KR20240000403A

KR20240000403A - 단백질 융합 기술을 이용하여 효모에서 인슐린을 대량 생산하는 방법

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Publication number: KR20240000403A
Application number: KR1020230080648A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 배정훈; 박세린; 박현주; 성봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2023-06-22
Publication date: 2024-01-02

Abstract

본 발명은 ⅰ) 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 ⅰ)단계의 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, 소 인슐린의 생산 방법; 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터; 상기 벡터가 형질전환된 숙주세포; 상기 소 인슐린의 생산 방법에 의해 생산된 활성형 소 인슐린; 및 상기 활성형 소 인슐린을 포함하는 세포 배양용 조성물;에 관한 것이다.

Description

단백질 융합 기술을 이용하여 효모에서 인슐린을 대량 생산하는 방법 {A method for production of insulin using protein fusion technique in yeast}

인슐린은 췌장의 Langerhans섬의 β-cell에서 만들어지며, 과다한 포도당이 혈액 내에 존재하게 되면 간이나 근육에 글리코겐 형태로 저장하는 역할을 하기 때문에 1형당뇨 치료제로 사용되는 호르몬이다. 인슐린은 또한 지방 합성 촉진, 지방 분해 억제 및 케톤체 생성 감소에 영향을 미치므로, 인슐린 관련 케톤증(ketosis) 및 산증(acidosis)의 다양한 증상을 교정하는 데에도 사용된다.

인슐린은 2개의 폴리펩타이드 B-chain 및 A-chain으로 구성되어 있으며, B-chain과 A-chain은 2개의 이황화 결합으로 연결되어 있으며 A-chain은 1개의 이황화 결합을 포함하고 있다. 인슐린이 생체 내에서 만들어지는 과정은 처음에 인슐린의 B-chain과 A-chain이 C-chain로 연결된 프로인슐린에 signal peptide가 붙은 형태인 Preproinsulin 형태로 만들어진다. Preproinsulin은 소포체로 전달되며 signal peptide가 제거되어 86개 아미노산으로 구성된 프로인슐린으로 전환된 후 골지체(Golgi)로 이동하며 인슐린으로 전환된다. 이때 C-peptide를 자르는 두가지 endopeptidases PC3는 B-chain과 C-peptide의 연결부위인 Arg31과 Arg32를 인식하여 절단하고 PC2는 A-chain과 C-peptide의 연결부위인 Lys64와 Arg65를 인식하여 절단한다. 만들어진 인슐린은 사이토졸(cytosol)로 이동한 후 clathrin에 의해 펄스 형태로 분비된다. 분비된 인슐린은 혈중 당의 농도에 의해 hexamer로 존재하던 인슐린이 monomer가 되면서 인슐린 수용체에 결합되어 혈당을 조절하게 된다.

인슐린이 당뇨병 치료제로 사용되기 시작한 초기에는, 돼지, 소 및 기타 동물의 췌장으로부터 추출되었지만, 이들 생성물은 인간 인슐린과 구조적으로 달라서 면역원성이 있기 때문에, 1980년대 이후에는 글로벌 제약기업인 Eli Lilly, Novo Nordisk 및 Sanofi 등 3개의 회사에서 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 독점 공급하고 있다.

현재, 인간 인슐린을 발현시키기 위하여 가장 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 대장균(Escherichia coli)과 효모(Saccharomyces sp.)이다.

인슐린을 대장균에서 발현하면 봉입체 형태로 발현되기 때문에 봉입체의 절단 및 복원(renaturation)을 위하여 여러 단계의 공정을 필요로 하는 문제점이 있다. 인슐린을 효모 균주를 이용하여 발현할 경우 조작 용이성, 배양 용이성, 외래 단백질의 변형, 및 분비 발현 능력 등으로 인한 장점이 있지만 프로인슐린의 접힘(folding)이 이루어지기 전에 kexin 효소에 의해 절단이 되기 때문에, 이를 피하기 위해 B-chain의 29번째 아미노산인 lysine과 A-chain의 1번째 아미노산인 glycine을 펩타이드 결합으로 연결한 Single-chain des-(B30) insulin을 이용한다. Single-chain des-(B30) insulin을 이용하여 효모에서 재조합 단백질을 생산한 다음 몇 번의 정제과정을 거친 후 효소처리에 의해 des-(B30) insulin을 생산한다. 그 후에 B-chain에 threonine을 축합시켜 생물학적 활성을 갖는 인슐린을 생산한다.

식량부족과 축산업을 통해 배출되는 온실가스로 인하여 축산업의 미래는 배양육으로 귀결된다. 배양육은 세포증식을 통하여 생산된 식용고기를 일컫는다. 가축을 기르지 않기에 기존 축산업에 비해 토지 사용량은 1%, 온실가스 배출량은 4%에 불과하다. 배양육 생산을 위한 배양액으로 주로 쓰이는 물질은 소의 태아에서 추출하는 혈청(소태아혈청)이다. 소태아혈청에는 세포가 자라는 데 필요한 영양소들이 충분히 들어있고, 세포를 공격하는 원치 않는 면역 반응을 나타내지 않아 세포배양에 주로 쓰인다. 다만 소태아혈청으로 배양육을 생산해 나가기에는 한계가 있다. 전 세계적으로 도축되는 소의 8% 정도만 임신상태에 있어 소태아혈청의 생산량은 매우 부족하고 고가이기 때문에 현재 글로벌 벤처 기업들에서는 소태아혈청을 대신할 배양액을 개발하는 데 심혈을 기울이고 있다. 소 인슐린(bINS)은 소태아혈청을 구성하는 핵심성분이기 때문에 증가하는 수요에 대응하기 위해서는 재조합 소 인슐린 생산기술 개발이 필수적임에도 아직까지 재조합 소 인슐린 생산관련 보고는 없는 상황이다.

본 발명의 하나의 목적은 ⅰ) 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 ⅰ)단계의 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, 소 인슐린의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 소 인슐린 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 소 인슐린의 생산 방법으로 생산된, 활성형 소 인슐린을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 소 인슐린의 생산 방법으로 생산된 활성형 소 인슐린을 포함하는, 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 하나의 양태는 i) 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린(bINS)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하는 단계; 및 ii) 상기 i) 단계의 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, 소 인슐린의 생산방법에 관한 것이다.

상기 소 인슐린의 생산방법에서, i) 단계는 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린(bINS)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 나타낸다. 이는 생성물의 구체적인 길이를 나타내는 것은 아니므로, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질, 아미노산 쇄, 또는 둘 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 나타내기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, 또는 "폴리펩타이드"와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 또한 용어 "폴리펩타이드"는, 여기에 제한되지 않지만, 공지된 보호/차단기에 의한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산에 의한 변형을 비롯한 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물도 포함될 수 있다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으나, 지정된 염기서열로부터 필수적으로 번역되는 것은 아니다. 이는 화학 합성에 의한 것을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.

본 발명에서 용어, "서열번호 3의 폴리펩타이드"는 C-말단이 제거된 효모 VOA1(YGR106C) 유전자로부터 유래된 것으로서, 친수성 아미노산으로 구성되어 전하가 가장 높은 부위인 HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL)의 일부 영역을 포함한다. 본 발명에서 상기 "서열번호 3의 폴리펩타이드"는 "HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL)" 또는 "HL18"과 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 "서열번호 3의 폴리펩타이드"는 목적 단백질의 고발현을 유도하기 위한 단백질 융합인자로 작용할 수 있고, 이때 목적 단백질은 소 인슐린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질 융합인자는 목적 단백질과 융합하여 발현시킬 경우, 융합 단백질의 용해도를 높임으로써 단백질의 접힘이나 골지체로의 이송에 도움을 주는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 3의 폴리펩타이드는 in vitro processing 효율을 개선하기 위하여, 펩타이드 서열의 N-말단 또는 C-말단 중 선택되는 어느 하나에 SV(Ser-Val) 서열이 도입된 것일 수 있다. 일 예로, 상기 "서열번호 3의 폴리펩타이드"는 50개 미만의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열일 수 있고, 구체적으로 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만 또는 19개 미만의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열일 수 있다.

상기 "서열번호 3의 폴리펩타이드"는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.

상기 "서열번호 3의 폴리펩타이드"는, 서열번호 3의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 폴리펩타이드에 해당될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 서열번호 3의 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 폴리펩타이드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드도 본 발명의 서열번호 3의 폴리펩타이드 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 "서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열"은 서열번호 4의 염기서열을 가지거나 포함할 수 있고, 서열번호 4의 염기서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, C-말단이 제거된 효모 VOA1(YGR106C) 유전자가 세포 밖으로 과량 분비됨을 확인하였으며(PCT/IB2006/003102 및 PCT/KR2008/007231), VOA1 단백질 부위 중 친수성 아미노산으로 구성되어 전하가 가장 높은 부위인 HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL)가 여러 단백질의 분비 융합인자로 작용함을 확인한 바, 이를 소 인슐린 발현에 이용하고자 하였다.

본 발명에서 용어 "소 인슐린(bovine insulin, bINS)"은 인슐린 중, 소에서 유래된 인슐린을 의미하며, 주로 포도당의 대사를 조절하고 체내 단백질 합성을 촉진하는 역할을 한다. 본 발명에서 "소 인슐린"은 "bINS"와도 혼용될 수 있다.

본 발명의 소 인슐린(bINS) 단백질의 아미노산 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI의 Genbank 등에서 얻을 수 있다.

본 발명의 소 인슐린 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 또한, 서열번호 5의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 소 인슐린 단백질에 해당될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 소 인슐린 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 소 인슐린 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 소 인슐린 단백질을 코딩하는 염기서열은 소 인슐린 유전자에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 상기, 소 인슐린 유전자는 소 인슐린 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 다양한 유래의 소 인슐린 유전자를 포함한다.

구체적으로, 상기 소 인슐린 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 염기서열을 가지거나 포함할 수 있고, 서열번호 6의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.

상기 염기서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 소 인슐린 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 소 인슐린 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 소 인슐린 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 염기서열은 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).

본 발명에서 용어 "소 인슐린 발현벡터"는 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린(bINS)을 코딩하는 염기서열을 포함하여, 소 인슐린을 발현하는 벡터를 의미한다.

본 발명에서 용어 "벡터" 란, 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 본 발명에서 상기 벡터는 숙주 세포에서 기능적인 모든 벡터를 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 도입된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 효모 발현벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp: integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다.

상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp: episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp: replicative yeast plasmid) 및 효모 중심절 플라스미드(YCp: yeast centromere plasmid)를 포함할 수 있다. 또한, 인위적 효모 염색체들(YACs: artificial yeast chromosomes)도 본 발명의 벡터로 이용이 가능하다. 구체적인 예로서, 이용 가능한 벡터는 YGa, pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 및 pYJ406를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 발현벡터는 효모에서 발현할 수 있는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현벡터는 플라스미드 형태이다. 본 발명에서 상기 목적 단백질은 "소 인슐린(bINS)"일 수 있고, 발현벡터는 소 인슐린을 코딩하는 유전자의 발현을 지시하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, DNA 영역이 다른 영역과 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예컨대, 프로모터가 서열의 전사를 조절할 수 있는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 벡터의 증폭은 조절 도메인의 발현과는 관계가 없고, 보통 복제원점에 의해 일어나는 숙주에서의 복제 능력 및 형질 전환체의 인지를 용이하게 하는 선별 유전자와 관계가 있다.

발현벡터에서 조절 서열의 필요성은 숙주의 종류 및 형질전환 방법에 따라 달라진다. 일반적으로, 조절 서열은 전사 프로모터, 인핸서, 전사 조절을 위한 선택적인 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 신호, 리보솜에 결합하는 적절한 mRNA 코딩 서열, 및 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 조절 서열은, 예컨대 GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185 (Goeddel, Academic Press, San Diego, Calif, 1990)에 기술되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주세포에 있어서 염기서열의 직접적인 구성적 발현(constitutive expression), 및 일부 숙주 세포에서의 염기서열의 직접적인 발현(예컨대, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 또한, 당업자는 형질전환시킬 숙주 세포의 선택이나 단백질의 바람직한 발현 수준 등의 요소를 고려하여 벡터를 설계할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현벡터는 6HIS, GST, MBP, NusA, 티오레독신(Thioredoxin), 유비퀴틴(Ubiquitin), FLAG, BAP, STREP, CBP, CBD, 및 S-태그로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 친화성 태그(Affinity tag)를 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 친화성 태그는 목적 단백질의 정제 효율을 높이기 위한 것일 수 있고, 구체적으로 상기 친화성 태그는 6HIS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 발현벡터는 켁신(Kexin), 퓨린, Factor Xa, 엔테로키나아제, 서브틸리신, 담배식각바이러스 프로테아제, 트롬빈 및 유비퀴틴 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로테아제(Protease) 인식 서열을 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 염기서열은, 단백질 분비 융합인자와 목적 단백질의 분리를 위해 삽입함으로써, 목적 단백질의 효율적인 정제가 일어나도록 하는 것일 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 소 인슐린 단백질과 본 발명의 HL18을 연결하는 펩타이드 서열은 프로테아제 인식 서열이 도입된 것일 수 있고, 상기 펩타이드 서열은 본 발명의 소 인슐린 단백질과 본 발명의 HL18 간의 접합 부위에서 절단을 일으킬 수 있다.

본 발명에서 링커(linker)는 상기 프로테아제 인식 서열 또는 친화성 태그(affinity tag)를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 본 발명에서 링커(linker) DNA는 켁신 인식 서열(Lys-Arg를 포함하는 아미노산 서열), 포유동물 퓨린 인식 서열(Arg-X-X-Arg를 포함하는 아미노산 서열), Factor-Xa 인식 서열(Ile-Glu-Gly-Arg를 포함하는 아미노산 서열), 엔테로키나제 인식 서열(Asp-Asp-Lys를 포함하는 아미노산 서열), 서브틸리신 인식 서열(Ala-Ala-His-Tyr를 포함하는 아미노산 서열), 담배식각바이러스 인식 서열(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly를 포함하는 아미노산 서열), 유비퀴틴 가수분해효소 인식 서열(Arg-Gly-Gly를 포함하는 아미노산 서열) 또는 트롬빈 인식 서열(Arg-Gly-Pro-Arg를 포함하는 아미노산 서열)을 코딩할 수 있으며, 구체적으로 엔테로키나제 인식 서열 또는 켁신 인식 서열을 코딩할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 발현벡터는 숙주 세포내로 도입되어 본 발명에서 기술되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.

구체적으로, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 함유할 수 있다. 본 발명의 프로모터 서열은 원핵 또는 진핵 또는 바이러스 기원일 수 있다. 원핵 유래의 서열의 예로는 박테리오파지 람다(The bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1973; Lambda II, Hendrix, R. W., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1980)의 PR 및 PL 프로모터; E. coli의 trp, recA, heat shock 및 lacZ 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터(Benoist et at, Nature, 290:304-310, 1981)를 포함한다. 효모에 적절한 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 프로모터는 마우스종양바이러스 (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV), 인간면역결핍바이러스의 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR), 말로니 바이러스(maloney virus), 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(cytomegalovirus immediate early promoter), 엡스타인바 바이러스(Epstein Barr virus), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 인간 메탈로티오네인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 벡터는 추가적인 조절 서열을 포함할 수 있다. 적절한 조절 서열의 예는 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cII의 샤인-달가노 서열이 대표적이다. 구체적으로, 본 발명에서, 상기 프로모터는 GAL10일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 발현벡터는 형질전환된 숙주세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커를 포함할 수 있다. 숙주의 형질전환은 당업계에 널리 알려진 다양한 기술 및 Sambrook 의 문헌에 기술되어 있는 기술 중 하나를 사용하여 이루어질 수 있다. 복제원점은 외래의 기원을 포함하는 벡터의 구성에 의해 제공될 수 있고, 또한 숙주세포 염색체 복제 메커니즘에 의해 제공될 수도 있는데, 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되면 후자는 충족된다. 한편, 바이러스 복제 원점을 함유하는 벡터를 사용하는 것 대신에, 당업자는 선별 마커 및 목적 단백질 DNA 로 공동 형질전환시키는 방법에 의하여 포유동물을 형질전환시킬 수도 있다.

본 발명에서 상기 발현벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 MFα pre-pro leader 펩타이드(서열번호 7), KEX2 인식 서열, bINS(B 펩타이드), KEX2 인식 서열, HL18(서열번호 3), 링커 서열(서열번호 9), bINS(A 펩타이드) 순서대로 연결한 서열이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 MFα pre-pro leader 펩타이드(서열번호 7)는 소 인슐린의 분비발현을 위한 분비 시그널로 사용되었다.

본 발명의 소 인슐린의 생산방법에서, ii) 단계는 상기 i) 단계의 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계이다.

본 발명에서 "숙주 세포"는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포 어떤 것이나 쓸 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모) 세포를 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 상기 숙주세포는 "효모"일 수 있으며, 구체적으로는 HAC1 유전자가 과발현된 효모일 수 있고, 보다 구체적으로는 인트론(Intron)이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 효모일 수 있다.

상기 용어, "HAC1"은 효모에서 비접힘단백질반응(unfolded protein response)를 조절하는 전사인자를 의미한다.

단백질의 접힘이 정확하지 않아 소포체에 스트레스가 발생하면 IRE1 nuclease가 HAC1 mRNA에서 인트론(Intron)을 제거하여 HAC1 단백질을 합성하고, 핵 안으로 이동한 HAC1 단백질은 소포체에서 단백질 접힘에 관여하는 샤페론 단백질 유전자 발현을 증가시켜 비접힘단백질반응(unfolded protein response)에 대응하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 활성형 소 인슐린을 보다 많이 생산하기 위한 목적으로, 인트론(Intron)이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 효모를 이용할 수 있다.

HAC1 유전자를 과발현하는 방법은 당업계에 공지된 유전자 도입 방법을 사용할 수 있으며, 그 방법은 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 transposon에 무작위로 integration하는 방법으로 세포에서 인트론(Intron)이 제거된 HAC1 유전자를 과발현시켰다.

본 발명에서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 아르술라(Arxula)종을 포함할 수 있다.

구체적인 종의 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 또는 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 숙주세포로서, 곰팡이는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus) 또는 트리코더마(Trichoderma) 종을 포함할 수 있고, 박테리아는 에스케리치아(Escherichia) 또는 바실러스(Bacillus) 종을 포함할 수 있고, 식물로는 애기장대, 옥수수, 담배 또는 감자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서 숙주세포로는 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하였으며, 구체적으로 cHAC1 유전자가 과발현된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Y2805를 이용하였다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 "트랜스펙션"과도 혼용되며, 외래 핵산(예컨대, DNA)를 숙주세포에 도입하는 당업계의 기술을 말한다.

DNA를 숙주 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 형질전환, 트랜스펙션, 전기천공, 핵주입 또는 리포솜, 미셀, 유령세포 및 원형질체와 같은 운반체와의 융합 등을 사용하여 일반적으로 수행될 수 있다. 벡터 DNA 또한 종래의 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 이용하여 원핵 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 상기 형질전환 또는 트랜스펙션 방법은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전법, 전기천공법, DEAE-덱스트란 매개법 또는 리포펙션 등을 포함할 수 있다.

숙주세포에 형질전환 또는 트랜스펙션 시키는 적절한 방법은 Sambrook 등의 문헌(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), 및 기타 실험 매뉴얼에 잘 기술되어 있다. 포유동물 세포로의 안정적인 트랜스펙션은 사용된 발현벡터 및 트랜스펙션 기술에 달려있다고 알려져 있고, 일부 세포만이 외래 DNA를 자신의 게놈에 삽입시킬 수 있다. 이러한 삽입체를 확인하고 선별하기 위하여 선별 마커(예컨대, 항생제 저항성)를 코딩하는 유전자를 관심 있는 유전자와 함께 숙주 세포에 도입할 수 있다. 다양한 선별 마커는 약물 저항성을 부여하는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트를 포함한다. 선별 마커를 코딩하는 핵산은 목적 단백질을 코딩하는 핵산과 같은 벡터 또는 다른 벡터에 연결되어 도입될 수 있다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 약물 선별에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 소 인슐린의 생산방법은, ⅲ) 상기 ii) 단계의 형질전환된 효모를 발효 배양하여, 소 인슐린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "배양"은, 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 유가식 배양은 생산물의 높은 최종 농도와 생산성을 가지는 배양 방법으로서, 고농도 세포 배양에 매우 자주 이용되며, 초기에 한 번 배지를 채운 후, 새로운 배양액이나 성장 제한 기질 용액 또는 생산물의 전구체 등을 추가로 공급하지만 반응 생성물은 발효조에 남아있게 하는 방법일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 재조합 미생물을 이용해 유가식 배양을 수행하여, 소 인슐린 단백질을 확보하였다.

본 발명에서 용어 "회수"는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라, 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 소 인슐린 단백질을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적 단백질을 회수할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 200 ml의 최소배지에서 배양한 균주를 1.8 L 발효배지(2% 포도당, 4% 효모추출물, 1% 펩톤)가 포함된 5 L 규모의 발효기에 접종하였고, 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30% 포도당, 30% 갈락토스, 15% 효모추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 50시간 동안 발효를 진행하였다.

본 발명의 소 인슐린의 생산방법은, 추가적으로 소 인슐린을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 생산된 소 인슐린은, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포가 자라는 배지에서 분리될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질이어서 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 인식하여 정제할 수 있다. 정제된 단백질은 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.

본 발명에서 소 인슐린의 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 정제는 프로테아제를 처리하여 HL 펩타이드와 소 인슐린 단백질을 분리시키는 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 켁신, 퓨린, Factor Xa, 엔테로키나아제, 서브틸리신, 담배식각바이러스 프로테아제, 트롬빈 및 유비퀴틴 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 소 인슐린 발현벡터에 관한 것이다.

상기 용어 "서열번호 3의 폴리펩타이드", "소 인슐린", 및 "소 인슐린 발현벡터"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 소 인슐린 발현벡터가 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 용어 "소 인슐린 발현벡터" 및 "형질전환"은 전술한 바와 같다.

또한 상기와 같이, 본 발명에서 "숙주 세포"는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포 어떤 것이나 쓸 수 있다. 구체적으로 숙주 세포는 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모) 세포를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 숙주세포는 "효모"일 수 있으며, HAC1 유전자가 과발현된 효모일 수 있고, 보다 구체적으로는 인트론(Intron)이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 효모일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 소 인슐린의 생산방법으로 생산된, 활성형 소 인슐린에 관한 것이다.

상기 용어, "소 인슐린의 생산방법"은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "활성형 소 인슐린"은, 본 발명의 소 인슐린 생산방법으로 생산된 인슐린 중에서도, 정확한 이황화 결합을 가지고 있어 소 인슐린 활성이 강하게 나타나는 소 인슐린을 의미한다.

상기 활성형 소 인슐린은 구체적으로, 샤페론이 강화된 균주에서 생산될 수 있고, 사페론 단백질은 비접힘단백질반응을 조절하여 단백질 접힘 과정이 충분히 진행되도록 도움으로써 활성형 소 인슐린을 제조하는 데 도움을 줄 수 있다. 또한 상기 샤페론 단백질 강화는 HAC1 또는 PDI1 유전자 강화를 통하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 HAC1에 대하여는 전술한 바와 같다.

상기 PDI1 유전자는 단백질의 이황화 결합을 만드는 효소인 protein disulfide isomerase를 암호화하는 유전자이다.

본 발명자들은 효모에서 소 인슐린의 분비발현을 향상시키고, 이황화 결합이 정확하게 형성된 소 인슐린을 생산하는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, HL 펩타이드와 융합한 소 인슐린을 HAC1 또는 PDI1 유전자가 과발현된 효모에서 발현 시, 활성형 소 인슐린을 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 소 인슐린의 생산방법으로 생산된 활성형 소 인슐린을 포함하는, 세포 배양용 조성물에 관한 것이다.

상기 용어, "소 인슐린의 생산방법", "활성형 소 인슐린", 및 "배양"은 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 세포 배양용 조성물에서 배양될 수 있는 세포는, 소 인슐린을 첨가한 배지에서 배양할 수 있는 당업계에 알려진 세포를 모두 포함할 수 있다. 상기 세포 배양용 조성물에서 배양될 수 있는 세포는 일 예로, 동물 세포, 구체적으로는 포유 동물의 세포일 수 있고, 보다 구체적으로는 NIH/3T3 세포, HaCaT 세포, 또는 소 근육 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 활성형 소 인슐린은 세포 성장을 촉진하는 효과가 있으므로, 세포 배양용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명에서는 단백질 융합인자로 HL 펩타이드를 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터를 인트론이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 효모 균주에 형질전환시킴으로써, 세포성장촉진능이 있는 인슐린을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.

도 1은 bINS 발현벡터 YGaMFα-HL18-bINS의 구조를 나타낸 그림이다.
도 2는 bINS 발현벡터에서 발현되는 융합 단백질 구조(서열번호 1), 및 융합 단백질로부터 bINS의 분비 발현 과정을 도식한 그림이다.
도 3은 벡터 YGaMFα-bINS, YGaMFα-HL18-bINS△C 및 YGaMFα-HL18-bINS로 각각 형질전환된 효모를 발효 배양하여, 상등액을 분석한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다. 위 그림은 균주 성장 및 분비 단백질을 측정한 결과이고, 아래 그림은 배양시간별 배양액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 단백질 크기 표지자).
도 4는 HAC1 및 PDI1 유전자 과발현 균주 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 5는 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 야생 균주, PDI1 과발현 균주 및 HAC1 과발현 균주를 발효 배양하여, 상등액을 분석한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다. 위 그림은 균주 성장 및 분비 단백질을 측정한 결과이고, 아래 그림은 배양시간별 배양액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 단백질 크기 표지자).
도 6은 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 야생 균주, PDI1 과발현 균주 및 HAC1 과발현 균주를 발효 배양하여, 상등액을 정제하고 HL 펩타이드를 제거한 후 순수한 bINS를 정제한 결과를 나타낸 도이다(레인 M: 단백질 크기 표지자, 레인 -: β-mercaptoethanol 포함하지 않는 단백질, 레인 +: β-mercaptoethanol 포함하는 단백질).
도 7은 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 야생 균주, PDI1 과발현 균주 및 HAC1 과발현 균주를 발효하여 생산된 각각의 소 인슐린 및 소췌장에서 분리한 인슐린의 이황화 결합 상태 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 야생 균주, PDI1 과발현 균주 및 HAC1 과발현 균주를 발효하여 생산된 각각의 소 인슐린 및 소췌장에서 분리한 인슐린의 NIH/3T3 세포 성장 촉진 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 야생 균주, PDI1 과발현 균주 및 HAC1 과발현 균주를 발효하여 생산된 각각의 소 인슐린 및 소췌장에서 분리한 인슐린의 HaCaT 세포 성장 촉진 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 YGaMFα-HL18-bINS 벡터로 형질전환된 HAC1 과발현 균주를 발효하여 생산된 소 인슐린 및 소췌장에서 분리한 인슐린의 소 근육세포 성장 촉진 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 소 인슐린 발현 균주의 제작

1-1. HL 펩타이드를 융합한 소 인슐린 발현벡터 제조

본 발명자들은 C-말단이 제거된 효모 VOA1 (YGR106C) 단백질 부위 중 친수성 아미노산으로 구성되어 VOA1 단백질에서 전하가 가장 높은 부위인 HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL)가 여러가지 단백질의 분비 융합인자로 작용함을 확인한 바(PCT/IB2006/003102 및 PCT/KR2008/007231), HL 펩타이드를 소 인슐린(bINS) 발현에 적용하고자 하였다. 이에 먼저, 소 인슐린(bINS)을 HL 펩타이드와 융합한 발현 벡터(YGaMFα-HL18-bINS)를 제조하였다 (도 1).

상기 HL 펩타이드는 28개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 목적 단백질과 융합하여 발현시킬 경우 융합 단백질의 용해도를 높임으로써 단백질의 접힘이나 골지체로의 이송에 도움을 주는 펩타이드이다. 이를 16개의 아미노산으로 구성되도록 소형화한 후, 켁신 프로테아제에 의한 in vivo processing이 용이하도록 N-말단에 SV 서열을 도입하고, 이를 HL18(SVEDEDGDDEYATEETLS, 서열번호 3)로 명명하였다.

상기 융합인자 HL18(서열번호 3)의 C-말단에는 링커 서열(서열번호 9)을 추가하였다. 먼저 bINS 정제 시 친화성 표지로 작용하는 6His 잔기를 추가하고, 정제 후 HL18과 bINS을 분리하기 위하여 엔테로키나제(enterokinase, EK) 인식 서열인 GDDDDK(서열번호 8) 및 켁신(Kexin, KEX2) 인식 서열인 GAAKR을 6His 잔기와 bINS 사이에 추가하였다.

분비 시그널로는 MFα의 pre-pro leader 펩타이드(서열번호 7)를 사용하였으며, bINS 서열(서열번호 5)에서 C-펩타이드 부위는 제외하고, 이 부위에 HL18 서열(서열번호 3)를 삽입하였다.

MFα pre-pro leader 펩타이드(서열번호 7), KEX2 인식 서열, bINS(B 펩타이드), KEX2 인식 서열, HL18(서열번호 3), 링커 서열(서열번호 9), bINS(A 펩타이드) 순서로 연결한 아미노산 서열(서열번호 1)을 기반으로, 효모 코돈으로 최적화하여 ㈜바이오닉스에 의뢰하여 유전자(서열번호 2)를 합성하였다. 합성한 유전자는 제한효소 EcoRI 및 SalI 으로 처리하여 GAL10 promoter와 GAL7 terminator 사이에 클로닝 하였다. 이렇게 제조된 YGaMFα-HL18-bINS 벡터는 GAL10 promoter, MFα pre-pro leader 펩타이드(서열번호 7), KEX2 인식 서열, bINS(B 펩타이드), KEX2 인식 서열, HL18(서열번호 3), 링커 서열(서열번호 9), bINS(A 펩타이드), GAL7 terminator 순서로 작동 가능하게 연결된 구조이다. 이를 통해 첫 번째, 두 번째 KEX2 인식 서열은 발현과정에서 켁신 효소에 의해서 잘리지만, 세 번째 링커 서열은 KR 주변서열을 조작하여 발현과정에서는 잘리지 않고 정제과정에서 켁신 효소를 과량처리한 경우에만 잘릴 수 있도록 설계하였다.

따라서, GAL10 promoter의 강력한 발현 유도로 만들어진 전사체는 리보좀에서 MFα pre-pro leader 펩타이드, KEX2 인식 서열, bINS(B 펩타이드), KEX2 인식 서열, HL18(서열번호 3), 링커 서열(서열번호 9), bINS(A 펩타이드)가 순서대로 연결된 융합 단백질 형태로 합성된 후, MFα pre 펩타이드에 의하여 분비 경로에 들어서면 소포체에서 MFα pre 펩타이드가 제거되고, MFα pro 펩타이드와 HL 펩타이드의 도움을 받아 최적의 구조를 형성한다. 이후, 골지체로 이동하여 첫 번째, 두 번째 KEX2 인식 부위가 켁신 효소에 의하여 잘리면 MFα pro 펩타이드가 제거되고, 세 번째 링커 서열 부위는 잘리지 않은 상태인 HL 펩타이드 및 bINS만 연결된 융합 단백질 형태로 세포밖으로 분비된다 (도 2).

1-2. 대조군 소 인슐린 발현벡터 제조

상기 HL 펩타이드가 소 인슐린(bINS) 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HL 펩타이드를 포함하지 않는 대조군으로, MFα pre-pro 펩타이드 및 bINS 서열이 직접 연결된 발현 벡터(YGaMFα-bINS)와, MFα pre-pro 펩타이드 및 bINS에서 C-펩타이드를 제거하고 B-펩타이드(B-chain)와 A-펩타이드(A-chain)가 직접 연결된 single chain bINS 서열이 직접 연결된 발현 벡터(YGaMFα-bINS△C)를 상기 1-1과 동일하게 유전자 합성하여 제조하였다.

1-3. 소 인슐린 발현 균주 제작

제조된 각각의 벡터(YGaMFα-bINS, YGaMFα-bINS△C, YGaMFα-HL18-bINS)를 효모(S. cerevisiae) Y2805 gal80 mutant 균주에 형질전환하여 각 단백질을 발현하는 균주를 제작하였다. 상기 균주에 대하여 유가식 발효를 수행하여 소 인슐린을 분비 발현하도록 하였다.

실시예 2. HL 펩타이드 융합에 의한 소 인슐린 생산성 분석

실시예 1에서 제조된 균주는 200 ml의 최소배지에서 배양한 균주를 1.8 L 발효배지(2% 포도당, 4% 효모추출물, 1% 펩톤)가 포함된 5 L 규모의 발효기에 접종하고, 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30% 포도당, 15% 효모추출물)를 균체 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 50시간 동안 발효를 진행하였다. 발효가 완료된 배양액은 농축하지 않고 10 ㎕를 취하여 SDS-PAGE 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 발효 종료시에 YGaMFα-bINS 벡터 형질전환체에서는 0.16g/L의 단백질이, YGaMFα-bINS△C 벡터 형질전환체에서는 0.13g/L의 단백질이 분비되었으며, SDS-PAGE 상에서 bINS를 확인하기 어려웠던 반면에, HL 펩타이드가 도입된 YGaMFα-HL18-bINS 벡터 형질전환체에서는 0.32g/L의 단백질이 분비되었으며, SDS-PAGE에서 bINS 단백질을 확인할 수 있었다.

따라서 HL 펩타이드를 이용하여 bINS를 발현할 경우, 다른 경우보다 2배 정도 발현량이 증가되는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 3. 소 인슐린의 정제

실시예 2에서 생산된 단백질은 Ni-NTA 칼럼을 이용한 IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography) 방법으로 정제하였다. 먼저, 필터(Satorious)를 사용하여 균주를 배양한 발효 배양액을 1차 정제 후, 30,000 MWCO Quick-stand(Amersham-Pharmacia Biotech, NJ)로 5배 농축하였으며, 곧바로 Ni-NTA 칼럼에 적용할 수 있도록 하기 위하여 농축 과정에서 농축액의 조성을 50 mM Tris-Cl(pH8.0), 0.5 M NaCl로 조정하였다. 50 ml의 발효 농축액을 20 ml의 Ni-NTA 칼럼에 적용하여 융합 단백질을 Ni-NTA 레진에 결합시킨 후 MPLC(Medium Pressure Liquid Chromatography, Bio-rad)를 이용하여 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole 용액을 농도구배를 두고 흘려주어 소 인슐린 단백질을 정제하였다.

HL18-bINS 융합 단백질의 경우에는, HL 펩타이드를 제거하기 위하여 정제된 용액의 조성을 5,000 MWCO Amicon Ultra centrifugal filter device(Millipore)를 이용하여 켁신 효소 작용 조건인 20 mM Tric-HCl(pH 8.0), 50 mM NaCl, 및 2 mM CaCl₂ 이 되도록 조정하고, 1 mg의 융합 단백질 당 2 ㎍의 켁신 효소를 25 ℃에서 15시간 이상 처리하였다. 켁신 효소 처리된 단백질을 다시 상기한 방법과 동일한 방법으로 Ni-NTA 칼럼에 적용하여 레진에 결합하지 않는 단백질만을 회수하는 방법으로 소 인슐린을 2차 정제하였다.

각각 1차 IMAC 에서 정제된 단백질 및 2차 IMAC 에서 정제된 단백질의 단백질 양을 정량하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1과 같이, YGaMFα-HL18-bINS 형질전환체 발효 배양액을 1차 IMAC 정제한 결과, B-HL18-A 융합 단백질이 124 mg 정제되었으며, 2차 IMAC 정제한 결과, HL 펩타이드가 제거된 bINS 단백질이 14.2 mg 정제되었다.

반면, YGaMFα-bINS 형질전환체에서 생산된 bINS는 C-chain이 제거되지 않았고, YGaMFα-bINS△C 형질전환체에서 생산된 bINS는 B-chain과 A-chain이 분리되지 않아서, 온전한 형태의 bINS 단백질을 생산할 수 없음을 확인하였다.

따라서, 프로인슐린(Proinsulin) 형태로 발현한 경우(YGaMFα-bINS 벡터 이용)와 single peptide로 발현한 경우(YGaMFα-bINS△C 벡터 이용), 소 인슐린 활성을 가지는 온전한 형태로 전환하기 위해서는 추가적인 공정이 필요한 반면, HL 펩타이드를 융합하여 발현한 경우(YGaMFα-HL18-bINS 벡터 이용)는 두 번의 IMAC으로 온전한 형태의 소 인슐린이 생산되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 소 인슐린 활성 강화를 위한 샤페론 강화 균주 제조

실시예 3에서 정제된 bINS 단백질의 활성과 관련, 이황화 결합 상태를 확인하기 위하여 ㈜프로테인웍스에 의뢰하여 LC-MS/MS 분석을 실시하였다.

그 결과, 대조군으로 비교한 소췌장에서 추출한 소 인슐린은 97%가 정확한 이황화 결합을 가지고 있는 반면, 실시예 2의 효모에서 생산된 소 인슐린은 14%만 정확환 이황화 결합을 가지고 있었다.

이러한 문제는 소포체에서 단백질 접힘 과정이 충분하지 못해 발생했을 가능성이 높기 때문에, 활성형 소 인슐린을 보다 많이 생산하기 위한 목적으로, 도 4에 도시한 방법에 따라, 샤페론 단백질이 강화된 균주를 제작하였다.

우선 HAC1 유전자(서열번호 10)를 상시 발현하는 균주를 제작하였다. HAC1은 효모에서 비접힘단백질반응(unfolded protein response)를 조절하는 전사인자이다. 단백질의 접힘이 정확하지 않아 소포체에 스트레스가 발생하면 IRE1 nuclease가 HAC1 mRNA에서 인트론(Intron)을 제거하여 HAC1 단백질을 합성하고, 핵 안으로 이동한 HAC1 단백질은 소포체에서 단백질 접힘에 관여하는 샤페론 단백질 발현을 증가시켜 비접힘단백질반응(unfolded protein response)에 대응하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 샤페론 단백질 강화를 위해 인트론(Intron)이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 효모를 이용하였다.

Intron이 제거된 HAC1 유전자를 ㈜바이오닉스에 의뢰하여 합성하였으며, transposon 서열을 포함하고 있는 integration 벡터(pTU2)의 GC510 promoter 와 GAL7 terminator 사이에 클로닝하였다.

GC510 promoter는 GAL10 promoter 5'서열과 CYC1 promoter 3' 서열이 연결된 인공 프로모터이며, GAL10 promoter와 달리 포도당이 존재하는 조건에서도 발현되며 포도당이 고갈되고 갈락토오스(Galactose)가 존재하면 GAL10 promoter처럼 induction 되도록 개발된 프로모터이다. Transposon 서열은 게놈상에 수십 카피가 존재하기 때문에 이 위치에 목적 유전자를 도입하면 세포 생태에 대한 영향을 최소화하면서 여러 카피의 유전자를 도입할 수 있다. 또한 pTU2 벡터는 반복서열을 포함하고 있어서 이 위치에서 recombination 되면 목적 유전자 발현 카세트만 남아있고 URA3 marker를 포함하는 벡터의 backbone은 제거되기 때문에 반복적으로 사용할 수 있다.

pTU2-HAC1 벡터를 효모(S.cerevisiae) Y2805 gal80 균주에 형질전환한 후 colony PCR을 이용하여 HAC1 유전자가 도입된 균주를 선별하였으며, 선별된 균주를 비선택배지인 YPD 액체배지 (2% 포도당, 1% 효모추출물, 2% 펩톤)에서 5시간 배양한 후 5-FOA 고체배지 (0.67% yeast nitrogen base without amino acid, 2% 포도당, 0.05 mg/ml 우라실, 0.1% 5-FOA)에 도말하여, URA3 유전자는 제거되고 도입된 HAC1 유전자는 남아있는 균주를 선별하였다.

다음으로, PDI1 유전자(서열번호 11) 과발현 균주를 제작하였다. PDI1는 단백질의 이황화 결합을 만드는 효소인 protein disulfide isomerase를 암호화하는 유전자이다. S.cerevisiae는 자체적으로 PDI1 유전자를 포함하고 있지만, 고등세포 유래 단백질의 이황화 결합에는 적합하지 않을 가능성이 있기 때문에, 인간 유래의 PDI1 유전자를 과발현하는 균주를 제작하였다. 방법은 당업계에 공지된 유전자 결손 방법을 사용할 수 있으며, 방법에는 제한이 없다. 인간 유래의 PDI1 유전자는 효모 최적 코돈으로 변경하여 ㈜바이오닉스에 의뢰하여 합성하였으며, HAC1 유전자 과발현 균주 제작 방법과 동일한 방법을 이용하여 PDI1 유전자가 과발현된 균주를 제작하였다.

실시예 5. 샤페론 강화 균주에서 발현된 소 인슐린 생산성 및 활성 분석

5-1. 샤페론 강화 균주에서 발현된 소 인슐린 생산성 분석

실시예 4에서 제작한 샤페론 강화 균주(HAC1 및 PDI1 과발현 균주)에 실시예 1에서 제작된 YGaMFα-HL18-bINS 벡터를 형질전환하여 bINS 발현 균주를 제작한 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 발효를 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 것과 같이, HAC1 과발현 균주는 야생 균주와 성장 속도 및 분비 단백질의 양은 유사하였다. PDI1 과발현 균주는 야생 균주에 비하여 성장이 20% 정도 빨랐으며, 그에 따라 분비 단백질의 양도 대조군에 비하여 30% 정도 증가하였다.

또한 실시예 3와 동일한 방법으로 정제한 결과, 표 2에 나타난 것과 같이, 아생형, HAC1 과발현 및 PDI1 과발현 균주에서는 모두 1차 IMAC에서는 124-155 mg의 단백질이 정제되었으며, 2차 IMAC 후에는 8-15 mg의 단백질이 정제되었다.

5-2. 샤페론 강화 균주에서 발현된 소 인슐린의 이황화 결합 상태 분석

5-1에서 정제된 각각의 bINS 단백질을 β-mercaptoethanol을 포함하는 조건(+)과 포함하지 않는 조건(-)에서 SDS-PAGE 분석으로 비교하였다. β-mercaptoethanol이 없는 조건(-)에서는 이황화 결합이 유지되므로 정확한 단백질 밴드를 확인하기 어렵지만, β-mercaptoethanol이 포함된 조건(+)에서는 β-mercaptoethanol의 환원 작용에 의하여 이황화 결합이 잘려 각각의 사슬로 분리되기 때문에, 도 6에 나타난 것과 같이, 예상하는 위치에서 A 사슬과 B 사슬이 확인되었다.

또한 단백질의 이황화 결합 상태를 확인하기 위하여 ㈜프로테인웍스에 의뢰하여 LC-MS/MS 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 것과 같이, 야생형 효모에서 생산된 소 인슐린은 14% 만 정확한 이황화 결합을 가지고 있었으나, PDI 과발현 균주에서는 38%가 정확한 이황화 결합을 가졌고, HAC1 과발현 균주에서는 57%로 더욱 증가한 것을 확인하였다.

5-3. 샤페론 강화 균주에서 발현된 소 인슐린의 세포 성장 촉진 활성 분석

5-1에 따라 아생형 균주, HAC1 과발현 균주 및 PDI1 과발현 균주에서 발현 및 정제된 소 인슐린의 세포 성장 촉진 활성을 확인하였다. 정제된 세 종류의 bINS을 이용하여 마우스 유래 섬유아세포인 NIH/3T3 세포 및 인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포의 성장 촉진 여부를 MTT assay 로 분석하였다. 대조군으로는 소췌장에서 추출한 인슐린을 이용하였다.

MTT assay를 수행하기 위해, 24 웰 플레이트에 NIH/3T3 세포 2x10⁴개를 혈청이 함유된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 하루 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지와 함께 각 소 인슐린 단백질을 mL당 0 내지 10000 ng 첨가하여 72시간 동안 배양한 후, EZ-CYTOX 키트(DOGEN社)를 사용하여 세포 성장 촉진 정도를 비교하였다.

또한, 동일한 방법으로 HaCaT 세포를 배양하고, 24시간 후 배지를 제거하고 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지와 함께 각 소 인슐린 단백질을 mL당 0 내지 500 ng 첨가하여 72시간 동안 배양한 후, EZ-CYTOX 키트(DOGEN社)를 사용하여 세포 성장 촉진 정도를 비교하였다.

추가적으로, 본 발명에서 생산된 재조합 소 인슐린의 소 근육세포 성장 촉진능을 확인하기 위하여, 소 근육 세포를 동일한 방법으로 배양한 후, 소 췌장에서 추출한 인슐린과 효모에서 생산된 인슐린을 1.8 μM 처리하고 세포 성장 촉진 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 것과 같이, 대조군으로 사용한 소췌장에서 추출한 인슐린과, 상기 효모 균주에서 생산된 세 가지 인슐린은 모두 1000 ng/ml 농도까지 NIH/3T3 세포 성장 촉진 효과를 보였으며, 더 높은 농도에서는 차이를 보이지 않았다. 특히 HAC1 과발현 균주에서 생산된 소 인슐린은 정확한 이황화 결합을 가지고 있는 소 인슐린의 함량이 높기 때문에, 세 단백질 중 가장 높은 NIH/3T3 세포 성장 촉진 효과를 나타냈다.

또한, 도 9에 나타난 것과 같이, 대조군으로 사용한 소췌장에서 추출한 인슐린과, 상기 효모 균주에서 생산된 세 가지 인슐린은 모두 500 ng/ml 농도까지 HaCaT 세포 성장 촉진 효과를 나타냈다. 또한 HAC1 과발현 균주에서 생산된 소 인슐린은 세 단백질 중 가장 높은 HaCaT 세포 성장 촉진 효과를 나타냈다.

또한, 도 10에 나타난 것과 같이, 효모에서 생산된 소 인슐린은 소 췌장에서 추출한 인슐린과 유사하게 소 근육세포의 성장을 촉진하는 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명에서 생산된 소 인슐린은 소췌장에서 추출한 인슐린과 유사하게 세포의 성장을 촉진하는 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

ⅰ) 서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린(bINS)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 소 인슐린 발현벡터를 제조하는 단계; 및
ⅱ) 상기 ⅰ)단계의 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, 소 인슐린의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 6HIS, GST, MBP, NusA, 티오레독신(Thioredoxin), 유비퀴틴(Ubiquitin), FLAG, BAP, STREP, CBP, CBD, 및 S-태그로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 친화성 태그(Affinity tag)를 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것인, 소 인슐린의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 켁신(Kexin), 퓨린, Factor Xa, 엔테로키나아제, 서브틸리신, 담배식각바이러스 프로테아제, 트롬빈 및 유비퀴틴 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로테아제(Protease) 인식 서열을 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것인, 소 인슐린의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것인, 소 인슐린의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 인트론이 제거된 HAC1 유전자가 과발현된 것인, 소 인슐린의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 및 아르술라(Arxula)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 소 인슐린의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 및 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 소 인슐린의 생산방법.
서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 소 인슐린을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 소 인슐린 발현벡터.
제8항의 벡터가 형질전환된 숙주세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 소 인슐린의 생산방법으로 생산된, 활성형 소 인슐린.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 소 인슐린의 생산방법으로 생산된 활성형 소 인슐린을 포함하는, 세포 배양용 조성물.