CN104561020A - 一种重组人生长激素的编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效分泌表达重组人生长激素的工程菌的构建方法，属于医药生物工程技术领域。发明中人生长激素基因为优化了密码子的基因，表达载体包含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA)、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽(ST Ⅱ)编码序列，能够使重组人生长激素在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，有利于产业化。

Description

一种重组人生长激素的编码基因及其应用

技术领域

本发明属于医药生物工程领域，具体涉及一种重组人生长激素的编码基因，及其应用。

背景技术

人生长激素(Human Growth Hormone,hGH)是由脑垂体侧翼的成群排列的生长激素细胞(α细胞)分泌的一种单一肽链、非糖化的亲水性蛋白质激素,是人类出生后促进生长最重要的激素,具有调节人体生长代谢等多重功能。人生长激素含有191个氨基酸残基,分子量为21700Da,等电点为4.9。晶体结构分析表明,人生长激素包含4个反平行α-螺旋,每个螺旋长度有20-31个氨基酸,其中三个α螺旋起关键作用。N端和C端螺旋(I和Ⅳ)较另两个(Ⅱ和Ⅲ)大,序列比较显示α螺旋区相对分子其他部分保守。分子在53位和165位、182位和189位之间各由一组二硫键连接,对形成正确的蛋白质分子构象具有重要意义。

生长激素能影响几乎所有类型的组织和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖类及脂肪的代谢，对人体新陈代谢等各种生理功能有广泛的调节功能。

重组人生长激素在临床上已广泛应用，在我国主要应用于儿童内源性生长激素缺乏引起的矮小症、Turner综合症、成人GHD、烧伤及创伤的修复等症的治疗。随着临床研究的深入，在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面有很好的疗效。

大肠杆菌作为目前最为方便简易的重组蛋白表达系统，结构复杂的异源蛋白在其胞质中表达时常形成包涵体而失去活性，在纯化提取时需要经过变性复性步骤，不仅条件难于控制，目的产物的活性和收率也损失很大，从而对实际生产应用形成了制约。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明申请人进行研究探索，寻找一种能够高效表达并分泌重组人生长激素的方案。

为此，本发明提供下列技术方案：

本发明提供一种人生长激素的编码基因，其中，所述基因的序列如SEQ IDNo.2所示。所述基因是使用大肠杆菌偏爱的密码子的人生长激素编码基因。

本发明还提供一种表达载体，其中，所述表达载体包含上述的人生长激素的编码基因。

优选的，所述表达载体是质粒。

更优选的，所述表达载体包括人生长激素编码序列(SEQ ID No.2)、大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列。

更优选的，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列如SEQ ID No.3所示、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列如SEQ ID No.4所示。

更优选的，所述表达载体中，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.2依次连接，通过EcoRI位点克隆至改造后的pBR322中得到的表达质粒，命名为pPS-hGH。

更优选的，所述的改造后的pBR322质粒为用PstI与EcoRI将原始载体pBR322酶切，去除约700bp核苷酸片段，再用约10bp核苷酸片段重新连接成环状。

本发明还提供一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含上述任一的表达载体。

优选的，所述宿主细胞是大肠杆菌。

更优选的，所述大肠杆菌是W3110大肠杆菌菌株。

更优选的，所述宿主细胞是：用上述任一的表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为PS-hGH。

本发明还提供一种重组人生长激素的制备方法，其中，所述制备方法，包括将上述任一的宿主细胞在合适的条件下表达并分泌所述重组人生长激素。

本发明选择使用大肠杆菌偏爱的密码子的人生长激素编码基因，使宿主细胞的表达效率更高，使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列能够更加有效地对生长激素基因进行转录与分泌引导。工程菌可获得较高的重组人生长激素产量(重组人生长激素含量可达总蛋白的40％以上)。同时，分泌型表达的重组人生长激素在纯化工艺上比较简单。将发酵菌体放入低渗溶液中，细胞壁的通透性增加，表达于细胞周质中的目的蛋白进入到溶液中。离心去除菌体，上清液经盐析与多步层析得到生长激素纯品。由于分泌型表达的重组人生长激素的一级结构及空间构象与人体自身分泌的生长激素完全相同，此类重组人生长激素具有与人体内源生长激素同等的活性。本发明制备的生长激素有利于工业规模的生产和加工，本发明提供的表达重组人生长激素的工程菌在生长激素的生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：表达载体pBR322图谱

图2：改造后pBR322图谱

图3：表达载体pPS-hGH酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果照片，其中1.DNAmarker DL2000；2.DNAmarkerλHindⅢ；3.酶切产物

图4：pPS-hGH质粒图谱

图5：工程菌PS-hGH摇瓶实验SDS-PAGE电泳结果及westernblot鉴定结果照片

图6：人生长激素标准品的HPLC图谱

图7：工程菌PS-hGH表达纯化的人生长激素HPLC图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例1构建重组人生长激素分泌表达质粒pPS-hGH

(1)设计并合成人生长激素基因序列。根据大肠杆菌密码子偏爱性，在人天然生长激素基因序列(SEQ ID No.1)基础上设计密码子优化的人生长激素的编码序列如SEQ ID No.2所示。

(2)合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列(SEQ ID No.3)、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽(SEQ ID No.4)的编码序列。

(3)改造原始pBR322质粒

合成两条引物：5’AATTCCCTGCCCTGCA3’(SEQ ID No.5)与5’GGGCAGGG3’(SEQ ID No.6),将二者等量混合，于95℃放置5分钟，再以每分钟10℃的温差进行降温处理，直至降到25℃。

用限制性内切酶EcoRI和PstI处理质粒pBR322(图1)，胶回收大片段，与上述两条引物的退火混合物混合，加入T4DNA连接酶，于4℃放置过夜。转化大肠杆菌DH5α，对转化子进行测序鉴定，连接正确的质粒即为改造后的pBR322(图2)。

(4)构建重组人生长激素分泌表达质粒pPS-hGH

合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列与大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列(phoA+STⅡ)，采用重叠PCR技术将phoA+STⅡ序列同密码子优化的人生长激素基因序列连接在一起。具体步骤如下：

设计并合成引物：

引物1：agcggaattcaacttctccatactttg(SEQ ID No.7)

引物2:tatagttgggaatgcataggcatttgtag(SEQ ID No.8)

引物3:ctacaaatgcctatgcattcccaactataccac(SEQ ID No.9)

引物4:cttagaattcctagaagccacagctgccct(SEQ ID No.10)

以合成或从其他已知载体上(如pGCSF)扩增的大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列(phoA+STⅡ)为模板，用引物1与引物2扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列与大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽的编码序列(phoA+STⅡ)，以人工合成的人生长激素基因为模板，用引物3与引物4扩增人生长激素基因序列；将引物1、引物2扩增产物与引物3、引物4扩增产物混合，经历以下程序3个循环：95℃30s,45℃30s，72℃30s,胶回收扩增的片段，用EcoRI消化，与同样用EcoRI消化的改造后pBR322混合，加入T4DNA连接酶，4℃连接过夜。次日转化大肠杆菌DH5α，挑选转化子，提质粒，用EcoRI进行酶切鉴定，结果见图3，结果表明用EcoRI能切出约1000bp的片段，与预计一致。将测序正确的质粒保存，命名为pPS-hGH(图4)。

实施例2制备重组人生长激素分泌表达工程菌PS-hGH

用质粒pPS-hGH转化大肠杆菌空宿主W3110，涂四环素抗性(10ug/ml)的LB琼脂平板，将得到的转化子接种于FM培养基中，37℃摇瓶培养过夜(24小时)，SDS-PAGE电泳鉴定表达结果，优选得到高效分泌表达重组人生长激素的工程菌PS-hGH。用同样方法构建含有天然人生长激素基因序列(SEQ IDNo.1)的工程菌，与本发明的工程菌PS-hGH共同进行表达量比较。

其中，FM培养基成分：

0.15％ 葡萄糖

1.0％ 酸水解酪蛋白

0.5％ 酵母抽提物

0.02％ MgSO4

0.30％ KCl

0.12％ NaCl

0.12M三乙醇胺 pH7.4。

SDS-PAGE电泳结果如图5所示，泳道设计：1、Marker；2、本发明工程菌PS-hGH诱导后；3、诱导前；4、含天然人生长激素基因序列(SEQ ID No.1)的工程菌诱导后。将SDS-PAGE的第二条带点转移到硝酸纤维膜上，以羊抗hGH抗体为一抗，兔抗羊辣根酶标记抗体为二抗进行蛋白印记试验。蛋白印记实验结果表明，所表达带为重组人生长激素蛋白，见图5中泳道5。

从电泳结果可见，密码子优化后的人生长激素基因比天然人生长激素基因的表达水平高，前者约占蛋白总量的40％，后者约占30％。采用统计学方法对多次表达产物的比例进行统计分析表明，密码子优化前后的人生长激素基因在表达水平上差异显著。

实施例3

重组人生长激素的纯化与鉴定

(1)菌体用20mM PB(pH7.0)缓冲液以1:6比例溶解，即1g菌体加入6ml 20mM PB(pH7.0)缓冲液，4℃温和搅拌溶解2小时后进行离心，收集离心上清，按190g/L加入硫酸铵，放置过夜盐析，12000rpm离心30分钟，沉淀用20mM PB(pH7.0)缓冲液溶解后透析24小时。

(2)DEAE-Sepharose fastflow层析

用20mM PB(pH7.0)起始缓冲液平衡5个柱床体积，将平衡透析后的样品以50ml/h流速加入柱内，加样结束后，以含0.05M的20mM PB(pH7.0)缓冲液洗脱，收集目的峰。

(3)SephacrylS-100凝胶过滤

用20mM PB(pH7.0)缓冲液平衡2个柱床体积，以2ml/min的流速将步骤2洗脱峰加入柱内，以4.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的重组人生长激素。收率可达40％以上。保留含目的蛋白的洗脱峰液，用高效液相法测定蛋白纯度。洗脱液浓缩后加入保护剂并除菌过滤即为半成品原液。测定其生物学活性。

(4)重组人生长激素的HPLC鉴定

以人生长激素标准品作为对照，用HPLC鉴定实施例3中获得的纯化产物。

柱子：protein-pak125

流动相：20mM pH7.0PB

检测波长：280nm，

上样量：100μl

所得HPLC图谱见图6、图7。图6为人生长激素标准品的HPLC图谱，图7为本发明工程菌表达纯化产物的HPLC图谱，二者出峰时间一致。

(5)生长激素生物活性检测

根据去垂体大白鼠体重法进行检测，通过计算，本申请方法制备的rhGH与标准品具有相同的生物活性。

Claims (8)

1.一种人生长激素的编码基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ IDNo.2所示。

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述编码基因。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是将大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽与人生长激素基因编码序列(SEQ ID No.2)顺次连在一起，克隆至改造后的pBR322中得到的表达质粒，命名为pPS-hGH。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的序列如SEQ ID No.3所示，所述大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽序列如SEQ ID No.4所示。

5.如权利要求3-4任一所述的表达载体，其特征在于，改造后的pBR322质粒为用PstI与EcoRI将原始载体pBR322酶切，去除约700bp核苷酸片段，再用约10bp核苷酸片段重新连接成环状。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求2-5任一所述的表达载体。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。

8.一种重组人生长激素的制备方法，其特征在于，将权利要求6-7任一所述的宿主细胞在合适的条件下表达并分泌人生长激素。