CN113684165B

CN113684165B - 一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产l-谷氨酰胺中的应用

Info

Publication number: CN113684165B
Application number: CN202110926225.XA
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 吕青兰; 徐美娟; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113684165A

Abstract

本发明公开了一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L‑谷氨酰胺中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述重组谷氨酸棒杆菌细胞内γ‑谷氨酸激酶、谷氨酸分泌机械通道蛋白及谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化酶活性丧失，并且运用质粒pXMJ19共表达了酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶及大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶。本发明提供了一种可高产L‑谷氨酰胺的重组谷氨酸棒杆菌CGQ03/pXMJ19‑glnA^Sc‑ppk^Ec，将此重组谷氨酸棒杆菌接种至5L发酵罐中发酵66h，即可使发酵液中L‑谷氨酰胺的产量高达73.5±3.1g/L、糖胺转化率高达0.368±0.034。

Description

一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酰胺中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酰胺中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-谷氨酰胺，又名2,5-二氨基-5-氧代戊酸，是一种半必需性氨基酸。它不仅是合成蛋白质的基本氨基酸之一，也是许多重要化合物如嘌呤、嘧啶等合成的氨基供体。由于L-谷氨酰胺特殊的营养及免疫功能，近年来被广泛应用于食品、医药和饲料等领域。主要有以下几个方面：(1)食品保健品。能够提高人体免疫力，保证氮代谢平衡，保持正常的消化功能，以及调节人体正常的酸碱平衡。(2)临床药物。用于肠胃溃疡等疾病的修复治疗及大面积烧伤等手术病人的恢复治疗等。L-谷氨酰胺可以促进蛋白质合成、增加淋巴细胞总数、帮助修复胃肠粘膜，因此对维持胃肠功能具有重要的作用。另外，L-谷氨酰胺能够维持人体正常的免疫功能，能促进机体组织的愈合，防止细菌以及病毒引发感染，减少手术后并发症的产生，它也是肝脏合成谷胱甘肽的主要物质之一。(3)动物饲料添加剂。将L-谷氨酰胺添加到免疫力较弱的动物幼崽饲料中，能够改善由于断奶引发的各类损伤，防止肠绒毛的萎缩，维持肠道正常的形态结构，从而促进幼崽的生长发育，提高其存活率。

目前，L-谷氨酰胺的生产方法主要有发酵法、酶法以及化学合成法。L-谷氨酰胺是由L- 谷氨酸和NH₄ ⁺在谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的催化下形成的，此过程需要ATP 参与，酶法合成L-谷氨酰胺存在操作复杂、产量低及反应过程中需要额外加入大量价格昂贵的ATP等缺陷，而化学法合成L-谷氨酰胺存在着严重的环境污染等问题，因此两种方法都不适合L-谷氨酰胺的工业生产。相比之下，发酵法生产L-谷氨酰胺条件温和，原料丰富且便宜，菌株改造空间大，发展前景较好。因此，目前常利用微生物发酵法生产L-谷氨酰胺。

Mikiro Hayashi等人将大肠杆菌JMQ8接种至发酵培养基发酵，可使发酵液中L-谷氨酰胺的产量达500mM(具体可见参考文献：Hayashi,M.,Tabata,K.2013.Metabolicengineering for L-glutamine overproduction by using DNA gyrase mutations inEscherichia coli.Appl Environ Microbiol,79(9),3033-9.)，但是生产菌株非食品安全菌株，并且产量不高；缺乏高产量高转化率的食品安全菌株以及发酵工艺条件的不成熟是限制目前L-谷氨酰胺工业生产进程主要的原因。

发明内容

为解决现有技术当中的L-谷氨酰胺的生产菌株的产量及产率低等问题，本发明提供了一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01，所述谷氨酸棒杆菌N01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021931。

所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01是以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为出发菌株，经ARTP诱变筛选获得。

本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以上述谷氨酸棒杆菌N01 为宿主细胞，敲除了宿主基因组上的编码γ-谷氨酸激酶的基因proB、编码谷氨酸机械通道蛋白的基因NCgl1221和编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的基因glnE，并且过表达了酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA和大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶基因ppk。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酸激酶的基因proB的NCBI Genebank登录号为：BA000036.3。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸机械通道蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸机械通道蛋白的基因NCgl1221的NCBIGenebank登录号为：NC_003450.3。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的基因glnE的NCBI Genebank登录号为：CP025533.1。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶的基因glnA的NCBI Genebank登录号为：CP046096.1。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶的基因ppk的NCBI Genebank登录号为：CP076318.1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌N01为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以pXMJ19质粒、pDXW-10质粒、 pJYW-4质粒或pEC-XK99E质粒为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述pXMJ19、pDXW-10、pJYW-4和pEC-XK99E质粒表达载体均购自BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心。

本发明还提供了构建上述重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)运用pK18mobsacB在出发菌N01中首先敲除编码γ-谷氨酸激酶基因proB获得单突变株CGQ01，继续在CGQ01中敲除谷氨酸机械通道蛋白基因NCgl1221获得双突变株CGQ02，继续在CGQ02中敲除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶基因glnE获得三突变株CGQ03；

(2)以pXMJ19质粒分别过表达酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA及大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶基因ppk，并将glnA与ppk进行串联表达，制备得到 pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec；

(3)将制备得到pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec导入CGQ03，制备得到重组谷氨酸棒杆菌CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec。

本发明还提供了一种生产L-谷氨酰胺的方法，所述方法为，采用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01或上述重组谷氨酸棒杆菌发酵制备L-谷氨酰胺。

在本发明的一种实施方式中，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01或重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中，得到种子液；将制备得到的种子液按照8％～10％(v/v) 的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备得到L-谷氨酰胺。

在本发明的一种实施方式中，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01或重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中，培养条件为：30℃、220rpm，控制发酵培养基的初始 pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为采用5L发酵罐发酵制备L-谷氨酰胺，所述方法为：将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01或重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中进行培养，得到一级种子液；将一级种子液按照10％(v/v)的接种量转接至种子培养基中，进行培养，得到二级种子液，将制备得到的二级种子液按照10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，制备得到L-谷氨酰胺。

在本发明的一种实施方式中，采用两阶段pH控制策略发酵生产L-谷氨酰胺：

由于发酵开始后的前20h为菌体生长期，利用50％氨水将pH控制为7.0，20h后，当发酵液中L-谷氨酸的开始积累，即L-谷氨酸浓度为1.0-2.0g/L时，使pH从7.0自然降低到6.2，并用纯氨水继续控制pH为6.0-6.2，使L-谷氨酰胺快速高效合成。

在本发明的一种实施方式中，将种子液接种至发酵培养基中，发酵条件为：温度30-32℃、转速500-700rpm、通气量3.0-4.0L/min。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基为葡萄糖120g/L、硫酸铵40g/L、玉米浆10 mL/L、尿素2.0g/L、三水合磷酸氢二钾2.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L、一水合硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.02g/L、七水合硫酸锌0.01g/L，初始pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，种子培养基为葡萄糖30g/L、玉米浆30mL/L、尿素6g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L，初始pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，发酵液中葡萄糖含量通过流加质量分数为80％的葡萄糖来维持，使发酵液中的葡萄糖的浓度在20-40g/L之间。

在本发明的一种实施方式中，5L发酵罐发酵过程中搅拌速度设置为600rpm，温度设置为30℃，通气量设置为3L/min，发酵时长为60～66h。

本发明还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌或上述方法在制备含有L-谷氨酰胺的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明提供了一种可高产L-谷氨酰胺的重组谷氨酸棒杆菌 CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec，将此重组谷氨酸棒杆菌接种至5-L发酵罐中发酵66h，L-谷氨酰胺的产量高达73.5±3.1g/L，糖胺转化率高达0.368±0.034。

(2)本发明通过敲除谷氨酸机械分泌通道蛋白NCgl1221，可大大降低发酵液中副产物 L-谷氨酸的含量。本发明通过敲除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶GlnE，解除了腺苷酰化作用，使谷氨酰胺合成酶的活性得到提高。本发明通过筛选获得了一种具有高催化效率的酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶，异源过表达此酶可有效提高L-谷氨酰胺的产量。本发明通过过表达大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶，增强了胞内ATP的含量，使L-谷氨酰胺的产量得到了一定的提高。本发明通过两阶段pH控制策略解决了菌体生长和发酵产酸之间的不平衡，实现5L发酵罐中L-谷氨酰胺的高产。

生物材料保藏

一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01，分类学命名为谷氨酸棒杆菌 N01Corynebacterium glutamicum N01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021931，保藏日期为：2021年7月26日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：敲除质粒pK18mobsacB-proB、pK18mobsacB-NCgl1221、pK18mobsacB-glnE的构建示意图。

图2：过表达质粒pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec的构建示意图。

图3：谷氨酸棒杆菌N01发酵过程曲线。

图4：重组谷氨酸棒杆菌CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec发酵过程曲线。

具体实施方式

发明已以较佳实施例公开了一种重组谷氨酸棒杆菌及其在L-谷氨酰胺生产中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能够在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

下述实施例中所涉及的C.glutamicum ATCC14067购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

谷氨酸棒杆菌感受态培养基(1L)：10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、3g甘氨酸、7g葡萄糖、1mL tween-80。

BHI液体培养基：38.5g脑心浸液肉汤粉溶于1L蒸馏水。

BHI固体培养基：在BHI液体培养基基础上添加2％琼脂粉。

LB固体培养基(1L)：10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物，20g琼脂粉。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

采用紫外分光光度计测定细胞密度OD₆₀₀；

利用生物传感分析仪(SBA-40ES，山东省科学院生物研究所)测定发酵液中葡萄糖的含量； L-谷氨酰胺、L-谷氨酸的含量通过HPLC(赛默飞)来测定，测定方法为柱前衍生邻苯二甲醛(OPA)法，使用了ZORBAX Eclipse AAA安捷伦色谱柱，梯度洗脱流速设置为1mL/min，柱温保持在40℃，在紫外波长338nm下定量检测。

糖胺转化率的计算公式如下：

式中：η：糖胺转化率；C_{L-谷氨酰胺}：发酵结束后发酵液中L-谷氨酰胺的浓度，g/L；C₀：发酵液中初始葡萄糖浓度，g/L；C_葡萄糖：发酵结束后发酵液中葡萄糖浓度，g/L；V₁：消耗质量分数为80％葡萄糖溶液的体积，L；V：发酵结束后发酵液的体积，L。

实施例1：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)N01菌株的获得

具体步骤如下：

(1)菌悬液的制备：从-80℃甘油管中用接种环挑取谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，在BHI 固体培养基上三区划线，置于30℃培养箱培养24h；挑取平板活化的单菌落，接种到装有10 mL BHI液体培养基的50mL摇瓶中，30℃、220rpm培养至OD₆₀₀约为10(对数生长期)；8000rpm离心3min收集细胞，并用50mL 0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次；最后加入一定量的PBS溶液使菌浓度约为10⁸CFU/mL，制备得到菌悬液；

(2)常压室温等离子体(ARTP)诱变：使用ARTP-IIIS仪器，以高纯氦气作为ARTP 的工作气源，在电源功率100W、照射距离2mm、气体流量8SLM及等离子体射流温度为 25-30℃的条件下，吸取10μL谷氨酸棒杆菌菌悬液于无菌钢板载片，处理20s(致死率为 90-95％)。每次处理后，将样品用1mL PBS冲洗到新鲜的无菌管中，适当稀释，并在含有 25mg/L氯霉素的BHI固体培养基上30℃培养2天，建立ARTP突变文库。

(3)谷氨酸棒杆菌N01的获得

挑取ARTP处理后在BHI无抗性平板上长出的单菌落，于含有2.5mL发酵培养基(葡萄糖120g/L，硫酸铵40g/L，玉米浆10mL/L，尿素2.0g/L，三水合磷酸氢二钾2.5g/L，无水硫酸镁0.5g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L以及七水合硫酸锌0.01 g/L，初始pH 7.0)的24深孔板中培养48h(220rpm，30℃)，通过HPLC测定发酵液中L- 谷氨酰胺的含量。正向突变株进一步转移至250mL摇瓶中发酵48h，以验证菌株生产L-谷氨酰胺的能力。

最终，筛选获得了一株L-谷氨酰胺初始产量约为25.7g/L的谷氨酸棒杆菌突变株并将其命名为谷氨酸棒杆菌N01。

实施例2：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGQ01的构建

具体步骤如下：

(1)构建敲除质粒pK18mobsacB-ΔproB

从NCBI网站公布的Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组上的γ-谷氨酸激酶的基因proB序列(NCBI Genebank登录号BA000036.3)，确定proB基因的序列位置并确定缺失片段为271-836位，选取proB缺失片段前后各约800bp大小的基因片段作为上下游同源臂，序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

以引物P1/P2和P3/P4从谷氨酸棒杆菌N01基因组中扩增出proB基因碱基缺失位点的上下游同源臂片段，PCR程序为：95℃,10min；95℃,30s；58℃,30s；72℃,1min；72℃,10min，循环30次。所得两个片段经纯化后，利用引物组P1/P4进行重叠延伸PCR扩增得到融合片段，经纯化后与线性化质粒pK18mobsacB(EcoR I/Hind III)通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，转化入E.coli JM109感受态细胞，得到转化子，将转化至接种至含有浓度为50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，挑取阳性转化子菌落PCR验证条带大小正确后，提质粒，送金唯智公司测序正确，则pK18mobsacB-ΔproB质粒构建成功(如图1所示)。

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(2)谷氨酸棒杆菌N01感受态细胞的制备

从-80℃甘油管中用接种环挑取谷氨酸棒杆菌N01，在BHI固体培养基上三区划线，置于30℃培养箱培养24h；挑取平板活化的单菌落，接种到装有10mL BHI液体培养基的50mL小瓶中，30℃，220rpm培养12h，制备得到种子液；将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量转接到装液量为100mL谷氨酸棒杆菌感受态培养基的500mL圆底摇瓶中，220rpm， 30℃培养至OD₆₀₀达到0.9-1.0；将菌体置于冰上预冷，在超净台中收集到50mL离心管中， 4℃，8000rpm离心5min，弃上清液；用50mL预冷的10％甘油重悬菌体并洗涤，4℃，8000 rpm离心5min，弃上清，重复洗涤三次；用2mL预冷的10％甘油将菌体重悬，每1mL离心管分装80μL感受态，置于冰上可直接用于电击转化，若长时间不用，置于-80℃保存。

(3)将5-10μL质粒pK18mobsacB-ΔproB加入到N01感受态细胞中，吹吸混匀后置于冰上5-10min；将上述混合物加入预冷的1mm电击杯中，于电压1.8kv，时间5ms条件下在电击仪上电击；立即加入800μL BHI液体培养基，并将混合液全部转入1.5mL离心管中，经46℃水浴热击6min后，置于30℃摇床，220rpm活化培养2h；6000rpm离心5min收集菌体，将菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素的BHI固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48h；从平板上挑取单菌落，以P1/P4为引物通过Taq DNA聚合酶对单菌落进行菌落PCR 验证；带有目的条带大小的阳性单菌落接种于含有BHI液体培养基的小瓶中，30℃，220rpm 培养12h后，按1％(v/v)接种量转接于含有20％(m/v)蔗糖的BHI液体培养基中，30℃， 220rpm继续培养12h；用接种环挑取一环培养物，划线于BHI无抗性平板上，30℃培养24 h，挑取单菌落利用P1/P4为引物进行菌落PCR验证，扩增出来的片段较野生型片段小，则为阳性克隆；将阳性克隆接BHI小瓶，30℃过夜培养，提取细菌基因组，并送金唯智公司测序，验证基因组上相应片段碱基缺失成功。

将谷氨酸棒杆菌N01中proB基因成功敲除的菌株命名为CGQ01。

实施例3：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGQ02的构建

具体步骤如下

(1)构建敲除质粒pK18mobsacB-ΔNCgl1221

从NCBI网站公布的Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组上的谷氨酸机械通道蛋白的基因NCgl1221序列(NCBI Genebank登录号：NC_003450.3)，确定NCgl1221基因的序列位置并确定缺失片段为401-1203位，选取NCgl1221缺失片段前后各约900bp大小的基因片段作为上下游同源臂，序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

按照实施例2步骤(1)的方法，采用引物P5/P6和P7/P8从谷氨酸棒杆菌N01基因组中扩增出NCgl1221基因碱基缺失位点的上下游同源臂片段，所得两个片段经纯化后，利用引物组P5/P8进行重叠延伸PCR扩增得到融合片段，经纯化后与线性化质粒pK18mobsacB(EcoR I/Hind III)通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，转化入E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性转化子菌落PCR验证条带大小正确后，提质粒，送基因测序(金唯智公司)正确，则pK18mobsacB-ΔNCgl1221质粒构建成功。

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(2)谷氨酸棒杆菌CGQ01感受态的制备

按照实施例2谷氨酸棒杆菌N01感受态细胞的制备方法，制备得到CGQ01感受态细胞，置于-80℃保存。

(3)将5-10μL质粒pK18mobsacB-ΔNCgl1221加入到CGQ01感受态细胞中，吹吸混匀后置于冰上5-10min；将上述混合物加入预冷的1mm电击杯中，于电压1.8kv，时间5ms条件下在电击仪上电击；立即加入800μL BHI液体培养基，并将混合液全部转入1.5mL离心管中，经46℃水浴热击6min后，置于30℃摇床，220rpm活化培养2h；6000rpm离心5min 收集菌体，将菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素的BHI固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48h；从平板上挑取单菌落，以P5/P8为引物通过Taq DNA聚合酶对单菌落进行菌落PCR 验证；带有目的条带大小的阳性单菌落接种于含有BHI液体培养基的小瓶中，30℃，220rpm 培养12h后，按1％(v/v)接种量转接于含有20％(m/v)蔗糖的BHI液体培养基中，30℃， 220rpm继续培养12h；用接种环挑取一环培养物，划线于BHI无抗性平板上，30℃培养24 h，挑取单菌落利用P1/P4为引物进行菌落PCR验证，扩增出来的片段较野生型片段小，则为阳性克隆；将阳性克隆接BHI小瓶，30℃过夜培养，提取细菌基因组，并送金唯智公司测序，验证基因组上相应片段碱基缺失成功。

将NCgl1221基因成功敲除的CGQ01菌株命名为CGQ02。

实施例4：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGQ03的构建

具体步骤如下：

(1)构建敲除质粒pK18mobsacB-ΔglnE

从NCBI网站公布的Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组上的谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的基因glnE序列(NCBI Genebank登录号：CP025533.1)，确定glnE基因的序列位置并确定缺失片段为751-2332位，选取glnE缺失片段前后各约1300bp大小的基因片段作为上下游同源臂，序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

按照实施例2步骤(1)的方法，以引物P9/P10和P11/P12从谷氨酸棒杆菌N01基因组中扩增出glnE基因碱基缺失位点的上下游同源臂片段，PCR程序为：95℃,10min；95℃,30s；58℃,30s；72℃,1min；72℃,10min，循环30次。所得两个片段经纯化后，利用引物组P9/P12进行重叠延伸PCR扩增得到融合片段，经纯化后与线性化质粒pK18mobsacB(EcoR I/HindIII) 通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，转化入E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性转化子菌落PCR验证条带大小正确后，提质粒，送基因测序(金唯智公司)正确，则pK18mobsacB-ΔglnE质粒构建成功。

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(2)谷氨酸棒杆菌CGQ02感受态的制备

按照实施例2谷氨酸棒杆菌N01感受态细胞的制备方法，制备得到CGQ02感受态细胞，置于-80℃保存。

(3)将5-10μL质粒pK18mobsacB-ΔglnE加入到CGQ02感受态细胞中，吹吸混匀后置于冰上5-10min；将上述混合物加入预冷的1mm电击杯中，于电压1.8kv，时间5ms条件下在电击仪上电击；立即加入800μL BHI液体培养基，并将混合液全部转入1.5mL离心管中，经46℃水浴热击6min后，置于30℃摇床，220rpm活化培养2h；6000rpm离心5min收集菌体，将菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素的BHI固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48h；从平板上挑取单菌落，以P9/P12为引物通过Taq DNA聚合酶对单菌落进行菌落PCR 验证；带有目的条带大小的阳性单菌落接种于含有BHI液体培养基的小瓶中，30℃，220rpm 培养12h后，按1％(v/v)接种量转接于含有20％(m/v)蔗糖的BHI液体培养基中，30℃， 220rpm继续培养12h；用接种环挑取一环培养物，划线于BHI无抗性平板上，30℃培养24 h，挑取单菌落利用P1/P4为引物进行菌落PCR验证，扩增出来的片段较野生型片段小，则为阳性克隆；将阳性克隆接BHI小瓶，30℃过夜培养，提取细菌基因组，并送金唯智公司测序，验证基因组上相应片段碱基缺失成功。

将glnE基因成功敲除的CGQ02菌株命名为CGQ03。

实施例5：表达不同来源的谷氨酰胺合成酶基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)根据NCBI中Genbank(CP046096.1)上公布的酿酒酵母谷氨酰胺合成酶编码基因glnA序列，设计引物glnA^Sc-F、glnA^Sc-R，从酿酒酵母基因组上扩增出长1113bp的glnA^Sc基因。将pXMJ19使用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，获得线性化质粒。

酶切体系(50μL)：质粒3000-5000ng，Q.Cut HindⅢ2.5μL，Q.Cut EcoRⅠ2.5μL，10xQ.Cut Buffer 5μL,ddH₂O补至50μL。酶切温度为37℃，酶切时间为1h。

目的基因glnA^Sc与线性化载体pXMJ19利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞)进行纯化回收，再通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，连接产物转化入E.coli BL21感受态细胞，获得转化产物。转化产物涂布于LB固体培养基(含25mg/L 氯霉素)上，于37℃恒温培养箱倒置培养12h，得到转化子。挑取平板上的转化子进行菌落 PCR验证，并提质粒送测序，验证正确后即获得重组质粒pXMJ19-glnA^Sc。

glnA^Sc-F：5’-aaacagaattaattaagcttaggaggagggttattagatggctgaagcaagcatcg-3’

glnA^Sc-R：5’-aaaacagccaagctgaattcttatgaagattctctttcaaattccttcg-3’

制备CGQ03感受态细胞，将5-10μL过表达质粒pXMJ19-glnA^Sc加入CGQ03感受态细胞中混合均匀，然后将上述混合物加入预冷的1mm电击杯中，于电压1.8kv，时间5ms条件下在电击仪上电击。立即加入800μL BHI液体培养液，并将混合液转入1.5mL离心管中，经46℃水浴热击6min后，于30℃，220rpm活化培养2h；6000rpm离心5min收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L氯霉素的BHI固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48h；从平板上挑取单菌落进行菌落PCR验证；阳性转化子接种于装液量为10mL的BHI 10mL小瓶中，甘油管保菌，制备得到CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc。

(2)将酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶分别调整为：枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^Bs(Genbank登录号为CP053102.1)、嗜酸乳杆菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^La (Genbank登录号为CP054559.1)、巴西固氮螺菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^Ab(Genbank 登录号为CP007793.1)、大肠杆菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^Ec(Genbank登录号为 CP053602.1)、浅紫灰链霉菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^Sl(Genbank登录号为 CP024985.1)、铜绿假单胞菌来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA^Pa(Genbank登录号为 LR657304.1)；按照上述方法分别制备重组菌：CGQ03/pXMJ19-glnA^Bs、CGQ03/pXMJ19-glnA^La、 CGQ03/pXMJ19-glnA^Ab、CGQ03/pXMJ19-glnA^Ec、CGQ03/pXMJ19-glnA^Sl、 CGQ03/pXMJ19-glnA^Pa。

实施例6：表达大肠杆菌E.coli BL21来源的多聚磷酸盐激酶的重组谷氨酸棒杆菌的构建

根据NCBI中Genbank(CP076318.1)上公布的大肠杆菌多聚磷酸盐激酶编码基因ppk 序列，设计引物ppk^Ec-F、ppk^Ec-R，从大肠杆菌BL21基因组上扩增出长2067bp的ppk^Ec基因。

同时将穿梭质粒pXMJ19使用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，获得线性化质粒。

将目的基因ppk^Ec与线性化载体pXMJ19利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞)进行纯化回收，再通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，连接产物转化入E.coli BL21感受态细胞，获得转化产物。转化产物涂布于LB固体培养基(含 25mg/L氯霉素)上，于37℃恒温培养箱倒置培养12h，得到转化子。挑取平板上的转化子进行菌落PCR验证，并提质粒送测序，验证正确后即获得重组质粒pXMJ19-ppk^Ec。

ppk^Ec-F：5’-aattaagcttgcatgcctgcagaggaggagggttattagatgggtcaggaaaagctatac-3’

ppk^Ec-R：5’-ccaaaacagccaagctgaattcttagtggtggtggtggtggtgttcaggttgttcgagtg-3’

制备CGQ03感受态细胞，将5-10μL过表达质粒pXMJ19-ppk^Ec导入CGQ03感受态细胞中，按照实施例4的方法，制备得到重组菌：CGQ03/pXMJ19-ppk^Ec。

实施例7：重组菌株CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec的构建

以重组质粒pXMJ19-glnA^Sc为模板，利用引物glnA^Sc-F和ScEc-2扩增出包含tac启动子及glnA^Sc基因片段。以重组质粒pXMJ19-ppk^Ec为模板，利用引物ScEc-3和ScEc-4扩增出包含tac启动子及ppk^Ec基因片段。两片段经胶回收纯化后，通过重叠延伸PCR获得包含tac启动子、glnA^Sc基因、tac启动子及ppk^Ec基因的融合片段。融合片段经纯化后与线性化质粒pXMJ19连接，连接产物转化入E.coli BL21感受态细胞，获得转化产物。转化产物涂布于 LB固体培养基(含25mg/L氯霉素)上，于37℃恒温培养箱倒置培养12h，得到转化子。挑取平板上的转化子进行菌落PCR验证，并提质粒送测序，验证正确后即获得重组质粒 pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec(如图2所示)。

ScEc-2：5’-attgtcaacagctcatttcagttatgaagattctctttcaaattccttcg-3’

ScEc-3：5’-ctgaaatgagctgttgacaattaatc-3’

ScEc-4：5’-cgccaaaacagccaagctg-3’

制备CGQ03感受态细胞，将5-10μL过表达质粒pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec导入CGQ03感受态细胞中，按照实施例4的方法，制备得到重组菌CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec。

实施例8：L-谷氨酰胺基因工程菌发酵生产L-谷氨酰胺

1、摇瓶发酵制备L-谷氨酰胺

发酵过程：

(1)从-80℃甘油管中用接种环挑取重组谷氨酸棒杆菌，分别在BHI固体培养基上三区划线，置于30℃培养箱培养24h进行活化；

(2)挑取活化的单菌落，分别接种到种子培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆30mL/L、尿素6g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L，初始pH 7.0)中，在30℃，220rpm培养12h后，制备得到种子液；

(3)分别将种子液按10％(v/v)的接种量转接到含有50mL发酵培养基(葡萄糖120g/L、硫酸铵40g/L、玉米浆10mL/L、尿素2.0g/L、三水合磷酸氢二钾2.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L、一水合硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.02g/L，七水合硫酸锌0.01g/L以及碳酸钙30g/L，初始pH 7.0)的500mL挡板摇瓶中开始发酵，温度为30℃，转速为220rpm，发酵时间为： 66h。

2、5L发酵罐发酵制备L-谷氨酰胺

(1)从-80℃甘油管中用接种环挑取重组谷氨酸棒杆菌，分别在BHI平板培养基上三区划线，置于30℃培养箱培养48h；

挑取平板活化的单菌落，分别接种到种子培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆30mL/L、尿素6g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L，初始pH 7.0)中，30℃，220rpm培养12 h后，制备得到一级种子液；

分别将一级种子液按10％(v/v)的接种量转接到含有200mL上述种子培养基的1L挡板摇瓶中，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀达到约30.0，得到二级种子液；

(2)分别将二级种子液按体积比10％(v/v)的接种量全部转移至5L发酵罐中，发酵罐中含1.8L发酵培养基(葡萄糖120g/L、硫酸铵40g/L、玉米浆10mL/L、尿素2.0g/L、三水合磷酸氢二钾2.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L、一水合硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.02 g/L以及七水合硫酸锌0.01g/L，初始pH 7.0)，进行发酵培养；

发酵参数控制：搅拌速度为600rpm，温度为30℃，通气量为3L/min，发酵时间为66h；发酵开始后采用两阶段pH控制策略调控L-谷氨酰胺的发酵，具体为：

发酵开始后的0～20h为菌体生长期，利用50％氨水将pH控制为7.0，当发酵至20h后，发酵液中L-谷氨酸的开始积累，此时L-谷氨酸浓度达到1.0～2.0g/L，使pH从7.0自然降低到6.2，此时，采用纯氨水继续控制pH为6.0～6.2，使L-谷氨酰胺快速高效合成。

发酵液中葡萄糖含量通过流加质量分数为80％的葡萄糖来维持，使发酵液中的葡萄糖的浓度维持在20-40g/L之间。

按照上述方法，分别将C.glutamicum ATCC 14067、C.glutamicum N01、CGQ01、CGQ02、 CGQ03、CGQ03/pXMJ19-glnA^Bs、CGQ03/pXMJ19-glnA^La、CGQ03/pXMJ19-glnA^Ab、CGQ03/pXMJ19-glnA^Ec、CGQ03/pXMJ19-glnA^Sl、CGQ03/pXMJ19-glnA^Pa CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc、CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec进行摇瓶发酵制备L-谷氨酰胺，结果如表1所示；

分别将C.glutamicum N01和CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec进行5L发酵罐发酵制备L-谷氨酰胺，结果如图3～4及表1所示。

表1不同菌株的L-谷氨酰胺产量及糖胺转化率

由表1可知，出发菌株C.glutamicum N01相比于模式菌株C.glutamicumATCC14067具有合成L-谷氨酰胺能力更强的优势，可用于进一步的代谢改造。

C.glutamicum N01菌株敲除proB基因(菌株CGQ01)L-谷氨酰胺的产量和对照组(菌株 N01)相比有所提高，说明敲除proB基因阻断了支路竞争途径，增强了流向L-谷氨酰胺的代谢流。

菌株CGQ01敲除NCgl1221基因(菌株CGQ02)破坏了谷氨酸分泌通道蛋白，从而副产物L-谷氨酸的含量显著降低，由12.3g/L降低至9.2g/L，同时L-谷氨酰胺的产量也得到了较大的提高，这可能是由于NCgl1221基因的敲除使更多的前体L-谷氨酸保留在胞内从而促进了L-谷氨酰胺的合成。

菌株CGQ03进一步解除了glnE对glnA的腺苷酰化作用，敲除glnE使L-谷氨酰胺的产量增加至36.2±2.5g/L。

在CGQ03中过表达了不同来源的glnA基因，其中，异源表达酿酒酵母来源的glnA基因，使L-谷氨酰胺的产量增加至45.9±1.4g/L。

异源过表达大肠杆菌来源的ppk基因，L-谷氨酰胺产量也得到了一定的提高。将glnA基因与ppk基因在载体pXMJ19上进行共表达，具有协同作用，相比对照菌L-谷氨酰胺产量显著提高。

最终的重组菌株CGQ03/pXMJ19-glnA^Sc-ppk^Ec于5L发酵罐中培养66h得到73.5±3.1g/L 的L-谷氨酰胺，相对于原始菌提高了186.0％，L-谷氨酰胺的糖酸转化率提高至0.368±0.034。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酰胺中的应用

<130> BAA210944A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Glu Arg Ile Ser Asn Ala Lys Arg Val Val Val Lys Ile Gly

1 5 10 15

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Ser Asp Leu Ile Val Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Met Ala

50 55 60

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100 105 110

Asp Ala Gly Lys Arg Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gln Arg Thr Ile Asp

115 120 125

Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ala Val Pro Ile Val Asn Glu Asn Asp Thr

130 135 140

Val Ala Thr Thr Gly Val Asn Phe Gly Asp Asn Asp Arg Leu Ala Ala

145 150 155 160

Ile Val Ala His Leu Val Ser Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Ser Asp

165 170 175

Val Asp Gly Leu Phe Asp Lys Asn Pro Thr Asp Pro Thr Ala Lys Phe

180 185 190

Ile Ser Glu Val Arg Asp Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val Ile Ala Gly

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245 250 255

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290 295 300

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Ala Gly Gln Ile Ile Gly Arg Gly Glu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Thr

325 330 335

Leu Gln Ser Met Val Gly Met Gln Thr Gln Asp Leu Pro Asp Gly Met

340 345 350

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355 360 365

Ala

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5 10 15

Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu

20 25 30

Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp

35 40 45

Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala

50 55 60

Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe

65 70 75 80

Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala

85 90 95

Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly

100 105 110

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145 150 155 160

Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser

165 170 175

Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile

180 185 190

Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly

195 200 205

Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro

210 215 220

Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val

225 230 235 240

Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val

245 250 255

Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr

260 265 270

Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val

275 280 285

Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala

290 295 300

Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn

325 330 335

Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu

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Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu

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<210> 3

<211> 1045

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp

35 40 45

Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn

50 55 60

Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala

65 70 75 80

Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Lys Leu Arg Val

85 90 95

Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu

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Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser

115 120 125

Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro

130 135 140

Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg

145 150 155 160

Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro

165 170 175

Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg

180 185 190

Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg

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245 250 255

Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp

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Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala

275 280 285

Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala

290 295 300

Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp

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Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln

325 330 335

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Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Thr Ala Ser Gln Arg

355 360 365

Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp

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850 855 860

Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp

865 870 875 880

Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg

885 890 895

Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr

900 905 910

Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu

915 920 925

Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser

930 935 940

Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro

945 950 955 960

Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala

965 970 975

Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro

980 985 990

Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp

995 1000 1005

Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr

1010 1015 1020

Arg Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp

1025 1030 1035

Ser Met Glu Gln Arg Glu Phe

1040 1045

<210> 4

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Glu Ala Ser Ile Glu Lys Thr Gln Ile Leu Gln Lys Tyr Leu

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gln Arg Gly Arg Ile Ile Ala Glu Tyr Val Trp Ile Asp

20 25 30

Gly Thr Gly Asn Leu Arg Ser Lys Gly Arg Thr Leu Lys Lys Arg Ile

35 40 45

Thr Ser Ile Asp Gln Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly Ser Ser Thr

50 55 60

Asn Gln Ala Pro Gly His Asp Ser Asp Ile Tyr Leu Lys Pro Val Ala

65 70 75 80

Tyr Tyr Pro Asp Pro Phe Arg Arg Gly Asp Asn Ile Val Val Leu Ala

85 90 95

Ala Cys Tyr Asn Asn Asp Gly Thr Pro Asn Lys Phe Asn His Arg His

100 105 110

Glu Ala Ala Lys Leu Phe Ala Ala His Lys Asp Glu Glu Ile Trp Phe

115 120 125

Gly Leu Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Phe Asp Met Tyr Asp Asp Val Tyr

130 135 140

Gly Trp Pro Lys Gly Gly Tyr Pro Ala Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys

145 150 155 160

Gly Val Gly Ala Gly Lys Val Tyr Ala Arg Asp Met Ile Glu Ala His

165 170 175

Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Leu Glu Ile Ser Gly Ile Asn Ala

180 185 190

Glu Val Met Pro Ser Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Cys Thr Gly

195 200 205

Ile Asp Met Gly Asp Gln Leu Trp Met Ala Arg Tyr Phe Leu His Arg

210 215 220

Val Ala Glu Glu Phe Gly Ile Lys Ile Ser Phe His Pro Lys Pro Leu

225 230 235 240

Lys Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Val Ser Thr Lys

245 250 255

Glu Met Arg Gln Pro Gly Gly Met Lys Tyr Ile Glu Gln Ala Ile Glu

260 265 270

Lys Leu Ser Lys Arg His Ala Glu His Ile Lys Leu Tyr Gly Ser Asp

275 280 285

Asn Asp Met Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Ser Met Thr Ala

290 295 300

Phe Ser Ser Gly Val Ala Asn Arg Gly Ser Ser Ile Arg Ile Pro Arg

305 310 315 320

Ser Val Ala Lys Glu Gly Tyr Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala

325 330 335

Ser Asn Ile Asp Pro Tyr Leu Val Thr Gly Ile Met Cys Glu Thr Val

340 345 350

Cys Gly Ala Ile Asp Asn Ala Asp Met Thr Lys Glu Phe Glu Arg Glu

355 360 365

Ser Ser

370

<210> 5

<211> 688

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Glu Lys Glu Leu Ser Trp Leu Ser

1 5 10 15

Phe Asn Glu Arg Val Leu Gln Glu Ala Ala Asp Lys Ser Asn Pro Leu

20 25 30

Ile Glu Arg Met Arg Phe Leu Gly Ile Tyr Ser Asn Asn Leu Asp Glu

35 40 45

Phe Tyr Lys Val Arg Phe Ala Glu Leu Lys Arg Arg Ile Ile Ile Ser

50 55 60

Glu Glu Gln Gly Ser Asn Ser His Ser Arg His Leu Leu Gly Lys Ile

65 70 75 80

Gln Ser Arg Val Leu Lys Ala Asp Gln Glu Phe Asp Gly Leu Tyr Asn

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Met Ala Arg Asn Gln Ile Phe Leu Ile Asn Glu

100 105 110

Arg Gln Leu Ser Val Asn Gln Gln Asn Trp Leu Arg His Tyr Phe Lys

115 120 125

Gln Tyr Leu Arg Gln His Ile Thr Pro Ile Leu Ile Asn Pro Asp Thr

130 135 140

Asp Leu Val Gln Phe Leu Lys Asp Asp Tyr Thr Tyr Leu Ala Val Glu

145 150 155 160

Ile Ile Arg Gly Asp Thr Ile Arg Tyr Ala Leu Leu Glu Ile Pro Ser

165 170 175

Asp Lys Val Pro Arg Phe Val Asn Leu Pro Pro Glu Ala Pro Arg Arg

180 185 190

Arg Lys Pro Met Ile Leu Leu Asp Asn Ile Leu Arg Tyr Cys Leu Asp

195 200 205

Asp Ile Phe Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Asp Ala Leu Asn Ala Tyr Ser

210 215 220

Met Lys Met Thr Arg Asp Ala Glu Tyr Asp Leu Val His Glu Met Glu

225 230 235 240

Ala Ser Leu Met Glu Leu Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Arg Leu Thr

245 250 255

Ala Glu Pro Val Arg Phe Val Tyr Gln Arg Asp Met Pro Asn Ala Leu

260 265 270

Val Glu Val Leu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Ser Arg Tyr Asp Ser Ile

275 280 285

Val Pro Gly Gly Arg Tyr His Asn Phe Lys Asp Phe Ile Asn Phe Pro

290 295 300

Asn Val Gly Lys Ala Asn Leu Val Asn Lys Pro Leu Pro Arg Leu Arg

305 310 315 320

His Ile Trp Phe Asp Lys Ala Gln Phe Arg Asn Gly Phe Asp Ala Ile

325 330 335

Arg Glu Arg Asp Val Leu Leu Tyr Tyr Pro Tyr His Thr Phe Glu His

340 345 350

Val Leu Glu Leu Leu Arg Gln Ala Ser Phe Asp Pro Ser Val Leu Ala

355 360 365

Ile Lys Ile Asn Ile Tyr Arg Val Ala Lys Asp Ser Arg Ile Ile Asp

370 375 380

Ser Met Ile His Ala Ala His Asn Gly Lys Lys Val Thr Val Val Val

385 390 395 400

Glu Leu Gln Ala Arg Phe Asp Glu Glu Ala Asn Ile His Trp Ala Lys

405 410 415

Arg Leu Thr Glu Ala Gly Val His Val Ile Phe Ser Ala Pro Gly Leu

420 425 430

Lys Ile His Ala Lys Leu Phe Leu Ile Ser Arg Lys Glu Asn Gly Glu

435 440 445

Val Val Arg Tyr Ala His Ile Gly Thr Gly Asn Phe Asn Glu Lys Thr

450 455 460

Ala Arg Leu Tyr Thr Asp Tyr Ser Leu Leu Thr Ala Asp Ala Arg Ile

465 470 475 480

Thr Asn Glu Val Arg Arg Val Phe Asn Phe Ile Glu Asn Pro Tyr Arg

485 490 495

Pro Val Thr Phe Asp Tyr Leu Met Val Ser Pro Gln Asn Ser Arg Arg

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Met Val Asp Arg Glu Ile Ala Asn Ala Gln Gln Gly

515 520 525

Leu Pro Ser Gly Ile Thr Leu Lys Leu Asn Asn Leu Val Asp Lys Gly

530 535 540

Leu Val Asp Arg Leu Tyr Ala Ala Ser Ser Ser Gly Val Pro Val Asn

545 550 555 560

Leu Leu Val Arg Gly Met Cys Ser Leu Ile Pro Asn Leu Glu Gly Ile

565 570 575

Ser Asp Asn Ile Arg Ala Ile Ser Ile Val Asp Arg Tyr Leu Glu His

580 585 590

Asp Arg Val Tyr Ile Phe Glu Asn Gly Gly Asp Lys Lys Val Tyr Leu

595 600 605

Ser Ser Ala Asp Trp Met Thr Arg Asn Ile Asp Tyr Arg Ile Glu Val

610 615 620

Ala Thr Pro Leu Leu Asp Pro Arg Leu Lys Gln Arg Val Leu Asp Ile

625 630 635 640

Ile Asp Ile Leu Phe Ser Asp Thr Val Lys Ala Arg Tyr Ile Asp Lys

645 650 655

Glu Leu Ser Asn Arg Tyr Val Pro Arg Gly Asn Arg Arg Lys Val Arg

660 665 670

Ala Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Glu Gln Pro Glu

675 680 685

<210> 6

<211> 770

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggcttgagc atttccagca gacgcacgcc aatgccaccg gcgcccaaaa tagcgacagt 60

tttattgtca tgcagccatg acttgttgtt ttccacctca ggccgcacgc tccacgactt 120

agccaaacga gtcgtcgcat gcatgtgcat ctgcgccaga attaaaccaa tggtggactc 180

agcaacggtg tcagcgtaca ggccagccgc gtttgcccaa cgtgccttct cattgacgac 240

accacgcttg accagcgcat caatacccgc catggaggcc tgcacgaact tgatgttctc 300

cggcaaatcc gggaactccg gcgctgaacc attaaagaaa atgaagtctg catctttaat 360

atcctcaacc cgctcatgtc cgccaccctc aatgacagcg gtcgtggact cccacaaatg 420

cggatacata acaaacttca tcgtcttaaa ctcctttaaa agtgcttttc gacgccacct 480

gccaccagca ggcccgcgct ttacgcgcgg ctggcgtagt tggacagata atctgcatgc 540

actaccgggc gctgcatgcc atctggaagg tcctgcgttt gcatgccaac cattgattgc 600

aaggtatcag aatcgtagga cacctcgcct cgcccgatga tttggccggc aggtcccaag 660

atctccacga tctcaccctg ttggaaatca ccaatgatct cagtaatgcc cacagccagc 720

aaagatttac caccggaggt cactgcttcc accgcgccat catcaagtcg 770

<210> 7

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtgcatgag gtgaacttgc cccactgctg ctgcagcctg cttgactgcc aattccgtgg 60

gccgggtgct caatccaagc ggggccattc ccgcggccac tgcgccagag gacacaacga 120

tgaggtccga gccagcttcc atgcgtgctt gcaaggcatt gacaatagtg ttgatgcggt 180

tgggatcgac ggtgtgtcca tcctcatcgt tagtcaatga ggacgaacca attttcacca 240

ccactcgctt agcgttggag atgcgttcac gcattccgga ttcatgtccg tatgcggcgc 300

tgtctttggt gtccggatcc actgccggga agctcgcacc gatgcttgct tcctggctgt 360

agggggtgac gggaagccct gtcaccggcg ccatttgggt tggcgttggg agattatccc 420

gtaatcgaac gctttcaggt gtgttctgcg tatcattcat agcgttacca tcgtatacac 480

gtagacctga aaagtgcttg gttttatcct tcccagcgtt cgcgggaagc ctcttggtcc 540

tcgccataat ccaactcatc gatgaggcca cgacgtacct gagatgcgcg tttacgctct 600

gcagcagaga tacgagaggt ctgttcaagg cgcacatcgg tgccacgtcc ggtaaggatt 660

ggatcgtcgc cagcggtggt cattggctcc cactcgaagg aaatgcctcc gatggtgacg 720

tttgcaccca catgtgctcc tgccttacga agcccgtcct caatgcccaa cttg 774

<210> 8

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtagccgtct tcttgaacga ctacaacctt gccgtcggct gcttccttgc ttgcggtgat 60

cgcatcgggg atgcggccgt gggaagcagc ttcaaggcgg ggaagggagt tgaaggtgac 120

gccggggagg gtgacttctg catcggaggt ggtgcgagcg aaagtgcggg cacccttgaa 180

tccgattcct gcgaggtctt cccaggccac aacctttttg cccttgaagg cgtagtttgc 240

ggtgatgccc tgttcatcaa cgatcgtgga tgattttaga acccagtaac cgaagatgac 300

agggagcgcg agcagccaaa acaggtactg aggggctgcg ccgatgacta ataatgagat 360

caggccaaaa acaacggcgc ccaaaatatg ggtgcgttct gggtgaaatt tttcggaaag 420

ctccacggat gccttttctg cgtctgaact cataatttcc aatagtagta aagaaatggg 480

acacgtctgt aatcagcgtc ctaaggggtg gacgtcggcg caactgtctc ttggaccgcg 540

gttggtgctt ccactgctgg agactgcgtc tgcgacgcag tcgtttcctc ctgcgacgtg 600

gcttcctcgg tcggttcgat ggtgtcggct cgctggggcg ttgcggttgc aggggttgag 660

gtttcctgct gcgtttcgac gttagattcc atcgttgggg tctcctccac cgtagtgggc 720

actgtcatcg aaggcgtgct tactggcgcg gaagtttcgg aggtggtcac cgcagttgag 780

gtggcagtgc ttggtgacag ccatccactg gagttttgcc aattctcact tggttccaca 840

gtcatgacct taaatagtga cagcaagagc agcgcaccca acaacaggga cgtgctcatg 900

<210> 9

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacccacgcc gaattgcttt tccgtcagga tgaaaaatcc ggccaagaag tccgcaacaa 60

tcgactgcgc accaaggcca atggcagctg acgcaatggt tgccggaatc gcagcgcccg 120

cgagagagaa accaaaagcc tgcatcgcgg agacggcaag catgaaaaac gccacaattt 180

gcgcgatata aacgccaacg ccggcgaacg cgagctggtt cttagtggtg tccgcatcgg 240

ctgcagactc cactcggcgc ttgataatac gcatggccag tcggccgata cgtggaatca 300

aaaacgccaa gaccaggata attgctacat caaaaccggt atcgacaatc caattccaca 360

atgaatagag caaatattga atgggtacgc ctaaaatcat gagccaagat tagcgctgaa 420

aagtagcggg agcctgcctg aactttgtga gaatcctgat tccttaaccg aagtggggga 480

gttttggggg tgggaatttt cgtgcgttgt ggaattggaa actcgatgtg tgtagcatga 540

cacaccatga ccattattcg acttgtagta gtaaccgcgc ggcgcctgcc gtaacggcct 600

tccaagtcgt ctcgtcaagc gccctcgaca acactcacca cagtgttgga acgagggctt 660

tcttgttggt tatgacccaa gtagccaact ttgcaacaga catctgtcgc actgcgtgca 720

cacgcatccg cgtcggaaca attttaaatg agggctttgt ctttaggctg agttgaaatc 780

ggcttggctt ggacgggtcc tgtgaaaatc cttatttagt aaaggagcca gaaagtcgtg 840

aatgtggcag cttctcaaca gcccactccc gccacggttg caagccgtgg tcgatccgcc 900

<210> 10

<211> 1250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgaagctcc aactgcggca acctggggtg tatctaatcg ttctgcgctg gttcgtgttc 60

ctacctaccg tttgaataag gaggagtcgc gccgggtgga ggtgcgtctt cctgataccg 120

cttgtaaccc atatttggcg ttttcagtga tgctcggcgc tggtttgaaa ggcattaaag 180

aaggttatga gctcgacgag ccagctgagg acgatatctc caacttgagc ttccgggaac 240

gtcgcgccat gggctacaac gatctgccaa gcagccttga tcaggcactg cgccaaatgg 300

aaaagtcaga gcttgttgct gacatcctcg gtgagcacgt ttttgagttt ttcttgcgca 360

ataagtggcg tgaatggcgt gactaccaag agcagatcac tccgtgggag ctccgaaaca 420

atcttgatta ctagactttt gcactccaat ggaaacccta cggcgaccca attgcgaccc 480

gatgaaggag gggagaagct atgtcaggac cgttaagaag tgaacgtaaa gtcgttggct 540

ttgtcagaga cccactgcca aaagttggtt ctttatcgct gaaatctgag catgcccaag 600

cagatctaga gcatttgggt tggcgcaatg ttgagtcttt ggatttgttg tggggcttgt 660

caggtgcagg cgatcccgat gtcgcgctga accttcttat tcggctgtat caggcacttg 720

aagcaatcgg cgaggatgct cgaaacgagc ttgatcaaga gattcgccag gatgaaaaac 780

tacgagtccg cctttttgca ttgttgggtg gttcctcggc tgtcggtgat cacttggtcg 840

ccaatccttt gcagtggaaa ctcttaaaac ttgatgcgcc atcgagggaa gagatgtttc 900

aggcgctgct ggaatctgtg aaagctcagc ctgctgtgct tgaggttgag gatttcagcg 960

atgcacacaa cattgcccga gacgatttga gcacgcctgg tttttacacg gctagtgtta 1020

ccgggcctga agcagagcga gtcttgaaat ggacttatcg cacgttgctg acccggattg 1080

ctgcgcatga tttagcgggt acctatccca ccgacatgcg gagaaaaggt ggcgatcctg 1140

ttccgtttag cacagtgacc atgcagctca gcgacctagc tgatgctgct ttgactgctg 1200

ctttagctgt ggcaattgcc aatgtttatg gtgaaaagcc ggttgattca 1250

<210> 11

<211> 1306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tatgcgagcc ggtagccggt gtggaagagc atgaggccgt cacatggtct attgctatct 60

gtgattccat gcggtcgagg cttgcgcagc cttccggtga tccacctttg gaggtggatc 120

tggggctgcg tcctgaaggg agatctggtg cgattgtgcg caccgttgat tcctatgtga 180

agtactacga aaagtggggt gaaacttggg agattcaggc gctgctgagg gctgcgtggg 240

ttgctggtga tcgtgagctg ggtattaagt tcttggagtc gattgatcgt ttccgctacc 300

cagttgacgg ggcaacgcag gcgcagcttc gtgaagttcg tcgaattaag gcgagggtgg 360

ataatgagag gcttccgcgc ggggctgatc gaaataccca taccaagctg ggtcggggag 420

cgttaactga catcgagtgg actgtgcagt tgttgaccat gatgcatgct catgagattc 480

cggagctgca caatacgtcg acgttggaag ttcttgaagt gctggaaaag catcagatta 540

ttaaccctgt gcaggtgcag acgcttcggg aagcgtggct gacggcaacg gctgctagga 600

atgcgcttgt gctggtcagg ggtaagagat tagatcagtt acctactcct ggtccgcacc 660

ttgcgcaggt ggctggtgcg tctggttggg atccaaatga gtaccaggag tatttggaaa 720

actatctgaa agtgaccagg aagagtcgtc aggttgttga tgaagtcttc tggggtgtgg 780

actctatgga gcaacgtgag ttttaggtag gtggtgggag ccccaaagtt gcggaaaatt 840

gttccaacta agggactata tgtaggtgtg ggtaacctaa gttaatcttt tgtgagcgtg 900

aggatttctc tgaggaatct agacgcagat taacttccgc ttggcagcga ccgggataac 960

accgcggttg cggccacgca ggctcacaaa ggacaccact atgacaagca ttattgcaag 1020

caacagcgac ctatcggagg cgctgcgcac ccacactgcg caggcccatg aagaggccga 1080

gcactcaacg tttatgaatg atctgctcac cgggaagctc gatgcgcagg catttatcaa 1140

gttgcaggag caatcatggt tgttctacac cgctttggaa gctgcagctc gtgcatgtgc 1200

agaggattcc cgtgcggctg gtctgctgga cccacgcctc gagcgcaagg aaacgttgga 1260

agctgatctg gataagctgc acgaaaacac cacctggcgt gacaac 1306

Claims

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌N01为宿主细胞，敲除了宿主基因组上的编码γ-谷氨酸激酶的基因proB、编码谷氨酸机械通道蛋白的基因NCgl1221和编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的基因glnE，并且过表达了酿酒酵母来源的谷氨酰胺合成酶基因glnA和大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶基因ppk；所述γ-谷氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述谷氨酸机械通道蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述多聚磷酸盐激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述谷氨酸棒杆菌N01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021931。

2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以pXMJ19质粒、pDXW-10质粒、pJYW-4质粒或pEC-XK99E质粒为表达载体。

3.一种生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌发酵制备L-谷氨酰胺。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为，将重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中，得到种子液；将制备得到的种子液按照8%~10%的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备得到L-谷氨酰胺。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中进行培养，培养条件为：30-32 ℃，控制种子培养基初始pH为7.0~7.2。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将重组谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中进行培养，得到一级种子液；将一级种子液按照10%的接种量转接至种子培养基中，进行培养，得到二级种子液；将制备得到的二级种子液按照10%的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，制备得到L-谷氨酰胺。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用两阶段pH控制策略发酵生产L-谷氨酰胺：发酵开始的0~20 h利用50% 氨水将pH维持为7.0；发酵至20 h后，用纯氨水继续控制pH为6.0~6.2。

8.权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备含有L-谷氨酰胺的产品中的应用。