明形質転換体の作製に用いられるグリシン繰り返し配列タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、配列番号９８で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号９９で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１００で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０１で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０２で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０３で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０４で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号１０５で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、より好ましくは、配列番号９８で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１００で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０２で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号１０４で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、さらに、これらのポリヌクレオチドの塩基配列と相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子のコーディングシークエンス（CDS）に由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。
　ヒトＴｙｐｅＩα１のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＴｙｐｅＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００３０９０）、チンパンジーＴｙｐｅＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１６９３２０）、ウシＴｙｐｅＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０３４０３９）、ラットＴｙｐｅＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿２１３４４０）、または、マウスＴｙｐｅＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００７７４２）等を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩα２のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＴｙｐｅＩα２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００３１８７）、チンパンジーＴｙｐｅＩα２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５１９２０７）、ウシＴｙｐｅＩα２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７４５２０）、ラットＴｙｐｅＩα２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０５３３５６）、またはマウスＴｙｐｅＩα２CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００７７４３）等を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩＩα１のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＴｙｐｅＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００６９５１）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５０９０２６）、ラットＴｙｐｅＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１２９２９）、マウスＴｙｐｅＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０３１１６３）、またはニワトリＴｙｐｅＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿２０４４２６）等を挙げることができる。ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８４５９１６）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１６３６６５）、ウシＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０７６８３１）、ラットＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０３２０８５）、マウスＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００９９３０）、またはニワトリＴｙｐｅＩＩＩα１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿４２１８４７）等を挙げることができる。さらに、これらのCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　また、前記コラーゲンの部分的な領域からなるグリシン繰り返し配列タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、配列番号１０６で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ６０Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０７で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ６０－Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０８で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７－Ｍ５２２－Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０９で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７－Ｍ５２２－Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１１０で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７－Ｍ５２２Ｘ２－Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１１１で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７－Ｍ５２２ｘ２－Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
　前記の「本発明形質転換体」は、更に「リジン水酸化酵素」のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが追加的に導入されて得られるもの、即ち、下記（１）から（４）のすべてのタンパク質を産生する形質転換体であってもよい。
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が１万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質；
（２）プロリン水酸化酵素；
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質；並びに
（４）リジン水酸化酵素：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　このような形質転換体は、アミノ酸配列中のリジン残基が水酸化されたグリシン繰り返し配列タンパク質を効率よく産生する能力を有している。このような形質転換体は、線維形性能が高く、かつ、安定性の高いグリシン繰り返し配列タンパク質を産生することができる。具体的には例えば、上記（１）から（４）のすべてのタンパク質を産生する形質転換体では、Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｙａａ繰り返し配列のＹａａに位置する全リジン残基のうち２０％以上が水酸化されているグリシン繰り返し配列タンパク質を産生することができ、好ましくは全リジン残基のうち４０％以上が水酸化されているグリシン繰り返し配列タンパク質を産生することができる。
　リジン残基が水酸化されたグリシン繰り返し配列タンパク質は、線維形性能が高く、かつ、３重螺旋構造がより安定化されたグリシン繰り返し配列タンパク質であり、このため、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなグリシン繰り返し配列タンパク質ということができる。
　本発明における「リジン水酸化酵素」としては、例えば、リジルヒドロキシラーゼ１、またはリジルヒドロキシラーゼ３等を挙げることができる。
　また、「リジン水酸化酵素」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。
　リジルヒドロキシラーゼ１、及び、リジルヒドロキシラーゼ３は、ホモダイマーを形成する酵素であり、グリシン繰り返し配列タンパク質の螺旋構造部分に存在するＧｌｙ－Ｘａａ－Ｙａａ繰り返し配列のＹａａに位置するリジンのδ位を水酸化する。
　前記リジン水酸化酵素としては、具体的には例えば、配列番号１１６で示されるアミノ酸配列を有するヒトリジルヒドロキシラーゼ（ＬＨ１）、または配列番号１１８で示されるアミノ酸配列を有するヒトリジルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）を挙げることができる。さらに、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質を挙げることができ、また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＬＨ１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８６５４７０）、チンパンジーＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１４２９３７）、ウシＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７７６５７３）、ラットＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿４４６２７９）、マウスＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３５２５２）、またはニワトリＬＨ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１００５６１８）のアミノ酸配列を挙げることができる。ヒトＬＨ３のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＬＨ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８５８４１３）、チンパンジーＬＨ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１５３９７９）、ウシＬＨ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿８８７２５４）、ラットＬＨ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿８３５２０２）、またはマウスＬＨ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３６０９２）等のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子由来のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたリジン水酸化酵素であってもよい。
　本発明形質転換体の作製に用いることができる「リジン水酸化酵素」のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、リジルヒドロキシラーゼ１（ＬＨ１）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び、リジルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。前記リジルヒドロキシラーゼ１をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、配列番号１１７で示されるヒトＬＨ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１１９で示されるヒトＬＨ３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基に欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのポリヌクレオチドの部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、さらに、これらのポリヌクレオチドの塩基配列と相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子のコーディングシークエンス(CDS)に由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。ヒトＬＨ１のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８６０３７７）、チンパンジーＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１４２９３７）、ウシＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７４１４８）、ラットＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０５３８２７）、マウスＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１１１２２）、または、ニワトリＰＬＯＤ１CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１００５６１８）等を挙げることができる。ヒトＬＨ３のオーソログ遺伝子のCDSとしては、イヌＰＬＯＤ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８５３３２０）、チンパンジーＰＬＯＤ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１５３９７９）、ウシＰＬＯＤ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿８８２１６１）、ラットＰＬＯＤ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１７８１０１）、またはマウスＰＬＯＤ３CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１１９６２）等を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子のCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、これらのオーソログ遺伝子のCDSに由来する塩基配列の部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　尚、前記のリジン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、例えば、酵母由来のプロモーター、具体的には例えば、アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター等の下流に連結されていることが好ましい。
　前記の「本発明形質転換体」は、更に「Ｈｓｐ４７」のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが追加的に導入されて得られるもの、即ち、下記（１）から（３）、及び、（５）のすべてのタンパク質を産生する形質転換体であってもよい。
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が１万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質；
（２）プロリン水酸化酵素；
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質；並びに
（５）Ｈｓｐ４７：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する、及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　このような形質転換体は、中性糖含有量がより少ない中性糖修飾後タンパク質を効率よく製造する能力を有している。このような酵母は、中性糖由来のグリシン繰り返し配列タンパク質が有する親水性に係る物性の変化を低下させ、より親油性の高い、本来グリシン繰り返し配列タンパク質が有する性質に近いグリシン繰り返し配列タンパク質を産生することができる。このようなグリシン繰り返し配列タンパク質は、３重螺旋構造がより安定化されたグリシン繰り返し配列タンパク質であり、このため、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなグリシン繰り返し配列タンパク質ということができる。
　「Ｈｓｐ４７」はヒートショックプロテイン４７（Heat shock protein 47）と一般的に呼ばれている、小胞体内腔に局在するストレス応答タンパク質である。
　本発明における「Ｈｓｐ４７」としては、その由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。具体的には例えば、配列番号１２０で示されるアミノ酸配列を有するヒトＨｓｐ４７を挙げることができる。また、これらのアミノ酸配列にアミノ酸配列の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質を挙げることができ、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＨｓｐ４７のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿５４２３０５）、チンパンジーＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＰ＿００１１７４９７９）、ウシＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１０３９５２８）、ラットＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０５８８６９）、マウスＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３３９５５）、またはニワトリＨｓｐ４７（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿９９０６２２）等のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子由来のアミノ酸配列にアミノ酸配列の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質であってもよい。
　本発明形質転換体の作製に用いることができる「Ｈｓｐ４７」のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には例えば、配列番号１２１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。また、このポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなるポリヌクレオチドであってもよく、また、Ｈｓｐ４７のアミノ酸配列に欠失、置換又は付加がなされたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。また、これらのポリヌクレオチドと相同性を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログ遺伝子のコーディングシークエンス(CDS)に由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。ヒトＨｓｐ４７のオーソログ遺伝子のCDSとしてはイヌＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿５４２３０５）、チンパンジーＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１１７４９７９）、ウシＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０４６０６３）、ラットＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１７１７３）、マウスＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００９８２５）、またはニワトリＨｓｐ４７CDS（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿２０５２９１）等を挙げることができる。さらに、これらのオーソログ遺伝子のCDSに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、またはこれらのオーソログ遺伝子のCDSに由来する塩基配列の部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　尚、前記のＨｓｐ４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、例えば、酵母由来のプロモーター、具体的には例えば、アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター等の下流に連結されていることが好ましい。
　本発明形質転換体は、下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）を、宿主細胞に導入することにより作製することができる。前記ポリヌクレオチドはｃＤＮＡのクローニング、化学合成オリゴヌクレオチドを用いたアッセンブリＰＣＲ、または遺伝子工学的な手法により作製することができる。また、市販のｃＤＮＡ等のクローンを入手して用いることもできる。
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が１万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（２）プロリン水酸化酵素をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　前記ポリヌクレオチドを、例えば、細胞内で前記ポリヌクレオチドを効率的に発現させる機能を有するプロモーター、ターミネーター、またはシグナル配列をコードするポリヌクレオチド等と連結して発現カセットとし、構築した発現カセットを宿主細胞に導入することにより前記ポリヌクレオチドを効率的に発現する形質転換体を作製することができる。
　前記発現カセットは、通常の遺伝子工学的手法を用いて、前記ポリヌクレオチドをプロモーターの下流、ターミネーターの上流に連結し、必要に応じてアミノ末端のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを置き換えることにより構築することができる。
　前記発現カセットの構築に利用される宿主・ベクター系としては、特に限定されないが、例えば、宿主としては、細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属、Pseudomonas属）、ベクターとしてバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドを用いる宿主・ベクター系、又は、宿主としては、酵母（例えば、Saccharomyces属）、ベクターとしては、エピソーム性プラスミド、ＡＲＳ－ＣＥＮ型プラスミドを用いる宿主・ベクター系等を挙げることができ、好ましくは、宿主としては、Eschericha属、ベクターとしては、プラスミドを挙げることができる。
　前記プロモーターとしては、本発明形質転換体の作製に用いられる宿主の細胞内で機能するプロモーターであれば特に限定はないが、特定の栄養源、基質によりその転写活性が誘導される誘導型プロモーターを好適に用いることができる。
　前記プロモーターとしては、具体的には例えば、ガラクトース代謝酵素遺伝子（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）、抑制性酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセリンアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤ）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＭＯＸ、ＡＯＤ１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＤＨ１、ＦＭＤ１）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ）、ペルオキシソーム膜タンパク質合成遺伝子（ＰＥＲ３）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ１）等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。また、前記ターミネーターとしては、本発明形質転換体を作製するために用いられる宿主の細胞内で機能するターミネーターであれば有効に利用できるが、例えば、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）のターミネーターを挙げることができる。また、前記シグナル配列としては、例えば、酵母αファクターのプレプロ配列、酵母インベルターゼのシグナル配列、酵母酸性フォスファターゼのシグナル配列等を挙げることができる。
　本発明形質転換体は、前記ポリヌクレオチドを有するプラスミドを用いて宿主の細胞を形質転換することで調製できる。発現カセットとなった前記ポリヌクレオチドを有するプラスミドを用いることで、前記ポリヌクレオチドを効率的に発現する形質転換体を作製することができる。
　本発明形質転換体の作製に用いられる宿主・ベクター系としては、例えば、宿主としては、細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属、Pseudomonas属）、ベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド又はコスミドを用いる宿主・ベクター系、宿主としては、酵母（例えば、Saccharomyces属）、ベクターとしては、エピソーム性プラスミド、ＡＲＳ－ＣＥＮ型プラスミドを用いる宿主・ベクター系、宿主としては、酵母（例えば、Komagataella属、Saccharomyces属、Hansenula属、Pichia属、Candida属、Ogataea属）、ベクターとしては、染色体組み込み型プラスミドを用いる宿主・ベクター系、宿主としては、糸状菌（Aspergillus属、Trichoderma属）、ベクターとしては、染色体組み込み型プラスミドを用いる宿主・ベクター系を挙げることができ、好ましくは、宿主としては、真核微生物（酵母、糸状菌）を挙げることができる。
　さらに、本発明形質転換体の作製に用いられる宿主としては、より好ましくは、酵母を挙げることができ、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を挙げることができる。サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とする場合には、ベクターとしては、染色体組み込み型プラスミド（ＹＩｐ型）、酵母内在性プラスミド２μｍ ＤＮＡ複製開始領域を有するプラスミド（ＹＥｐ型）、及び、染色体由来の自己複製領域を有するプラスミド（ＹＣｐ型）を挙げることができ、これらのプラスミドに大腸菌で複製可能な複製起点が組み込まれてシャトルベクターとなったプラスミドを用いることで、前記ポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドを容易に構築することができる。また、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を宿主とする場合には、ベクターとしては、染色体組み込み型プラスミドを挙げることができ、大腸菌で複製可能な複製起点が組み込まれてシャトルベクターとなったプラスミドを用いることで前記ポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドを容易に構築することができる。さらに好ましくは、メタノール資化性酵母であるコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を宿主として、染色体組み込み型プラスミドをベクターとして挙げることができる。具体的には、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）を宿主として好適に用いることができ、ベクターとしては、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ等の市販のプラスミド、また、ベクターの構成要素である相同的組換え領域、マーカー、プロモーター、ターミネーター等を組み込んで作製したプラスミドを好適に用いることができる。
　染色体組み込み型のプラスミドは、プラスミド上に宿主の染色体の塩基配列と相同な塩基配列を有する相同的組換え領域を有しており、この領域で宿主の染色体上に組み込まれるため、宿主の細胞内で安定的に保持される。相同的組換え領域としては、特に限定されないが、例えば、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子、ribosome ＤＮＡ、Ｔｙ因子（Transposon of Yeast element）等を挙げることができる。また、マーカーとしては、宿主の細胞内に導入されることにより形質の変化を引き起こす遺伝子を挙げることができ、例えば、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等を挙げることができる。具体的には、前記アミノ酸合成系遺伝子としては、例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＴＲＰ１、前記核酸合成系遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２等を挙げることができる。また、抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ゼオシン、ブラストサイジンＳ、ジェネティシン、Ｇ４１８、クロラムフェニコール、ブレオマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を挙げることができる。また、前記アミノ酸合成系遺伝子、前記核酸合成系遺伝子は、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子等が欠損している宿主と組み合わせて宿主の欠損変異を補完することにより、形質転換体を選抜するマーカーとして使用することができる。また、染色体組み込み型のプラスミドが宿主の染色体に組み込まれた形質転換体を選抜するための目印としてマーカーを用いることができる。
　前記ポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドを宿主の細胞内に導入する方法としては、特に限定はないが、宿主として細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属、Pseudomonas属）を用いる場合には、例えば、塩化カルシウム法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。宿主として酵母（例えば、Komagataella属、Saccharomyces属、Hansenula属、Candida属、Ogataea属）を用いる場合には、例えば、リチウム法、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。宿主として糸状菌（Aspergillus属、Trichoderma属）を用いる場合には、プロトプラスト－ＰＥＧ法、プロトプラスト－エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
　本発明形質転換体は、下記（１）、（２）及び（３）の全てのタンパク質をその細胞内で産生することで特徴づけられる。
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が１万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質；
（２）プロリン水酸化酵素；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　本発明形質転換体を、通常の微生物学的手法に従って培養することにより上記（１）から（３）の全てのタンパク質を産生させることができる。本発明形質転換体の培養に用いられる培地は、当該技術分野で既知の培地を用いることができ、培養は通常の微生物学的手法に準じた方法により実施できる。
　前記培地としては、特に限定されず、合成培地及び天然培地のいずれの培地でも用いることができるが、例えば、前記合成培地として、炭素源（例えば、各種糖類、グリセロール、メタノール）、窒素源（例えば、尿素、アンモニア水、アンモニウム塩又は硝酸塩）の他、無機塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｂ、Ｚｎ、Ｉ又はＣｕ等の無機塩）、微量栄養素（例えば、各種ビタミン、各種アミノ酸、又はヌクレオチド）等を含有するものを挙げることができる。また、前記天然培地としては、培地成分として、前記合成培地の成分に加えて、例えば、イーストエキストラクト、ペプトン、カゼイン等を含有する培地を挙げることができる。さらに、本発明形質転換体の作製に用いた前記発現カセットに誘導型プロモーターが用いられている場合には、誘導型プロモーターを活性化する栄養源、基質等（例えば、ガラクトース、ラクトース、シュクロース、メタノール、ＩＰＴＧ等）を培地に添加することによりプロモーターを活性化することができる。
　本発明形質転換体がメタノール資化性酵母である場合には、メタノール含有培地を用いることで効率的に上記（１）、（２）及び（３）の全てのタンパク質を発現させることができる。具体的には、ＭＭ培地（１．３４％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ、４ｘ１０－５％ビオチン、０．５％メタノール）、ＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ、４ｘ１０－５％ビオチン、０．５％メタノール）、ＢａｓａｌＳａｌｔ培地（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＩＳＢＮ：０－８９６０３－４２１－６　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）、ＦＭ２２培地（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＩＳＢＮ：０－８９６０３－４２１－６　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）等を挙げることができる。培地のｐＨは、中性若しくは弱塩基性、又は、弱酸性、具体的にはｐＨ３ないしは８に調製した培地を用いることができ、より好ましくはｐＨ４ないしは７に調製した培地を用いることができる。
　培養形式は液体培養が好ましく、培養温度は１５℃ないしは４０℃であることが好ましい。培養時間は１時間ないしは１０００時間であることが好ましく、また、培養は振盪、又は、攪拌条件下で実施することが好ましく、空気、酸素の通気下において実施することができる。また、培養操作法としては回分培養法、半回分培養法又は連続培養法により実施することが好ましく、また、培養期間中に、必要に応じて、高濃度の培地成分を流加することができる。
　尚、必要に応じて、前記培養（本培養）に先立って前培養を行うことができる。前培養用の培地としては、特に限定されないが、例えば、ＹＮＢ培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ、４ｘ１０－５％ビオチン、２％グルコース）、ＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）、ＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ、４ｘ１０－５％ビオチン、１％メタノール）等を挙げることができる。前培養の培養条件は特に限定されないが、培養時間は１０時間ないしは１００時間、培養温度は１５℃ないしは４０℃であることが好ましい。前培養は振盪、又は、攪拌条件下で実施することが好ましく、空気、酸素の通気下において実施することができる。また、培養操作法としては回分培養法が好ましい。
　上記（１）、（２）及び（３）の全てのタンパク質の発現は、通常の生化学的手法及びタンパク質工学な手法により検出することができ、例えば、イムノアッセイによる方法を挙げることができる。具体的には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び、イムノビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング等を挙げることができ、好ましくは、ウェスタンブロッティングを挙げることができる。
　本発明は、本発明形質転換体が産生して得られうることを特徴とするグリシン繰り返し配列タンパク質（本発明タンパク質）を含む。本発明形質転換体を用いることにより中性糖含量が少ない、グリシン繰り返し配列タンパク質が得られうる。また、本発明タンパク質は医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある（具体的には例えば、中性糖由来のグリシン繰り返し配列タンパク質が有する親水性に係る物性の変化を低下させ、より親油性の高い、本来グリシン繰り返し配列タンパク質が有する性質に近い）高性能な多用途素材である。
　グリシン繰り返し配列タンパク質に含まれる、中性糖の定量は、通常の生化学的な手法により行うことができる。具体的には、フェノール硫酸法、液体クロマトグラフィーによる単糖組成分析等を行うことで中性糖を定量することができる。
　また、グリシン繰り返し配列タンパク質の線維形成能は、例えば、以下のような方法により測定することができる。具体的には例えば、精製したグリシン繰り返し配列タンパク質を、塩濃度１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ｐＨ７．３ないしは７．４に再調整した後、３７℃に保温することにより、グリシン繰り返し配列タンパク質分子が再配向して溶液が白濁する。当該白濁現象をグリシン繰り返し配列タンパク質の線維形成能とみなすことができる。従って、当該性質を利用して、濃度０．０５％のグリシン繰り返し配列タンパク質溶液を、塩濃度１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ｐＨ７．３ないしは７．４で３７℃に保温し、そのときの吸光度を経時的に測定することにより、線維形成能を測定することができる。
　本発明は、微生物細胞内に、下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）のいずれもを導入する第一工程、
　第一工程により得られる形質転換体を培養することによりグリシン繰り返し配列タンパク質を産生させる第二工程、及び
　第二工程で産生されたグリシン繰り返し配列タンパク質を回収する第三工程、
を含むことを特徴とするグリシン繰り返し配列タンパク質の取得方法（本発明取得方法）を含む：
（１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が1万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
（３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
＜特性（Ａ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
＜特性（Ｂ）＞
グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）が含まれている：
ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
　第一工程は前記本発明形質転換体について記載した方法で実施することができる。第二工程は前記本発明形質転換体を用いて上記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）にコードされるタンパク質を産生させる方法と同様の方法で実施することができる。
　第三工程は、通常の生化学的手法に従って実施することができる。具体的には、第二工程で産生されたグリシン繰り返し配列タンパク質を、菌体、培養液上清から精製することで実施することができる。
　前記精製を実施する方法としては、特に限定されないが、例えば、破砕・可溶化する工程と、分画・純化する工程を組み合わせることで実施することができる。具体的には、破砕・可溶化する工程には、例えば、超音波、ガラスビーズなどで物理的に破砕する方法、酵素、酸、アルカリ、界面活性剤等を用いて可溶化する方法、有機溶媒、バッファー等による溶媒抽出法等を挙げることができる。また、分画・純化する工程には、例えば、塩析、溶媒沈殿、等電点沈殿等による沈殿形成法、イオン交換、ゲル濾過、疎水相互作用、アフィニティ等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過、凍結乾燥、結晶化、透析等の方法を挙げることができる。より具体的には、例えば、下記の（ａ）から（ｅ）の工程を有する方法を挙げることができる。
（ａ）ガラスビーズを用いて菌体を破砕する工程、
（ｂ）得られた破砕液にタンパク質分解酵素を添加してタンパク質を分解する工程、
（ｃ）分解された破砕液を遠心分離することにより、上清を回収する工程、
（ｄ）回収された上清を種々のｐＨ条件下で塩析して純化する工程、および
（ｅ）塩析により回収された沈殿を溶解して脱塩・除粒子する工程。
　本発明取得方法により取得されたグリシン繰り返し配列タンパク質は、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な（具体的には例えば、中性糖由来のグリシン繰り返し配列タンパク質が有する親水性に係る物性の変化を低下させ、より親油性の高い、本来グリシン繰り返し配列タンパク質が有する性質に近い）多用途素材である。このようなグリシン繰り返し配列タンパク質は、例えば、免疫学上での低抗原性誘導という潜在的な可能性からも好まれるであろう。
　以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　遺伝子のクローニング、プラスミドの構築の方法は「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN O-471-50338-X等に記載されている方法を参考として引用できる。以下に、クローニング等の工程の詳細を説明する。
実施例１　（クローニング）
（１－１）　ヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのクローニング（pHIS4-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド１及び２を合成した。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より市販のコマガタエラ　パストリス（Komagataella pastoris）　NRRL Y-11430（ATCC76273）を購入した。下記オリゴヌクレオチド１及び２をプライマーとし、ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（HIS4）をコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１：GATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA（配列番号１）
(b)オリゴヌクレオチド２：TAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACG（配列番号２）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）　５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）　０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水　４０．５μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約２．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．６ｋｂのDNAをpCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitorgen）を形質転換した。尚、プラスミドへのクローニングにはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHIS4をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pHIS4-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pHIS4-TOPOを得た。
（１－２）　アルギノスクシネートリアーゼをコードするＤＮＡのクローニング（pARG4-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド３及び４を合成した。下記オリゴヌクレオチド３及び４をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アルギノスクシネートリアーゼ（ARG4）をコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド３：ACGAAAATATGGTACCTGCCCTCAC（配列番号３）
(b)オリゴヌクレオチド４：GTTCTATCTACCCGAGGAAACCGATACATA（配列番号４）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）　５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）　０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水　４０．５μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約２．２ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．２ｋｂのDNAをpCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からARG4をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pARG4-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pARG4-TOPOを得た。
（１－３）　アルコールデヒドロゲナーゼ１プロモーターのクローニング（pAOX1Pro+15aa-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド５及び６を合成した。下記オリゴヌクレオチド５及び６をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アルコールデヒドロゲナーゼ１（AOX1）のプロモーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド５：AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTT（配列番号５）
(b)オリゴヌクレオチド６：ATCCACCACCTAGAACTAGGATATCAAAC（配列番号６）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）　５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）　０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水　４０．５μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６２℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．０ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning（Invitrogen）キットを用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pAOX1Pro+15aa-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pAOX1Pro+15aa-TOPOを得た。
（１－４）　ペルオキシソームマトリクスタンパク質プロモーターのクローニング（pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406Ｉ(+)の構築）
　下記オリゴヌクレオチド７及び８を合成した。下記オリゴヌクレオチド７及び８をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ペルオキシソームマトリクスタンパク質（PER3）のプロモーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド７：CTAAGGGTCTCACTGGTGTTTCAGC（配列番号７）
(b)オリゴヌクレオチド８：AGTTCCTTGCAACTGTAGTGGTCG（配列番号８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて70秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを３０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて70秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．１ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Zero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からPER3プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pCR-BII-PER3 Pro(+)と記すこともある。）を精製することにより、pCR-BII-PER3 Pro(+)を得た。
　下記オリゴヌクレオチド９及び１０を合成した。下記オリゴヌクレオチド９及び１０をプライマーとし、ｐCR-BII-PER3 Pro(+)プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、PER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド９：AACCGCGGCTCGTCACTATCGTCGTTG（配列番号９）
(b)オリゴヌクレオチド１０：CGAACGTTACCTGAAGATAGGTAAAAAAAAATTGC（配列番号１０）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミドＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを５回行い、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．０ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からPER3プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I(+)と記すこともある。）を精製することにより、pCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I(+)を得た。
（１－５）　アルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターのクローニング（pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I(-)の構築）
　下記オリゴヌクレオチド１１及び１２を合成した。下記オリゴヌクレオチド１１及び１２をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アルコールデヒドロゲナーゼ２（AOX2）のプロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１１：AACCGCGGCTAGTAGAACTTTGACATCTGCTA（配列番号１１）
(b)オリゴヌクレオチド１２：CGAACGTTTTGATTTGTTTGTGGGGATTTAG（配列番号１２）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて７０秒間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて７０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを３０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて７０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．１ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX2プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I(-)と記すこともある。）を精製することにより、pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I(-)を得た。
（１－６）　ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーターのクローニング（pCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I(-)の構築）
　下記オリゴヌクレオチド１３及び１４を合成した。下記オリゴヌクレオチド１３及び１４をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FLD1）のプロモーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１３：GCAGTGTTGGCTAACGTCTATTCG（配列番号１３）
(b)オリゴヌクレオチド１４：ACTTCATGGGCTCTTGGAGGAAG（配列番号１４）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて70秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを３０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて70秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．３ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．３ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Zero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFLD1プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pCR-BII-FLD1 Pro(+)と記すこともある。）を精製することにより、pCR-BII-FLD1 Pro(+)を得た。
　下記オリゴヌクレオチド１５及び１６を合成した。下記オリゴヌクレオチド１５及び１６をプライマーとし、pCR-BII-FLD1 Pro(+)プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、FLD１プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド１５：AACCGCGGCCTGAATACCGTAACATAGTGAC（配列番号１５）
(b)オリゴヌクレオチド１６：CGAACGTTTCAAGAATTGTATGAACAAGCAAAG（配列番号１６）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミドＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを５回行い、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．９ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．９ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFLD1プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、pCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I(-)と記すこともある。）を精製することにより、pCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I(-)を得た。
（１－７）　アルコールデヒドロゲナーゼ１ターミネーターのクローニング（pAOX1 term-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド１７及び１８を合成した。下記オリゴヌクレオチド１７及び１８をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アルコールデヒドロゲナーゼ１（AOX1）のターミネーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１７：CCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTC（配列番号１７）
(b)オリゴヌクレオチド１８：GCACAAACGAACGTCTCACTTAAT（配列番号１８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）　５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）　０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水　４０．５μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．３ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Cometent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1ターミネーターが挿入されたプラスミド（以下、pAOX1 term-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pAOX1 term-TOPOを得た。
（１－８）　アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子の３’側下流ノンコーディング領域のクローニング（pAOX1-3’-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド１９及び２０を合成した。下記オリゴヌクレオチド１９及び２０をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１－１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アルコールデヒドロゲナーゼ１（AOX1）遺伝子の３’側下流ノンコーディング領域を増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１９：TCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAAT（配列番号１９）
(b)オリゴヌクレオチド２０：GATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAAATC（配列番号２０）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）　５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）　０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水　４０．５μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、５８℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．８ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．８ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１　３’側下流ノンコーディング領域が挿入されたプラスミド（以下、pAOX1-3’-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pAOX1-3’-TOPOを得た。
（１－９）　αファクターをコードするＤＮＡのクローニング（pαfactor-TOPOの構築）
　下記オリゴヌクレオチド２１及びオリゴヌクレオチド２２を合成した。製品評価技術基盤機構（NITE）より市販のサッカロマイセス　セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）　S288C（NBRC1136）を購入した。下記オリゴヌクレオチド２１及び２２をプライマーとし、NBRC1136のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、αファクターをコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド２１：TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA（配列番号２１）
(b)オリゴヌクレオチド２２：GTACGAGCTAAAAGTACAGTGGGAACAAA（配列番号２２）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．６ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Cometent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pαfactor-TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pαfactor-TOPOを得た。
（１－１０）　ヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡのクローニング（pBlue-HsCOL１A１の構築）
　下記オリゴヌクレオチド２３及び２４を合成した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いてオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加した後、下記オリゴヌクレオチド２３及び２４をプライマーとし、Human brain cDNA（東洋紡）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２３：CAGCCACAAAGAGTCTACATGTCTAGG（配列番号２３）
(b)オリゴヌクレオチド２４：AGGTTGGGATGGAGGGAGTT（配列番号２４）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液　５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　２９μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて２０秒間の変性反応、５８℃にて１０秒間のアニーリング反応、及び、７４℃にて５分間の伸長反応からなる反応サイクルを３５回行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約４．５ｋｂのＤＮＡをMagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
　pBluescriptII KS(+)プラスミド（Stratagene）を制限酵素EcoRVにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
　前記約４．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pBlue-HsCOL1A1と記すこともある。）を精製することによりpBlue-HsCOL1A1を得た。
（１－１１）　ヒトコラーゲンTypeIα2をコードするＤＮＡのクローニング（pUC18-HsCOL1A2の構築）
　Human Neonatal Dermal Fibroblasts由来のTotal　RNAをCell Applications, Incより入手した。ReverTra Plus（東洋紡）を用いcDNAを合成した。下記オリゴヌクレオチド２５及び２６を合成した。下記オリゴヌクレオチド２５及び２６をプライマーとし、前記cDNAを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα2をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２５：GCCAAGCTTGCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGAC（配列番号２５）
(b)オリゴヌクレオチド２６：CGGTACCCGGGGATCCTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTCC（配列番号２６）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液　５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　２９μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９4℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１０秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなる反応サイクルを３０回行った。増幅された約４．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いてゲルから抽出・精製した。得られたDNAを制限酵素SphI及びBamHIで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
　pUC18プラスミド（東洋紡）を制限酵素SphI及びBamHIで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
　前記約４．１ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pUC18-HsCOL1A2と記すこともある。）を精製することによりpUC18-HsCOL1A2を得た。
（１－１２）　ヒトコラーゲンTypeIIIα1をコードするＤＮＡのクローニング（pUC19-HsCOL3A1の構築）
　下記オリゴヌクレオチド２７及び２８を合成した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いてオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加した後、下記オリゴヌクレオチド２７及び２８をプライマーとし、Human brain cDNA（東洋紡）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIIIα1をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７：GGCTGAGTTTTATGACGGGC（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８：GACAAGATTAGAACAAGAGG（配列番号２８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液　５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　２９μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて２０秒間の変性反応、５８℃にて１０秒間のアニーリング反応、及び、７４℃にて５分間の伸長反応からなる反応サイクルを３５回行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約４．６ｋｂのＤＮＡをMagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
　pUC19プラスミド（東洋紡）を制限酵素SmaIにて切断しMagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した後、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化し、再度、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
前記約４．６ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、当該プラスミドをpUC19-HsCOL3A1と記すこともある。）を精製することにより、pUC19-HsCOL3A1を得た。
（１－１３）　ゼオシン耐性カセットの作製及びクローニング（pUC57-ZeoRの構築）
　配列番号１１２で示したゼオシン耐性カセットを、アッセンブリPCR法で作製した。作製したDNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-ZeoRと記す。
（１－１４）　約１３ｋＤａのFK506結合タンパク質をコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YFKBP13Aの構築）
　配列番号１１３で示した約１３ｋＤａのFK506結合タンパク質（FKBP13A）をコードするDNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YFKBP13Aと記す。
（１－１５）　約１９ｋＤａのFK506結合タンパク質をコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YFKBP19の構築）
　配列番号７８で示した約１９ｋＤａのFK506結合タンパク質（FKBP19）をコードするDNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YFKBP19と記す。
（１－１６）　約２３ｋＤａのFK506結合タンパク質をコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YFKBP23の構築）
　配列番号７６で示した約２３ｋＤａのFK506結合タンパク質（FKBP23）をコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YFKBP23と記す。
（１－１７）　約６３ｋＤａのFK506結合タンパク質をコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YFKBP63の構築）
　配列番号１１４で示した約６３ｋＤａのFK506結合タンパク質（FKBP63）をコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YFKBP63と記す。
（１－１８）　約６５ｋＤａのFK506結合タンパク質をコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YFKBP65の構築）
　配列番号１１５で示した約６５ｋＤａのFK506結合タンパク質（FKBP65）をコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YFKBP65と記す。
（１－１９）　ヒトTypeIα1コラーゲンをコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YHsCOL1A1の構築）
　配列番号９８で示したヒトTypeIα1コラーゲンをコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YHsCOL1A1と記す。
（１－２０）　ヒトTypeIα2コラーゲンをコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YHsCOL1A2の構築）
　配列番号１００で示したヒトTypeIα2コラーゲンをコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YHsCOL1A2と記す。
（１－２１）　ヒトTypeIIα1コラーゲンをコードする合成DNAの作製及びクローニング（pUC57-YHsCOL2A1の構築）
　配列番号１０２で示したヒトTypeIIα1コラーゲンをコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpUC57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをpUC57-YHsCOL2A1と記す。
実施例２　（発現カセット導入プラスミドの構築）
（２－１）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）発現カセット、及び、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４Ｈβ）発現カセット導入プラスミド（pEXP-A-P4HBsig(-)A1rev）の作製
（２－１－１）　pSN003の構築
　下記オリゴヌクレオチド２９及び３０を合成した。下記オリゴヌクレオチド２９及び３０をプライマーとし、ｐAOX1Term－TOPO（実施例（１－７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、AOX１ターミネーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２９：TCGACTAGTTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAA（配列番号２９）
(b)オリゴヌクレオチド３０：AACTGCAGGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号３０）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミドＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素SpeI及びPstIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pBluescriptII SK(+)プラスミド（Stratagene）を制限酵素SpeI及びPstIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．３ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1ターミネーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pSN003と記すこともある。）を精製することにより、pSN003を得た。
（２－１－２）　pSN004の構築
　pAOX1Pro+15aa-TOPO（実施例（１－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、AOX1プロモーターを含む約１．０ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN003（実施例（２－１－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化したのち、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約１．０ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーターを含む約１．０ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pSN004と記すこともある。）を精製することにより、pSN004を得た。
（２－１－３）　pSN005の構築
　オリゴヌクレオチド３１及び３２を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド３１：TATTCGAAACGCATATGTGACCGGCAGACTAGTGG（配列番号３１）
(b)オリゴヌクレオチド３２：CCACTAGTCTGCCGGTCACATATGGGTTTCGAATA（配列番号３２）
　下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド３１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド３２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ）　１０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２　　　（１００ｍＭ）　１０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）　１０μｌ
(f)滅菌蒸留水　６０μｌ
　前記オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー１）を精製した。
　また、pSN004（実施例（２－１－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．３ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
　前記ＤＮＡ（リンカー１）及び約４．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー１）が挿入されたプラスミド（以下、pSN005と記すこともある。）を精製することにより、pSN005を得た。
（２－１－４）　pSN015の構築
　下記オリゴヌクレオチド３３及び３４を合成した。下記オリゴヌクレオチド３３及び３４をプライマーとし、pαfactor-TOPO（実施例（１－９）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、αファクター遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：GGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TCGACTAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC（配列番号３４）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN005（実施例（２－１－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクター遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN015と記すこともある。）を精製することにより、pSN015を得た。
（２－１－５）　pSN020の構築
　ヒトプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（P4Hβ）のｃＤＮＡクローン(Clone ID:3848651)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド３５及び３６を合成した。下記オリゴヌクレオチド３５及び３６をプライマーとし、P4HβのｃＤＮＡクローンを鋳型としてPCRを行うことにより、シグナル配列のないＰ４ＨβをコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３５：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３５）
(b)オリゴヌクレオチド３６：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG（配列番号３６）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．５ｋbのＤＮＡを制限酵素SpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN015（実施例（２－１－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素SpeIにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約１．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からシグナル配列のないP4HβをコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN020と記すこともある。）を精製することにより、pSN020を得た。
（２－１－６）　pP4Hbsig(-)rev-TOPOの構築
　下記オリゴヌクレオチド３７及び３８を合成した。下記オリゴヌクレオチド３７及び３８をプライマーとし、pSN020と命名されたプラスミド（実施例（２－１－５）参照）を鋳型としてPCRを行うことにより、αファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３７：AACCGCGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号３７）
(b)オリゴヌクレオチド３８：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて３．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約３．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約３．０ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pP4HBsig(-)rev－TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pP4HBsig(-)rev－TOPOを得た。
（２－１－７）　pSN007の構築
　オリゴヌクレオチド３９及び４０を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド３９：TATTCGAAACGACGCGTGTCAGCTAGCACTAGTGC（配列番号３９）
(b)オリゴヌクレオチド４０：GCACTAGTGCTAGCTGACACGCGTCGTTTCGAATA（配列番号４０）
　下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド３９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド４０（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ）　１０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２　　　（１００ｍＭ）　１０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）　１０μｌ
(f)滅菌蒸留水　６０μｌ
　前記オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド４０とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー３）を精製した。
　また、pSN004（実施例（２－１－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．２ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
　前記ＤＮＡ（リンカー３）及び前記４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー３）が挿入されたプラスミド（以下、pSN007と記すこともある。）を精製することにより、pSN007を得た。
（２－１－８）　pSN017の構築
　ヒトプロリル－4－ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）のｃＤＮＡクローン(Clone ID:4797051)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド４１及び４２を合成した。下記オリゴヌクレオチド４１及び４２をプライマーとし、P4Hα１のｃDNAクローンを鋳型としてPCRを行うことにより、P4Hα1をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４１：TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号４１）
(b)オリゴヌクレオチド４２：TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号４２）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN007（実施例（２－１－７）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からP4Hα1をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN017と記すこともある。）を精製することにより、pSN017を得た。
（２－１－９）　pP4HA1-SmaI-TOPOの構築
　下記オリゴヌクレオチド４３及び３８を合成した。下記オリゴヌクレオチド４３及び３８をプライマーとし、pSN017（実施例（２－１－８）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行うことにより、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４３：AACCCGGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号４３）
(b)オリゴヌクレオチド３８：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて３．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約２．８ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．８ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からプロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、と記すこともある。）を精製することにより、pP4HA1-SmaI-TOPOを得た。
（２－１－１０）　pSN023の構築
　下記オリゴヌクレオチド４４及び４５を合成した。下記オリゴヌクレオチド４４及び４５をプライマーとし、pARG4-TOPO（実施例（１－２）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行うことにより、ARG4をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４４：AACTCGAGACGAAAATATGGTACCTGCCCT（配列番号４４）
(b)オリゴヌクレオチド４５：CCATCGATACAGAGGTATCATCCAATGATTCC（配列番号４５）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約２．２ｋｂのＤＮＡを制限酵素XhoI及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pBluescriptII SK（＋）（Stratagene）プラスミドを制限酵素XhoI及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約２．２ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からARG4をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN023と記すこともある。）を精製することにより、pSN023を得た。
（２－１－１１）　pEXP-A-P4Hbsig(-)revの構築
　pP4Hbsig(-)rev-TOPO（実施例（２－１－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素SacII及びCfr9Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約３．０ｋｂのαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN023（実施例（２－１－１０）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素SacI及びCfr9Iにて切断した後、約５．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約３．０ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-P4Hbsig(-)revと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-P4Hbsig(-)revを得た。
（２－１－１２）　pEXP-A-P4Hbsig(-)A1revの構築
　pP4HA1-SmaＩ-TOPO（実施例（２－１－９）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Cfr9Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．８ｋｂのプロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-P4Hbsig(-)rev（実施例（２－１－１１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Cfr9Iにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約３．０ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からプロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-P4Hbsig(-)A1revと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-P4Hbsig(-)A1revを得た。
（２－２）　FK506結合タンパク質発現カセット導入プラスミドの作製
（２－２－１）　pTS011の構築
　ヒートショックプロテイン４７（Hsp47）のcDNAクローン(Clone ID:3030138)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド４６及び４７を合成した。下記オリゴヌクレオチド４６及び４７をプライマーとし、HSP47のcＤＮＡクローンを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、HSP47をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４６：TATTCGAAACGATGCGCTCCCTCCTGCTTCTC（配列番号４６）
(b)オリゴヌクレオチド４７：TTACTAGTTATAACTCGTCTCGCATCTTGTCACC（配列番号４７）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１．５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN005（実施例（２－１－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHSP47をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pTS011と記すこともある。）を精製することにより、pTS011を得た。
（２－２－２）　pEXP-A-HSP47native signalの構築
　pTS011（実施例（２－２－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．３ｋｂのHSP47をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　ｐEXP-A-P4Hbsig(-)rev（実施例（２－１－１１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．３ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHSP47をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-HSP47native signalと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-HSP47native signalを得た。
（２－２－３）　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2revの構築
　下記オリゴヌクレオチド４８及び４９を合成した。下記オリゴヌクレオチド４８及び４９をプライマーとし、ｐＵＣ５７－ＺｅｏＲ（実施例（１－１３）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ゼオシン耐性カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４８：TTATCGATCCCACACACCATAGCTTCA（配列番号４８）
(b)オリゴヌクレオチド４９：TGATCGATAGCTTGCAAATTAAAGCCTTC（配列番号４９）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１．５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．２ｋｂのＤＮＡを制限酵素ClaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約１．２ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal（実施例（２－２－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ClaIにて切断した後、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約１．２ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からゼオシン耐性カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2revと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2revを得た。
（２－２－４）　pEXP-A-FKBP13A ZeoRの構築
　pUC57-YFKBP13A（実施例（１－１４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約０．４ｋｂのFKBP13AをコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev（実施例（２－２－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．４ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFKBP13AをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FKBP13A ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FKBP13A ZeoRを得た。
（２－２－５）　pEXP-A-FKBP19 ZeoRの構築
　pUC57-YFKBP19（実施例（１－１５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約０．６ｋｂのFKBP19をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev（実施例（２－２－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFKBP19をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FKBP19 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FKBP19 ZeoRを得た。
（２－２－６）　pEXP-A-FKBP23 ZeoＲの構築
　pUC57-YFKBP23（実施例（１－１６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約０．７ｋｂのFKBP23をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev（実施例（２－２－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．７ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFKBP23をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FKBP23 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FKBP23 ZeoRを得た。
（２－２－７）　pEXP-A-FKBP63 ZeoRの構築
　pUC57-YFKBP63（実施例（１－１７）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．７ｋｂのFKBP63をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev（実施例（２－２－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．７ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFKBP63をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FKBP63 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FKBP63 ZeoRを得た。
（２－２－８）　pEXP-A-FKBP65 ZeoRの構築
　pUC57-YFKBP65（実施例（１－１８）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．８ｋｂのFKBP19をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-HSP47native signal ZeoR2rev（実施例（２－２－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．８ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からFKBP65をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FKBP65 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FKBP65 ZeoRを得た。
（２－２－９）　pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoRの構築
　ｐCR-BII-PER3 Pro SacII-Psp1406I(-)（実施例（１－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動によりPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加された約１．０ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．２ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．０ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoRを得た。
（２－２－１０）　pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoRの構築
　pCR-BII-AOX2 Pro SacII-Psp1406I(-) （実施例（１－５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動によりAOX2プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加された約１．１kbのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．２ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX2プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoRを得た。
（２－２－１１）　pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoRの構築
　ｐCR-BII-FLD1 Pro SacII-Psp1406I(+)（実施例（１－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により、FLD1プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加された約０．９ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-A-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．２ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．９ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＦＬＤ１プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-A-FLD１ Pro-FKBP23 ZeoRを記すこともある。）を精製することにより、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoRを得た。
（２－３）　ヒトコラーゲンTypeIα1発現カセット、及び、ヒトコラーゲンTypeIα2発現カセット導入プラスミド（pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1）の作製
（２－３－１）　pSN001の構築
　下記オリゴヌクレオチド５０及び５１を合成した。下記オリゴヌクレオチド５０及び５１をプライマーとし、pHIS4-TOPO（実施例（１－１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行うことにより、HIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５０：GGAAGCTTGATCTCCTGATGACTGACTCACTG（配列番号５０）
(b)オリゴヌクレオチド５１：CCCTGCAGTAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCA（配列番号５１）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約２．６ｋｂのＤＮＡを制限酵素HindIII及びPstIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pBluescriptII SK（＋）プラスミド（Stratagene）を制限酵素HindIII及びPstIにて切断した後、約３．０ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約２．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約３．０ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN001と記すこともある。）を精製することにより、pSN001を得た。
（２－３－２）　pSN002の構築
　下記オリゴヌクレオチド５２及び５３を合成した。下記オリゴヌクレオチド５２及び５３をプライマーとし、pAOX1-３'-TOPO（実施例（１－８）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行うことにより、AOX1 3’側下流ノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５２：GCATCGATTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGG（配列番号５２）
(b)オリゴヌクレオチド５３：AAGGGCCCGATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAA（配列番号５３）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約０．８ｋｂのＤＮＡを制限酵素ClaI及びApaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN001（実施例（２－３－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ClaI及びApaIにて切断した後、約５．６ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約０．８ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．６ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1 3’側下流ノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pSN002と記すこともある。）を精製することにより、pSN002を得た。
（２－３－３）　pSN006の構築
　オリゴヌクレオチド５４及び５５を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド５４：TATTCGAAACGCATATGGTACCGGCAGACTAGTGG（配列番号５４）
(b)オリゴヌクレオチド５５：CCACTAGTCGCCTAGGCGACATATGGTTTCGAATA（配列番号５５）
　下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド５４（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド５５（５０ｐｍｏｌ／μｌ）　５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ）　１０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２　　　（１００ｍＭ）　１０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）　１０μｌ
(f)滅菌蒸留水　６０μｌ
　前記オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー２）を精製した。
　また、pSN004（実施例（２－１－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．２ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
　前記ＤＮＡ（リンカー２）及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー２）が挿入されたプラスミド（以下、pSN006と記すこともある。）を精製することにより、pSN006を得た。
（２－３－４）　pEXH002の構築
　pSN006（実施例（２－３－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びPstIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．３ｋｂのAOX1プロモーター及びAOX1ターミネーターを含むＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN002（実施例（２－３－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びPstIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター及びAOX1ターミネーターを含むＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXH002と記すこともある。）を精製することにより、pEXH002を得た。
（２－３－５）　PTS001の構築
　pUC57-YHsCOL1A1（実施例（１－１９）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．４ｋｂのヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN006（実施例（２－３－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．２kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約４．４ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、PTS001と記すこともある。）を精製することにより、PTS001を得た。
（２－３－６）　pEXP-HA-YHsCOL1A1の構築
　pTS001（実施例（２－３－５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．３ｋｂのAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXH002（実施例（２－３－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約５．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-YHsCOL1A1と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-YHsCOL1A1を得た。
（２－３－７）　pTS002の構築
　pUC57-YHsCOL1A2（実施例（１－２０）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．１ｋｂのヒトコラーゲンTypeIα2をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN006（実施例（２－３－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．２kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約４．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pTS002と記すこともある。）を精製することにより、pTS002を得た。
（２－３－８）　pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52Iの構築
　下記オリゴヌクレオチド５６及び５７を合成した。下記オリゴヌクレオチド５６及び５７をプライマーとし、pTS002（実施例（２－３－７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα2発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５６：AACGGCCGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号５６）
(b)オリゴヌクレオチド５７：AACGGCCGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号５７）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて６分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１８回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約５．４ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約５．４ｋｂのDNAを、pCR-BluntII-TOPOプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52Iと記すこともある。）を精製することにより、pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52Iを得た。
（２－３－９）　pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1の構築
　pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I（実施例（２－３－８）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ヒトコラーゲンTypeIα2発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加された約５．４ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-HA-YHsCOL1A1（実施例（２－３－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約５．４ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1を得た。
（２－４）　ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド（pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15）の作製
（２－４－１）　pAT021の構築
　下記オリゴヌクレオチド５８及び５９を合成した。下記オリゴヌクレオチド５８及び５９をプライマーとし、pTS001（実施例（２－３－５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ベクタープラスミドを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５８：CGGCTTACCAGCCTCGC（配列番号５８）
(b)オリゴヌクレオチド５９：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号５９）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約５．８ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約５．８ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約５．８ｋｂのＤＮＡをセルフライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基発現、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットを有するプラスミド（以下、pAT021と記すこともある。）を精製することにより、pAT021を得た。
（２－４－２）　pEXP-HA-YHsCOL1A1 N60C15の構築
　pAT021（実施例（２－４－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．５ｋｂのAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXH002（実施例（２－３－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約２．５ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-YHsCOL1A1 N60C15と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-YHsCOL1A1 N60C15を得た。
（２－４－３）　pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52Iの構築
　下記オリゴヌクレオチド６０及び６１を合成した。下記オリゴヌクレオチド６０及び６１をプライマーとし、pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I（実施例（２－３－８）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ベクタープラスミドを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６０：GGGTTTACCTGGGTGGCCG（配列番号６０）
(b)オリゴヌクレオチド６１：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６１）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約６．１ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約６．１ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約６．１ｋｂのＤＮＡをセルフライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットを有するプラスミド（以下、pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52Iと記すこともある。）を精製することにより、pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52Iを得た。
（２－４－４）　pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15の構築
　pYHsCOL1A2 N60C15 Exp unit-Eco52I（実施例（２－４－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加された約２．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXH-HA-YHsCOL1A1 N60C15（実施例（２－４－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約２．３ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15を得た。
（２－５）　ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド（pEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 M500X2）の作製
（２－５－１）　pAT017の構築
　下記オリゴヌクレオチド６２及び６３を合成した。下記オリゴヌクレオチド６２及び６３をプライマーとし、pTS001（実施例（２－３－５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα1へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６２：GGTCCACAGGGTCCAGGAG（配列番号６２）
(b)オリゴヌクレオチド６３：ATCAGCTCCTGGTGATCCCTTTTC（配列番号６３）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　下記オリゴヌクレオチド５９及び６４を合成した。下記オリゴヌクレオチド５９及び６４をプライマーとし、pTS001（実施例（２－３－５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするＤＮＡ、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＣ末端ノンへリックス領域及びＣ末端側ヘリックス領域１５残基をコードするＤＮＡ、AOX1ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなる領域を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５９：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号５９）
(b)オリゴヌクレオチド６４：TGGTGGACCTTGAAAACCCTG（配列番号６４）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約５．７ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたＤＮＡはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約５．７ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．７ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα1へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、pAT017と記すこともある。）を精製することにより、pAT017を得た。
（２－５－２）　pAT027の構築
　下記オリゴヌクレオチド６５及び６６を合成した。下記オリゴヌクレオチド６５及び６６をプライマーとし、pBlue－HsCOL1A1（実施例（１－１０）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα1へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６５：GGACCCCAGGGCCCCG（配列番号６５）
(b)オリゴヌクレオチド６６：ATCAGCACCAGGGGATCCTTTC（配列番号６６）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　下記オリゴヌクレオチド６３及び５９を合成した。下記オリゴヌクレオチド６３及び５９をプライマーとし、pAT017（実施例（２－５－１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンTypeIα1のヘリックス領域の中央５２２残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンTypeIα1のC末端ノンへリックス領域及びC末端側ヘリックス領域１５残基をコードするDNA、AOX1ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６３：ATCAGCTCCTGGTGATCCCTTTTC（配列番号６３）
(b)オリゴヌクレオチド５９：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号５９）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて７分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて７分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約７．３ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα1へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、pAT027と記すこともある。）を精製することにより、pAT027を得た。
（２－５－３）　pEXP-HA-HsCOL1A1 M500X2の構築
　pAT027（実施例（２－５－２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．６ｋｂのAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするDNAからなるＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXH002（実施例（２－３－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約５．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-HsCOL1A1 M500X2と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-HsCOL1A1 M500X2を得た。
（２－５－４）　pAT018の構築
　下記オリゴヌクレオチド６７及び６８を合成した。下記オリゴヌクレオチド６７及び６８をプライマーとし、pTS002（実施例（２－３－７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６７：GGGCCAGTTGGCGCAG（配列番号６７）
(b)オリゴヌクレオチド６８：TGCTTCTCCAGATGGTCCTTTCTC（配列番号６８）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　下記オリゴヌクレオチド６１及び６９を合成した。下記オリゴヌクレオチド６１及び６９をプライマーとし、pTS002（実施例（２－３－７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンTypeIα2のＣ末端ノンへリックス領域及びＣ末端側ヘリックス領域１５残基をコードするDNA、AOX1ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６１：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６１）
(b)オリゴヌクレオチド６９：TGCGGGTCCTTGGAATC（配列番号６９）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約５．４ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約５．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、pAT018と記すこともある。）を精製することにより、pAT018を得た。
（２－５－５）　pAT018-Eco52Iの構築
　pAT018（実施例（２－５－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素AccIII及びPmeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．６ｋｂのAOX1プロモーターの3’側領域、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするＤＮＡ、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pYHsCOL1A2 Exp unit-Eco52I（実施例（２－３－８）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素AccIII及びPmeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．９kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約２．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．９ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーターの３’側領域、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pAT018-Eco52Iと記すこともある。）を精製することにより、pAT018-Eco52Iを得た。
（２－５－６）　pAT028-Eco52Iの構築
　下記オリゴヌクレオチド７０及び７１を合成した。下記オリゴヌクレオチド７０及び７１をプライマーとし、pUC18－HsCOL1A２（実施例（１－１１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７０：GGCCCTGTTGGTGCTGC（配列番号７０）
(b)オリゴヌクレオチド７１：AGCCTCTCCAGAGGGACCCTT（配列番号７１）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　下記オリゴヌクレオチド６８及び６１を合成した。下記オリゴヌクレオチド６８及び６１をプライマーとし、pAT018-Eco52I（実施例（２－５－５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするＤＮＡ、ヒトコラーゲンTypeIα2のヘリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡ、ヒトコラーゲンTypeIα2のＣ末端ノンへリックス領域及びＣ末端側ヘリックス領域１５残基をコードするＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６８：TGCTTCTCCAGATGGTCCTTTCTC（配列番号６８）
(b)オリゴヌクレオチド６１：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６１）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて７分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて７分４０秒間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約７．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．６ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、pAT028-Eco52Iと記すこともある。）を精製することにより、pAT028-Eco52Iを得た。
（２－５－７）　pEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2の構築
　pAT028-Eco52I（実施例（２－５－６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．６ｋｂのヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現カセットを有するDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXP-HA-HsCOL1A1 M500X2（実施例（２－５－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52Iにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
　前記約５．６ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現カセットを有するＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2を得た。
（２－６）　ヒトコラーゲンTypeIIIα1発現カセット導入プラスミド（pEXP-HA-HsCOL3A1）の作製
（２－６－１）　pSN026の構築
　下記オリゴヌクレオチド７２及び７３を合成した。下記オリゴヌクレオチド７２及び７３をプライマーとし、pUC19-HsCOL3A1（実施例（１－１２）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトTypeIIIα1をコードするＤＮＡの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７２：TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGG（配列番号７２）
(b)オリゴヌクレオチド７３：TTACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAACGT（配列番号７３）
　反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）　１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ－ｍｉｘ）　５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）　２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）　５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）　１μｌ
(g)滅菌蒸留水　３３μｌ
　ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２３回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
　前記ＰＣＲの結果得られた約４．４ｋｂのＤＮＡを制限酵素 BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約４．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pSN006（実施例（２－３－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約４．２ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約４．４ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、ヒトTypeIIIα1をコードするＤＮＡの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pSN026と記すこともある。）を精製することにより、pSN026を得た。
（２－６－２）　pEXP-HA-HsCOL3A1の構築
　pSN026（実施例（２－６－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．３ｋｂのAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIIIα1をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　pEXH002（実施例（２－３－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
　前記約５．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIIIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-HsCOL3A1と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-HsCOL3A1を得た。
（２－７）　ヒトコラーゲンTypeIIα1発現カセット導入プラスミド（pEXP-HA-YHsCOL2A１）の作製
（２－７－１）　pIM200の構築
　pUC57-YHsCOL2A1（実施例（１－２１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．４ｋｂのヒトコラーゲンTypeIIα1をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製する。
　pSN006（実施例（２－３－３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．２kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製する。
　前記約４．４ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換する。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いる。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養する。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養する（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTypeIIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pIM200と記すこともある。）を精製することにより、pIM200を得る。
（２－７－２）　pEXP-HA-YHsCOL2A1の構築
　pIM200（実施例（２－７－１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．３ｋｂのAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIIα1をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製する。
　pEXH002（実施例（２－３－４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Eco52I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製する。
　前記約５．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換する。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いる。
　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養する。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養する（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンTypeIIα1をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、pEXP-HA-YHsCOL2A1と記すこともある。）を精製することにより、pEXP-HA-YHsCOL2A1を得る。
実施例３　（発現カセット導入酵母の作製）
（３－１）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入酵母の作製
（３－１－１）　酵母の形質転換
　アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より市販のコマガタエラ　パストリス（Komagataella pastoris）PPY12株（ATCC204163）を購入した。
　エレクトロポレーション法により、PPY12株を実施例２－１で得られたpEXP-A-P4Hbsig(-)A1revで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）にPPY12株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-P4Hbsig(-)A1rev（実施例（２－１－１２）参照）を制限酵素AatIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液に遺伝子導入装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％ヒスチジン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０５０５２５－５－３株を得た。
（３－１－２）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現検討
　０５０５２５－５－３株を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニットを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ラットプロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニットマウス抗体（６３１６７、ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を２００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０５０５２５－５－３株ではプロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニットに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニットを生産することが示された。
　前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ヒトプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットウサギ抗体（ＳＰＡ－８９０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を５０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を２００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０５０５２５－５－３株ではプロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを生産することが示された。
（３－２）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット導入酵母の作製
（３－２－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を実施例２－３－９で得られたpEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1で形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５－５－３株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1（実施例（２－３－９）参照）を制限酵素XbaIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０７０３２７－１－１１株を得た。
（３－２－２）　ヒトコラーゲンTypeIα1、及び、ヒトコラーゲンTypeIα2の発現検討
　０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出した。その結果、０７０３２７－１－１株ではコラーゲンTypeIα1のプロコラーゲンに相当する分子量のバンド、及び、コラーゲンTypeIα2のプロコラーゲンに相当する分子量のバンドが検出されたことから、ヒトコラーゲンTypeIα1、及び、ヒトコラーゲンTypeIα2を産生することが示された。
（３－３）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入酵母の作製
（３－３－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を実施例２－４－４で得られたpEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 Ｎ60Ｃ15で形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-HA-YHsCOL1A2-1A1 N60C15（実施例（２－４－４）参照）を制限酵素XbaIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０８０１１８－３－３株を得た。
（３－３－２）　ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現検討
　０８０１１８－３－３株（実施例（３－３－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ヒトプロコラーゲンTypeIα1ヤギ抗体（SC-8782、Santa Cruz）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑ヤギ IgG-HRP Linked ロバジ抗体（SC-2033、Santa Cruz）を２０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０１１８－３－３株ではヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
　前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ヒトコラーゲンTypeIウサギ抗体（ab292、abcam）を５０００倍希釈に、二次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０１１８－３－３株（実施例（３－７－１）参照）ではヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
（３－４）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入酵母の作製
（３－４－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を実施例２－５－７で得られたpEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2で形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-HA-HsCOL1A2-1A1 M500X2（実施例（２－５－７）参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０８０８０１－２－４株を得た。
（３－４－２）　ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド、並びに、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現検討
　０８０８０１－２－４株（実施例（３－４－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ヒトプロコラーゲンTypeIα1ヤギ抗体（SC-8782、Santa Cruz）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑ヤギ IgG-HRP Linked ロバジ抗体（SC-2033、Santa Cruz）を２０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０８０１－２－４株ではヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
　前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体は抗ヒトコラーゲンTypeIウサギ抗体（ab292、abcam）を５０００倍希釈に、二次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０８０１－２－４株ではヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
（３－５）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、及び、ヒトコラーゲンTypeIIIα1発現カセット導入酵母の作製
（３－５－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を実施例２－６－２で得られたpEXP-HA-HsCOL3A1で形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-HA-HsCOL3A1（実施例（２－６－２）参照）を制限酵素XbaIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０８０９１７－１－２株を得た。
（３－５－２）　ヒトコラーゲンTypeIIIα1の発現検討
　０８０９１７－１－２株（実施例（３－５－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出した。その結果、０８０９１７－１－２株ではコラーゲンTypeIIIα1のプロコラーゲンに相当する分子量のバンドが検出されたことから、ヒトコラーゲンTypeIIIα1を生産することが示された。
（３－６）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、及び、ヒトコラーゲンTypeIIα1発現カセット導入酵母の作製
（３－６－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を実施例２－７－２で得られるpEXP-HA-YHsCOL2A1で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５－５－３株（実施例（３－１－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-HA-YHsCOL2A1（実施例（２－７－２）参照）を制限酵素XbaIで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－６－２）　ヒトコラーゲンTypeIIα1の発現検討
　形質転換体（実施例（３－６－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出する。コラーゲンTypeIIα1のプロコラーゲンに相当する分子量のバンドが検出されることにより、ヒトコラーゲンTypeIIα1を生産することが示される。
（３－７）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα1発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα2発現カセット、及び、FKBP13A発現カセット導入酵母の作製
（３－７－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を実施例２－２－４で得られたpEXP-A-FKBP13A ZeoRで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-FKBP13A ZeoR（実施例（２－２－４）参照）を制限酵素BglIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。pEXP-A-FKBP13A ZeoRの形質転換体として０８１０２２－２－１株を得た。
（３－７－２）　FKBP13Aの発現検討
　０８１０２２－２－１株（実施例（３－７－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、FK506結合タンパク質を検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ１３Ａウサギ抗体（11700-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８１０２２－２－１株ではFKBP13Aに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、FKBP13Aを生産することが示された。
（３－８）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、及び、FKBP19発現カセット導入酵母の作製
（３－８－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を実施例２－２－５で得られたpEXP-A-FKBP19 ZeoRで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７－１－１１（実施例（３－２－１）参照）株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-FKBP19 ZeoR（実施例（２－２－５）参照）を制限酵素BglIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。pEXP-A-FKBP19 ZeoRの形質転換体として０８１０２２－１－１株を得た。
（３－８－２）　FKBP19の発現検討
　０８１０２２－１－１（実施例（３－８－１）参照）株を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、FK506結合タンパク質を検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ１９マウス抗体（H00051303-B01、Abnova）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８１０２２－１－１株ではFKBP19に相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、FKBP19を生産することが示された。
（３－９）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、及び、FKBP23発現カセット導入酵母の作製（その１）
（３－９－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を実施例２－２－６で得られたpEXP-A-FKBP23 ZeoRで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－６）参照）を制限酵素BglIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。pEXP-A-FKBP23 ZeoRの形質転換体として０８１０２４－３－１株を得た。
（３－９－２）　FKBP23の発現検討
　０８１０２４－３－１株（実施例（３－９－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、FK506結合タンパク質を検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８１０２４－３－１株ではFKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、FKBP23を生産することが示された。
（３－１０）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、及び、FKBP63発現カセット導入酵母の作製
（３－１０－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を実施例２－２－７で得られたpEXP-A-FKBP63 ZeoRで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-FKBP63 ZeoR（実施例（２－２－７）参照）を制限酵素BglIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。pEXP-A-FKBP63 ZeoRの形質転換体として０８１０２４－２－１株を得た。
（３－１０－２）　FKBP63の発現検討
　０８１０２４－２－１株（実施例（３－１０－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出した。その結果、０８１０２４－２－１株ではFKBP63に相当する分子量のバンドが検出されたことから、FKBP63を生産することが示された。
（３－１１）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、及び、FKBP65発現カセット導入酵母の作製
（３－１１－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）を実施例２－２－８で得られたpEXP-A-FKBP65 ZeoRで形質転換した。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７－１－１１株（実施例（３－１１－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
　１０μｇのpEXP-A-FKBP65 ZeoR（実施例（２－２－８）参照）を制限酵素BglIIで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。pEXP-A-FKBP65 ZeoRの形質転換体として０８１０２４－１－１株を得た。
（３－１１－２）　FKBP65の発現検討
　０８１０２４－１－１株（実施例（３－１１－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、FK506結合タンパク質を検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ６５ウサギ抗体（12172-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８１０２４－１－１ではFKBP65に相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、FKBP65を生産することが示された。
（３－１２）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、及び、FKBP23発現カセット導入酵母の作製（その２）
（３－１２－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）をpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０８１８－３－１株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）を制限酵素BglIIで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－１２－２）　FKBP23の発現検討
　形質転換体（実施例（３－１２－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ）６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行なう。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、FK506結合タンパク質を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いる。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。FKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されることにより、FKBP23を生産することが示される。
（３－１３）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、FKBP23発現カセット導入酵母の作製
（３－１３－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０８０１１８－３－３株（実施例（３－３－１）参照）をpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2　Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０１１８－３－３株（実施例（３－３－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）を制限酵素BglIIで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－１３－２）　FKBP23の発現検討
　形質転換体（実施例（３－１３－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ＦＫＢＰ２３を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いる。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。FKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されることにより、FKBP23を生産することが示される。
（３－１４）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα1のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIα2のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、FKBP23発現カセット導入酵母の作製
（３－１４－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０８０８０１－２－４株（実施例（３－４－１）参照）をpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０８０１－２－４株（実施例（３－４－１）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）を制限酵素BglIIで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－１４－２）　FKBP23の発現検討
　形質転換体（実施例（３－１４－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ＦＫＢＰ２３を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いる。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。FKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されることにより、FKBP23を生産することが示される。
（３－１５）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIIIα1発現カセット、及び、FKBP23発現カセット導入酵母の作製
（３－１５－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、０８０９１７－１－２株（実施例（３－５－１）参照）をpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０９１７－１－２株（実施例（３－５－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23　ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－１５－２）　FKBP23の発現検討
　形質転換体（実施例（３－１５－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ＦＫＢＰ２３を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いる。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。FKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されることにより、FKBP23を生産することが示される。
（３－１６）　プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンTypeIIα1発現カセット、及び、FKBP23発現カセット導入酵母の作製
（３－１６－１）　酵母の形質転換
　エレクトロポレーション法により、プロリル－４－ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル－４－ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、及び、ヒトコラーゲンTypeIIα1発現カセット導入酵母（実施例（３－６－１）参照）をpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）で形質転換する。
　１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０９１７－１－２株（実施例（３－５－１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ660）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD660＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
　１０μｇのpEXP-A-PER3 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－９）参照）、pEXP-A-AOX2 Pro-FKBP23　ZeoR（実施例（２－２－１０）参照）、或は、pEXP-A-FLD1 Pro-FKBP23 ZeoR（実施例（２－２－１１）参照）を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
　前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０－５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
（３－１６－２）　FKBP23の発現検討
　形質転換体（実施例（３－１６－１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
　前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
　前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電気泳動ゲルは５～１５％グラジェントゲル（XV　PANTERA　MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン－Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
　得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ＦＫＢＰ２３を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、１次抗体としては抗ＦＫＢＰ２３ウサギ抗体（12092-1-AP、ProteinTech　Group）を２０００倍希釈に、２次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いる。２次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。FKBP23に相当する分子量の位置にシグナルが検出されることにより、FKBP23を生産することが示される。
実施例４　（コラーゲンの調製）（その１）
（４－１）　酵母の培養及び菌体の調製（その１）
　０７０３２７－１－１１株（実施例（３－２－１）参照）、０８１０２２－２－１株（実施例（３－７－１）参照）、０８１０２２－１－１株（実施例（３－８－１）参照）、０８１０２４－３－１株（実施例（３－９－１）参照）、０８１０２４－２－１株（実施例（３－１０－１）参照）、及び、０８１０２４－１－１株（実施例（３－１１－１）参照）を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行った。
　３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ　ｓａｌｔ培地を調製した。前培養液を終濃度ＯＤ660＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始した。
　本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始した。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始した。グリセロール流加は培養液のＯＤ660＝約４００となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御した。約１３６時間の培養により０７０３２７－１－１１株の培養液が１６９６ｇ、０８１０２２－２－１株の培養液が１６７１ｇ、０８１０２２－１－１株の培養液が１６３９ｇ、０８１０２４－３－１株の培養液が１５９０ｇ、０８１０２４－２－１株の培養液が１６７４ｇ、及び、０８１０２４－１－１株の培養液が１５９９ｇ得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ　ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４　２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４　１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ　４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール　４０ｇ／Ｌ
　前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ　０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３　０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２　２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン　０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸　５ｍL／Ｌ
　前記培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。培地成分を取り除くため前記菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製した。０７０３２７－１－１１株の菌体が６３２．６ｇ、０８１０２２－２－１株の菌体が６５０．２ｇ、０８１０２２－１－１株の菌体が６２７．６ｇ、０８１０２４－３－１株の菌体が５７８．３ｇ、０８１０２４－２－１株の菌体が６３８．７ｇ、及び、０８１０２４－１－１株の菌体が６１４．３ｇ得られた。
（４－２）　コラーゲンの抽出・精製）（その１）
　０７０３２７－１－１１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇ、０８１０２２－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇ、０８１０２２－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇ、０８１０２４－３－１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇ、０８１０２４－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇ、及び、０８１０２４－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体６００ｇを破砕してコラーゲンを抽出・精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行った。
　前記菌体を４０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕した。
　リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈した。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、SIGMA）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温した。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
　前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
　前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。終濃度４ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分の重量の２．８倍の重量の０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加して攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
　前記上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。前記上清に終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
　前記上清を透析チューブ（Spectra/Por　１３２６６５、SPECTUM　LABORATORIES）に入れ、１０倍容量の１ｍＭ　ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過した。０７０３２７－１－１１株の菌体から６７．６ｇ、０８１０２２－２－１株の菌体から８６．４ｇ、０８１０２２－１－１株の菌体から９８．８ｇ、０８１０２４－３－１株の菌体から４２．６ｇ、０８１０２４－２－１株の菌体から４９．４ｇ、及び、０８１０２４－１－１株の菌体から７２．６ｇの精製コラーゲン溶液が得られた。
実施例５　（精製コラーゲン溶液の分析）（その１）
（５－１）　精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度測定（その１）
　ヒトコラーゲンTypeIをFibroGenより入手した。BCAプロテインアッセイキット（Thermo　Fisher　Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIを標品として精製コラーゲン溶液のヒトコラーゲンTypeI濃度を測定した。０７０３２７－１－１１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は４．８９ｍｇ／ｍｌ、０８１０２２－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は５．６４ｍｇ／ｍｌ、０８１０２２－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は４．８８ｍｇ／ｍｌ、０８１０２４－３－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は３．７２ｍｇ／ｍｌ、０８１０２４－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は７．３９ｍｇ／ｍｌ、及び、０８１０２４－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeI濃度は４．６８ｍｇ／ｍｌであった。
（５－２）　フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その１）
　６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製した。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液を分取した。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下した。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定した。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出した。得られた値から、コラーゲンTypeI　１分子あたりの中性糖数を算出した。マンノースの分子量は１８０、コラーゲンTypeIの分子量は３１８８００として算出を行った。０７０３２７－１－１１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１５．４、０８１０２２－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１８．１、０８１０２２－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１０．５、０８１０２４－３－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は８．７、０８１０２４－２－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１５．９、及び、０８１０２４－１－１株（実施例（４－１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１４．７であった。
実施例６　（コラーゲンの調製）（その２）
（６－１）　酵母の培養及び菌体の調製（その２）
　形質転換体［実施例（３－１２－１）、実施例（３－１３－１）、実施例（３－１４－１）、実施例（３－１５－１）、及び、実施例（３－１６－１）参照］を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行う。
　３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ　ｓａｌｔ培地を調製する。前培養液を終濃度ＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始する。
　本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始する。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始する。グリセロール流加は培養液のＯＤ６６０＝約１３０となった時点で停止する。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行う。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御する。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御する。約１３６時間の培養により培養液を得る。以下に用いた培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ　ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４　２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４　１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ　４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール　４０ｇ／Ｌ
　前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌する。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加する。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ　０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３　０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２　２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン　０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸　５ｍL／Ｌ
　前記培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収する。培地成分を取り除くため前記菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収する。この作業を合計２回繰り返し、０５０８１８－３－１株の菌体を調製する。
（６－２）　コラーゲンの抽出・精製（その２）
　形質転換体［実施例（３－１２－１）、実施例（３－１３－１）、実施例（３－１４－１）、実施例（３－１５－１）、及び、実施例（３－１６－１）参照］の菌体を破砕してコラーゲンを抽出・精製する。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行う。
　前記菌体を２０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製する。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕する。
　リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈する。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整する。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、シグマ）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温する。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。前記上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
　前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
　前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整する。終濃度４ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
　前記上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整する。前記上清に終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１Ｎの ＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。
　前記溶解液を透析チューブ（Spectra/Por　１３２６６５、SPECTUM　LABORATORIE）に入れ、１０倍量の１ｍＭ　ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行った後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過することにより精製コラーゲン溶液を得る。
実施例７　（精製コラーゲン溶液の分析）（その２）
（７－１）　精製コラーゲン溶液のコラーゲン濃度測定（その２）
　ヒトコラーゲンTypeIをFibroGenより入手する。BCAプロテインアッセイキット（Thermo　Fisher　Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIを標品として精製コラーゲン溶液（実施例（６－２）参照）のコラーゲン濃度を測定する。
（７－２）　フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その２）
　６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製する。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液（実施例（６－２）参照）を分取する。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下する。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定する。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出する。得られた値から、コラーゲン　１分子あたりの中性糖数を算出する。
　本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなグリシン繰り返し配列タンパク質を、本来の物性が損なわれない状態で生産する形質転換体、及び、当該形質転換体を用いてグリシン繰り返し配列タンパク質を取得する方法等が提供可能となる。
配列番号１に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号２に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号３に記載される塩基配列は、arg4のクローニングのためのプライマー
配列番号４に記載される塩基配列は、arg4のクローニングのためのプライマー
配列番号５に記載される塩基配列は、aox1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号６に記載される塩基配列は、aox1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号７に記載される塩基配列は、per3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号８に記載される塩基配列は、per3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号９に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたper3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１０に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたper3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox2プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox2プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１３に記載される塩基配列は、fld1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１４に記載される塩基配列は、fld1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１５に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたfld1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたfld1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１７に記載される塩基配列は、aox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１８に記載される塩基配列は、aox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号１９に記載される塩基配列は、aox1 3’非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号２０に記載される塩基配列は、aox1 3’非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号２１に記載される塩基配列は、αファクターのクローニングのためのプライマー
配列番号２２に記載される塩基配列は、αファクターのクローニングのためのプライマー
配列番号２３に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のクローニングのためのプライマー
配列番号２４に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のクローニングのためのプライマー
配列番号２５に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のクローニングのためのプライマー
配列番号２６に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のクローニングのためのプライマー
配列番号２７に記載される塩基配列は、ヒトcol3a1のクローニングのためのプライマー
配列番号２８に記載される塩基配列は、ヒトcol3a1のクローニングのためのプライマー
配列番号２９に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号３０に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号３１に記載される塩基配列は、psn005構築のためのリンカー１
配列番号３２に記載される塩基配列は、psn005構築のためのリンカー１
配列番号３３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたα遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター構築のためのプライマー
配列番号３４に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたα遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター構築のためのプライマー
配列番号３５に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4hbのクローニングのためのプライマー
配列番号３６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4hbのクローニングのためのプライマー
配列番号３７に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号３８に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号３９に記載される塩基配列は、psn007構築のためのリンカー３
配列番号４０に記載される塩基配列は、psn007構築のためのリンカー３
配列番号４１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4ha1のクローニングのためのプライマー
配列番号４２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4ha1のクローニングのためのプライマー
配列番号４３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号４４に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたarg4のクローニングのためのプライマー
配列番号４５に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたarg4のクローニングのためのプライマー
配列番号４６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたhsp47遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号４７に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたhsp47遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号４８に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたzeor遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号４９に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたzeor遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号５０に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたhis4のクローニングのためのプライマー
配列番号５１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたhis4のクローニングのためのプライマー
配列番号５２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1 3’非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号５３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1 3’非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号５４に記載される塩基配列は、psn006構築のためのリンカー３
配列番号５５に記載される塩基配列は、psn006構築のためのリンカー３
配列番号５６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号５７に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号５８に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号５９に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６０に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６１に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６２に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６３に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６４に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６５に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６６に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６７に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６８に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号６９に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号７０に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号７１に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号７２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたヒトcol3a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号７３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたヒトcol3a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号７６に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトＦＫＢＰ２３におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号７８に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトＦＫＢＰ１９におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号９８に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンにおけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１００に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType I α 2前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１０２に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType II α 1前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１０４に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType III α 1前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１１２に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトＦＫＢＰ１３ＡにおけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１１３に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトＦＫＢＰ６３におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１１４に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトＦＫＢＰ６５におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号１１５に記載される塩基配列は、ゼオシン（TM）耐性カセットのための合成ＤＮＡ

Claims (22)

  1. 　下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）のいずれもが微生物細胞内に導入された形質転換体：
    （１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が1万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
    （２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
    （３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
    ＜特性（Ａ）＞
    グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
    ＜特性（Ｂ）＞
    グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸が含まれている：
    ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
  2. 　請求項１記載の形質転換体であって、前記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）にコードされるタンパク質をいずれもその細胞内に産生する形質転換体。
  3. 　前記ＦＫ５０６結合タンパク質が、ＦＫＢＰ２３又はＦＫＢＰ１９である請求項１又は２記載の形質転換体。
  4. 　前記ＦＫ５０６結合タンパク質が、ＦＫＢＰ２３である請求項１又は２記載の形質転換体。
  5. 　前記ＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されている請求項１から４のいずれかに記載の形質転換体。
  6. 　請求項１から５のいずれかに記載の形質転換体であって、更にリジン水酸化酵素をその細胞内に産生する形質転換体。
  7. 　前記リジン水酸化酵素が、リジルヒドロキシラーゼ１又はリジルヒドロキシラーゼ３から選択される少なくとも１種類のリジン水酸化酵素である請求項６記載の形質転換体。
  8. 　請求項１から５のいずれかに記載の形質転換体であって、更にＨｓｐ４７をその細胞内に産生する形質転換体。
  9. 　前記プロリン水酸化酵素が、プロリル－４－ヒドロキシラーゼである請求項１から８のいずれかに記載の形質転換体。
  10. 　前記プロリン水酸化酵素が、プロリル－４－ヒドロキシラーゼのαサブユニット及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼのβサブユニットを含む酵素である請求項１から８のいずれかに記載の形質転換体。
  11. 　前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼのβサブユニットのアミノ末端に酵母αファクターのプレプロ配列が融合されている請求項１０記載の形質転換体。
  12. 　前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼのαサブユニットが、α１サブユニット、α２サブユニット又はα３サブユニットである請求項１０または１１に記載の形質転換体。
  13. 　前記プロリン水酸化酵素のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１つが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されている請求項１から１２のいずれかに記載の形質転換体。
  14. 　前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質が、コラーゲンＴｙｐｅＩからＴｙｐｅＸＸＩＸの中から選択される少なくとも１種類のコラーゲンである請求項１から１３のいずれかに記載の形質転換体。
  15. 　前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質が、コラーゲンＴｙｐｅＩ、コラーゲンＴｙｐｅＩＩ及びコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩの中から選択される少なくとも１種類のコラーゲンである請求項１～１３のいずれかに記載の形質転換体。
  16. 　前記微生物細胞が、真核生物細胞である請求項１～１５のいずれかに記載の形質転換体。
  17. 　前記真核生物細胞が、酵母細胞である請求項１６記載の形質転換体。
  18. 　前記酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞である請求項１７記載の形質転換体。
  19. 　前記メタノール資化性酵母細胞が、Komagataella pastorisである請求項１８記載の形質転換体。
  20. 　請求項１から１９のいずれかに記載の形質転換体が産生して得られうる前記特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質。
  21. 　微生物細胞内に、下記ポリヌクレオチド（１）、（２）及び（３）を導入する第一工程、
    　第一工程により得られる形質転換体を培養することによりグリシン繰り返し配列タンパク質を産生させる第二工程、並びに
    　第二工程で産生されたグリシン繰り返し配列タンパク質を回収する第三工程、
    を含むグリシン繰り返し配列タンパク質の製造方法：
    （１）ＦＫ５０６に結合性を有し、且つ、分子量が1万５千以上６万以下であるＦＫ５０６結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
    （２）プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；並びに
    （３）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有するグリシン繰り返し配列タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド：
    ＜特性（Ａ）＞
    グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を有する；及び
    ＜特性（Ｂ）＞
    グリシン繰り返し配列タンパク質におけるポリペプチド鎖の連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列にイミノ酸が含まれている：
    ここで、上記Xaa及びYaaはそれぞれ任意のアミノ酸を表わす。
  22. 　請求項２１記載の製造方法により製造されたグリシン繰り返し配列タンパク質。
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