CN109988233B

CN109988233B - 重组人生长激素及其编码基因、制备方法及应用

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Publication number: CN109988233B
Application number: CN201711327350.9A
Authority: CN
Inventors: 马永; 赵百学; 王安良; 江辰阳; 吴诚
Original assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: CN109988233A

Abstract

本发明涉及一种重组人生长激素及其编码基因、制备方法及应用，属于基因工程领域。本发明提供了一种重组人生长激素(rhGH)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化制备方法。具体涉及到：1、rhGH大肠杆菌表达菌株的构建；2、rhGH高密度发酵工艺开发；3、rhGH包涵体变性和复性工艺开发；4、复性后rhGH样品的纯化制备。通过以上4个层面的技术攻关，本专利方法生产的rhGH具有较高的生物活性，且该方法产量高、成本低廉、易于放大，能作为因缺乏生长激素而导致疾病的治疗用药物。

Description

重组人生长激素及其编码基因、制备方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组人生长激素(rhGH)及其编码基因，大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的方法，以及其在制备治疗因缺乏生长激素而引起的疾病的药物中的应用。

背景技术

人生长激素(Human Growth Hormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。含有191个氨基酸残基，分子量为22k Da左右，分子中无糖基化。人生长激素具有广泛的生理功能，几乎能影响所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。

人生长激素(hGH)在人体生长发育过程中起着重要作用，能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。h GH原来仅用于生长激素缺乏儿童矮小症，后因基因工程产品问世，临床用量足以保证，随后又将适应症范围扩大到成人生长激素缺乏、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。

生长激素的种族特异性很强，动物的生长激素人类是不能应用的，只有人类自身的生长激素才具有临床治疗功能。因此过去临床应用只能从人脑垂体提取，来源十分有限，价格也非常昂贵。到了上世纪70年代后期随着分子生物学的发展，特别是基因工程技术的发展，使得利用基因工程手段大规模生产重组人生长激素成为现实。应用DNA重组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径:一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。

本发明研究了包涵体表达形式的生长激素。一般生长激素在大肠杆菌宿主内部表达一般以包涵体形式进行表达，以使用pET28a载体为例，重组人生长激素在大肠杆菌细胞内产生不溶性包涵体，表达量通常可以达到1g/L以上。包涵体可以通过简单的对菌体裂解液离心即可收集，并且初始纯度可以达到50％左右，有利于后续纯化成本的降低。但是值得注意的是，包涵体是无活性的蛋白聚集体，因此对于包涵体形式的生长激素一般需要包涵体变复性工艺才可以部分恢复生理活性。目前关于生长激素包涵体复性的研究已经很多，很多研究成果表明包涵体复性获得的样品与天然的生长激素相比具有相当的生理活性，因此使用包涵体复性的方式进行生长激素的生产制备在技术上可行。

本发明着重研究了重组人生长激素大肠杆菌高密度发酵的生产工艺，以及包涵体的变复性和纯化工艺，从而提供生产工艺简单，成本低廉同时具有良好生物活性的重组人生长激素。

发明内容

本专利要解决的三个技术层面的问题是：1、构建符合药用蛋白要求的rhGH大肠杆菌表达菌株，实现高效表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rhGH大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发rhGH包涵体的变性和复性工艺，确立易于放大、成本低廉、工艺简单纯化方法，制备高纯度、高生物活性的rhGH。

本发明目的之一在于提供一种针对大肠杆菌表达系统密码子优化后的重组人生长激素的基因序列，如SEQ ID NO：1。

本发明目的之二在于提供一种重组人生长激素的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2。

本发明目的之三在于提供一种用于携带和表达rhGH基因的表达载体，如pET载体等；

本发明之四在于提供一种用于rhGH重组表达质粒表达的宿主，如BL21(DE3)等；

本发明之五在于提供一种表达rhGH大肠杆菌的高密度发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵。所述的高密度发酵包括如下步骤：

将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；

设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；

发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中甘油耗尽，开始进行补料培养；

待菌体生长至0D₆₀₀≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM/L的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-8h结束培养。

所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，甘油10-30g/L，七水合硫酸镁1-4g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(V/V)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

所述补料培养基的流加速度维持在25-35g/h之间

所述微量元素母液成分包括：FeSO4.7H2O 10g/L、ZnSO4.7H2O 2.25g/L、CuSO4.5H2O 15g/L、MnSO4.5H2O 5g/L、CaCl2.7H2O 1g/L、CoCl.6H2O 1g/L、Na2MoO4.2H2O1.125g/L、H3BO3 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L。

DO属于发酵过程中重要监控参数之一，对于有氧培养而言大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，同时发酵液中的氧浓度变化也是发酵过程监测和菌体生长情况的重要反馈信号之一。例如，在分批培养结束时要进行补料培养，而补料开始的信号则是DO的突然上升。一般而言，发酵液DO过低会造成菌体的生长缓慢、质粒丢失、蛋白产量低的问题；发酵液中DO过高则会导致菌体生长过快、代谢负荷过重、质粒丢失、蛋白产量低、能耗增大等问题。因此，控制发酵过程中的DO在合理区间是保证发酵结果的必要手段。一般情况下，对于高密度发酵而言，发酵的前期菌体代谢较慢可以通过提高转速和空气通气量来保证DO的稳定。随着菌体生长代谢趋于旺盛耗氧量随之提高，此时通过提高转速(转速过高会导致剪切力过大、菌体死亡及质粒丢失)和空气通气量无法满足对氧气的需求，因此需要通入纯氧以起到维持DO的作用。对于高密度发酵后期，随着生物量的增大，发酵液趋于粘稠，氧气传质下降，DO的控制会更加困难，此时氧气对于DO维持就更为重要。本发明通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-40％之间，具体来说就是，设定DO为40％，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.5-1VVM，然后通过逐渐提高转速(不超过1000转)以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。

所述发酵种子活化方法具体为：将构建好的rhGH大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。

所述发酵一级种子液制备方法为：从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到LB液体培养基中，30-37℃，220rpm摇床培养10-16h，此为一级种子液。

所述发酵二级种子液制备方法为：将一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀≈3-5之间，此为二级种子液。

上述任何用于菌体培养的器皿和培养基在使用前均应进行过滤或者湿热灭菌，任何培养基在灭菌结束冷却后使用前均应加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素以保证纯种培养。

rhGH本发明目的之五在于提供一种rhGH包涵体变性前预纯化的处理方法，通过该方法可以去除rhGH包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，降低下游纯化成本，提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。包括：菌体破碎收集后的rhGH包涵体固体颗粒使用bufferB(20-100mM Tris+0.5-5mM EDTA+100-300mM NaCl+0.5-2M脲+1mM PMSF+0.5-2％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L(包涵体质量按湿重计算)，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次→将上步收集的rhGH包涵体使用bufferC(20-100mM Tris+100-300mM NaCl+0.5-5mM EDTA+2-4M脲+1mMPMSF+0.5-2％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次→将上步收集的包涵体使用bufferD(20-100mM Tris+0.5-5mM EDTA+1-1.5M NaCl+1mM PMSF盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次→将上步收集的包涵体使用bufferE(20-100mM Tris+0.4M蔗糖+1mM PMSF盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次→将上步收集的包涵体使用去离子水重悬至10-25g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rhGH包涵体。

本发明还提供了一种rhGH包涵体变性的方法，具体包括：预纯化后的包涵体使用含有8-10M脲bufferF(50mM Tris+1mM EDTA+1mM PMSF+100mM氯化钠+5mM DTT盐酸调节pH10.5)充分重悬至50-100g/L，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物→将上步离心收集的上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步除去不溶物即得rhGH包涵体变性液。

本发明还提供了一种用于易于放大的rhGH包涵体复性方法，该方法具有成本低廉、操作简单、复性蛋白活性高的特点。该方法包括：将rhGH包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到复性缓冲液bufferG中，变性液流加的速度控制在1-2ml/min(对于5L复性缓冲液而言，其他复性体积的话进行相应的同比例缩小或者放大)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.05-0.3mg/ml之间，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于10-20℃条件下静置24-48h，复性结束。所述复性缓冲液bufferG为复性成败的关键，其主要组分包括：20-100mM Tris+5-20％甘油+0.5-5mM EDTA+1mM PMSF+1-3mM胱氨酸+3-10mM半胱氨酸+脲1-2M。

本发明还提供了一种rhGH包涵体复性后样品的纯化方法，该方法具有操作简单和易于放大的特点。所述纯化方法是使用阴离子交换层析和疏水色谱层析对rhGH包涵体复性后样品纯化，纯化后的rhGH SDS-PAGE电泳检测纯度达到95％以上。所述方法包括：将复性结束后的rhGH包涵体复性液使用超滤法浓缩换液为20mM Tris HCl，pH8.0→将换液后的rhGH样品使用QHP进行纯化→将QHP纯化后的rhGH样品合并超滤换液为20mM TrisHCl，pH8.0，然后使用20mM Tris-HCl 1.6M硫酸铵pH8.0稀释一倍，最终使用疏水层析进行纯化，电泳检测纯化后纯度。

本发明还提供上述重组人生长激素在制备治疗因缺乏生长激素而引起的疾病的药物中的应用。

本发明的主要优点在于：

1、提供的rhGH使用的大肠杆菌表达菌株和表达载体符合相关制药领域的要求，并且具有较高的目的蛋白表达量和方便下游处理的特点。

2、提供的rhGH大肠杆菌高密度发酵方法具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点，并且提供的高密度发酵工艺具有蛋白产出高的特点(达到1.5g/L以上)。

3、提供的包涵体变性溶解方法具有易于重复和放大、变性效果好的特点(90％以上)。

4、提供的包涵体复性方法具有易于放大、操作简单、复性蛋白生物活性高的特点。

5、提供的包涵体复性液纯化方法具有步骤简单(离子交换+疏水层析)、易于放大、操作简单的特点，经过二步纯化，样品纯度可以达到99％以上。

附图说明

图1：单克隆PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M：200bp DNALadder；Lane1-6：不同单菌落菌液对应的PCR产物。

图2：实施例1rhGH诱导表达后菌体SDS-PAGE鉴定图；M：蛋白质分子量标准；Lane1-6：BL21(DE3)-pET28a-rhGH不同单菌落培养物。

图3：实施例2rhGH高密度发酵产物SDS-PAGE鉴定图，M：蛋白质分子量标准；Lane1：rhGH高密度发酵产物。

图4：实施例3rhGH包涵体预纯化后变性液SDS-PAGE鉴定图，M：蛋白质分子量标准；Lane1：rhGH包涵体预纯化后变性液。

图5：实施例6第一步纯化后rhGH的还原和非还原检测，M：蛋白质分子量标准；Lane1-4：rhGH第一步纯化后的样品还原电泳检测；Lane5-8：rhGH第一步纯化后的样品非还原电泳检测。

图6：实施例6第二步纯化后rhGH的还原和非还原检测，M：蛋白质分子量标准；Lane1：rhGH复性液还原电泳检测；Lane2：rhGH复性液非还原电泳检测；Lane3-5：rhGH第二步纯化样品还原电泳；Lane6-9：rhGH第二步纯化样品非还原电泳。

图7重组人生长激素体内药效活性评价结果，其中虚线部分为注射失活供试品和标准品的平台期。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行进一步的阐述，需理解，这些实施例仅用于对本发明加以说明而不用于限制本发明。

实施例1 rhGH大肠杆菌菌株的构建和表达鉴定

发明人将hGH基因(GenBank登录号：NM_000515.4)针对大肠杆菌密码子优化、mRNA自由能优化，并将优化后的rhGH基因(SEQ NO.1)委托金斯瑞生物科技有限公司进行合成，合成后的基因被插入到了pUC57载体构建成重组克隆质粒，记为pUC57-rhGH；该质粒pUC57-rhGH使用分子克隆的手段被导入到大肠杆菌Top10(记为Top10-pUC57-rhGH)表达克隆宿主中。为了将rhGH基因从pUC57载体克隆至pET28a中，参见如下步骤：

1、取冻存于-80℃冰箱的Top10-pUC57-rhGH和DH5α-pET28a(购自南京金斯瑞)菌株甘油管，融化后前者接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，后者接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm摇床过夜培养后使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提(购自于天根生化科技有限公司)。

2、将pET28a质粒和pUC57-rhGH重组质粒同时使用XbaI和XhoI限制性内切酶(购自于NEB)进行双酶切，酶切结束后对酶切产物进行琼脂糖电泳凝胶分析，使用DNA纯化回收试剂盒(购自于天根生化科技有限公司)回收酶切产物片段，回收操作按照试剂盒说明书进行。

3、将回收的rhGH和pET28a酶切产物使用T4 DNA连接酶(购自于NEB)进行酶连，酶连方案使用连接酶说明书推荐方案进行，酶连结束后将酶连产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自于天根生化科技有限公司)。转化完毕后，将感受态细胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜培养。

4、从转化平板上挑取单克隆接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，37℃，220rpm培养8h。培养完毕后取出部分菌液，作为PCR扩增模板对单菌落进行PCR鉴定，PCR引物为T7启动子通用引物。PCR扩增体系为50μl，所使用DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶(购自于天根生化科技有限公司)，所使用扩增条件按照说明书推荐方案进行。PCR结束后，使用1％琼脂糖电泳凝胶进行分析，分析结果如图1所示。

5、使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提，将所抽提质粒进行DNA测序。比对分析测序结果，测序结果正确的质粒对应菌株即为阳性的目标菌株，记为BL21(DE3)-pET28a-rhGH。

6、将步骤4中的单菌落培养物按照1％接种量接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(50ml)中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀≈1.0时加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达，诱导表达6h后离心收集菌体。

7、将步骤6中诱导表达后菌体加入Loading buffer后放于100℃加热10min，然后使用SDS-PAGE电泳分析，分析结果如图2所示。通过图2可以看出rhGH单菌落均可以表达。

实施例2 rhGH高密度发酵

本实施例主要阐述了BL21(DE3)-pET28a-rhGH菌株的高密度发酵工艺，发酵工艺中使用成分明确的葡萄糖和甘油作为菌体代谢的碳源，使用氨水(发酵过程中既用于pH调节也用做氮源用于菌体代谢)和磷酸氢二铵作为菌体代谢的氮源；由于避免使用类似于酵母粉、蛋白胨之类的复合培养基，避免了复合氮源/碳源带来的批次之间不稳定性，因此不同发酵批次的培养基成分可以很容易实现控制，并且由于葡萄糖和甘油成本较低，因此发酵工艺总体成本得到良好的控制。发酵结束后发酵菌体OD₆₀₀可达90-120之间，目的蛋白表达量达到1.5g/L以上。

制备例1具体步骤如下：

1、发酵种子液的制备：将实施例1中构建好的rhGH大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化；

2、从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8h，此为一级种子液。

3、将步骤2中的一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液制备。

4、分批发酵培养基的成分：一水合柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾13g/L，磷酸氢二铵4g/L，甘油15g/L，七水合硫酸镁1.5g/L；按照分批发酵培养基的成分称取3L量的试剂，使用2L单蒸水溶解后，调节pH至6.5，定容至3L。将配好的分批发酵培养基倒入发酵罐(NBS-3L)进行灭菌，冷却后，通过注射器向发酵罐中打入3ml上文中提到的微量元素母液(过滤除菌)和终浓度为50μg/ml的卡那霉素(过滤除菌)抗生素。按照补料培养基的成分称取500ml量的相关试剂(甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L)补料培养基，定容至500ml后121℃，20min灭菌处理，使用前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的前述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

5、将制备好的二级种子液按照10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基的发酵罐中开始补料-分批高密度发酵培养，设定发酵温度为37℃、pH为7.0、DO 40％，pH使用氨水和磷酸(20％)进行关联调节，DO通过关联转速、通气量和高纯氧进行控制。发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中甘油耗尽，开始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在25-35g/h范围)。待菌体生长至0D₆₀₀≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达6h结束培养。取部分发酵液离心收集菌体沉淀，菌体沉淀使用PBS重悬，然后使用探针式超声波破碎仪破碎裂解菌体获得菌体裂解物，离心处理裂解物，收集沉淀和上清，沉淀使用8M脲水溶液重悬，然后使用SDS-PAGE表达分析，分析结果如图3所示。使用离心法收集发酵液中的菌体，所收集得到菌体可以进行进一步破碎处理也可冻存于-40℃冰箱中备用。

制备例1中的步骤1-3为本领域的常规方法，制备例中列出的具体条件仅用作说明而非限制本发明。

制备例1中的补料-分批发酵培养基是高密度发酵的关键，组分明确、成本低廉，在制备例1的基础上对培养基组分含量进行微调(见表1)，同时步骤5的高密度发酵参数也进行微调(见表2，表中未列参数与制备例1相同)，取制备例2、3的发酵菌体使用实施例1中的第7步方法进行SDS-PAGE表达分析，结果和制备例基本一致。

表1

参数	制备例1	制备例2	制备例3
				一水合柠檬酸(g/L)	1.5	0.5	3
磷酸二氢钾(g/L)	13	8	15
				磷酸氢二铵(g/L)	4	3	7
甘油(g/L)	15	10	30
				七水合硫酸镁(g/L)	1.5	2.5	3

表2

参数	制备例1	制备例2	制备例3
				接种量(％)	10	5	15
pH	6.8	7.0	7.2
				DO(％)	40	30	45
IPTG(mM)	1.0	0.5	0.2
				诱导表达时间(h)	4	6	8

实施例3 rhGH发酵菌体的处理和包涵体的预纯化

本实施例阐述了rhGH发酵菌体的破碎方法，可以取得更好的菌体破碎效果。rhGH包涵体的预纯化，通过预纯化处理去除rhGH包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，可以降低下游纯化成本、提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。

实施例2制备例1得到的发酵菌体按照如下步骤进行rhGH包涵体的获得和预纯化，具体如下：

1、发酵菌体使用缓冲液A(50mM Tris+1mM EDTA+100mM氯化钠+1mM PMSF，盐酸调节pH8.0)充分重悬至菌体浓度为100g/L，室温搅拌1.5h。

2、使用ATS-AH1500高压均质机对发酵菌体进行物理破碎，调节压力900bar，进行均质破碎2次，6500g/20min离心收集rhGH包涵体，离心后所得上清丢弃，沉淀即为包涵体。

3、使用缓冲液B(50mM Tris+1mM EDTA+100mM氯化钠+1.5M脲+1mM PMSF+1％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L(包涵体质量按湿重计算)，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。

4、将步骤3收集的rhGH包涵体使用缓冲液C(50mM Tris、1mM EDTA、100mM氯化钠、1mM PMSF、1％TritonX-100、4M脲，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。

5、将步骤4收集的包涵体使用缓冲液D(50mM Tris、1mM EDTA、1M氯化钠、1mMPMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。

6、将步骤5收集的包涵体使用缓冲液E(50mM Tris、0.4M蔗糖、1mM PMSF，盐酸调节pH8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液。

7、将步骤6收集的包涵体使用去离子水重悬至10g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rhGH包涵体。取部分预纯化后的包涵体使用含有8M脲的20mM Tris-HCl(pH8.0)进行变性，离心收集变性液的上清液然后SDS-PAGE检测包涵体纯度，分析结果如图4所示，通过电泳检测分析可以看出通过预纯化后包涵体中杂蛋白得到了部分的去除，起到了纯化的作用。对预纯化后的包涵体性液使用Quantity One软件进行灰度分析，纯度约为48％。

8、将步骤7最终收集得到的包涵体蛋白使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，干燥至恒重后称量干燥后样品的质量。换算后可得1L发酵液最终可以获得3.5g预纯化后包涵体冻干粉，折算纯度后可得每升发酵液可以获得1.7g目的蛋白。

实施例2制备例2、3得到的发酵菌体按照实施例3收集得到rhGH固体颗粒，预纯化步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表3，表中未列参数与制备例1相同。

表3

用制备例1相同的方法进行纯度和含量的计算，制备例2、3纯度约为45％、50％；折算纯度后可得每升发酵液均可以获得1.7g左右目的蛋白。

实施例4 rhGH包涵体变性液制备

包涵体的变性是复性前必要步骤，变性的充分程度直接影响着后续的复性效果。一般而言包涵体的变性剂包括：8-10M脲、4-6M盐酸胍、SDS、高浓度DTT等。相比较而言，由于具有较低的使用成本和变性强度(易于放大过程中的使用)，脲被广泛应用于包涵体变性。本实施例阐述了rhGH包涵体变性的手段，通过该手段进行变性后的rhGH包涵体可以进行下一步的复性，实施例3制备例1得到的预纯化的包涵体变性步骤如下：

1、预纯化后的包涵体使用含有8M脲缓冲液F(50mM Tris+1mM EDTA+100mM氯化钠+1mM PMSF+5mM DTT，盐酸调节pH10.5)充分重悬至50g/L(按湿重计)，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物。

2、将上步离心收集的上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步除去不溶物即得rhGH包涵体变性液。

实施例5 rhGH包涵体变性液的稀释复性

本实施例阐述了rhGH包涵体稀释复性方法，该方法的原理是通过人工配制的复性缓冲液从而提供一种蛋白折叠环境，将变性后蛋白溶液缓慢的加入到复性缓冲液中从而实现变性剂浓度的降低诱发蛋白折叠形成正确的高级结构，最终形成有活性的rhGH。该方法在操作中只需要进行一步稀释，操作简单，因此在工业上很容易实现放大，所复性蛋白经过体内活性测定表明活性基本与市售的对照品具有相似的活性。通过本发明的发酵、变复性方法制备的GH在活性上与市售产品相当；目前市售的CHO和大肠杆菌分泌重组表达rhGH产量均比较低，相对成本就比较高，本发明方法制备的rhGH产量更高，成本就要低很多。

制备例1的复性具体步骤如下：

1、配制5L包涵体复性缓冲液G(50mM Tris+1mM EDTA+1mM PMSF+5％甘油+1M脲+1mM胱氨酸+3mM半胱氨酸，盐酸调节pH至8.0)。

2、取部分实施例4制备的rhGH包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到步骤1制备的复性缓冲液中，变性液添加的过程中保持复性液被快速搅拌以便变性液可以快速的混匀。变性液流加的速度控制在1-2ml/min(对于5L复性缓冲液而言)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.15mg/ml左右，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于15℃条件下静置36h，复性结束。

实施例4得到的变性液复性步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表4，表中未列参数与制备例1相同。

表4

实施例6 rhGH包涵体复性样品的纯化制备

该实施例阐述了rhGH包涵体复性后样品的纯化方法。使用DNAMAN预测rhGH的等电点为5.2左右，因此在大于该等电点pH条件下可以使用阴离子交换色谱进行rhGH的纯化制备。发明人使用两步层析法对rhGH进行纯化(第一步为阴离子交换层析，第二步为疏水层析)，纯化后rhGH的样品的非还原电泳纯度可以达到95％以上。层析所用材料均为常见介质，复性液处理的工艺为常见手段，因此该方法具有操作简单和易于放大的特点。实施例5复性液的纯化具体步骤如下：

1、5L rhGH包涵体复性液使用PALL台式超滤系统(选用3KDa膜包)进行超滤浓缩，浓缩至体积为0.5L，然后加入0.5L的20mM Tris HCl pH8.0，再次浓缩到0.5L，此为一个换液循环，如此重复换液循环10次。收集换液后的rhGH样品，使用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，收集清液。

2、第一步层析纯化：使用AKTA Purifier纯化系统，阳离子交换柱Sepharose FastFlow(xk26/20柱材，柱床体积为30ml)对步骤1中样品进行纯化。平衡缓冲液(20mM Tris pH8.0)，洗脱用缓冲液(20mM Tris 1M氯化钠pH8.0)。首先使用平衡缓冲液对柱床进行平衡，平衡至pH、电导率、UV280稳定，然后10ml/min上样，上样结束后再次使用平衡缓冲液平衡至pH、电导率、UV280稳定。线性洗脱：逐渐提高洗脱液经过柱床的浓度，在10个柱体积，经过柱床的洗脱缓冲液浓度达到50％，当UV280>30mAu时开始收集样品。将纯化收集的样品使用截留分子量为3KDa的超滤浓缩管进行超滤浓缩，取浓缩后的样品使用非还原电泳进行纯度检测，分析结果如图5所示，使用Quantity One软件对电泳结果进行灰度分析，分析纯度为93％。

3、第二步层析纯化：使用AKTA Purifier纯化系统，疏水层析柱Phnely sephorse(GE产，预装柱)对步骤2中样品进行纯化。样品的处理：将步骤2中的电泳检测纯度较好的样品合并，超滤换液为pH8.0的20mM TrisHCl，然后使用20mM Tris 1.6M硫酸铵对半稀释，使用孔径为0.22μm的过滤膜过滤后即可。平衡缓冲液(20mM Tris 0.8M硫酸铵pH 8.0)，洗脱用缓冲液(20mM Tris pH8.0)。首先使用平衡缓冲液对柱床进行平衡，平衡至pH、电导率、UV280稳定，然后5ml/min上样，上样结束后再次使用平衡缓冲液平衡至pH、电导率、UV280稳定。线性洗脱：逐渐提高洗脱液经过柱床的浓度，在10个柱体积，经过柱床的洗脱缓冲液浓度达到100％，当UV280>30mAu时开始收集样品；将纯化收集的样品使用截留分子量为3KDa的超滤浓缩管进行超滤浓缩，取浓缩后的样品使用非还原电泳进行纯度检测，分析结果如图6所示，使用Quantity One软件对电泳结果进行灰度分析，分析纯度为99％。将浓缩后的蛋白样品使用PBS(pH7.4)超滤浓缩换液，然后使用BCA法测定蛋白浓度，根据投料的包涵体量和最终获得的复性后蛋白纯品可得活性rhGH的产量为600mg/L(活性蛋白质量/发酵液体积)，兼具了低成本和高产出的特点。

实施例7rhGH包涵体复性样品的体内药效评价

rhGH的体内药效活性测定参考2005版《中国药典》中关于重组人生长激素活性测定的方法进行评价。

具体步骤如下：

1.选择60-80gSD大鼠，以10％水合氯醛按照3.5ml/kg的剂量麻醉动物。

2.待动物翻正反射消失后，保定动物，颈部备皮，皮肤消毒；

3.沿颈中部近下颚处作一2cm纵向切口，分开颌下腺，暴露胸甲状肌，在此肌肉右侧近咽部钝性分离血管神经，直至骨板；

4.擦去骨板上的肌肉，找到枕骨脊，沿枕骨脊继续向头部剥离两侧肌肉组织，直至可见“T"型凸起及蝶枕骨联合；

5.在蝶枕骨联合上方2mm处，即垂体窝附近，用2mm钻头钻通骨板；

6.通过钻孔吸取垂体，检查垂体是否为三叶。8.逐层缝合肌肉皮肤，术后肌注氨苄西林钠抗感染；

7.取去垂体手术后2-3周，体重变化小于手术前±10％的大鼠，按照体重随机分成4组，每组6只动物，每只编号并记录体重；

8.分别自颈部皮下注射一种浓度为33.33μg/ml的对照品(市售rhGH)或供试品溶液0.5ml，每日一次，连续3天，第4天注射经失活处理的对照品和供试品，再连续给药2天，考察药物与动物生长的相关性。

9、于最后1次给药后24h，处死大鼠，称体重，尸检，观察蝶鞍区是否有垂体残留，剔除有垂体残留的大鼠。

以每只动物给药后体重增加的克数作为反应值，结果如图7所示。体内药效试验的结果分析可以看出：供试动物接受本发明rhGH给药后体重增长，其每日增长量以及增长趋势与市售的对照药基本相当。表明两者具有相当的活性。并且在同时注射经失活处理的标准品和供试品时，同时进入停止生长的平台期，这也进一步验证了供试品药效和动物模型的可靠性。

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 重组人生长激素及其编码基因、制备方法及应用

<130> 重组人生长激素及其编码基因、制备方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgttcccga ccatcccgct gagccgtctg tttgacaacg cgatgctgcg tgcgcaccgt 60

ctgcaccagc tggcgttcga tacctaccaa gagtttgagg aagcgtatat cccgaaggaa 120

cagaaataca gcttcctgca gaacccgcaa accagcctgt gctttagcga gagcattccg 180

accccgagca accgtgagga aacccagcaa aagagcaacc tggagctgct gcgtatcagc 240

ctgctgctga ttcagagctg gctggaaccg gtgcaattcc tgcgtagcgt ttttgcgaac 300

agcctggtgt atggcgcgag cgacagcaac gtttacgacc tgctgaagga tctggaggaa 360

ggtatccaga ccctgatggg tcgtctggaa gacggcagcc cgcgtaccgg tcagatcttc 420

aagcaaacct acagcaagtt cgataccaac agccacaacg acgatgcgct gctgaaaaac 480

tacggcctgc tgtattgctt ccgtaaggac atggataaag tggagacctt tctgcgtatt 540

gtgcaatgcc gtagcgttga aggtagctgc ggcttctgat aa 582

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu

1 5 10 15

Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe

20 25 30

Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn

50 55 60

Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser

85 90 95

Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr

100 105 110

Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg

115 120 125

Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr

130 135 140

Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn

145 150 155 160

Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr

165 170 175

Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

180 185 190

Claims

1.一种重组人生长激素的编码基因，序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有如权利要求1所述的重组人生长激素编码基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET载体。

3.含有如权利要求2所述重组人生长激素编码基因表达载体的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为BL21(DE3)。

4.一种表达重组人生长激素的方法，该方法包括：

（1）将如权利要求3所述的宿主菌按5-15%的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中，并设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45%之间进行发酵；

（2）待DO曲线出现急剧上升的时候，开始进行补料培养；

（3）待菌体生长至0D₆₀₀≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM/L的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-8h结束培养；其中，发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3 g/L，磷酸二氢钾8-15 g/L，磷酸氢二铵3-7 g/L，甘油10-30 g/L，七水合硫酸镁1-4 g/L；

所述补料培养基成分包括：甘油1024 g/L，七水合硫酸镁8-12 g/L。

5.一种重组人生长激素包涵体变性前预纯化的处理方法，该方法包括：将如权利要求4结束培养后的菌体破碎后收集包涵体固体颗粒，分别采用Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E重悬后离心收集包涵体沉淀，

所述BufferB包含20-100mM Tris+ 0.5-5mM EDTA+100-300mM NaCl+0.5-2M 脲+ 1mMPMSF+ 0.5-2% TritonX-100，盐酸调节pH8.0；

BufferC包含20-100mM Tris+100-300mM NaCl+ 0.5-5mM EDTA+ 2-4M脲+ 1mM PMSF+0.5-2% TritonX-100，盐酸调节pH8.0；

BufferD包含20-100mM Tris+ 0.5-5mM EDTA+ 1-1.5M NaCl + 1mM PMSF 盐酸调节pH8.0；

BufferE包含20-100mM Tris+ 0.4M 蔗糖+ 1mM PMSF 盐酸调节pH8.0。

6.一种重组人生长激素变性的方法，具体包括：以权利要求5处理得到的包涵体使用含有8-10M脲Buffer F充分重悬至50-100g/L，室温搅拌处理10-15h，离心收集上清液后使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步除去不溶物即得重组人生长激素包涵体变性液；所述BufferF包括：50mM Tris+ 1mM EDTA + 1mM PMSF+100mM 氯化钠+ 5mM DTT盐酸调节pH10.5。

7.一种重组人生长激素包涵体复性方法，具体包括：以权利要求6处理得到的包涵体变性液加入到复性缓冲液BufferG中，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.05-0.3mg/ml之间，将复性缓冲液置于10-20℃条件下静置24-48h，复性结束；

所述Buffer G组分包括：20-100mM Tris+5-20%甘油+ 0.5-5mM EDTA+ 1mM PMSF+1-3mM 胱氨酸+ 3-10mM 半胱氨酸+脲1-2M。

8.一种重组人生长激素的纯化方法，具体包括：将权利要求7中复性结束后的重组人生长激素包涵体复性液使用超滤法浓缩换液为20mM Tris HCl，pH8.0；

将换液后的重组人生长激素样品使用QHP进行纯化；

将QHP纯化后的重组人生长激素样品合并超滤换液为20mM TrisHCl，pH8.0，然后使用20mM Tris-HCl 1.6M硫酸铵 pH8.0稀释一倍，最终使用疏水层析进行纯化。