CN101760470A - 一种制备重组人生长激素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组人生长激素的方法，解决现有利用大肠杆菌表达重组人生长激素的方法均存在各自不同的缺点以及得到的人生长激素活性低、纯度低等问题，包括构建人生长激素基因克隆，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列，再加入PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，最后利用Factor Xa蛋白酶去除HIS标签，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体，得到的人生长激素产品纯度高，产量高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。

Description

一种制备重组人生长激素的方法

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组人生长激素的方法。

背景技术

人生长激素(human growth hormone，HGH)，又称为促生长素(somatotorpin)，是由191个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子质量在22kD左右，等电点P1为4.9，分子中存在两对二硫键。人生长激素是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素。脑垂体在下丘脑生长激素释放因子的刺激下，便能释放生长激素，而生长激素抑制素则能抑制它的释放。HGH的受体遍及人的全身。HGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞膜上特异性受体结合后，改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。

人生长激素对几乎人体所有组织(除神经组织外)都有促生长功能，还能促使脂肪、糖类的降解，增进蛋白质和核酸的合成。人们发现，生长激素含量的变化影响到人体的多个系统，包括免疫系统，循环系统，泌尿系统等。在临床上面，HGH传统上主要用于治疗儿童自发性的垂体型侏儒症，安全有效。近些年来，人们逐渐将其应用到了烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松、肥胖及衰老等疾病。

生长激素的种属特异性很强，不同物种的生长激素的差别很大。传统临床应用的生长激素是从人脑的垂体中提取的，价格昂贵无法推广，一个人的垂体中最多只能提取出3～5mg的人生长激素。20世纪80年代之后，分子生物学的出现带动了生产重组蛋白的发展，使得利用基因工程的方法大规模生产HGH成为可能。这样可以得到与天然人生长因子相似或者完全一致的基因工程药物。1985年美国FDA首次批准基因技术生产的重组人生长激素用于临床治疗和使用，其需求量和销售额在基因工程药物中排前列。

传统的利用大肠杆菌表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型的重组人生长激素，一种则是生产胞内型。经实践验证，生产分泌型的重组人生长激素，虽然步骤简单，杂蛋白干扰较少，氧化型的环境利于蛋白折叠，但是其表达量很低，一般要和胞内型要差1个数量级以上。但是生产胞内型的蛋白却又存在工艺步骤复杂、杂蛋白干扰较多等缺点。此外，采用上述两种方法所得到的人生长激素还存在活性低、纯度低等缺点。

发明内容

本发明为了解决现有利用大肠杆菌表达重组人生长激素的方法均存在各自不同的缺点以及得到的人生长激素活性低、纯度低等问题，提供一种制备重组人生长激素的方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种制备重组人生长激素的方法，包括以下步骤：(1)根据人生长激素HGH全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列nHGH，然后在nHGH基因序列的5`末端依次增加两段基因序列，分别为Factor Xa蛋白酶切位点序列FX和HIS标签序列HIS6，得到表达基因片断HIS6-FX-nHGH；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并在其3`末端加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶切位点序列pp，构建得到PDI-pp，然后将其连接到基因片断HIS₆-FX-nHGH的5`末端，最后一起克隆进入pET-21b载体，即重组为表达载体pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH，简称21b-nHGH，相应表达出的重组蛋白为PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH；(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH转化至大肠杆菌ORIGAMI，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出中间阶段的HIS6-FX-nHGH蛋白，得到含有人生长激素的溶液；(4)将含有人生长激素的溶液进行纯化处理，得到含有人生长激素的精品。上述HGH基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示。

为了得到和天然序列完全一致的HGH蛋白，本发明利用Factor Xa蛋白酶去除HIS₆的标签，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体，具体做法是将步骤(3)得到的含有HIS₆-FX-nHGH蛋白的溶液调整到pH为8.0，加入Factor Xa蛋白酶进一步酶切，最终释放出和人体中天然的HGH蛋白序列完全一致的蛋白nHGH。

上述步骤中，替换掉人生长激素HGH全序列中大肠杆菌不利表达的密码子的方法是本领域的普通技术人员熟知的，所得到的优化基因序列nHGH如序列表中所示SEQ ID NO：2；所述HIS标签序列HIS6即为六个连续的组氨酸，其序列也是本领域的普通技术人员公知的；分子伴侣PDI的全长基因序列以及蛋白酶切位点序列pp也是公知的，其中分子伴侣PDI的全长基因序列如序列表中所示SEQ ID NO：3；对于将含有人生长激素的溶液进行纯化处理的方法，在现有技术中有很多中，但是大都存在纯化率低、纯化工序复杂等缺点，本发明提供一种最简单的、纯化率较高的最佳方法，具体如下：

步骤(4)中对含有人生长激素的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，60mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到人生长激素的精品。

PDI伴侣分子对于HGH的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和HGH的相对位置是可变的，所以伴侣分子PDI和nHGH最终的重组蛋白包含nHGH-PDI或PDI-nHGH或HIS6-nHGH-PDI或HIS6-PDI-nHGH中的任意一种，均可以提高HGH的可溶性表达。

与现有技术相比，利用本发明的基因重组表达方法，首先，采用胞内型表达的方式来提高蛋白产量；第二，采用优化的nHGH序列去除了稀有密码子的影响，进一步提高目的蛋白产量；第三，加入分子伴侣PDI蛋白来帮助HGH蛋白在胞内环境中正确折叠，保证提出蛋白的活性；第四，为了简化后续的纯化工艺，加入了HIS₆的标签辅助纯化，保证目的蛋白快速高效的分离；第五，为了得到和天然序列完全一致的HGH蛋白，最后利用Factor Xa蛋白酶去除HIS₆的标签，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体。总之本发明所述的方法可以兼顾表达产量，纯化工艺、产物活性和最终的氨基酸组成，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为pET-21b的质粒示意图谱；

图2为图1的展开构建示意图，显示pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH的质粒构建方法；

图3为基因21b-nHGH经双酶切后的酶切鉴定电泳图；

图4为提纯产物中HIS₆-FX-nHGH和HGH含量、纯度的SDS-PAGE结果示意图；

图5为提纯产物HGH含量的ELISA法检测结果示意图；

图6为鉴定提纯产物精确分子量的质谱检测结果示意图。

具体实施方式

实施例一：nHGH基因表达载体的构建及表达：

1)构建pET-21b-PDI-pp的备用载体

设计PDI的引物，包含酶切位点，从5`-3`排列如下所示：

PDI-S：GAGATATA CATATG GACGCCCCAGAGGAGGAGGACC

PDI-a：GCG GGATCC GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAG

CAGTTCATCTTTCAC

引物稀释成50pmol/ul，然后进行PCR步骤。

PCR反应体系50ul：

ddH₂O：             40ul

10*PCR BUFFER       5ul

dNTP                1ul

模板：              1ul

上/下游引物：       1ul

pfu酶               1ul

PCR反应条件(Tag酶)：

94℃  8min

94℃  30s

65℃  30s

72℃  1min    30循环

72℃  10min    

琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于1600bp左右，胶回收目的基因，用Nde I和BamH I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET-21b载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-PDI-pp载体。

2)人生长激素(human growth hormone，简称HGH)全长序列如序列表中所示SEQ ID NO：1；

替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列nHGH，如序列表中所示SEQ ID NO：2

针对nHGH序列设计全套引物，全部从5`-3`排列如下所示：

nHGHs-FX(P1)：ATCGAAGGTCGTTTCCCAACCATTCCCTTATCC

nHGHs-HIS-FX(P2)：CCAT AGATCTg CACCACCACCATCATCACATCGAAGGTCGTTTCC

nHGHa(P3)：CCG GAATTC TTATCA GAAACCGCAGGAACCTTCC

引物稀释成50pmol/ul待用。然后利用热启动PCR的方法逐步将HIS₆-FX-nHGH基因克隆出来，PCR的顺序为：利用P1和P3为上下游引物，PCR得到产物FX-nHGH；再将其稀释50倍作为模版利用P2和P3作为上下游引物，PCR得到产物HIS₆-FX-nHGH。

PCR反应条件：

94℃  8min

94℃  30s

65℃  30s

72℃  30s    20循环

94℃  30s

55℃  30s

72℃  30s    20循环

72℃  10min

反应结束之后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与600bp位置左右的一条亮带即为目的基因(HIS₆-FX-nHGH)的大小。

凝胶回收目的基因，用限制性内切酶Bgl II和EcoR I将其切成粘性末端，用BamHI和EcoR I处理pET-21b-PDI-pp载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH载体(简写为21b-nHGH)。如图3所示，左边为碱基标准长度对照，右边为21b-nHGH载体利用PCR的方法鉴定HGH基因的插入，图示显示载体中克隆得到了符合nHGH长度大小的条带，证明载体构建成功。上述HGH基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示，质粒pET-21b的图谱来自商业化的试剂盒，扩增的序列经过设计插入其中的多克隆位点中。

3)将正确的21b-nHGH质粒转化大肠杆菌ORIGAMI，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG储液，30℃培养4-6小时(时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1∶100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1∶1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与21b-nHGH菌体混合(菌体质量比值约为1∶50)。

4)配制适合保存酶活的缓冲体系：

Tris：    6.057g/L

NaCl：    2.925g/L

甘油：    50ml/L

用缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌(可选)，用冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃)，12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0左右，振荡反应约4h(冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出HIS₆-FX-nHGH蛋白，此时所得溶液为高浓度的含有重组HIS₆-FX-nHGH的蛋白溶液。该溶液可用下述实施例3的方法对其浓度及活性进行鉴定。

5)进一步切除多余蛋白序列

如果根据实际要求需要切除掉HIS标签获得纯天然的蛋白，可以用FactorXa蛋白酶进一步处理纯化后的nHGH蛋白。将HIS₆-FX-nHGH蛋白溶液调整到PH＝8.0，0.1M NaCl，2mM CaCl₂，在23℃左右的环境中加入Factor Xa即可。1ug的Factor Xa可以在6小时之内酶切超过50ug的融合蛋白，效率很高。切除完后的溶液可以再利用镍离子亲和柱去处没有切除干净的融合蛋白和切下来的HIS标签，这样可以快速得到序列和天然蛋白完全一致的HGH蛋白溶液。该溶液可用下述实施例3的方法对其浓度及活性进行鉴定。

实施例二：nHGH原液提纯蛋白

在高浓度的含有HIS₆-FX-nHGH或HGH的蛋白溶液中，调整其PH值到8.0。配制上柱缓冲液：

MCAC-15                        MCAC-1000

20mM Tris盐酸PH10.0            20mM Tris盐酸PH10.0

0.5M NaCl                      0.5M NaCl

10％(v/v)甘油(可调整至20％)    10％(v/v)甘油

15mMol/L  咪唑                 1M咪唑

用MCAC-15溶液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后把柱材和nHGH溶液共育，室温(冰上更佳)轻摇30min。然后上柱，用MCAC-60洗脱杂蛋白，最后用MCAC-250洗脱目的蛋白。将所得产物透析过夜，即得到高纯度的HIS₆-FX-nHGH精品或HGH精品。

实施例三：纯化后HGH精品的鉴定

首先利用SDS-PAGE鉴定表达产物的浓度：

样品处理液：SDS 1g，Glycerol 5mL，溴酚蓝(BPB)固体痕量，二硫苏糖醇(DDT)2.5mL，B液25mL，加去离子水至50mL

取酶切后nHGH溶液10ul，加入2ul样品处理液，至沸水浴5分钟。点样量为5ul/孔。标准蛋白分子量同样处理。用考马氏亮蓝R-250染色。如图4所示，进行SDS-PAGE分析和活性检测，最左边一道为蛋白质分子量对照，中间为HIS₆-FX-nHGH样品，右边为最终酶切后的HGH样品。初步鉴定提取出蛋白的种类。

表达产物的鉴定：

利用人生长激素(GH)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉中美科技有限公司，货号E0044h)来鉴定溶液中的HGH含量。将其中的HGH标准品用样品稀释液稀释至1ml，至浓度为10ug/ml。然后将待测样品(包括HIS-FX-HGH和FactorXa酶切后的HGH两种样品)均作10000倍稀释，作为起始浓度。将标准溶液和待侧溶液做4倍的梯度稀释，按照100ul的体积加入检测用板中。酶标板加上盖或覆膜，37度温育2小时。然后依次加入检测液A，检测液B，底物溶液和终止液完成检测。用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。实验结果如图5显示，得到的HIS-FX-HGH和HGH样品均被检测到，浓度大约是100ug/ml。

如图6所示，利用4800 MALDI-TOF/TOF Protemics Analyzer(AppliedBiosystems，USA)检测提纯得到的HIS-FX-HGH蛋白样品。此蛋白序列包括全部的HGH序列和前面的标签部分，计算得到分子量为23.88K，实测结果为23.86K，证明蛋白序列正确，实验中以BSA蛋白作为标准对照。

SEQUENCE LISTING

<110>杨霞

<120>一种制备重组人生长激素的方法

<160>3

<210>1

<211>573

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccgtcgcctg    60

taccagctgg catatgacac ctatcaggag tttgaagaag cctatatcct gaaggagcag    120

aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgct tctcagagtc tattccaaca    180

ccttccaaca gggtgaaaac gcagcagaaa tctaacctag agctgctccg catctccctg    240

ctgctcatcc agtcatggct ggagcccgtg cagctcctca ggagcgtctt cgccaacagc    300

ctggtgtatg gcgcctcgga cagcaacgtc tatcgccacc tgaaggacct agaggaaggc    360

atccaaacgc tgatgtggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaat    420

cagtcctaca gcaagtttga cacaaaatcg cacaacgatg acgcactgct caagaactac    480

gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg    540

cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc                                 573

<210>2

<211>573

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

ttcccgacta ttccactgtc tcgtctgttc gataatgcaa tgctgcgtgc gcgtcgtctg    60

taccagctgg cgtacgacac gtatcaggag ttcgaggaag catatatcct gaaagaacag    120

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<210>3

<211>1527

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

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gaggaggagg accacgtctt ggtgctgcgg aaaagcaact tcgcggaggc gctggcggcc    120

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accaaggaga acctgctgga ctttatcaaa cacaaccagc tgccccttgt catcgagttc    720

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agcttcaagg gcaagatcct gttcatcttc atcgacagcg accacaccga caaccagcgc    900

atcctcgagt tctttggcct gaagaaggaa gagtgcccgg ccgtgcgcct catcaccttg    960

gaggaggaga tgaccaagta caagcccgaa tcggaggagc tgacggcaga gaggatcaca    1020

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gttgacgacc tcgaggacct cgaagaagca gaggagccag acatggagga agacgatgac    1500

cagaaagctgtgaaagatgaactgtaa                                          1527

Claims (4)

1.一种制备重组人生长激素的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)根据人生长激素HGH全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列nHGH，然后在nHGH基因序列的5`末端依次增加两段基因序列，分别为Factor Xa蛋白酶切位点序列FX和HIS标签序列HIS6，得到表达基因片断HIS6-FX-nHGH；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并在其3`末端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，构建得到PDI-pp，然后将其连接到基因片断HIS₆-FX-nHGH的5`末端，最后一起克隆进入pET-21b载体，即重组为表达载体pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH，相应表达出的重组蛋白为PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH；

(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-PDI-pp-HIS₆-FX-nHGH转化至大肠杆菌ORIGAMI，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；

(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出中间阶段的HIS6-FX-nHGH蛋白，得到含有人生长激素的溶液；

(4)将含有人生长激素的溶液进行纯化处理，得到含有人生长激素的精品。

2.根据权利要求1所述的一种制备重组人生长激素的方法，其特征是将步骤(3)得到的含有HIS₆-FX-nHGH蛋白的溶液调整到pH为8.0，加入Factor Xa蛋白酶进一步酶切，最终释放出和人体中天然的HGH蛋白序列完全一致的蛋白nHGH。

3.根据权利要求1或2所述的一种制备重组人生长激素的方法，其特征是步骤(4)中对含有人生长激素的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，60mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到人生长激素的精品。

4.根据权利要求1或2所述的一种制备重组人生长激素的方法，其特征是伴侣分子PDI和nHGH最终的重组蛋白包含nHGH-PDI或PDI-nHGH或HIS₆-nHGH-PDI或HIS₆-PDI-nHGH中的任意一种。

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