CN1384190A - 通过发酵生产l－谷氨酰胺的方法和产生l－谷氨酰胺的细菌 - Google Patents

通过发酵生产l－谷氨酰胺的方法和产生l－谷氨酰胺的细菌 Download PDF

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Abstract

通过在培养基中培养具有L－谷氨酰胺生产能力并且已经修饰使它的细胞内谷氨酰胺合成酶活性增强,优选地已经进一步修饰使它的细胞内谷氨酸脱氢酶活性增强的棒状杆菌细菌,在培养基中生产和积累L－谷氨酰胺,并且回收L－谷氨酸,来生产L－谷氨酸。

Description

通过发酵生产L-谷氨酰胺的 方法和产生L-谷氨酰胺的细菌
发明领域
本发明涉及属于棒状细菌的产生L-谷氨酰胺的细菌和生产L-谷氨酰胺的方法。L-谷氨酰胺是工业上有用的氨基酸，可作为调味品，肝脏功能促进剂，氨基酸输液，广泛的氨基酸制剂等等的成分。
背景技术
为了采用发酵方法生产L-谷氨酸，已经大量地使用通过育种改进微生物的方法。就是说由于在许多情况下野生型菌株本身生产L-谷氨酸的能力非常低，已知通过突变给予辅源营养或类似物特性的抗性或给与代谢调节突变的方法和将这些结合使用的方法。虽然采用上面的方法获得了合适产量的L-谷氨酰胺，但是进一步改进发酵产量以便在工业上以低成本生产-谷氨酰胺是绝对必要的。
此外，L-谷氨酰胺发酵也遇到了L-谷氨酸副产物的问题。例如在日本待审专利公开号3-232497中建议了解决该问题的方法。虽然，该方法将L-谷氨酸的生产抑制到一定的程度，但是仍然有L-谷氨酸副产物并且L-谷氨酰胺的产量是不够的。
由于上文提到的L-谷氨酰胺产生菌的这样的改进利用了用诱变剂等处理宿主细菌和从掺入随机突变的细菌选择显示L-谷氨酰胺产率改进的菌株的方法，它们需要更多的劳动和遇到困难。
发明内容
本发明的目的之一是找到具有改进的L-谷氨酰胺产率和抑制L-谷氨酸副产物的特性的棒状细菌，从而提供了利用具有这样的特性的菌株生产L-谷氨酰胺的方法。
本发明的发明人进行了刻苦的研究以便达到上面的目的。结果它们发现胞内谷氨酰胺合成酶活性增强的棒状细菌菌株与具有野生型菌株的谷氨酰胺合成酶活性的菌株相比显示更优秀的L-谷氨酰胺产生能力和显著抑制副产物L-谷氨酸的产生。再者，他们发现同时加强谷氨酰胺合成酶活性和谷氨酸盐脱氢酶活性改进了L-谷氨酰胺的产率。此外他们成功地分离了编码L-谷氨酰胺合成酶的新基因和编码L-谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的新基因，因此完成了本发明。
就是说，本发明提供了下面的内容。
(1)棒状细菌，具有L-谷氨酰胺产生能力并且已经被修饰以便应该加强胞内谷氨酰胺合成酶活性。
(2)根据(1)的细菌，其中通过增加谷氨酰胺合成酶基因的表达量加强谷氨酰胺合成酶活性。
(3)根据(2)的细菌，其中通过增加编码谷氨酰胺合成酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达调控序列以便编码该细菌的胞内谷氨酰胺合成酶的基因的表达获得加强，增加了谷氨酰胺合成酶基因的表达量。
(4)根据(1)的细菌，其中通过腺苷化缺失对胞内谷氨酰胺合成酶的活性控制加强谷氨酰胺合成酶活性。
(5)根据(4)的细菌，其中通过腺苷酸化控制其胞内谷氨酰胺合成酶的活性被一个或多个携带的其腺苷酸化活性控制被缺失的谷氨酰胺合成酶所缺失，在该细菌细胞中谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性降低，在该细菌细胞中PII蛋白质活性降低。
(6)根据(1)-(5)任一项所述的细菌，其中该细菌进一步被修饰以便其胞外谷氨酸脱氢酶活性得到加强。
(7)根据(6)所述的细菌，其中通过增加谷氨酸脱氢酶基因的表达量加强了谷氨酸脱氢酶活性。
(8)根据(7)的细菌，其中通过增加编码谷氨酸脱氢酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达控制序列增加谷氨酸脱氢酶基因的表达量，以便增加了编码细菌胞内谷氨酸脱氢酶的基因的表达量。
(9)生产L-谷氨酰胺的方法，包括在培养基中培养根据(1)-(8)任一项的细菌以产生和在培养基中积累L-谷氨酰胺并且收集L-谷氨酰胺。
(10)编码下面(A)或(B)定义的蛋白质的DNA：
(A)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：2的氨基酸序列并且具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质。(11)根据(10)的DNA，它是下面(a)或(b)定义的DNA：
(a)含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号659-1996位的核苷酸序列的DNA，
(b)在严谨条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号659-1996位的核苷酸序列，或可从该序列制备的探针杂交并且编码具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质的DNA。(12)编码下面(C)或(D)定义的蛋白质的DNA：
(C)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，
(D)具有包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：3的氨基酸序列并且具有谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性的蛋白质。(13)根据(12)的DNA，它是下面(d)或(d)定义的DNA：(c)含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号2006-5200位的核苷酸序列的DNA，(d)在严谨条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号2006-5200位的核苷酸序列，或可从该序列制备的探针杂交并且编码具有谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性的蛋白质的DNA。
根据本发明，在利用棒状杆菌发酵生产L-谷氨酰胺时可以抑制副产物L-谷氨酸的产生并且改进L-谷氨酰胺的生产效率。此外，可以利用本发明的DNA繁殖产生L-谷氨酰胺的棒状杆菌。
                   具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细的解释。
(1)本发明的棒状杆菌在本发明中，“棒状杆菌”包括已经被划分为短杆菌属，但是目前统一称为棒状杆菌属的那些(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括属于接近于棒状杆菌属的短杆菌属的细菌。这样的棒状杆菌的例子介绍如下。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌
醋谷棒状杆菌
corynebacterium alkanolyticum
美棒状杆菌
谷氨酸棒状杆菌
百合花棒状杆菌
corynebacterium melassecola
corynebacterium thermoaminogenes
力士棒状杆菌
分支短杆菌
黄色短杆菌
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌
玫瑰色短杆菌
解糖短杆菌
生硫短杆菌
产氨短杆菌
白色短杆菌
蜡状短杆菌
嗜氨微杆菌
具体地说，例举了这些细菌的下面的菌株：
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870
醋谷棒状杆菌ATCC15806
corynebacterium alkanolyticum ATCC21511
美棒状杆菌ATCC15991
百合花棒状杆菌ATCC13020，13032，13060
分支短杆菌ATCC15990
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 FERM BP-1539)
力士棒状杆菌ATCC13868
谷氨酸棒状杆菌ATCC14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERMBP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
乳发酵短杆菌，ATCC13869
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
产氨短杆菌ATCC6871，ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
蜡状短杆菌ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354为了获得这些菌株，例如美国典型培养物保藏中心(美国，VA20110-2209，Manassas，Boulevard大学10801)可以提供这些菌株。就是说，各个菌株有其指定的保藏号，根据各个菌株的保藏号可以请求提供这些菌株。在美国典型培养物保藏中心的目录中指明了对应于各个菌株的保藏号。此外，AJ12340菌株于1987年10月27日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在，独立的行政机构，国家高级工业科学和技术研究院，国际专利生物体保藏机构(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，ibaraki-ken，日本，邮编：305-8566))作为布达佩斯条约下的国际保藏，保藏号为FERM BP-1539。AJ12418菌株于1989年1月5日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所作为布达佩斯条约下的国际保藏，保藏号为FERM BP-2205。
在本发明中，“产生L-谷氨酰胺的能力”是指当在培养基中培养本发明的棒状杆菌时在培养基中积累L-谷氨酰胺的能力。棒状杆菌的野生型菌株的特性使之本身具有产生L-谷氨酰胺的能力或可以通过繁育给予或加强。
为了通过繁育给予或加强产生L-谷氨酰胺的能力，可以使用分离6-重氮-5-氧代-正亮氨酸抗性菌株的方法(日本专利待审公开号3-232497)，分离嘌呤类似物和/或甲硫氨酸亚砜抗性菌株的方法(日本专利待审公开号61-202694)，分离α-酮丙二酸抗性菌株的方法(日本专利待审公开号56-151495)，给予对含有谷氨酸的肽的抗性的方法(日本专利待审公开号2-186994)等等。作为具有L-谷氨酰胺产生能力的棒状杆菌细菌的特定例子，可以提到下面的菌株。黄短杆菌AJ11573(FERM P-5492，参考日本专利待审公开号56-151495)，黄短杆菌AJ12210(FERM P-8123，参考日本专利待审公开号61-202694)，黄短杆菌AJ12212(FERM P-8123，参考日本专利待审公开号61-202694)，黄短杆菌AJ12418(FERM BP-2205，参考日本专利待审公开号2-186994)，黄短杆菌DH18(FERM P-11116，参考日本专利待审公开号3-232497)，Corynebact erium melassecolaDH344(FERM P-11117，参考日本专利待审公开号3-232497)，谷氨酸棒状杆菌AJ11574(FERM P-5493，参考日本专利待审公开号56-151495)。
术语“修饰以便胞内谷氨酸酰胺合成酶(也称为“GS”)活性可以得到加强”是指每个细胞的GS活性高于非修饰的菌株例如野生型棒状杆菌。例如可以提到其中每个细胞中GS分子的量增加的情况，其中每个GS分子的GS比活性增加等等的情况。此外，作为比较目的使用的野生型棒状杆菌，例如可以提到黄短杆菌ATCC14067，由于加强了胞内GS活性，可以获得培养基中积累的L-谷氨酰胺的量增加的效果，L-谷氨酸副产物降低的效果等等。
通过加强编码GS的基因的表达可以获得棒状杆菌细胞中GS活性加强。通过增加编码GS的基因的拷贝数可以获得基因的表达量增加。例如通过将编码GS的基因片段与在细菌中起作用的载体优选的是多拷贝型载体连接可以制备重组DNA，将其导入到具有L-谷氨酰胺产生能力的宿主转化。或者，将上面提到的重组DNA导入到野生型棒状杆菌以获得转化体，然后给予转化体L-谷氨酰胺产生能力。
对于GS基因，可以使用来源于棒状杆菌的任何基因和来源于其他生物体例如属于埃希氏杆菌属的细菌的任何基因。其中，基于其表达的情况优选的是来源于棒状杆菌的基因。
对于编码棒状杆菌的GS的基因，已经阐明了glnA(FEMS微生物学通信81-88，154，1997)。因此，利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物，例如在序列表中SEQ ID NO：4和5提到的引物，以棒状杆菌的染色体DNA作为模板，通过PCR获得GS基因(聚合酶链反应；参见White，T.J.等人，遗传学趋势，5，185(1989))。以类似的方式可以获得编码其它微生物的GS的基因。
采用Saito和Miura的方法从作为DNA供体的细菌制备染色体DNA(参见H.saito和K.Miura，生物化学和生物物理通讯，72，619(1963)，例如日本生物科学和生物工程协会编辑，第97-98页，Baifukan，1992的生物工程试验的教科书)。
偶然，同工酶经常存在于参与氨基酸生物合成系统的酶。本发明的发明人通过利用与前面提到的glnA基因核苷酸序列同源性成功地分离和克隆了编码棒状杆菌的GS的同工酶的基因。将该基因称作为“glnA2”。得该基因的方法将在下文描述。glnA2和glnA可用于加强棒状杆菌的GS活性。
如果采用PCR方法扩增的GS基因连接到在大肠杆菌和/或棒状杆菌细胞中可自主复制的载体DNA以制备重组DNA，将其导入到大肠杆菌，随后的程序变得容易。在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体的例子包括pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pBR322，pACYC184，pMW219等等。
在棒状杆菌细菌中起作用的载体指例如可以在棒状杆菌细菌中自主复制的质粒。其中的特定的例子包括如下：pAM330(指日本待审专利公开号，NO.58-67699)pHM1519(指日本待审专利公开号，NO.58-77895)
另外，如果将具有使质粒在棒状杆菌中自主复制的能力的DNA片段从这些载体中取出，并插入到前面提到的用于大肠杆菌的载体中，它们可以用作所谓的穿梭载体，可以在大肠杆菌和棒状杆菌中自主复制。
这样的穿梭载体的例子包括下面提到的那些。同时表示出的有含有每个载体的微生物，在国际保藏处其登记号分别表示在圆括号中。
pAJ655大肠杆菌AJ11882(FERMBP-136)
谷氨酸棒状杆菌SR8201(ATCC39135)
pAJ1844大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
谷氨酸棒状杆菌SR8202(ATCC39136)
pAJ611大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148谷氨酸棒状杆菌SR8203(ATCC39137)
pAJ440枯草芽孢杆菌AJ11901(FERMBP-140)
pHC4大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
如下可以从保藏的微生物得到这些载体。即，利用溶菌酶和SDS溶解在指数生长期收集的微生物细胞，并在30000xg离心。在从溶菌物得到的上清液中加入聚乙烯乙二醇，再通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心来分级分离和纯化。
为了通过连接GS基因和可以在棒状杆菌细菌中起作用的载体来制备重组DNA，用对应于含有GS基因的基因的末端的限制酶消化载体。通常，利用连接酶如T4 DNA连接酶进行连接反应。
为了在微生物中导入如上所述制备的重组DNA，迄今已经报道的任何已知转化方法都可以利用。例如，可利用的有用氯化钙处理受体细胞，从而能增强DNA渗透性的方法，这已经在大肠杆菌K-12中有报道(MANDEL，M.和HIGA，A.《分子生物学杂志》，第53卷：第159页(1970))，和从生长期的细胞制备感受态细胞，接着在其中导入DNA的方法，这在枯草芽孢杆菌中有报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A和Young，F.E.，基因，1,153(1977))。另外，同样可利用的是将DNA受体细胞制备成原生质体或原生质球，它们可以容易地吸取重组DNA，接着在细胞中导入重组DNA，该方法已知可用于枯草杆菌，放线菌和酵母(CHANG，S.和CHOEN，S.N.，《分子基因遗传学》，第168卷，第111页(1979年)；BIBB，M.J.，WARD，J.M.和HOPWOOD，O.A，《自然》，第274卷，第398页(1978)；HINNEN，A，HICKS，J.B.和FINK，G.R.，《美国国家科学院院刊》，第75卷，第1929页(1978))。利用电脉冲的方法也可以进行棒状杆菌细菌的转化(SUGIMOTO等人，日本待审专利公开号，2-207791)。
通过在棒状杆菌细菌的染色体DNA中导入多个GS基因的拷贝也可以增加GS基因的拷贝。为了在棒状杆菌细菌的染色体DNA中导入多个GS基因的拷贝数，利用在染色体DNA中存在的多个拷贝作为靶的序列进行同源重组。作为在染色体DNA中以多个拷贝存在的序列，可以利用重复DNA，在转座因子的末端存在的倒转重复。同样，正如日本在审专利公开号2-109985公开的，在转座子中掺入GS基因，并允许它转移和导入到染色体DNA中该多个拷贝的基因是可能的。
除了通过前面提到的基因扩增，用更强的一个取代染色体DNA或质粒上的GS基因的表达控制序列作为启动子也可以增强GS活性。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子等等是已知的强启动子。另外，在GS基因的启动子区中，如国际专利公开号WO00/18935公开的，引入几个核甘酸的核甘酸取代物，使它修饰成更强的一个也是可能的。通过启动子的取代或修饰，GS基因的表达增强了，所以GS活性增强了。这样的表达控制序列的修饰可以和GS基因的拷贝数的增加结合。
例如，以和基因取代相同的方式，利用后面所述的温度敏感质粒可以进行表达控制序列的取代。棒状杆菌的温度敏感质粒的例子包括p48K，pSFKT2(两者参考日本在审专利公开号2000-262288)，pHSC4(参考法国在审专利公开号2667875，1992年和日本在审公开号5-7491)等等。这些质粒在棒状杆菌中，至少可以在25℃的温度下自我复制，并且在37℃的温度下不能自我复制。虽然在后面的实施例中pSFKT2用于取代GDH基因的启动子序列，以相似的方法，利用pHSC4取代pSFKT2可以进行基因取代。将含有pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(当前的，国际专利有机体保藏处，国家现代工业科学和技术研究院，独立管理公司(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-8566))，收到的登记号为FERM P-11763。然后，根据布达佩撕条约，在1991年8月26日转移成国际保藏，收到的登记号是FERM BP-3524。
除了基于如上所述增加GS基因的表达量，通过细胞内的GS腺苷酸化缺失其调节也可以增强GS活性。通过腺苷酸化氨基酸序列中的酪氨酸残基，GS变化成失活形式(美国国家科学院院刊，642-649，(58)，1967；生物化学杂志，3769-3771，(243)1968)。所以，通过缺失GS的腺苷酸化，可以增强细胞内的GS活性。本文所用的腺苷酸化的缺失不仅指基本上完全缺失腺苷酸化，而且指减少这样的腺苷酸化，从而使细胞内GS的活性增强。
通常利用腺苷酰转移酶进行GS的腺苷酰化(美国国家科学院院刊，第1703-1710页，(58卷)，1967)。有人建议，在棒状杆菌细菌中，基因库登记号Y13221的序列表示的glnA基因产物的405位酪氨酸残基腺苷酸化(FEMS微生物学通讯，303-310，1999(173))。在glnA基因中，导入突变可以缺失腺苷酸化GS引起的失活，所以应该用另一个氨基酸残基替代酪氨酸残基。
另外，通过降低细胞内谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶(ATase)的活性也可以删除腺苷酸化对GS的失活。虽然棒状杆菌细菌的腺苷酰转移酶还是未知的，但本发明人成功地分离了一个编码棒状杆菌细菌的腺苷酰转移酶的基因，glnE。其方法将在下面叙述。
为了降低棒状杆菌细菌中细胞内的ATase活性，可以利用例如紫外辐射或利用通常进行诱变处理的诱变试剂如N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌细菌，并且选择ATase活性降低的突变菌株的方法。除了通过诱变处理，通过基因裂解也可以获得Atase活性降低的棒状杆菌细菌。即，用含有缺失编码ATase的基因的部分序列修饰的glnE的基因的DNA转化棒状杆菌细菌，以致不能产生正常发挥功能的ATase(缺失类型的glnE基因)，所以在染色体上发生缺失类型的glnE基因和glnE基因的重组来裂解染色体上的glnE基因。通过同源重组进行基因取代的基因破坏已经确定，其中存在利用线性DNA，含有温度敏感的复制起点的质粒等等的方法。
例如用如下方法，用缺失类型的glnE基因替代宿主染色体上的glnE基因。即，通过插入温度敏感复制原点，突变的glnE基因和对药物如氯霉素有抗性的标记基因制备重组DNA，然后用重组DNA转化棒状杆菌细菌。另外，在温度敏感复制原点不发挥功能的温度下培养转化体，然后在含有药物的培养基中培养转化体菌株，得到染色体DNA中掺入了重组DNA的转化体菌株。
将重组DNA如上所述掺入染色体DNA的菌株中，突变的glnE基因与原初存在于染色体上的glnE基因再结合，并且将染色体glnE基因和缺失类型的glnE基因的两个融合基因插入染色体中，从而重组DNA的其它部分(载体部分，温度敏感复制原点和药物抗性标记)应该存在于两个融合基因之间。因为正常glnE基因在这种情况下是占优势的，所以，转化体菌株表达正常的ATase。
然后，为了在染色体DNA上只留下缺失类型的glnE基因，通过两个glnE基因的重组，从染色体DNA将一个拷贝的glnE基因与载体部分(包括温度敏感复制原点和药物抗性标记)一起删除。在这种情况下，将正常的glnE基因留在染色体DNA上，从染色体DNA中切出缺失类型的glnE基因，或相反，将缺失类型的glnE基因留在染色体DNA上，将正常的glnE基因从染色体DNA中切出。在这两种情况中，当细胞在温度敏感复制原点可以发挥功能的温度下培养的时候，切出的DNA可以作为质粒保留在细胞中。随后，如果细胞在温度敏感复制原点不能发挥功能的温度下培养时，可以将质粒上的glnE基因与质粒一起从细胞中删除。然后，利用PCR，Southern杂交等等选择缺失类型glnE基因留在染色体上的菌株可以得到glnE破坏的菌株。
另外，通过降低细胞内PH蛋白质的活性也可以缺失腺苷酸化对GS的失活。已知PII蛋白质也参与了ATase对GS的腺苷酸化。PII蛋白质是控制GS活性的信号转移蛋白质，已知它是通过尿苷酰转移酶(UTase)被尿苷酸化的。尿苷酸化的PII蛋白质促进ATase对GS的脱腺苷酸化，并且，脱尿苷酸化的PII蛋白质促进ATase对GS的腺苷酸化。
据报道，在UTase缺陷型菌株中，GS是高度腺苷酸化的(细菌学杂志，第569-577页，(134卷)1978)。PII蛋白质的突变抑制过度腺苷酸化的表现型(《细菌学杂志》，第816-822页，(164卷)，1985)。即，降低PII蛋白质的活性也可以缺失腺苷酸化对GS的失活。PII蛋白质活性的降低指减弱促进ATase的腺苷酸化的功能。编码棒状杆菌细菌的PII蛋白质的glnB基因也已经分离，有人建议，通过缺失GS基因缺失GS的腺苷酸化对GS的抑制(《FEMS微生物学通讯》，第303-310页，(173卷)1999)。
为了降低棒状杆菌细菌的PH蛋白质的活性，可以利用例如，通过紫外辐射或利用通常用于诱变处理的诱变试剂如N-甲基-N’-硝基N-亚硝基胍或硝酸来处理棒状杆菌细菌，并且选择PII蛋白质活性降低的突变菌株的方法。除了诱变处理，也可以通过基因破坏获得PII蛋白质活性降低的棒状杆菌细菌。即，用含有删除编码pII蛋白质的基因的部分序列修饰的glnB的基因的DNA转化棒状杆菌细菌，以致不能产生正常发挥功能的pII蛋白质(缺失类型的glnB基因)，所以应该在染色体上进行缺失类型的glnB基因和glnB基因的重组来破坏染色体上的glnB基因。通过同源重组进行基因取代的基因破坏已经确定，其中存在利用线性DNA，含有温度敏感的复制起点的质粒等等的方法。
例如用如下方法，用缺失类型的glnB基因替代宿主染色体上的glnB基因。即，通过插入温度敏感复制原点，突变的glnB基因和对药物如氯霉素有抗性的标记基因制备重组DNA，然后用重组DNA转化棒状杆菌细菌。另外，在温度敏感复制原点不发挥功能的温度下培养得到的转化体菌株，然后在含有药物的培养基中培养转化体菌株，得到染色体DNA中掺入了重组DNA的转化体菌株。
在重组DNA如上所述掺入染色体DNA的菌株中，突变的glnB基因与原初存在于染色体上的glnB基因再结合，并且将染色体glnB基因和缺失类型的glnB基因的两个融合基因插入染色体中，从而重组DNA的其它部分(载体区段，温度敏感复制原点和药物抗性标记)应该存在于两个融合基因之间。因为正常glnB基因在这种情况下是占优势的，所以，转化体菌株表达正常的pII蛋白质。
然后，为了在染色体DNA上只留下缺失类型的glnB基因，通过两个glnB基因的重组，从染色体DNA将一个拷贝的glnB基因与载体区段(包括温度敏感复制原点和药物抗性标记)一起删除。在这种情况下，将正常的glnE基因留在染色体DNA上，从染色体DNA中切出缺失类型的glnB基因，或相反，将缺失类型的glnB基因留在染色体DNA上，将正常的glnB基因从染色体DNA中切出。在这两种情况中，当细胞在温度敏感复制原点可以发挥功能的温度下培养的时候，切出的DNA可以作为质粒保留在细胞中。随后，如果细胞在温度敏感复制原点不能发挥功能的温度下培养时，可以将质粒上的glnB基因与质粒一起从细胞中去除。然后，利用PCR，Southern杂交等等选择缺失类型glnB基因留在染色体上的菌株可以得到glnB破坏的菌株。
通过将两种或三种这样的GS突变的结合也可以将GS腺苷酸化去除，所述的突变去除了上面提到的腺苷酸化，降低了ATase活性和降低PII蛋白质的活性。
虽然通过用ATase将GS腺苷酸化去除也可以加强GS活性，但是也可以通过将它与前面提到的用于加强GS基因的拷贝数的手段或修饰表达控制序列的手段结合获得。
为了通过利用本发明的棒状杆菌高效地生产L-谷氨酰胺，使用加强了谷氨酸盐脱氢酶(也称作为“GDH”)活性，同时加强了GS活性的菌株是优选的。
术语“修饰以便应该加强胞内GDH活性”是指每个细胞的GDH活性变得高于非修饰的菌株例如野生型棒状杆菌。例如，可以提到的情况有每个细胞中GDH分子的数目增加，每个GDH分子的GDH比活性增强等等。此外，作为可比较的目的物的野生型的棒状杆菌细菌，例如可以提到黄短杆菌ATCC14067。由于胞内GDH活性加强，结果使得具有产生L-谷氨酰胺能力的棒状杆菌的培养时间缩短。
通过加强编码GDH的基因的表达可以获得棒状杆菌细胞中GDH活性的加强。通过增加编码GDH的基因的拷贝数可以获得基因的表达量增加。例如，通过将编码GDH的基因片段与在细菌中起作用的载体优选的是多拷贝型载体连接，并且导入到具有产生L-谷氨酰胺的能力的宿主使之转化可以制备重组DNA。或者，将上面提到的重组DNA导入到野生型棒状杆菌以获得转化菌株，然后赋予获得的转化菌株具有产生L-谷氨酰胺的能力。
作为编码GDH的基因，可以利用起源于棒状杆菌细菌的任何基因和起源于其它生物体如属于埃希氏杆菌属的细菌的基因。在这些中间，从容易表达的观点来看，起源于棒状杆菌的细菌的基因是优选的。
编码棒状杆菌细菌的GDH的基因(gdh基因)的核苷酸序列已经得到过阐述(分子微生物学，6(3)，317-326(1992))。所以，通过利用根据核苷酸序列制备的引物，例如序列表中SEQ ID NO：12和13中提到的引物，和将棒状杆菌的染色体DNA作为模板的PCR可以得到GDH基因。用同样的方法也可以得到编码除了棒状杆菌细菌以外的微生物的GDH的基因。
用和用于前面提到的GS基因相似的方法可以在棒状杆菌细菌中导入gdh基因。
在本发明的棒状杆菌细菌中，GS和GDH以外的酶催化L-谷氨酰胺生物合成的活性是可以增强的。催化L-谷氨酰胺生物合成反应的酶的例子包括异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，柠檬酸合成酶，丙酮酸脱氢酶，烯醇丙酮酸羧化酶，丙酮酸羧化酶，丙酮酸激酶，果糖磷酸激酶等等。
另外，催化从L-谷氨酰胺生物合成途径分支并产生L-谷氨酰胺以外的化合物的反应的酶的活性可能降低或消失。催化这样的反应的酶的例子包括异柠檬酸裂合酶，α-酮戊二酸脱氢酶，谷氨酸合成酶。
(2)利用本发明的微生物生产L-谷氨酰胺
通过在培养基中培养如上所述获得的棒状杆菌细菌生产和在培养基中积累L-谷氨酰胺，并且从培养基收集L-谷氨酰胺，可以有效地生产L-谷氨酰胺，并且可以抑制L-谷氨酸的副产物生产。
为了利用本发明的棒状杆菌生产L-谷氨酰胺，可以利用含有碳源，氮源和矿质盐以及有机痕量营养如氨基酸和维生素的基础培养基进行培养。可以利用合成培养基或天然培养基。只要可以被培养的菌株利用，可以利用任何种类的碳源和氮源。
作为碳源，可以利用糖如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物和糖浆，也可以单独或结合其它碳源利用有机酸如乙酸和柠檬酸和醇如乙醇。
作为氮源，利用了氨，铵盐，如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵和乙酸铵，硝酸盐等等。
作为有机痕量营养，利用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有这些物质的如蛋白胨，酪氨酸，酵母提取物和大豆蛋白质分解产物。当利用其生长需要氨基酸等等的营养缺陷型突变株时，补充需要的营养是优选的。
作为矿质盐，利用了磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐等等。
当发酵温度控制在20-45度，pH为5-9时，以通气培养方式进行培养。当在培养过程中pH下降时，加入碳酸钙或用碱如氨气中和培养基。在10小时到120小时的培养中，以如上所述的方式有相当量的L-谷氨酰胺在培养肉汤中积累。
可以用常规方法从培养后的培养肉汤中收集L-谷氨酰胺。例如，在培养肉汤中除去细胞后，通过浓缩肉汤结晶L-谷氨酰胺可以回收L-谷氨酰胺。
(3)本发明的编码具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质的DNA(glnA2基因)和编码具有谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性的蛋白质的DNA(glnE基因)
本发明的第一个DNA是编码GS的基因。本发明的第二个DNA是编码ATase的基因。利用已知的glnA基因的部分片段作为探针，可以通过杂交，从乳发酵短杆菌的染色体DNA文库获取这些基因。利用乳发酵短杆菌例如，乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，和SEQ ID NOS：18和19所示的引物进行的PCR可以获得已知的glnA基因的部分片段。
生产基因组DNA文库，杂交，PCR，制备质粒，消化和连接DNA，转化等等用于获取本发明的DNA和增强GS活性和GDH活性的方法在Sambrook，J.，Fritsh，E.F和Maniatis，T，“分子克隆”，冷泉港实验室出版，1.21，1989年中有叙述。
根据谷氨酸棒状杆菌的glnA基因的核苷酸序列(基因库登记号，Y13221)设计前面提到的引物的核苷酸序列。利用这些引物，可以获取还有对应于glnA基因的核苷酸编号1921-2282(基因库登记号Y13221)的区域的DNA片段。
如上所述获取的含有本发明的glnA2的DNA片段的核苷酸序列和可以为该序列编码的氨基酸序列的例子如SEQ ID NO：1所示。另外，只具有glnA2编码的谷氨酰胺酸合成酶活性的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
另外，在前面提到的DNA片段中，在紧接gln A2基因的ORF的下游发现了另一个ORF。根据已知序列的同源性比较，预测ORF是编码具有谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性(ATase)的蛋白质的基因。只有具有ATase活性的蛋白质的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：3。
通过本发明鉴定了含有本发明的glnA2或glnE的DNA片段的核苷酸序列。所以，利用根据核苷酸序列生产的引物，通过PCR方法从乳发酵短杆菌的染色体DNA可以分离他们。
本发明的第一个DNA可以是编码在一个或多个位点含有替代，缺失，插入，叠加或颠换的谷氨酰胺合成酶的一个DNA，只要编码蛋白质的谷氨酰胺合成酶的活性没有缺失。虽然根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或类型，本文指的“几个”氨基酸的数目不同，但它特定地可能是2到90，优先地是2到50，更优先地是2到20。
本发明的第二个DNA可以是编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的，在一个或多个位点含有一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或颠换的一个DNA，只要编码蛋白质的谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性不缺失。虽然根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或类型，本文所指的“几个”氨基酸的数目不同，它特定地可以是2到350，优选地可以是2到50，更优选地是2到20。甚至在谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性损伤的情况下，这样的DNA也在本发明的范围中，只要它引起同源重组。
通过例如，位点特异的诱变的方法修饰glnA2或glnE的核苷酸序列使在特定位点的一个或多个氨基酸残基含有取代，缺失，插入，叠加或颠换可以获得编码与前面提到的GS或Atase实质上相同的蛋白质的DNA。通过常规的已知诱变处理也可以获得如上所述修饰的DNA。诱变处理包括用羟胺等等在体外诱变处理之前处理DNA的方法，和在用紫外辐射或用于常见诱变处理的诱变试剂如N-甲基-N‘-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和硝酸诱变处理之前处理微生物如含有DNA的埃希氏属细菌的方法。
通过在适当的细胞中表达具有如上所述的突变的DNA，研究表达的产物的活性可以获取编码和谷氨酰胺合成酶或谷氨酰胺和腺苷酰转移酶基本相同的蛋白质的DNA。从编码谷氨酰胺合成酶或谷氨酰胺合成酶和具有突变的腺苷酰转移酶的DNA或从具有该DNA的细胞，通过分离与具有含有例如对应于序列表的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核苷酸659到1996或2066到5200的核苷酸序列的探针在严格条件下杂交的DNA也可以获取编码与GS或ATase基本相似的蛋白质的DNA，并且该DNA编码具有谷氨酰胺合成酶的蛋白质，或具有谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性的蛋白质。本文指的“严格条件”是所谓的特异杂合体形成，而非特异杂合体不形成的条件。通过任何数值形式清楚地表达这一条件是困难的。但是，例如，严格条件的例证可以是这样的条件：在该条件下，具有高同源性例如具有不少于50％的同源性的DNA相互杂交，但同源性低于上面的DNA相互不杂交。或者，严格条件的例子可以是这样的条件，在该条件下，DNA在对应于Southern杂交的普通条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选地0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度下相互杂交。
作为探针，也可以利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列。利用SEQID NO：1的核苷酸序列生产的寡聚核苷酸作为引物，含有SFQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR可以制备这样的探针。当将长度约为300bp的DNA片段用作探针，杂交的洗涤条件包括例如50℃，2×SSC和0.1％SDS。
在如上所述的这样的条件下可杂交的基因包括在基因中具有终止密码子的那些，和由于活性中心的突变而不具有活性的那些。但是，通过将各个基因与可商业获得的活性表达载体连接，并且测量谷氨酰胺合成酶或谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性可以容易地除去这样的突变。通过例如酶学方法，XVIIA卷，910-915页，学术出版社(1970)可以测量谷氨酰胺合成酶的活性，通过例如酶学方法，XVIIA，922-923页，学术出版社(1970)所述的方法可以测量谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性。甚至编码活性降低或去除的谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的DNA也可以用于本发明。
编码与GS基本相同的DNA的特定例子包括编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列优选地具有80％或更多的，更优选地具有85％或更多的，更优选地具有90％或更多的同源性和具有GS活性的蛋白质的DNA。编码与ATase基本相同的蛋白质的DNA的特定的例子包括编码与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列优选地具有65％或更多的，更优选地具有80％或更多，更优选地具有90％或更多的同源性，并且具有ATase活性的蛋白质的DNA。
                       实施本发明的最佳方式
在下文中，参考下面的实施例，本发明将更详细地被说明。
                实施例1：评估GS基因扩增的菌株(1)克隆棒状杆菌细菌的glnA基因谷氨酸棒状杆菌的glnA序列已经得到阐述(FEMS微生物学通讯，81-88页，(154卷)1997年)。根据报道的核苷酸序列，合成了序列表中的SEQ ID NO：4和5所示的引物，利用黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体作为模板的PCR方法扩增glnA片段。
利用细菌基因组DNA纯化试剂盒(现代遗传技术公司)制备黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体DNA。进行PCR30个循环，每个循环包括利用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)在94℃变性30秒，在55度退火15秒，和在72度延伸2分钟的反应。
以常规方法纯化产生的PCR产物，并用限制酶SalI消化，用连接试剂盒(Takara Shuzo)连接SalI消化的pMW219(Nippon Gene)，并用于转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞。在含有10微克/毫升的IPTG，40微克/毫升的X-Gal和25微克/毫升的卡那霉素的L培养基上平铺细胞，并且培养过夜。然后，挑选出现的白色菌落，并分离成单个菌落获得转化体。
通过碱方法从转化体制备质粒，将载体中插入glnA基因的质粒命名为pMW219GS。(2)构建具有glnA和棒状杆菌复制原点的质粒另外，为了构建具有glnA基因和棒状杆菌细菌的复制原点的质粒，用限制酶BamHI和KpnI消化已经得到并且在棒状杆菌细菌中自我复制的含有质粒pHM1519的复制原点(农业生物化学，48卷，2901-2903(1984))的质粒pHK4(参考日本在审专利公开号，5-7491)得到含有复制原点的基因片段。利用DNA钝化末端的试剂盒(Takara Shuzo)将得到的片段的末端钝化，并且利用KpnI接头(Takara Shuzo)插入PMW219GS的KprI位点。将这一质粒命名为pGS。
(3)在棒状杆菌细菌中导入pGS，并且评估培养物
用电脉冲的方法(参考日本在审专利公开号2-207791)，用质粒pGS转化L-谷氨酰胺生产细菌，黄色短杆菌AJ12418(FERM BP-2205：参考日本在审专利公开号，2-186994)得到转化体。利用得到的质粒AJ12418/pGS，如下进行L-谷氨酰胺生产的培养。
在1升纯净水中含有100克葡萄糖，60克(NH4)2SO4，2.5克KH2PO4，0.4克MgSO4.7H2O，0.01克FeSO4.7H2O，350微克VB1-HCL，4微克生物素，200毫克大豆水解物和50克CaCO3的培养基(用NaOH调节到pH6.8)上接种在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基上培养得到的AJ12418/pGS菌株的细胞，在31.5度，振摇培养直到培养基中的糖消耗完。
在完成培养后，通过液体层析经适当稀释的培养肉汤，分析培养肉汤中积累的L谷氨酰胺的量。将CAPCELL PAK C18(Shiseido)用作柱，用1升蒸馏水中含有0.095％的磷酸，3.3毫摩尔/毫升的庚烷磺酸和5％的乙腈的洗脱液洗脱样品。根据210纳米处的吸光度变化分析积累的L-谷氨酰胺的量。将这一分析结果表示在表1。表1
菌株        L-Gln(克/升) L-Glu(克/升) 培养时间(hr)
AJ12418        38.4         0.7           70AJ12418/pGS    45.1         0.02          82
在导入pGS的菌株中，明显地提高了L-谷氨酰胺(L-Gln)的积累，并且L-谷氨酸(L-Glu)的副产物大大地受到抑制。从这些结果可见，GS的加强对于L-谷氨酰胺的生产中产量的提高是有效的。GS酶活性的数据表示在实施例2的表2中。
实施例2：评估GS腺苷酰位点已修饰的菌株
(1)构建腺苷酰位点已修饰的质粒棒状杆菌细菌的glnA基因产物的腺苷酰位点已经阐明(FEMS微生物学通讯，303-310，(173)1999年)。所以，通过用腺苷腺苷酰位点已修饰的glnA基因取代染色体的glnA基因可以获得腺苷酰位点已修饰的菌株。特定的过程叙述如下。
首先，利用黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体DNA作为模板和序列表中如SEQ ID NOS：6和7所示的合成DNA作为引物进行PCR得到glnA基因的N末端侧的扩增产物。另外，为了获得glnA基因C末端侧的扩增产物，利用黄色短杆菌ATCC14067菌株作为模板，序列表中如SEQ ID NOS：8和9所示的合成DNA作为引物进行PCR。因为在序列表中如SEQ ID NOS：7和8所示的序列中导入了错配，在每个扩增产物的末端导入了突变。然后，为了获得导入突变的glnA基因片段，利用前面提到的以等摩尔量混合的glnA的N-和C-末端侧的基因产物作为模板和序列表中如SEQ ID NOS：10和11所示的合成DNA作为引物进行PCR，获得在腺苷酸位点导入突变的glnA基因扩增产物。以常规的方法纯化产生的PCR产物，用HincII消化，并插入pHSG299(TakaraShuzo)的HincII位点中。这一质粒命名为pGSA。(2)构建腺苷酰位点已修饰的菌株和评估培养物因为上面的pGSA不含有能够使它在棒状杆菌细菌的细胞中自我复制的区域，当用这一质粒转化棒状杆菌细菌时，虽然存在的频率极低，但获得了通过同源重组在染色体中掺入质粒的转化体形式的菌株。
通过电脉方法，以高浓度用质粒pGSA转化L-谷氨酰胺生产细菌，黄色短杆菌AJ12418(参考日本在审专利公开号，2-207791)，利用卡那霉素抗性作为标记获得转化体。然后，再培养这些转化体，获得变成卡那霉素敏感的菌株。另外，确定卡那霉素敏感菌株的glnA基因的序列，将用起源于pGSA的glnA的那个区域替代序列中的腺苷酸位点的菌株命名为QA-1。用AJ12418，AJ12418/pGS和QA-1菌株，以和实施例1，(3)所述相同的方法进行L-谷氨酰胺生产的培养。结果表示在表2。表2
菌株      L-Gln(g/L) GS活性(U/mg) 培养时间(小时)
AJ12418     39.0       0.030         70AJ12418/pGS 46.1       0.067         81QA-1        44.3       0.040         72
对于QA-1菌株，比较AJ12418观察到了L-谷氨酰胺的积累增加。
表2中也显示了测量这些菌株的GS活性的结果。在含有100毫摩尔/升咪唑-盐酸(pH7.0)，0.1毫摩尔/升的NH4HCl，1毫摩尔/升的MnCl2，1毫摩尔/升的磷酸烯醇丙酮酸，0.3毫摩尔/升的NADH，10U的乳酸脱氢酶，25U的丙酮酸激酶，1mMATP和10mM MSG的溶液中加入粗酶溶液，参考发酵和生物工程杂志，70卷，第3期，182-184页，1990年中所述的方法，在30度340纳米处测量吸光度的变化而测量GS活性。对于空白的测量，利用了前面提到的不含MSG的反应溶液。通过离心从前面提到的培养肉汤中分离细胞，用100毫摩尔/升的咪唑-盐酸(PH7.0)洗涤细胞，将细胞超声波破碎，通过离心除去未裂解的细胞和不溶性蛋白质制备粗酶溶液。利用小牛血清白蛋白作为标准样品，用Protein Assay(BioRad)定量粗酶溶液的蛋白质浓度。
        实施例3：GDH基因已扩增的菌株的评估(1)构建gdh已扩增的菌株和评估培养物如下构建克隆了棒状杆菌细菌的gdh基因的质粒pGDH。首先提取了黄色短杆菌ATCC13869菌株的染色体，利用染色体DNA作为模板，序列表中如SEQ IDNOS：12和13的合成DNA作为引物进行PCR。将得到的DNA片段的末端钝化，插入到pHSG399(Takara Shuzo)的SmaI位点。将这一质粒命名为pHSG399GDH。
然后，将起源于能够在棒状杆菌细菌中自我复制的质粒pHM1519(农业生物化学，48，2901-2903(1984年))的复制原点导入到pHSG399GDH的SalI位点。特定地，用限制酶BamHI和KpnI消化前面提到的pHK4，获得含有复制原点的基因片段，将得到的片段末端钝化，用SalI接头(Takara Shuzo)插入pHSG399GDH的SalI位点。将这一质粒命名为pGDH。
用pGDH转化L-谷氨酰胺生产细菌，黄色短杆菌AJ12418菌株，得到转化体。利用得到的转化体AJ12418/pGDH，通过实施例1所述的方法进行生产L-谷氨酰胺的培养。表3中表示结果。在GDH增强的菌株中，L-谷氨酰胺的产量下降，L-谷氨酸的副产物增加，但是培养时间大大缩短了。表3
菌株   L-Gln(g/L) L-Glu(g/L)培养时间(小时)
AJ12418      38.8       0.7         70AJ12418/pGDH 29.5      12.0         55
          实施例4：构建和评估GS和GDH同时增强的菌株(1)构建gdh启动子已修饰的质粒提取黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体DNA，利用染色体DNA作为模板和将序列表中SEQ ID NOS：14和15所示的合成DNA作为引物进行PCR。用限制酶StuI和PvuII消化得到的DNA片段，插入pHSG399的SmaI位点。用限制酶SacI消化这一质粒，得到含有gdh启动子和gdh基因的部分片段的DNA片段，将它插入pKF19k(Takara Shuzo)的SacI位点。将这一质粒命名为pKF19GDH。
利用Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo)，在启动子区域导入突变。利用pKF19GDH作模板，Mutan-Super Express Km附带的选择引物和如序列表中SEQID NO：16或17所示的5‘末端磷酸化的合成DNA作为诱变引物进行LA-PCR。通过乙醇沉淀纯化反应产物，用该产物转化大肠杆菌MV1184(Takara Shuzo)的感受态细胞得到转化体。
从转化体提取质粒，确定gdh启动子区域的序列。在这些中间，将具有表4所示的序列的那些命名为pKF19GDH1和pKF19GDH4。与具有野生型的启动子的gdh相比，通过用pKF19GDH1的序列替代gdh启动子序列可以将GDH活性提高3倍，或者，通过用pKF19GDH4类型的序列替代gdh启动子序列可以提高5倍(参考国际专利公开号WO00/18935)。
用限制酶SacI消化这些质粒，得到含有gdh启动子和gdh基因的部分片段的DNA片段，将它插入pSFKT2的SacI位点(参考日本在审专利公开号2000-262288)。分别将这些质粒命名为pSFKTGDH1和pSFKTGDH4。PSFKT2是起源于黄色短杆菌ATCC13869菌株的质粒pAM330的衍生物，它是在棒状杆菌中的自我复制已经变成温度敏感的质粒。表4
  质粒                    gdh启动子序列
pKF19GDH  TGGTCAtatctgtgcgacgctgcCATAAT(SEQ ID NO：20)pKF19GDH1 TGGTCAtatctgtgcgacgctgcTATAAT(SEQ ID NO：21)pKF19GDH4 TTGCCAtatctgtgcgacgctgcTATAAT(SEQ ID NO：22)
(2)在染色体中导入gdh启动子突变如下，在染色体上的gdh启动子序列中导入突变。首先，用电脉冲方法，用质粒pSFKTGDH1或pSFKTGDH4转化QA-1菌株，分别得到转化体。转化后，在25℃培养转化体。然后，在34℃培养这些转化体，选择在34℃显示卡那霉素抗性的菌株。由于前面提到的质粒不能在34℃自我复制，所以只有通过同源重组在染色体中掺入这些质粒的菌株显示卡那霉素抗性。另外，在缺乏卡那霉素时培养染色体中掺入这些质粒的菌株，选择变成卡那霉素敏感的菌株。将在染色体上的gdh启动子区域中导入和pSFKTGDH1或pSFKTGDH4相同的突变的菌株分别命名为QB-1和QB-4。(3)构建gdh基因已扩增的菌株和测量GDH活性用实施例3，(2)所述的质粒pGDH转化的L-谷氨酰胺生产细菌，黄色短杆菌QA-1菌株，得到转化体。利用得到的转化体QA-1/pGDH，用实施例1所述的方法进行生产L-谷氨酸的培养。在含有100毫摩尔/升的TRIS-盐酸(PH7.5)，20毫摩尔/升的NH4Cl，10毫摩尔/升的α-酮戊二酸和0.25毫摩尔/升的NADPH的溶液中加入粗酶溶液，并且测量340纳米处的吸光度的变化测量GDH活性，参考分子微生物学，317-326(6)1992年。通过离心从前面提到的培养肉汤分离细胞，用100毫摩尔/毫升TRIS盐酸(PH7.5)洗涤细胞，超声波破碎细胞，离心除去未裂解的细胞，制备粗酶溶液。用小牛血清白蛋白作为标准样品，用Protein Assay(Bio-Rad)定量粗酶溶液的蛋白质浓度。结果表示在表5。
至于L-谷氨酰胺的产量，GDH启动子已修饰的菌株，QB-1和QB-4显示有高产量。另外，QA-1/pGDH菌株也显示了比用AJ12418菌株得到的更高的产量。QA-1/pGDH菌株的培养时间最短。在QB-1和QB-4菌株中L-谷氨酰胺的副产物大大增加。从这些结果中可以证明，同时增强GS和GDH对于提高L-谷氨酰胺的产量和缩短培养时间是有效的。表5
菌株   L-Gln    L-Glu    培养时间     GDH活性(g/L)    (g/L)      (hr)       (U/mg)
AJ12418QA-1/PGDHQB-1QB-4   40.5      0.8        68          1.647.9      1.0        60          15.250.5      0.1        65          4.150.0      0.3        65          9.6
实施例5：编码GS的同工酶的基因的分离在报道获得谷氨酸棒状杆菌的glnA的论文中(FEMS微生物学通讯，154(1997年)81-88页)，叙述了ΔglnA破坏的菌株变成显示谷氨酰胺营养缺陷，并且失去GS活性，也有报道数据显示了Southern影印的结果，表明了存在同工酶。另外，日本科学协会(Gakkai Shuppan中心)出版的“氨基酸发酵”第232-235页叙述了存在两种谷氨酸棒状杆菌的GS。所以，可以尝试获得编码第二个GS同工酶的基因。(1)制备探针
通过菌落杂交得到编码GS同工酶(glnA2)的基因。首先，利用序列表中SEQID NOS：18和19所示的引物和乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR得到glnA基因的部分片段。利用DIG-High Prime DNA标记&检测起始试剂盒I(Boehringer Mannheim)标记这一DNA片段，并且用作探针。(2)菌落杂交
提取乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，用限制酶Sau3AI部分消化，将得到的DNA片段插入pHSG299的载体的BamHI位点，并用于转化大肠杆菌JM109菌株。将得到的转化体转移到Hybond-N+(Amersham PharmaciaBiotech)，变性，中和，然后用实施例5，(1)中通过DIG-High Prime DNA标记&检测起始试剂盒I制备的探针杂交。这时，识别强烈杂交的转化体和弱杂交的转化体。从这些转化体制备质粒DNA，确定插入片段的核苷酸序列。结果是，可能得到含有与棒状杆菌细菌的已知的谷氨酰胺合成酶具有高同源性的基因的克隆。序列表中如SEQ ID NO：1表示了后一个插入片段的总的核苷酸序列。
推测了开放读码框架，从核苷酸序列推测的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNOS：2和3所示。将这些氨基酸序列的每一个与已知序列比较同源性。利用的数据库是Genbank。结果表明，两个开放读码框架编码的氨基酸序列是棒状杆菌细菌的新蛋白质。
利用Genetyx-Mac计算机程序(东京软件开发公司)分析核苷酸序列和氨基酸序列。根据Lipman和Pearson的方法(科学，227，1435-1441页，1985年)进行同源性的分析。
如序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列显示与已经报道的谷氨酸棒状杆菌的GS(FEMS微生物学通讯，81-88，(154卷)，1997年)，结核分支杆菌的GS(基因库登记号Z70692)和天蓝色链霉菌的GS(基因库AL136500)分别具有34.6％，65.6％和60％的同源性(表6)，并且发现它是棒状杆菌细菌的同工酶。
另一方面，如序列表中SEQ ID NO：3所示的序列显示与已经报道的鸟结核分支杆菌的ATase(基因库登记号Z70692)和天蓝色链霉菌的ATase(基因库登记号Y17736)分别具有51.9％和33.4％的同源性(表7)，并且发现它是棒状杆菌细菌的ATase。所以，发现在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的开放读码框架是glnA2，编码SFQ IDNO：3所示的氨基酸序列的开放读码框架是glnE。表6
菌株             基因名称  氨基酸数目  同源性
乳发酵短杆菌     glnA2       446A.A.    -谷氨酸棒状杆菌   glhA        478A.A.    34.6％鸟结核分支杆菌   glnA2       446A.A.    65.6％天蓝色链霉菌     glnA        453A.A.    60.0％
表7
菌株          基因名称  氨基酸数目  同源性
乳发酵短杆菌    glnE    1045A.A.     -鸟结核分支杆菌  glnE    994A.A.      51.9％天蓝色链霉菌    glnA    784A.A.      33.4％
         实施例6：利用ATase缺陷菌株生产L-谷氨酰胺
由于在前面的实施例5中已经阐明了编码ATase的基因glnE，glnE缺陷菌株可以从L-谷氨酰胺生产细菌AJ12418构建。特定的过程表示如下。
首先，利用黄色短杆菌ATCC 14067菌株的染色体作为模板和SEQ IDNOS：23和24的合成DNA作为引物进行PCR得到glnE基因的部分片段，以常规的方法纯化产生的PCR产物，然后将末端钝化并插入pHSG299(TakaraShuzo)的HincII位点。将这一质粒命名为pGLNE。然后，为了删除这一质粒中的glnE基因的部分区域，用HincII消化pGLNE并自我连接，将得到的质粒命名为pΔGLNE。这一质粒含有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第2341位到第4650位个核苷酸，但质粒中已经删除了从第3343位HincII识别位点到第3659位HincII识别位点的约300bp。
因为上面的pΔGLNE不含有能使它在棒状杆菌细菌的细胞中自我复制的区域，当棒状杆菌细菌用这一质粒转化时，虽然存在的频度非常低，但可以作为转化体生产通过同源重组在染色体中掺入质粒的菌株。
通过电脉冲的方法用高浓度的质粒pΔGLNE转化L-谷氨酰胺生产细菌，黄色短杆菌AJ12418，利用卡那霉素抗性作为标记得到转化体。然后，再培养这些转化体，得到变成卡那霉素敏感的菌株。另外，提取得到的卡那霉素敏感菌株的染色体DNA，并且利用各个染色体DNA作为模板，序列表中如SEQ IDNOS：23和24所示的合成DNA作为引物进行PCR，得到glnE基因的部分片段。当用HincII消化时，其PCR产物不提供约300bp的片段的菌株已确定是glnE破裂的菌株。将这一菌株命名为QA-T。用和实施例1，(3)所述相同的方法，利用AJ12418和QA-T菌株进行生产L-谷氨酰胺的培养。结果表示在表8。
QA-T菌株与AJ12418菌株比较，L-谷氨酰胺的积累提高。表8中也表示了测量这些菌株的GS活性的结果。证明，比较AJ12418菌株而言，QA-T菌株中GS活性提高了。表8
菌株        L-Gln(g/L)  GS活性(U/毫克)  培养时间(小时)
AJ12418     39.0        0.03              70QA-T        45.1        0.05              75
(序列表的解释)SEQ ID NO：1：glnA2和glnE核苷酸序列SEQ ID NO：2：glnA2氨基酸序列SEQ ID NO：3：glnE氨基酸序列SEQ ID NO：4：用于glnA扩增的引物NSEQ ID NO：5：用于glnA扩增的引物CSEQ ID NO：6：glnA的第一个PCR引物NNSEQ ID NO：7：glnA的第一个PCR引物NCSEQ ID NO：8：glnA的第一个PCR引物CNSEQ ID NO：9：glnA的第一个PCR引物CCSEQ ID NO：10：glnA的第二个PCR引物NSEQ ID NO：11：glnA的第二个PCR引物CSEQ ID NO：12：用于gdh扩增的引物NSEQ ID NO：13：用于gdh扩增的引物CSEQ ID NO：14：用于gdh扩增的引物N2SEQ ID NO：15：用于gdh扩增的引物C2SEQ ID NO：16：用于gdb启动子突变的引物M1SEQ ID NO：17：用于gdb启动子突变的引物M4SEQ ID NO：18：用于glnA探针制备的引物NSEQ ID NO：19：用于glnA探针制备的引物CSEQ ID NO：20：野生型gdb启动子序列SEQ ID NO：21：突变型gdh启动子序列SEQ ID NO：22：突变型gdb启动子序列SEQ ID NO：23：用于glnE裂解的引物NSEQ ID NO：24：用于glnE裂解的引物C
                    序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>通过发酵生产L-谷氨酰胺的方法和产生L-谷氨酰胺的细菌<130>OP1288<140><141>2001-05-30<150>JP2001-28163<151>2001-02-05<150>JP2001-162806<151>2001-05-30<160>24<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>5500<212>DNA<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)<220><221>CDS<222>(659)..(1996)<220><221>CDS<222>(2006)..(5200)<400>1gatcagtgct tcggcttctt cttcgaagtt ggtggactct gcctttttca aaagtgcggt     60gatacgatga tgcgctttgg cctgtgccgg ggtcattggg ctggtgtctt gattgtctaa    120ggcgtggagc tctgcgagca ttgcccagtc aggcaaggta cttagcttcg gtagctcggt    180gagaatcttc tccagggtca tcaccggcaa gtggctagtt tcggcggcac gcgttccgtt    240cacccacagt gtgtacatct catcggagca ggagtaagca atctcaggta gcgcgtgaaa    300caggagtgga tcaatatcgg cggaaaactc atggcggaga tcggcgggag tccacccacg    360aagcgcacag aaacctaggt ggctgatgat gctttcttct aaaatctgac ggtaagagtc    420ttgtgcgtcg gtgacgttgt cggagaagtg ggagagggtc attgcggttt ccttattcgt    480aggagagttc taatttcggt gcggttctca gtgaaccacc caagctggac acctcccacc    540cccgtgtcat caaaaaaccg cgacatcctt gagtaactct gagaaaaact acccccgatg    600cgagtataaa agtggcaaat gcgcagtcga tgtcccatcg ctgcgtagat tagttttc      658atg aac agc gaa cag gaa ttt gta ctc agc gcc att gaa gaa cgc gac      706Met Asn Ser Glu Gln Glu Phe Val Leu Ser Ala Ile Glu Glu Arg Asp1               5                  10                  15att aag ttt gtg cgt cta tgg ttc act gac att ctt gga cac ttg aag      754Ile Lys Phe Val Arg Leu Trp Phe Thr Asp Ile Leu Gly His Leu Lys
         20                  25                  30tca gtg gtt gtg gct cct gca gaa cta gag tct gcg ttg gaa gaa ggc      802Ser Val Val Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ala Leu Glu Glu Gly
     35                  40                  45atc gga ttc gat ggc tca gcc att gag ggc tac gcg cgt atc tcg gaa      850Ile Gly Phe Asp Gly Ser Ala Ile Glu Gly Tyr Ala Arg Ile Ser Glu
 50                  55                  60gcg gac acc att gcc cgc cca gat cca tcg aca ttc cag gtc ctc cca      898Ala Asp Thr Ile Ala Arg Pro Asp Pro Ser Thr Phe Gln Val Leu Pro65                  70                  75                  80cta gaa gcg ggc atc tca aaa ctg cag gca gca cgc ctg ttt tgc gat      946Leu Glu Ala Gly Ile Ser Lys Leu Gln Ala Ala Arg Leu Phe Cys Asp
             85                  90                  95gtc acg atg ccg gac gga cag cca tct ttt tct gac ccg cgc caa gtg      994Val Thr Met Pro Asp Gly Gln Pro Ser Phe Ser Asp Pro Arg Gln Val
        100                 105                 110ctg cgc agg cag gtc caa cta gct gca gat gaa ggc ttg acc tgc atg     1042Leu Arg Arg Gln Val Gln Leu Ala Ala Asp Glu Gly Leu Thr Cys Met
    115                 120                 125atc tca cca gag att gag ttc tat ttg gtg caa agc ctt cgc acc aac     1090Ile Ser Pro Glu Ile Glu Phe Tyr Leu Val Gln Ser Leu Arg Thr Asn
130                 135                 140gga ctg cca cct gtg ccc act gac aac ggc gga tat ttc gac caa gcc     1138Gly Leu Pro Pro Val Pro Thr Asp Asn Gly Gly Tyr Phe Asp Gln Ala145                 150                 155                 160aca ttc aat gag gcg ccg aat ttc cgt cga aac gcg atg gta gcg ctg     1186Thr Phe Asn Glu Ala Pro Asn Phe Arg Arg Asn Ala Met Val Ala Leu
            165                 170                 175gag gaa ctc ggc atc cct gtc gag ttc tcc cac cat gaa act gca cct     1234Glu Glu Leu Gly Ile Pro Val Glu Phe Ser His His Glu Thr Ala Pro
        180                 185                 190ggc cag caa gaa atc gat tta cgc cat gcg gat gcg ctc acc atg gcc     1282Gly Gln Gln Glu Ile Asp Leu Arg His Ala Asp Ala Leu Thr Met Ala
    195                 200                 205gac aac atc atg acc ttc cgc tac atc atg aaa cag gtg gca agg gac     1330Asp Asn Ile Met Thr Phe Arg Tyr Ile Met Lys Gln Val Ala Arg Asp
210                 215                 220caa ggc gtt ggg gca tca ttt atg ccc aag cca ttc caa gaa cat gca     1378Gln Gly Val Gly Ala Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Gln Glu His Ala225                 230                 235                 240ggc tcc gcc atg cac acg cac atg tcc tta ttt gag ggc gat acc aac     1426Gly Ser Ala Met His Thr His Met Ser Leu Phe Glu Gly Asp Thr Asn
            245                 250                 255gcg ttc cac gat cca gac gat tct tac atg ctg tcc aaa acc gca aaa     1474Ala Phe His Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Met Leu Ser Lys Thr Ala Lys
        260                 265                 270cag ttc atc gct gga atc ttg cat cac gct cca gaa ttc acc gct gtg     1522Gln Phe Ile Ala Gly Ile Leu His His Ala Pro Glu Phe Thr Ala Val
    275                 280                 285acc aac cag tgg gtc aat tcc tac aaa cgc atc gtg tac gga aac gaa     1570Thr Asn Gln Trp Val Asn Ser Tyr Lys Arg Ile Val Tyr Gly Asn Glu
290                 295                 300gct cca act gcg gca acc tgg ggt gta tct aat cgt tct gcg ctg gtt     1618Ala Pro Thr Ala Ala Thr Trp Gly Val Ser Asn Arg Ser Ala Leu Val305                 310                 315                 320cgt gtt cct acc tac cgt ttg aat aag gag gag tcg cgc cgg gtg gag     1666Arg Val Pro Thr Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu Ser Arg Arg Val Glu
            325                 330                 335gtg cgt ctt cct gat acc gct tgt aac cca tat ttg gcg ttt tca gtg     1714Val Arg Leu Pro Asp Thr Ala Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Val
        340                 345                 350atg ctc ggc gct ggt ttg aaa ggt att aaa gaa ggt tat gag ctc gac     1762Met Leu Gly Ala Gly Leu Lys Gly Ile Lys Glu Gly Tyr Glu Leu Asp
    355                 360                 365gag cca gct gag gac gat atc tcc aac ttg agc ttc cgg gaa cgt cgc     1810Glu Pro Ala Glu Asp Asp Ile Ser Asn Leu Ser Phe Arg Glu Arg Arg
370                 375                 380gcc atg ggc tac aac gat ctg cca aac agc ctt gat cag gca ctg cgc     1858Ala Met Gly Tyr Asn Asp Leu Pro Asn Ser Leu Asp Gln Ala Leu Arg385                 390                 395                 400caa atg gaa aag tca gag ctt gtt gct gac atc ctc ggt gag cac gtt     1906Gln Met Glu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asp Ile Leu Gly Glu His Val
            405                 410                 415ttt gag ttt ttc ttg cgc aat aag tgg cgt gaa tgg cgt gac tac caa     1954Phe Glu Phe Phe Leu Arg Asn Lys Trp Arg Glu Trp Arg Asp Tyr Gln
        420                 425                 430gag cag atc act ccg tgg gag ctc cga aac aat ctt gat tac tagactttt   2005Glu Gln Ile Thr Pro Trp Glu Leu Arg Asn Asn Leu Asp Tyr
    435                 440                 445gcactccaat ggaaacccta cggcgaccca attgcgaccc gataaaggag gggagaagct   2065atg tca gga ccg tta aga agt gaa cgt aaa gtc gtt ggc ttt gtc aga     2113Met Ser Gly Pro Leu Arg Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Phe Val Arg1               5                  10                  15gac cca ctg cca aaa gtt ggt tct tta tcg ctg aaa tct gag cat gcc     2161Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala
         20                  25                  30caa gca gat cta gag cat ttg ggt tgg cgc aat gtt gag tct ttg gat     2209Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp
     35                  40                  45ttg ttg tgg ggc ttg tca ggt gca ggc gat ccc gat gtc gcg ctg aac     2257Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn
 50                  55                  60ctt ctt att cgg ctg tat cag gca ctt gaa gca atc ggc gag gat gct     2305Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala65                  70                  75                  80cga aac gag ctt gat caa gag att cgc cag gat gaa gaa cta cga gtc     2353Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val
             85                  90                  95cgc ctt ttt gca ttg ttg ggt ggt tcc tcg gct gtc ggt gat cac ttg     2401Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu
        100                 105                 110gtc gcc aat cct ttg cag tgg aaa ctc tta aaa ctt gat gcg cca tcg     2449Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser
    115                 120                 125agg gaa gag atg ttt cag gcg ctg ctg gaa tct gtg aaa gct cag cct     2497Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro
130                 135                 140gct gtg ctt gag gtt gag gat ttc agc gat gca cac aac att gcc cga     2545Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg145                 150                 155                 160gac gat ttg agc acg cct ggt ttt tac acg gct agt gtt acc ggg cct     2593Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro
            165                 170                 175gaa gca gag cga gtc ttg aaa tgg act tat cgc acg ttg ctg acc cgg     2641Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg
        180                 185                 190att gct gcg cat gat tta gcg ggt acc tat ccc acc gac atg cgg aga     2689Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg
    195                 200                 205aaa ggt ggc gat cct gtt ccg ttt agc aca gtg acc atg cag ctc agc     2737Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser
210                 215                 220gac cta gct gat gct gct ttg act gct gct tta gct gtg gca att gcc     2785Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala225                 230                 235                 240aat gtt tat ggt gaa aag ccg gtt gat tca gct tta tct gtc atc gcg     2833Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala
            245                 250                 255atg ggc aaa tgt ggc gcg cag gaa ttg aac tac att tca gat gtg gac     2881Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp
        260                 265                 270gtg gtg ttt gtt gca gag ccg gca aac tct aaa tca aca cgc acc gca     2929Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala
    275                 280                 285gca gag ctc att cgc atc ggt agc aac tcg ttc ttt gag gtg gat gca     2977Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala
290                 295                 300gca ctt cgc cca gaa ggt aaa agt ggc gct ctt gtg cgc tct ttg gat     3025Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp305                 310                 315                 320tcc cat atg gcg tat tac aag cgc tgg gcg gaa acc tgg gaa ttt cag     3073Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln
            325                 330                 335gca ctg ctg aaa gct cgt ccc atg acg ggt gat att gac ctt ggg cag     3121Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln
        340                 345                 350tcc tat gtg gat gct ctt tca ccg ttg att tgg gcg gct agc cag cgg     3169Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg
    355                 360                 365gaa tca ttt gtc aca gat gtc caa gct atg cgc cgt cga gtg ttg gac     3217Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp
370                 375                 380aat gtt ccg gaa gac ttg cgt gat cgt gag ctg aag ctt ggt cgc ggt     3265Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly385                 390                 395                 400ggt ttg agg gat gtg gag ttt gct gtc cag ctc ctt cag atg gtg cat     3313Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His
            405                 410                 415ggt cgc att gat gag acg ttg cgg gtt cgg tca acg gta aat gct ttg     3361Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu
        420                 425                 430cat gtg ttg gtt gat cag gga tat gtg ggt cgt gaa gac ggg cat aat     3409His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn
    435                 440                 445ctc att gag tcg tat gag ttt ttg cgc ctg ttg gag cat cgc ctt caa     3457Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln
450                 455                 460ttg gag cgg atc aag cgc act cac ttg tta ccg aaa cct gat gac cga     3505Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg465                 470                 475                 480atg aat atg cgc tgg ttg gcg cgc gct tct ggg ttt act ggt tcg atg     3553Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met
            485                 490                 495gag caa agt tcg gcc aaa gct atg gaa cgg cat ttg cgt aag gtt cgt     3601Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg
        500                 505                 510ttg cag att cag tcg ttg cat agt cag ctg ttt tat cgg cca ctg ctg     3649Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu
    515                 520                 525aac tct gtg gtc aac ttg agc gcg gat gcc atc aga ttg tct ccg gat     3697Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp
530                 535                 540gct gca aag cta caa ttg ggg gca ttg gga tac ctg cat cca tca cgt     3745Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg545                 550                 555                 560gct tat gaa cac ctg act gct ctt gca tca gga gct agc cgt aaa gcc     3793Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala
            565                 570                 575aag att cag gcg atg ttg ctg ccc acg ttg atg gag tgg ctg tct caa     3841Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln
        580                 585                 590aca gct gaa cca gat gcg gga ttg ctg aat tac cgc aag ctt tct gat     3889Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp
    595                 600                 605gct tcc tat gat cgc agc tgg ttt ttg cgc atg ctg cgt gat gag ggc     3937Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly
610                 615                 620gta gtg ggg cag cgg ttg atg cgt att ttg gga aat tct ccc tat att     3985Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile625                 630                 635                 640tct gaa ctg att atc tcc act ccg gac ttt gtg aaa cag ctg ggt gat     4033Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp
            645                 650                 655gcg gcg tct ggt cct aaa ttg ctt gct act gca ccg act cag gtt gtg     4081Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val
        660                 665                 670aaa gca atc aag gcg acg gtg tcg cgt cat gag tca cct gat cgg gcg     4129Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala
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690                 695                 700tct gct gat ttg ctc aac atg ctc act gtt cag gaa gta tgc caa agc     4225Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser705                 710                 715                 720ttg tca cta gtc tgg gat gcg gtg ttg gat gct gcc ttg gat gcg gaa     4273Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu
            725                 730                 735atc cgt gct gca ctt aac gat cca cag aaa cca gat cag cct ctg gcc     4321Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala
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    755                 760                 765tac ggt tct gat gcc gat gtg atg ttt gta tgc gag ccg gta gcc ggt     4417Tyr Gly Ser Asp Ala Asp Val Met Phe Val Cys Glu Pro Val Ala Gly
770                 775                 780gtg gaa gag cat gag gcc gtc aca tgg tct att gcg atc tgt gat tcc     4465Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser785                 790                 795                 800atg cgg tcg agg ctt gcg cag cct tcc ggt gat cca cct ttg gag gtg     4513Met Arg Ser Arg Leu Ala Gln Pro Ser Gly Asp Pro Pro Leu Glu Val
            805                 810                 815gat ctg ggg ctg cgt cct gaa ggg aga tct ggt gcg att gtg cgc acc     4561Asp Leu Gly Leu Arg Pro Glu Gly Arg Ser Gly Ala Ile Val Arg Thr
        820                 825                 830gtt gat tcc tat gtg aag tac tac gaa aag tgg ggt gaa act tgg gag     4609Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu
    835                 840                 845att cag gcg ctg ctg agg gct gcg tgg gtt gct ggt gat cgt gag ctg     4657Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu
850                 855                 860ggc att aag ttc ttg gag tcg att gat cgt ttc cgc tac cca gtt gac     4705Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp865                 870                 875                 880ggg gca acg cag gcg cag ctt cgt gaa gtt cgt cga att aag gcg agg     4753Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg
            885                 890                 895gtg gat aat gag agg ctt ccg cgc ggg gct gat cga aat acc cat acc     4801Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr
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930                 935                 940acg ttg gaa gtt ctt gaa gtg ctg gaa aag cat cag att att aac cct     4945Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro945                 950                 955                 960gtg cag gtg cag acg ctt cgg gaa gcg tgg ctg acg gca acg gct gct     4993Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala
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        980                 985                 990act cct ggt ccg cac ctt gcg cag gtg gct ggt gcg tct ggt tgg gat     5089Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp
    995                1000                1005cca aat gag tac cag gag tat ttg gaa aac tat ctg aaa gtg acc agg     5137Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr Arg1010                1015                1020aag agt cgt cag gtt gtt gat gaa gtc ttc tgg ggt gtg gac tct atg     5185Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met1025                1030                1035                1040gag caa cgt gag ttt taggtaggtg gtgggagccc caaagttgcg gaaaattgtt c   5241Glu Gln Arg Glu Phe
           1045caactaaggg actatatgta ggtgtggata acctaagtta atcttttgtg agcgtgagga   5301tttctctgag gaatctagac gcagattaac ttccgcttgg cagcgaccgg gataacaccg   5361cggttgcggc cacgcaggct cacaaaggac accactatga caagcattat tgcaagcaac   5421agcgacctat cggaggagct gcgcacccac actgcgcggg cacatgaaga ggccgagcac   5481tcaacgttta tgaatgatc                                                5500<210>2<211>446<212>PRT<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)<400>2Met Asn Ser Glu Gln Glu Phe Val Leu Ser Ala Ile Glu Glu Arg Asp1                5                  10                  15Ile Lys Phe Val Arg Leu Trp Phe Thr Asp Ile Leu Gly His Leu Lys
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 50                  55                  60Ala Asp Thr Ile Ala Arg Pro Asp Pro Ser Thr Phe Gln Val Leu Pro65                  70                  75                  80Leu Glu Ala Gly Ile Ser Lys Leu Gln Ala Ala Arg Leu Phe Cys Asp
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130                 135                 140Gly Leu Pro Pro Val Pro Thr Asp Asn Gly Gly Tyr Phe Asp Gln Ala145                 150                 155                 160Thr Phe Asn Glu Ala Pro Asn Phe Arg Arg Asn Ala Met Val Ala Leu
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        180                 185                 190Gly Gln Gln Glu Ile Asp Leu Arg His Ala Asp Ala Leu Thr Met Ala
    195                 200                 205Asp Asn Ile Met Thr Phe Arg Tyr Ile Met Lys Gln Val Ala Arg Asp
210                 215                 220Gln Gly Val Gly Ala Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Gln Glu His Ala225                 230                 235                 240Gly Ser Ala Met His Thr His Met Ser Leu Phe Glu Gly Asp Thr Asn
            245                 250                 255Ala Phe His Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Met Leu Ser Lys Thr Ala Lys
        260                 265                 270Gln Phe Ile Ala Gly Ile Leu His His Ala Pro Glu Phe Thr Ala Val
    275                 280                 285Thr Asn Gln Trp Val Asn Ser Tyr Lys Arg Ile Val Tyr Gly Asn Glu
290                 295                 300Ala Pro Thr Ala Ala Thr Trp Gly Val Ser Asn Arg Ser Ala Leu Val305                 310                 315                 320Arg Val Pro Thr Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu Ser Arg Arg Val Glu
            325                 330                 335Val Arg Leu Pro Asp Thr Ala Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Val
        340                 345                 350Met Leu Gly Ala Gly Leu Lys Gly Ile Lys Glu Gly Tyr Glu Leu Asp
    355                 360                 365Glu Pro Ala Glu Asp Asp Ile Ser Asn Leu Ser Phe Arg Glu Arg Arg
370                 375                 380Ala Met Gly Tyr Asn Asp Leu Pro Asn Ser Leu Asp Gln Ala Leu Arg385                 390                 395                 400Gln Met Glu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asp Ile Leu Gly Glu His Val
            405                 410                 415Phe Glu Phe Phe Leu Arg Asn Lys Trp Arg Glu Trp Arg Asp Tyr Gln
        420                 425                 430Glu Gln Ile Thr Pro Trp Glu Leu Arg Asn Asn Leu Asp Tyr
    435                 440                 445<210>3<211>1045<212>PRT<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)<400>3Met Ser Gly Pro Leu Arg Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Phe Val Arg1               5                  10                  15Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala
         20                  25                  30Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp
     35                  40                  45Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn
 50                  55                  60Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala65                  70                  75                  80Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val
             85                  90                  95Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu
        100                 105                 110Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser
    115                 120                 125Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro
130                 135                 140Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg145                 150                 155                 160Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro
            165                 170                 175Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg
        180                 185                 190Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg
    195                 200                 205Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser
210                 215                 220Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala225                 230                 235                 240Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala
            245                 250                 255Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp
        260                 265                 270Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala
    275                 280                 285Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala
290                 295                 300Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp305                 310                 315                 320Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln
            325                 330                 335Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln
        340                 345                 350Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg
    355                 360                 365Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp
370                 375                 380Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly385                 390                 395                 400Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His
            405                 410                 415Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu
        420                 425                 430His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn
    435                 440                 445Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln
450                 455                 460Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg465                 470                 475                 480Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met
            485                 490                 495Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg
        500                 505                 510Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu
    515                 520                 525Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp
530                 535                 540Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg545                 550                 555                 560Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala
            565                 570                 575Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln
        580                 585                 590Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp
    595                 600                 605Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly
610                 615                 620Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile625                 630                 635                 640Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp
            645                 650                 655Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val
        660                 665                 670Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala
    675                 680                 685Ile Gln Ala Ala Arg Ser Leu Arg Arg Gln Glu Leu Ala Arg Ile Ala
690                 695                 700Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser705                 710                 715                 720Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu
            725                 730                 735Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala
        740                 745                 750Asn Ile Ser Val Ile Gly Met Gly Arg Leu Gly Gly Ala Glu Leu Gly
    755                 760                 765Tyr Gly Ser Asp Ala Asp Val Met Phe Val Cys Glu Pro Val Ala Gly
770                 775                 780Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser785                 790                 795                 800Met Arg Ser Arg Leu Ala Gln Pro Ser Gly Asp Pro Pro Leu Glu Val
            805                 810                 815Asp Leu Gly Leu Arg Pro Glu Gly Arg Ser Gly Ala Ile Val Arg Thr
        820                 825                 830Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu
    835                 840                 845Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu
850                 855                 860Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp865                 870                 875                 880Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg
            885                 890                 895Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr
        900                 905                 910Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu
    915                 920                 925Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser
930                 935                 940Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro945                 950                 955                 960Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala
            965                 970                 975Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro
        980                 985                 990Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp
    995                1000                1005Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr Arg1010                1015                1020Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met1025                1030                1035                1040Glu Gln Arg Glu Phe
           1045<210>4<211>29<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>4ggggtcgacg gatcgacagg taatgcatt                                      29<210>5<211>29<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>5ggggtcgacg gatccaccat gatggagga                                      29<210>6<211>22<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>6cttcccagta gcaccatacg ac                                                22<210>7<211>26<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>7ctggtggcag ttcgaagagg tccttg                                            26<210>8<211>26<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>8ggacaaggac ctcttcgaac tgccag                                            26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>9cggcgagacc gtcgattggg aggagc                                            26<210>10<211>22<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>10gtagcacctt acgaccaaac cg                                                           22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>11ggagccggtc gacgaggagc                                                             20<210>12<211>25<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>12gctagcctcg ggagctctct aggag                                                       25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>13gatctttccc agactctggc cacgc                                     25<210>14<211>17<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>14cagttgtggc tgatccg                                              17<210>15<211>18<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>15ctttcccaga ctctggcc                                             18<210>16<211>22<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>16cgctgctata attgaacgtg ag                                             22<210>17<211>44<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>17ctttgttgcc atatctgtgc gacgctgcta taattgaacg tgag                     44<210>18<211>21<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>18ccaccacgaa gtcggtggcg g                                              23<210>19<211>21<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>19ttggagcctc gaagcctgga a                                              21<210>20<211>29<212>DNA<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<400>20tggtcatatc tgtgcgacgc tgccataat                               29<210>21<211>29<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：启动子序列<400>21tggtcatatc tgtgcgacgc tgctataat                               29<210>22<211>29<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：启动子序列<400>22ttgccatatc tgtgcgacgc tgctataat                               29<210>23<211>23<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>23agacctacga gtccgccttt ttg                                     23<210>24<211>21<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_特征<222>()..()<223>人工序列说明：引物<400>24cgatcaccag caacccacgc a                                          21

Claims (13)

1.具有L-谷氨酰胺生产能力并且已经修饰以致它的细胞内谷氨酰胺合成酶活性被增强的棒状杆菌细菌。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中通过增强谷氨酰胺合成酶基因的表达量增强谷氨酰胺合成酶活性。
3.根据权利要求2所述的细菌，其中通过增加编码谷氨酰胺合成酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达控制序列增加谷氨酰胺合成酶的基因的表达量，使编码细菌的细胞内谷氨酰胺合成酶的基因的表达增强。
4.根据权利要求1所述的细菌，其中通过腺苷酰化去除细胞内谷氨酰胺合成酶的活性控制增强了谷氨酰胺合成酶的活性。
5.根据权利要求4所述的细菌，其中腺苷酰化对细胞内谷氨酰胺合成酶的活性控制被一个或多个携带的其腺苷酰化的活性控制缺陷的谷氨酰胺合成酶去除，降低了细菌细胞中的谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性并降低了细菌细胞中的PII蛋白质活性。
6.根据根据权利要求1-5的任何一项所述的细菌，其中细菌已经进一步修饰使它的细胞内谷氨酰胺脱氢酶活性增强。
7.根据权利要求6所述的细菌，其中通过增强谷氨酰胺脱氢酶基因的表达量增强了谷氨酰胺脱氢酶的活性。
8.根据权利要求7所述的细菌，其中增加编码谷氨酸脱氢酶的拷贝数或修饰基因的表达控制序列增加了谷氨酸脱氢酶基因的表达量，使编码细菌细胞内的谷氨酸脱氢酶的基因的表达增强。
9.生产L-谷氨酰胺的方法，包括在培养基中培养权利要求1-8任一项所述的细菌，在培养基中生产和积累L-谷氨酰胺，并且回收L-谷氨酰胺。
10.编码下面的(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：
(A)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有含一个或几个氨基酸残基的替代，缺失，插入，叠加或颠换的SEQID NO：2的氨基酸序列并且具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的DNA，是下面(a)或(b)定义的DNA：
(a)在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中含有核苷酸编号为659-1996的核苷酸序列的DNA，
(b)在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中核苷酸659-1996的核苷酸序列或可以与从该序列中制备的探针杂交，并且编码具有谷氨酰胺合成酶活性的DNA。
12.编码下面(C)或(D)中定义的蛋白质的DNA：
(C)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，
(D)具有含一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，叠加或颠换的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且具有谷氨酰胺合成酶和腺苷酰转移酶活性的蛋白质。
13.根据权利要求12所述的DNA，是下面(c)或(d)定义的DNA：
(c)含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸编号2006-5200的核苷酸序列的DNA，
(d)在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸编号2006-5200的核苷酸序列或从该序列中制备的探针杂交并且编码具有谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性的蛋白质的DNA。
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