CN111763680A - 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 - Google Patents
一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111763680A CN111763680A CN201910426492.3A CN201910426492A CN111763680A CN 111763680 A CN111763680 A CN 111763680A CN 201910426492 A CN201910426492 A CN 201910426492A CN 111763680 A CN111763680 A CN 111763680A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- human insulin
- expression vector
- escherichia coli
- analogue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101900345593 Escherichia coli Alkaline phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 22
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 43
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 50
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 108010067006 heat stable toxin (E coli) Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 101001077660 Homo sapiens Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100025144 Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Human genes 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910018890 NaMoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229910052927 chalcanthite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007905 drug manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种人胰岛素样生长因子‑I或其类似物的制备方法以及用于该制备方法的人胰岛素样生长因子‑I或其类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞，属于生物医药领域。本发明实施例通过选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时通过优化改造的人胰岛素样生长因子‑I或其类似物的编码基因，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构，以及通过利用大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽引导人胰岛素样生长因子‑I或其类似物的分泌表达。经实验证明，经过优化过密码子的人胰岛素样生长因子‑I或其类似物能分泌至培养基中，其表达量较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体是一种人胰岛素样生长因子-I或其类似物的制备方法以及用于该制备方法的人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞。
背景技术
已知胰岛素样生长因子(Insulin like Growth Factor，IGFs)是由两类物质组成，即人胰岛素样生长因子-I(Insulin like Growth Factor I，IGF-I)和人胰岛素样生长因子-II(In sulin like Growth Factor II，IGF-II)。在人体内，IGF-I是主要部分，能分泌IGF-I的人体细胞有肝细胞、肾细胞、脾细胞等多达十几种。而IGF-II更多的是参与胚胎的发育，在人体内的重要性及功能的广泛性不及IGF-I。
IGF-I基因位于12号染色体，编码分子量为7648的70个氨基酸组成的单链多肽，含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处。有关研证明IGF-I介导生长激素的作用而促进生物的生长，因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-I水平的影响。现已证明IGF-I在人体内有极其重要并且丰富的生物学功能，如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等，与生长荷尔蒙的作用相类似，都是起非常作用的生长因子。除了经典的IGF-I之外，人们还发现了它的几种类似物。截短型人胰岛素样生长因子-I(Recombinant Human Insulin Like Growth Factor-1 Des(1-3)，Des(1-3)IGF-I，以下简称DesIGF-I)是其中一种IGF-I类似物，这种截短型IGF-I与完整性相比，其N端氨基酸少了3个，它最初在胎儿及成人的脑，牛的初乳中被发现。据报道，这种截短型IGF-I的生物活性比完整性高1.4-10倍，这是由于截短型IGF-I与IGF-I结合蛋白的结合能力较弱而致游离的IGF-I增多的缘故。
此外，国内外也在开发IGF-I的类似物。美国专利US5679771A公开了一系列特定的长链人胰岛素样生长因子(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-I，Lr3IGF-I)，其中Lr3IGF-I是由83个氨基酸残基组成的人胰岛素样生长因子衍生物。该Lr3IGF-I是由人胰岛素样生长因子序列上将第三位的氨基酸残基Glu取代为Arg并在IGF-I的N末端添加13个氨基酸而形成的多肽。在专利US5679771A中，这种IGF-I的衍生物能保持人胰岛素样生长因子的生物学活性，促进细胞和组织生长增殖。目前Lr3IGF-I已经在抗体药物生产工艺中细胞表达中得到广泛的应用。
然而，现有的基因重组技术中，生产IGF-I或其类似物的方法为酵母细胞生产，或者大肠杆菌表达生产。大肠杆菌生产方法采用融合蛋白表达技术或需要包涵体变复性，如中国专利CN108265063A和CN102732549A中公开的方法，此类方法存在收率低，需要引入额外的肠激酶，增加成本，变复性不易放大，蛋白复性率低等缺点。另外，通过使用酵母细胞生产IGF-I或其类似物，IGF-I类似物的表达量低，容易被酵母分泌的蛋白酶降解，且存在酵母特异的碳水化合物分枝等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人胰岛素样生长因子-I或其类似物的制备方法以及用于该制备方法的人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种人胰岛素样生长因子-I(IGF-I)或其类似物的编码基因，其中，所述的人胰岛素样生长因子-I的类似物为截短型人胰岛素样生长因子-I(DesIGF-I)或长链人胰岛素样生长因子-I(Lr3IGF-I)；所述人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ IDNo：2所示；所述截短型人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：7所示；所述长链人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：8所示。
本发明实施例还提供一种含有上述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因的表达载体。
优选的，所述的表达载体是通过将大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA promoter)、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(STII signal peptide)与所述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因依次连在一起，并克隆至质粒载体pBR322中得到的。
优选的，所述表达载体的制备方法包括以下步骤：先用限制内切酶PstI与EcoRI将质粒载体pBR322进行酶切，去除800-1000bp的片段；接着，将剩下的大片段与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和所述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因用T4-DNA连接酶连接成一个完整的环状表达操纵子，得到所述的表达载体。
优选的，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的序列如序列表中SEQ ID No：3所示。
优选的，所述大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的序列如序列表中SEQ ID No：4所示。
本发明实施例还提供一种包含上述表达载体的宿主细胞。
优选的，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
本发明实施例还提供一种人胰岛素样生长因子-I或其类似物的制备方法，其包括以下步骤：将上述的宿主细胞进行表达和分泌，即可得到所述的人胰岛素样生长因子-I或其类似物。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例通过选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时通过优化改造的人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构，以及通过利用大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽引导人胰岛素样生长因子-I或其类似物的分泌表达。经实验证明，经过优化过密码子的人胰岛素样生长因子-I或其类似物能分泌至培养基中，其表达量较高。本发明实施例通过以上述启动子、信号肽组合作为表达调控元件，能够使重组人胰岛素样生长因子-I或其类似物在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，其分泌表达量较高。所以，本发明实施例提供的人胰岛素样生长因子-I或其类似物的制备方法具有工艺简单易行，步骤操作简单，周期短，重复性高，收率较高且稳定，制备成本较低廉等优点，适合进行大规模的生产制备。
附图说明
图1是质粒载体pBR322的图谱。
图2是质粒载体pBR322酶切后的图谱。
图3是表达载体pPT-IGF酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果照片(其中1为DNA marker；2-4为EcoRI和XbarI酶切产物；5-6为EcoRI和PSTI酶切产物)。
图4是制备表达载体pPT-IGF的过程示意图。
图5是表达载体pPT-IGF的图谱。
图6是制备表达载体pPT-DesIGF的过程示意图。
图7是表达载体pPT-DesIGF的图谱。
图8是制备表达载体pPT-Lr3IGF的过程示意图。
图9是表达载体pPT-Lr3IGF的图谱。
图10是pPT-IGF工程菌分离纯化后的SDS-PAGE电泳结果照片(其中1为DNAmarker；2-3是分泌的且纯化后的IGF-I)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种人胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的编码基因，具体的，该编码基因是以天然的IGF-I编码序列(如序列表中SEQ ID No：1所示)为基础，然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构，AT，GC含量接近且分布均匀的特点进行设计的。其设计的IGF-I的编码基因的寡核苷酸序列为：5′GGTCCGGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAA3′(如序列表中SEQ ID No：2所示)。
实施例2
该实施例提供了一种截短型人胰岛素样生长因子-I(DesIGF-I)的编码基因，具体的，该编码基因是以天然的IGF-I编码序列(如序列表中SEQ ID No：1所示)为基础，然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构，AT，GC含量接近且分布均匀的特点进行设计的。其设计的DesIGF-I的编码基因的寡核苷酸序列为：5′ACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAA3′(如序列表中SEQ ID No：7所示)。
实施例3
该实施例提供了一种长链人胰岛素样生长因子-I(Lr3IGF-I)的编码基因，具体的，该编码基因是以天然的IGF-I编码序列(如序列表中SEQ ID No：1所示)为基础，然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构，AT，GC含量接近且分布均匀的特点进行设计的。其设计的Lr3IGF-I的编码基因的寡核苷酸序列为：5′ATGTTTCCGGCCATGCCGCTGAGCAGCCTGTITGTGAATGGTCCGGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAA3′(如序列表中SEQ ID No：8所示)。
实施例4
该实施例提供了一种用于制备IGF-I的表达载体，具体的，该表达载体的制备方法包括如下步骤：
(1)先合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子，其中大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的编码序列如序列表中SEQ ID No：3所示；并在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列的5′端和3′端分别引入PSTI和XbaI限制酶切位点，得到含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因。
(2)将天然的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的编码序列：ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCA(如序列表中SEQ ID No：4所示)与上述实施例1得到的IGF-I的编码基因序列合并合成大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽加重组IGF-I的串联编码序列，并在其5′端设计XbaI限制性酶切位点和引入SD序列，在3′端设计引入EcoRI酶切位点，得到大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和IGF-I的串联基因(STII-IGF)，其具体的序列如下：TCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGGTCCGGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAAGAATTC3′(如序列表中SEQ ID No：5所示)。
(3)参照附图4，将原始质粒载体pBR322(其图谱如附图1所示)用限制性内切酶PstI与EcoRI进行酶切，去除约900bp的片段，胶回收得到的剩下的大片段(其图谱如附图2所示)，备用；接着，用限制性内切酶PSTI和XbaI处理上述含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因，胶回收含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段；然后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI处理上述人工合成的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和IGF-I的串联基因，胶回收含热稳定肠毒素II信号肽和IGF-I的串联基因片段；再接着，将上述胶回收剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和IGF-I的串联基因片段按1∶1∶1的等摩尔比进行混合，并加入T4-DNA连接酶，放置在4℃的温度条件下过夜，得到混合物，混合物中质粒载体pBR322剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和IGF-I的串联基因片段便可依次连接形成一个完整的环形表达操纵子，其序列如序列表中SEQ ID No：6所示。
(4)将上述得到混合物转化DH5α感受态细胞，然后挑选转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI、PSTI进行酶切鉴定，其结果见附图3。结果表明用EcoRI能切出约760bp的片段，与预计的一致。最后，将测序正确的质粒进行保存，即可得到用于制备IGF-I的表达载体，该表达载体命名为pPT-IGF(其图谱如附图5所示)。
实施例5
该实施例提供了一种用于制备IGF-I的宿主细胞以及一种IGF-I的制备方法，具体的，先将上述实施例4得到的表达载体转化大肠杆菌空宿主W3110(W3110为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的市售产品)，得到用于制备IGF-I的宿主细胞；接着，将宿主细胞涂在含有浓度为5μg/ml的四环素抗性基因的LB琼脂平板上，并挑选6个得到的转化子接种于pH为7.2的FA培养基中，得到pPT-IGF工程菌，其中FA培养基的成分包括：质量分数为0.1％葡萄糖、质量分数为1.5％酸水解酪蛋白、质量分数为0.1％酵母抽提物、质量分数为0.04％MgSO4、质量分数为0.5％的(NH4)2SO4、质量分数为0.4％的KCl以及摩尔浓度为0.12mol/L的三乙醇胺；然后将pPT-IGF工程菌在37℃条件下过夜摇瓶培养24小时后，用SDS-PAGE电泳鉴定其表达结果，结果表明，IGF-I可以分泌至培养基中，其表达量约为0.35mg/ml。
实施例6
该实施例提供了一种用于制备DesIGF-I的表达载体，具体的，该表达载体的制备方法包括如下步骤：
(2)先合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子，其中大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的编码序列如序列表中SEQ ID No：3所示；并在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列的5′端和3′端分别引入PSTI和XbaI限制酶切位点，得到含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因。
(2)将天然的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的编码序列：ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCA(如序列表中SEQ ID No：4所示)与上述实施例2得到的DesIGF-I的编码基因序列合并合成大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽加重组DesIGF-I的串联编码序列，并在其5′端设计XbaI限制性酶切位点和引入SD序列，在3′端设计引入EcoRI酶切位点，得到大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和DesIGF-I的串联基因(STII-DesIGF)，其具体的序列如下：TCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAAGAATTC3′(如序列表中SEQ ID No：9所示)。
(3)参照附图6，将原始质粒载体pBR322(其图谱如附图1所示)用限制性内切酶PstI与EcoRI进行酶切，去除约900bp的片段，胶回收得到的剩下的大片段(其图谱如附图2所示)，备用；接着，用限制性内切酶PSTI和XbaI处理上述含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因，胶回收含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段；然后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI处理上述人工合成的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和DesIGF-I的串联基因，胶回收含热稳定肠毒素II信号肽和DesIGF-I的串联基因片段；再接着，将上述胶回收剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和DesIGF-I的串联基因片段按1∶1∶1的等摩尔比进行混合，并加入T4-DNA连接酶，放置在4℃的温度条件下过夜，得到混合物，混合物中质粒载体pBR322剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和DesIGF-I的串联基因片段便可依次连接形成一个完整的环形表达操纵子，其序列如序列表中SEQ ID No：10所示。
(4)将上述得到混合物转化DH5α感受态细胞，然后挑选转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI、PSTI进行酶切鉴定。结果表明用EcoRI能切出约750bp的片段，与预计的一致。最后，将测序正确的质粒进行保存，即可得到用于制备DesIGF-I的表达载体，该表达载体命名为pPT-DesIGF(其图谱如附图7所示)。
实施例7
该实施例提供了一种用于制备DesIGF-I的宿主细胞以及一种DesIGF-I的制备方法，具体的，先将上述实施例6得到的表达载体转化大肠杆菌空宿主W3110(W3110为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的市售产品)，得到用于制备DesIGF-I的宿主细胞；接着，将宿主细胞涂在含有浓度为5μg/ml的四环素抗性基因的LB琼脂平板上，并挑选6个得到的转化子接种于pH为7.2的FA培养基中，得到pPT-DesIGF工程菌，其中FA培养基的成分包括：质量分数为0.1％葡萄糖、质量分数为1.5％酸水解酪蛋白、质量分数为0.1％酵母抽提物、质量分数为0.04％MgSO4、质量分数为0.5％的(NH4)2SO4、质量分数为0.4％的KCl以及摩尔浓度为0.12mol/L的三乙醇胺；然后将pPT-DesIGF工程菌在37℃条件下过夜摇瓶培养24小时后，用SDS-PAGE电泳鉴定其表达结果，结果表明，DesIGF-I可以分泌至培养基中，其表达量约为0.35mg/ml。
实施例8
该实施例提供了一种用于制备Lr3IGF-I的表达载体，具体的，该表达载体的制备方法包括如下步骤：
(3)先合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子，其中大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的编码序列如序列表中SEQ ID No：3所示；并在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列的5′端和3′端分别引入PSTI和XbaI限制酶切位点，得到含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因。
(2)将天然的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的编码序列：ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCA(如序列表中SEQ ID No：4所示)与上述实施例3得到的Lr3IGF-I的编码基因序列合并合成大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽加重组Lr3IGF-I的串联编码序列，并在其5′端设计XbaI限制性酶切位点和引入SD序列，在3′端设计引入EcoRI酶切位点，得到大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和Lr3IGF-I的串联基因(STII-Lr3IGF)，其具体的序列如下：TCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAATGTTTCCGGCCATGCCGCTGAGCAGCCTGTTTGTGAATGGTCCGGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAATTCGTTTGCGGTGACCGTGGTTTCTACTTCAACAAACCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCTCGTCGTGCTCCGCAGACCGGTATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGACCTGCGTCGTCTGGAAATGTACTGCGCTCCGCTGAAACCGGCTAAATCTGCTTAATAAGAATTC3′(如序列表中SEQ ID No：11所示)。
(3)参照附图8，将原始质粒载体pBR322(其图谱如附图1所示)用限制性内切酶PstI与EcoRI进行酶切，去除约900bp的片段，胶回收得到的剩下的大片段(其图谱如附图2所示)，备用；接着，用限制性内切酶PSTI和XbaI处理上述含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因，胶回收含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段；然后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI处理上述人工合成的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和Lr3IGF-I的串联基因，胶回收含热稳定肠毒素II信号肽和Lr3IGF-I的串联基因片段；再接着，将上述胶回收剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和Lr3IGF-I的串联基因片段按1∶1∶1的等摩尔比进行混合，并加入T4-DNA连接酶，放置在4℃的温度条件下过夜，得到混合物，混合物中质粒载体pBR322剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和Lr3IGF-I的串联基因片段便可依次连接形成一个完整的环形表达操纵子，其序列如序列表中SEQ ID No：12所示。
(4)将上述得到混合物转化DH5α感受态细胞，然后挑选转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI、PSTI进行酶切鉴定。结果表明用EcoRI能切出约800bp的片段，与预计的一致。最后，将测序正确的质粒进行保存，即可得到用于制备Lr3IGF-I的表达载体，该表达载体命名为pPT-Lr3IGF(其图谱如附图9所示)。
实施例9
该实施例提供了一种用于制备Lr3IGF-I的宿主细胞以及一种Lr3IGF-I的制备方法，具体的，先将上述实施例8得到的表达载体转化大肠杆菌空宿主W3110(W3110为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的市售产品)，得到用于制备Lr3IGF-I的宿主细胞；接着，将宿主细胞涂在含有浓度为5μg/ml的四环素抗性基因的LB琼脂平板上，并挑选6个得到的转化子接种于pH为7.2的FA培养基中，得到pPT-Lr3IGF工程菌，其中FA培养基的成分包括：质量分数为0.1％葡萄糖、质量分数为1.5％酸水解酪蛋白、质量分数为0.1％酵母抽提物、质量分数为0.04％MgSO4、质量分数为0.5％的(NH4)2SO4、质量分数为0.4％的KCl以及摩尔浓度为0.12mol/L的三乙醇胺；然后将pPT-Lr3IGF工程菌在37℃条件下过夜摇瓶培养24小时后，用SDS-PAGE电泳鉴定其表达结果，结果表明，Lr3IGF-I可以分泌至培养基中，其表达量约为0.35mg/ml。
实施例10
该实施例提供了一种pPT-IGF工程菌的发酵培养和分离纯化方法，具体的，先选用的发酵培养基为半合成培养基，其配方如下：MgSO4 12g、KH2PO4 5g、K2HPO4·3H2O 25g、MgSO4、12g、KH2PO4 5g、K2HPO4·3H2O 25g、NaCl 20g、(NH4)2SO4 30g、葡萄糖8g、酵母粉40g、蛋白胨90g、微量元素8ml，其余的为水，定容4.5L；其中，微量元素的配方如下：FeCl3·6H2O10g、CoCl2·6H2O 2.1g、CuSO4·5H2O 2.4g、NaMoO4·2H2O 5.2g、浓盐酸50ml、H3BO3 2.4g，其余的为水，定容1L。
取500ul实施例5中得到的pPT-IGF工程菌，接入300ml的LB培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10小时，以4％的接种量接入装有上述4.5L发酵培养基的10L发酵罐中进行发酵。发酵温度设定为37℃，通气量为4ml/min，pH为7.0，初始搅拌为200rpm，溶氧控制在20％以上；另外，在初始葡萄糖耗尽后流加50％葡萄糖，培养9小时后菌体浓度OD600为50左右，开始流加补料(5％的蛋白胨)；然后继续培养12小时后收集菌体。
取上述接有pPT-IGF工程菌的发酵培养基上清液用截留分子量为5kD的超滤膜进行超滤浓缩，去除分子量小于5kD的杂质和色素，并浓缩至1/8的体积，通过不断补入10mmol/L的Tris(三羟甲基氨基甲烷，pH为7.5)来置换成色素；接着，在超滤液中加入硫酸铵至摩尔浓度为0.5mol/L，并装入Phenyl Sepharose 6FF层析柱。其中，层析柱预先用0.5mol/L的硫酸铵平衡，再用10mmol/L的Tris(pH为7.5)洗脱，收集含IGF-I组分；然后，用50mmol/L的醋酸钠(pH为6.5)缓冲液将Phenyl Sepharose 6FF洗脱液组分稀释10倍后上CMSepharose 6FF层析柱，先用50mmol/L的醋酸钠(pH为6.5)和0.1mol/L的NaCl洗杂，再用0.3mol/L的NaCl洗脱，便可收集纯化的IGF-I组分，其中pPT-IGF工程菌分离纯化后的SDS-PAGE电泳结果如附图10所示。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因，所述的人胰岛素样生长因子-I的类似物为截短型人胰岛素样生长因子-I或长链人胰岛素样生长因子-I，其特征在于，所述人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：2所示；所述截短型人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：7所示；所述长链人胰岛素样生长因子-I的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：8所示。
2.一种含有如权利要求1所述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体是通过将大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽与所述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因依次连在一起，并克隆至质粒载体pBR322中得到的。
4.根据权利要求3所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体的制备方法包括以下步骤：先用限制内切酶PstI与EcoRI将质粒载体pBR322进行酶切，去除800-1000bp的片段；接着，将剩下的大片段与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和所述人胰岛素样生长因子-I或其类似物的编码基因用T4-DNA连接酶连接成一个完整的环状表达操纵子，得到所述的表达载体。
5.根据权利要求3或4所述的一种表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的序列如序列表中SEQ ID No：3所示。
6.根据权利要求3或4所述的一种表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的序列如序列表中SEQ ID No：4所示。
7.一种包含如权利要求2-6中任一项所述的表达载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
9.一种人胰岛素样生长因子-I或其类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求7-8任一项所述的宿主细胞进行表达和分泌，得到所述的人胰岛素样生长因子-I或其类似物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910426492.3A CN111763680A (zh) | 2019-05-22 | 2019-05-22 | 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910426492.3A CN111763680A (zh) | 2019-05-22 | 2019-05-22 | 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111763680A true CN111763680A (zh) | 2020-10-13 |
Family
ID=72718277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910426492.3A Pending CN111763680A (zh) | 2019-05-22 | 2019-05-22 | 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111763680A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5444045A (en) * | 1992-09-17 | 1995-08-22 | Gropep, Pty. Ltd. | Method of administering IGF-1, IGF-2, and analogs thereof to birds |
| US6310040B1 (en) * | 1991-11-08 | 2001-10-30 | Cephalon, Inc. | Treating retinal neuronal disorders by the application of insulin-like growth factors and analogs |
| CN103882015A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-06-25 | 席玥 | 一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用 |
| CN104561020A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-04-29 | 苏州金诺生物技术有限公司 | 一种重组人生长激素的编码基因及其应用 |
| US20170096469A1 (en) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. | Bi-Specific Therapeutic Proteins for Tissue Repair |
-
2019
- 2019-05-22 CN CN201910426492.3A patent/CN111763680A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6310040B1 (en) * | 1991-11-08 | 2001-10-30 | Cephalon, Inc. | Treating retinal neuronal disorders by the application of insulin-like growth factors and analogs |
| US5444045A (en) * | 1992-09-17 | 1995-08-22 | Gropep, Pty. Ltd. | Method of administering IGF-1, IGF-2, and analogs thereof to birds |
| CN103882015A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-06-25 | 席玥 | 一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用 |
| CN104561020A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-04-29 | 苏州金诺生物技术有限公司 | 一种重组人生长激素的编码基因及其应用 |
| US20170096469A1 (en) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. | Bi-Specific Therapeutic Proteins for Tissue Repair |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵大鹏: "人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）中试工艺的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库, no. 4, pages 69 - 70 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| EP0128733B1 (en) | Human insulin-like growth factor (igf) produced from a recombinant host, process, expression vector and recombinant host therefor, and igf-containing pharmaceutical composition | |
| Oka et al. | Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli. | |
| EP0035384B1 (en) | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence | |
| JP2622479B2 (ja) | ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド | |
| US5691169A (en) | Process for preparing a desired protein | |
| RU2094439C1 (ru) | Рекомбинантный полипептид pgh(a) с n-концевым аланином | |
| CA2385857C (en) | C peptide for improved preparation of insulin and insulin analogs | |
| WO1984004330A1 (en) | Secretion of exogenous polypeptides from yeast | |
| EP0163406B1 (en) | Novel polypeptide expression method | |
| JPS6253999A (ja) | インシユリン類似体 | |
| JPH10501413A (ja) | 合成リーダーペプチド配列類 | |
| IE840975L (en) | Human insulin - like growth factor. | |
| WO2020187271A1 (zh) | 利用双质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸 | |
| CN112584853B (zh) | 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法 | |
| EP0996713B1 (en) | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin | |
| CA2076320C (en) | Process for producing peptide | |
| EP0026598A1 (en) | DNA transfer vectors for human proinsulin and human pre-proinsulin, microorganisms transformed thereby, and processes involving such substances | |
| KR100989413B1 (ko) | 새로운 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| Kang et al. | Effect of modification of connecting peptide of proinsulin on its export | |
| CN111094572B (zh) | 一种密码子优化的人胰岛素类似物前体基因和信号肽基因 | |
| CN111763680A (zh) | 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 | |
| CN102732549B (zh) | 一种重组胰岛素样生长因子-i的制备方法 | |
| Mayne et al. | Direct expression of human growth in Escherichia coli with the lipoprotein promoter | |
| JP2007501622A (ja) | 組換えポリペプチドを精製するための方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Hangzhou Jiedi Biotechnology Co.,Ltd. Person in charge of patents Document name: Notification of Nth Examination Opinion |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |