JP2002300887A - 発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 - Google Patents
発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌Info
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Abstract
において、生産性を向上させ、グルタミン酸の副生の抑
制する。 【解決手段】 L−グルタミン生産能を有し、かつ細胞
内のグルタミンシンテターゼ活性が増強され、好ましく
はさらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され
たコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にL−グルタ
ミンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより、L
−グルタミンを製造する。
Description
−グルタミン生産菌およびL−グルタミンの製造法に関
する。L−グルタミンは、調味料、肝機能促進薬、アミ
ノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤などの成分として、
産業上有用なアミノ酸である。
には、微生物の育種改良法が多用されてきた。すなわ
ち、野生株そのもののL−アミノ酸生産の生産能は極め
て低い場合が多いので、突然変異により栄養要求性、ア
ナログ耐性、もしくは代謝調節変異を付与したり、又は
これらを組み合わせる方法が知られている。上述の方法
によれば、それなりの収量でL−グルタミンは得られる
が、工業的に安価にL−グルタミンを製造する為には、
さらに発酵収率を向上させることが不可欠である。
−グルタミン酸が副生するという問題がある。この問題
を解決する方法が、例えば特開平3-232497号公報に提案
されている。この方法によれば、ある程度L−グルタミ
ン酸の生成を抑えることができるが、依然としてL−グ
ルタミン酸の副生があると同時に、L−グルタミンの収
量が不十分である。
においては、変異処理剤などで宿主菌を処理し、ランダ
ムに変異が入った菌からL−グルタミンの生産性が向上
した株を選択する方策が用いられていたため、大きな労
力と困難を伴っていた。
菌のL−グルタミンの生産性向上、及びグルタミン酸の
副生の抑制に至る特性を見出し、当該特性を有する菌株
を用いたL−グルタミンの製造法を提供することを課題
とする。
点を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞中のグルタ
ミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌の菌株
が、該活性が野生株並である菌株に比べて、L−グルタ
ミン生産能において優れていると同時に、L−グルタミ
ン酸の副生が大幅に抑制できることを見出した。また、
グルタミンシンテターゼ活性とグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を同時に増強させることにより、L−グルタ
ミンの生産速度が向上することを見出した。さらに、新
規なグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子、及び
グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通りで
ある。
細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリ
ネ型細菌。 (2)グルタミンシンテターゼ活性の増強が、グルタミ
ンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数を高める
こと、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼを
コードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の
発現調節配列を改変することによるものである(1)記載
の細菌。 (3)グルタミンシンテターゼ活性の増強が、細胞内の
グルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節
が解除されたことによるものである(1)記載の細菌。 (4)細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化
による活性調節の解除が、アデニリル化による活性調節
が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細菌に保持
させること、前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼ
・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下したこと、
又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低下したこ
とのいずれか一つ又は2以上によるものである(3)記載
の細菌。 (5)さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強
された(1)〜(4)のいずれかに記載の細菌。 (6)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピ
ー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシ
ンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるよう
に同遺伝子の発現調節配列を改変することによるもので
ある(5)記載の細菌。
の細菌を培地に接種し、該培地中に生成蓄積したL−グ
ルタミンを採取することを特徴とするL−グルタミンの
製造法。
ぱく質をコードするDNA。 (A)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する
たんぱく質。 (B)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ
グルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質。 (9)下記(a)又は(b)に示すDNAである(8)記
載のDNA。 (a)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号6
59〜1996からなる塩基配列を含むDNA。 (b)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号6
59〜1996からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有す
るたんぱく質をコードするDNA。 (10)下記(C)または(D)に示すたんぱく質をコ
ードするDNA。 (C)配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質 (D)配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有
するたんぱく質。 (11)下記(c)又は(d)に示すDNAである(10)
記載のDNA。 (c)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号2
006〜5200からなる塩基配列を含むDNA。 (d)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号2
006〜5200からなる塩基配列又は同塩基配列から
調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニ
リルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコー
ドするDNA。
クテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリ
ウム属に分類された細菌も含み(Int. J. Syst. Bacter
iol., 41, 255(1981))、またコリネバクテリウム属と
非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このよ
うなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム ブレビバクテリウム・フラバム ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13
032, ATCC13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FER
M BP-1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067,
AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATC
C6872 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号
が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受け
ることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付
けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託セン
ター)(〒305-5466 日本国茨城県つくば市東1丁目1
番地1 中央第6)にFERM BP-1539の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418
株は、1989年1月5日付けで通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。
能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培
地中にL−グルタミンを蓄積する能力をいう。このL−
グルタミン生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質とし
て有するものであってもよく、育種によって付与または
増強された性質であってもよい。
または増強するには、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン
耐性を付与する方法(特開平3-232497)、プリンアナロ
グ耐性および/またはメチオニンスルホキサイド耐性を
付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマロン酸耐
性を付与する方法(特開昭56-151495)、グルタミン酸
を含有するペプチドに耐性を付与する方法(特開平2-18
6994)などが挙げられる。L−グルタミン生産能を有す
るコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が
挙げられる。
RM P-5492) 特開昭56-151495公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205)
特開平2-186994公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特
開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117)
特開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-549
3) 特開昭56-151495公報参照
下、「GS」ともいう)活性が増強された」とは、細胞当
たりのGS活性が野生型のコリネ型細菌のそれよりも高く
なったことをいう。例えば、細胞当たりのGS分子の数が
増加した場合や、GS分子当たりのGS活性が上昇した場合
などが該当する。また、比較対象となる野生型のコリネ
型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・フラバム ATC
C14067である。細胞内のGS活性が増強された結果、培地
中のL−グルタミン蓄積量が上昇するという効果や、L
−グルタミン酸の副生が減少するという効果がある。
をコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達
成される。例えば、GSをコードする遺伝子断片を、該細
菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベ
クターと連結して組換えDNAを作製し、これをL−グル
タミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよ
い。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導
入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にL−グ
ルタミン生産能を付与してもよい。
よびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のい
ずれも使用することができる。このうち、発現の容易さ
の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子が好ましい。
て、既にglnAが明らかにされている(FEMS Microbiology
Letters 81-88, (154) 1997)ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号4お
よび5に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色
体DNAを鋳型とするPCR法(PCR:polymerase chain reac
tion; White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (19
89)参照)によって、GS遺伝子を取得することができ
る。他の微生物のGSをコードする遺伝子も、同様にして
取得され得る。
から、例えば、斎藤、三浦の方法(H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風館、
1992年参照)等により調製することができる。
はアイソザイムが存在することが多い。本発明者らは、
前述のglnA遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コ
リネ型細菌のGSのアイソザイムをコードする遺伝子の単
離およびクローン化に成功した。この遺伝子を「glnA
2」とする。その取得工程は後述する。glnA2も、glnAと
同様に、コリネ型細菌のGS活性の増強に利用することが
できる。
ェリヒア・コリ及び/またはコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを
調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、
後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内に
おいて自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC1
8、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pAC
YC184, pMW219等が挙げられる。
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照 また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ
ドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出
し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入する
と、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律
複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用するこ
とができる。
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びSDSを用いて溶菌し、30000×gで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ーを連結して組換えDNAを調製するには、GS遺伝子の末
端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は
T4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質
転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コ
リK−12について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法
(Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159(197
0))があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してDNAを導入する方法( Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977))がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換
えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に
導入する方法( Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978))も応用できる。また、コリネ型細菌の形質
転換は、電気パルス法(杉本ら、特開平2-207791号公
報)によっても行うことができる。
伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在させ
ることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DN
A上にGS遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上
に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えに
より行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列として
は、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するイ
ンバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開
平2-109985号公報に開示されているように、GS遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA
上に多コピー導入することも可能である。
以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のGS遺伝子の
プロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する
ことによっても達成される。例えば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロ
モーターとして知られている。また、国際公開WO00/189
35に開示されているように、GS遺伝子のプロモーター領
域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変
することも可能である。これらのプロモーター置換また
は改変によりGS遺伝子の発現が強化され、GS活性が増強
される。これら発現調節配列の改変は、GS遺伝子のコピ
ー数を高めることと組み合わせてもよい。
感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行う
ことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドと
しては、p48K及びpSFKT2(以上、特開2000-262288号公
報参照)、pHSC4(フランス特許公開1992年2667875号公
報、特開平5-7491号公報参照)等が挙げられる。これら
のプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では
自律複製することができるが、37℃では自律複製できな
い。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を
置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC
4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができ
る。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、19
90年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所(現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生
物寄託センター)(〒305-5466 日本国茨城県つくば市
東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-11763
として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄
託されている。
発現量を増強する以外に、細胞内のGSのアデニリル化に
よる活性調節が解除されることによっても達成される。
GSは、そのアミノ酸配列中のチロシン残基をアデニリル
化されることにより不活性型に変化する(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 642-649, (58) 1967)(J. Biol. Che
m., 3769-3771, (243) 1968)。したがって、このGSのア
デニリル化を解除することによって、細胞内のGS活性を
増強することができる。ここで、アデニリル化の解除と
は、アデニリル化が実質的に完全に解除されることに加
えて、細胞内のGS活性が増強されるようにアデニリル化
が低減されることを含む。
ランスフェラーゼによって行われる(Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 1703-1710, (58) 1967)。コリネ型細菌
においては、Genebank accession Y13221の配列に示さ
れるglnA遺伝子産物の405位のチロシン残基がアデニリ
ル化されることが示唆されている(FEMS Microbiology
Letters, 303-310,(173)1999)。このチロシン残基を他
のアミノ酸残基に置換するようにglnA遺伝子に変異を導
入することによってGSのアデニリル化による不活性化を
解除できる。
アデニリルトランスフェラーゼ(ATase)の活性を低下
させることによっても、GSのアデニリル化による不活性
化を解除できる。コリネ型細菌のアデニリルトランスフ
ェラーゼは未知であったが、本発明者らは、コリネ型細
菌のアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
glnEの単離に成功した。その工程については後述する。
させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射または
N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NT
G)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、ATase活性が低下した変異株を
選択する方法が挙げられる。また、ATase活性が低下し
たコリネ型細菌は、変異処理の他に、ATaseをコードす
る遺伝子(glnE)の部分配列を欠失し、正常に機能する
ATaseを産生しないように改変したglnE遺伝子(欠失型g
lnE)を含むDNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失
型glnEと染色体上のglnEとの間で組換えを起こさせるこ
とにより、染色体上のglnEを破壊することができる。こ
のような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子
破壊は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法や温
度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などが
ある。
するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性
複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬剤
に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えDNA
を調製し、この組換えDNAでコリネ型細菌を形質転換
し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株
を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養すること
により、組換えDNAが染色体DNAに組み込まれた形
質転換株が得られる。
れた株は、染色体上にもともと存在するglnE配列との組
換えを起こし、染色体glnEと欠失型glnEとの融合遺伝子
2個が組換えDNAの他の部分(ベクター部分、温度感
受性複製起点及び薬剤耐性マーカー)を挟んだ状態で染
色体に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnEが優性であるので、形質転換株は正常なATaseを
発現する。
残すために、2個のglnEの組換えにより1コピーのglnE
を、ベクター部分(温度感受性複製起点及び薬剤耐性マ
ーカーを含む)とともに染色体DNAから脱落させる。
その際、正常なglnEが染色体DNA上に残され、欠失型
glnEが切り出される場合と、反対に欠失型glnEが染色体
DNA上に残され、正常なglnEが切り出される場合があ
る。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温
度で培養すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で
細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能
しない温度で培養すると、プラスミド上のglnEは、プラ
スミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたは
サザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠
失型glnEが残った株を選択することによって、glnEが破
壊された株を取得することができる。
下させることによっても、GSのアデニリル化による不活
性化を解除できる。ATaseによるGSのアデニリル化にはP
IIたんぱく質も関与することが知られている。PIIたん
ぱく質とは、GS活性を調節するためのシグナル伝達たん
ぱく質であり、ウリジリルトランスフェラーゼ(UTase)
によるウリジリル化を受けることが知られている。ウリ
ジリル化されたPIIたんぱく質は、ATaseによるGSの脱ア
デニリル化を促進し、脱ウリジリル化されたPIIたんぱ
く質はATaseによるGSのアデニリル化を促進する。
ニリル化されることが報告されている(J. Bacteriolog
y, 569-577, (134) 1978)。過剰にアデニリル化される
この表現形は、PIIたんぱく質の変異によって抑制され
る(J.Bacteriology, 816-822,(164)1985)。すなわちP
IIたんぱく質の活性低下によっても、GSのアデニリル化
による不活性化を解除できる。PIIたんぱく質の活性低
下とは、ATaseによるアデニリル化を促進する機能が低
下することをいう。コリネ型細菌のPIIたんぱく質をコ
ードするglnB遺伝子は既に単離されており、その欠失に
よりGSのアデニリル化による抑制が解除されることが示
唆されている(FEMS Microbiology Letters, 303-310,
(173) 1999)。
下させるためには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射
またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NT
G)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、PIIたんぱく質の活性が低下し
た菌株を選択する方法が挙げられる。また、PIIたんぱ
く質の活性が低下したコリネ型細菌は、変異処理の他
に、PIIたんぱく質をコードする遺伝子glnBの部分配列
を欠失し、正常に機能するPIIたんぱく質を産生しない
ように改変したglnB遺伝子(欠失型glnB遺伝子)を含む
DNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型glnBと染色体
上のglnBとの間で組換えを起こさせることにより、染色
体上のglnBを破壊することができる。このような相同組
換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立
されており、直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製起
点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
るためには、例えば以下のようにすればよい。温度感受
性複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬
剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えDN
Aを調製し、この組換えDNAでコリネ型細菌を形質転
換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換
株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養するこ
とにより、組換えDNAが染色体DNAに組み込まれた
形質転換体が得られる。
れた株は、染色体上にもともと存在するglnB配列との組
換えを起こし、染色体glnBと欠失型glnBとの融合遺伝子
2個が組換えDNAの他の部分(ベクター部分、温度感受
性複製起点及び薬剤耐性マーカー)を挟んだ状態で染色
体上に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnBが優性であるので、形質転換体は正常なglnBを発
現する。
すために、2個のglnBの組換えにより1コピーのglnB
を、ベクター部分(温度感受性複製起点および薬剤耐性
マーカーを含む)とともに染色体DNAから脱落させる。
その際、正常なglnBが染色体上に残され、欠失型glnBが
切り出される場合と、反対に欠失型glnBが染色体DNA上
に残され、正常なglnBが切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に安
定に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しな
い温度で培養すると、プラスミド上のglnBは、プラスミ
ドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザ
ンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型
glnEが残った株を選択することによって、glnBが破壊さ
れた株を取得することができる。
リル化を受けないようなGSの変異、ATaseの活性低下、
及びPIIたんぱく質の活性低下から選ばれる2つ、又は
3つの手段を組み合わせることよっても、達成すること
ができる。
るGSのアデニリル化の解除によっても可能であるが、前
述のGS遺伝子のコピー数を高める手段や、発現調節配列
の改変をする手段と組み合わせて行ってもよい。
ミンを効率よく生産するには、GS活性と同時にグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ(以下、「GDH」ともいう)活性
が高められた菌株を用いるのが好ましい。
細胞当たりのGDH活性が野生型のコリネ型細菌のそれよ
りも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのGDH
分子の数が増加した場合や、GDH分子当たりのGDH活性が
上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野
生型のコリネ型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・
フラバム ATCC14067である。細胞内のGDH活性が増強さ
れた結果、L−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌
の培養時間が短縮されるという効果がある。
DHをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって
達成される。例えば、GDHをコードする遺伝子断片を、
該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型
のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをL−
グルタミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すれ
ばよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNA
を導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にL
−グルタミン生産能を付与してもよい。
の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の
生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。発
現容易の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子を用い
ることが好ましい。
dh遺伝子)の塩基配列は、既に明らかにされている(Mo
lecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326)ので、
その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配
列表配列番号12及び13に示すプライマーを用いて、コリ
ネ型細菌染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、
gdh遺伝子を取得することができる。コリネ型細菌等の
他の微生物のGDHをコードする遺伝子も、同様にして取
得され得る。gdhのコリネ型細菌への導入は、前記のGS
遺伝子と同様にして行うことができる。
GDH以外のL−グルタミン生合成を触媒する酵素の活性
が増強されていてもよい。例えばグルタミン生合成を触
媒する酵素としては、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ等がある。
分岐してL−グルタミン以外の化合物を生成する反応を
触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。
このような反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸
リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒロゲナーゼ、グルタ
ミン酸シンターゼ等が挙げられる。
ミンの生産 上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養
し、該培地中にL−グルタミンを生成蓄積せしめ、該培
地からL−グルタミンを採取することにより、L−グル
タミンを効率よく製造することができ、かつ、L−グル
タミン酸の副生を抑制することができる。
ミンを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて常法により行うことがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌
株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いても
よい。
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培
養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウ
ムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和す
る。かくして10時間〜120時間程度培養することによ
り、培養液中に著量のL−グルタミンが蓄積される。
採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。
例えば、培養液から菌体を除去した後に、濃縮晶析する
ことによって採取される。
性を有するたんぱく質をコードするDNA(glnA2遺伝子)
および、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランス
フェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA(g
lnE遺伝子)
遺伝子である。また、本発明の第二のDNAは、ATase
をコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、公知の
glnA遺伝子の部分断片をプローブとするハイブリダイゼ
ーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの染色体DNAライリブラリーから取得するこ
ともできる。公知のglnA遺伝子の部分断片は、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム、例えばブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体
DNAを鋳型にして、配列番号18および19に示すプ
ライマーを用いてPCR法によって増幅することによっ
て取得される。
性及びGDH活性の増強に際して、ゲノムDNAライブラ
リーの作製、ハイブリダイゼーション、PCR、プラス
ミドDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転換等
の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,
T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1.21 (1989)に記載されている。
リネバクテリウム・グルタミカムのglnA遺伝子(GenBan
k ACCESSION Y13221)の塩基配列に基づいて設計された
ものであり、これらのプライマーを用いれば、glnA遺伝
子(GenBank ACCESSION Y13221)の塩基番号1921〜2282
に相当する領域を含むDNA断片が得られる。
を含むDNA断片の塩基配列及びこの配列がコードし得
るアミノ酸配列の一例を配列番号1に示す。また、glnA
2がコードするグルタミンシンテターゼ活性を有するた
んぱく質のアミノ酸配列のみを配列番号2に示す。
伝子のORFのすぐ下流に別のORFが見出された。既
知の配列との相同性比較の結果、当該ORFはグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質(ATase)をコードする遺伝子(gln
E)であると予想された。ATase活性を有するたんぱく質
のアミノ酸配列のみを配列番号3に示す。
は、本発明によりその塩基配列が明らかになったので、
同塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたPCR
法により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の染色体DNAから単離することができる。
んぱく質のグルタミンシンテターゼ活性が損なわれない
限り、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミ
ノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタ
ミンシンテターゼをコードするものであってもよい。こ
こで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱく質の立体
構造における位置や種類によっても異なるが、具体的に
は2から90個、好ましくは、2から50個、より好ま
しくは2から20個である。
んぱく質のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトラン
スフェラーゼ活性が損なわれない限り、1若しくは複数
の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むグルタミンシンテターゼ・ア
デニリルトランスフェラーゼをコードするものであって
もよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱ
く質の立体構造における位置や種類によっても異なる
が、具体的には2から350個、好ましくは、2から5
0個、より好ましくは2から20個である。グルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性を
損なう場合においても、相同組換えを起こす限り本発明
に含まれる。
のたんぱく質をコードするDNAは、例えば部位特異的
変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むように、glnA2又はgln
Eの塩基配列を改変することによって得られる。また、
上記のような改変されたDNAは、従来知られている変
異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変
異処理前のDNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ
処理する方法、及び変異処理前のDNAを保持する微生
物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理する方法が挙げられる。
な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることによ
り、グルタミンシンテターゼ、または、グルタミンシン
テターゼ・アデニリルトランスフェラーゼと実質的に同
一のたんぱく質をコードするDNAが得られる。また、
変異を有するグルタミンシンテターゼ、もしくは、グル
タミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼを
コードするDNAまたはこれを保持する細胞から、例え
ば配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち塩基番号
659〜1996または2066〜5200からなる塩基配列又はその
一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、グルタミンシンテターゼ活性を
有するたんぱく質をコードするDNA、または、グルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質をコードするDNAを単離することに
よっても、GS又はATaseと実質的に同一のたんぱく質を
コードするDNAが得られる。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば5
0%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である60℃、1×SSC,0.1%
SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDS
に相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられ
る。
一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブ
は、配列番号1の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプライマーとし、配列番号1の塩基配列を
含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製するこ
とができる。プローブとして、300bp程度の長さの
DNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーション
の洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDS
が挙げられる。
伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、
活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、
それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグ
ルタミンシンテターゼ活性、または、グルタミンシンテ
ターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を、例えば
グルタミンシンテターゼ活性についてはMethods in Enz
ymology, Vol.XVIIA,910-915, ACADEMIC PRESS (1970)
記載の方法で、グルタミンシンテターゼ・アデニリルト
ランスフェラーゼ活性についてはMethods in Enzymolog
y Vol.XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970)記載の
方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別す
ることができる。活性が低下あるいは欠失したグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAも本発明においては利用可能である。
るDNAとして具体的には、配列番号2に示すアミノ酸
配列と、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、
さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつGS活性
を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
また、ATaseと実質的に同一のタンパク質をコードする
DNAとして具体的には、配列番号3に示すアミノ酸配
列と、好ましくは65%以上、より好ましくは80%以上、さ
らに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつATase活性
を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
説明する。
らかにされている(FEMS Microbiology Letters 81-88,
(154) 1997)。報告されている塩基配列に基づいて、配
列表配列番号4および5に示すプライマーを合成し、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型にしてPCR法によりglnA断片を増幅した。
株の染色体DNAの調製は、BacterialGenome DNA Purific
ation Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用
いて行った。また、PCR反応は、Pyrobest DNA Polymera
se(宝酒造)を用い、変性94℃ 30秒、会合55℃ 15秒、
伸長72℃ 2分の条件で30サイクル行った。
限酵素SalIで切断し、SalIで切断したpMW219(ニッポン
ジーン)とライゲーションキット(宝酒造)を用いて連
結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセ
ル(宝酒造)を形質転換し、IPTG 10μg/ml, X-Gal 40
μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布
し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。
ドを調製した後、ベクターにglnA遺伝子が挿入されてい
るプラスミドをpMW219GSと名付けた。
するプラスミドの構築 さらに、glnA遺伝子とコリネ型細菌の複製起点を有する
プラスミドを構築するために、既に取得されているコリ
ネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric.
Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984))由来の複製起点
を持つプラスミドpHK4(特開平5-7491号公報参照)を制
限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺
伝子断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キッ
ト(宝酒造)を用い平滑末端化した後、KpnIリンカー
(宝酒造)を用いてpMW219GSのKpnI部位に挿入した。本
プラスミドをpGSと名付けた。
評価 L−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ
12418(FERM BP-2205:特開平2-186994号公報参照)を
電気パルス法(特開平2-207791号公報参照)によりプラ
スミドpGSで形質転換し、形質転換体を得た。得られた
形質転換体AJ12418/pGSを用いてL−グルタミン生産の
ための培養を以下のように行った。
ト培地にて培養して得たAJ12418/pGS株の菌体を、グル
コース100g、(NH4)2SO4 60g、KH2PO4 2.5g、MgSO4・7H2
O 0.4g、FeSO4・7H2O 0.01g、VB1-HCl 350μg、ビオチン
4μg、大豆加水分解物200mg、CaCO3 50gを純水1Lに含む
培地(NaOHでpH6.8に調整されている)に接種し、31.5
℃にて培地中の糖が消費されるまでしんとう培養した。
積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラ
フィーにより分析した。カラムはCAPCELL PAK C18(資
生堂)を用い、サンプルは0.095%リン酸、3.3mMヘプタ
ンスルホン酸、5%アセトニトリルを蒸留水1Lに含む溶
離液で溶出し、210nMの吸光度の変化によりL−グルタ
ミン蓄積量を分析した。このときの結果を表1に示し
た。
蓄積が顕著に向上し、またL−グルタミン酸(L-Glu)
の副生が大幅に抑制された。これらの結果から、L−グ
ルタミンの生産において、GSの増強が収量の向上に有効
であることが示された。なお、GSの酵素活性のデータ
は、実施例2の表2に示した。
既に明らかにされている(FEMS Microbiology Letters,
303-310,(173)1999)。そこで、アデニリル化部位が改
変されたglnA遺伝子で、染色体上のglnA遺伝子とを置換
することにより、アデニリル化部位改変株の取得を行っ
た。具体的な方法を以下に記す。
067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号6と7
の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnA遺伝子N
末端側の増幅産物を得た。一方、glnA遺伝子C末端側の
増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号
8と9の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列
表配列番号7と8にはミスマッチが導入されているの
で、これらの増幅産物の末端には変異が導入される。次
に、変異が導入されたglnA遺伝子断片を得るために、上
記glnA N末側およびC末側の遺伝子産物を、それぞれほ
ぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表
配列番号10と11の合成DNAをプライマーとしてPCRを
行い、アデニリル化部位に変異導入されたglnA遺伝子増
幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後、H
incIIで消化し、pHSG299(宝酒造)のHincII部位に挿入
した。このプラスミドをpGSAと名付けた。
養評価 上述のpGSAは、コリネ型細菌の細胞内で自律複製可能と
する領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌
を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミ
ドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転
換体として出現する。
・フラバムAJ12418を電気パルス法(特開平2-207791号
公報参照)により高濃度のプラスミドpGSAを用いて形質
転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を得
た。次にこれらの形質転換体を継代培養し、カナマイシ
ン感受性となった株を取得した。さらに、カナマイシン
感受性株のglnA遺伝子の配列を決定し、その配列中のア
デニリル化部位がpGSA由来のglnAのその領域と置換され
たものをQA-1と名付けた。AJ12418、AJ12418/pGS、QA-1
株を用いて、L−グルタミン生産のための培養を実施例
1(3)記載の方法と同様にして行った。その結果を表
2に示した。
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても、表2に示した。GS活性は、
Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.7
0, No.3, 182-184, 1990に記載の方法を参考とし、イミ
ダゾール-HCl(pH7.0)100mM, NH4Cl 0.1mM, MnCl2 1mM,
ホスホエノールピルビン酸1mM, NADH 0.3mM, ラクテー
トデヒドロゲナーゼ10U, ピルビン酸キナーゼ25U, ATP
1mM, MSG 10mMを含む溶液に、粗酵素液を加え、30℃に
おける340nMの吸光度変化を測定することによって測定
した。ブランクの測定には、上記反応液よりMSGを除い
たものを用いた。粗酵素液は、上記の培養液より遠心分
離により菌体を分離し、イミダゾール-HCl(pH7.0)100mM
で洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去
することにより、調製した。粗酵素液のたんぱく質濃度
は、牛血清アルブミンを標準試料として、ProteinAssay
(Bio-Rad)を用いて定量した。
ミドpGDHの構築は、以下のように行った。まずブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色
体DNAを抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号1
2と13の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行っ
た。得られたDNA断片を平滑末端化し、これをpHSG399
(宝酒造)のSmaI部位に挿入した。このプラスミドをpH
SG399GDHと名付けた。
細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric. Biol.
Chem., 48, 2901-2903 (1984))由来の複製起点を導入
した。具体的には、前述のpHK4を制限酵素BamHIおよびK
pnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、
得られた断片を平滑末端化した後、SalIリンカー(宝酒
造)を用いてpHSG399GDHのSalI部位に挿入した。本プラ
スミドをpGDHと名付けた。
・フラバムAJ12418株をpGDHで形質転換し、形質転換体
を得た。得られた形質転換体AJ12418/pGDHを用いて、L
−グルタミン生産のための培養を実施例1記載の方法で
行った。その結果を表3に示した。GDH増強株ではL−
グルタミンの収量が減少し、L−グルタミン酸の副生が
増加したが、培養時間は大幅に短縮された。
評価 (1)gdhプロモーター改変プラスミドの構築 ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNA
を抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号14と1
5の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行った。得ら
れたDNA断片を制限酵素StuI、PvuIIで切断し、これをpH
SG399のSmaI部位に挿入した。このプラスミドを制限酵
素SacIで処理することによりgdhプロモーターおよびgdh
遺伝子の部分断片を含むDNA断片を取得し、pKF19k(宝
酒造)のSacI部位に挿入した。このプラスミドをpKF19G
DHと名付けた。
tan-Super Express Km(宝酒造)を用いた。pkF19GDHを
鋳型として、Mutan-super Express Km添付のセレクショ
ンプライマーと変異導入用のプライマーとして配列表配
列番号16又は17の5'末端リン酸化合成DNAを添加し
て、LA-PCRを行った。反応産物はエタノール沈殿により
精製した後、これを用いてエシェリヒア・コリJM109の
コンピテントセル(宝酒造)を形質転換し、形質転換体
を得た。
プロモーター領域の配列を決定した。このうち、表4に
示す配列を有していたものを、pKF19GDH1, pKF19GDH4と
命名した。gdhプロモーター配列をpKF19GDH1型に置換す
ることにより、GDH活性は野生型のプロモーターを有す
るgdhに比べ約3倍、pKF19GDH4型に置換することにより
GDH活性は約5倍に向上させることができると予想され
る(国際公開WO00/18935参照)。
し、gdhプロモーターおよびgdh遺伝子の部分断片を含む
DNA断片を取得し、pSFKT2(特開2000-262288号公報参
照)のSacI部位に挿入した。これらのプラスミドを、そ
れぞれpSFKTGDH1、pSFKTGDH4と名付けた。pSFKT2は、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株
由来のプラスミドpAM330の誘導体であり、コリネ型細菌
中での自律複製が温度感受性となっているプラスミドで
ある。
導入 染色体上のgdhプロモーター配列への変異の導入は、以
下のようにして行った。まず、QA-1株を電気パルス法に
よりプラスミドpSFKTGDH1、pSFKTGDH4で形質転換し、そ
れぞれ形質転換体を得た。なお、形質転換後の培養は25
℃で行った。次に、これらの形質転換体を34℃で培養
し、34℃においてカナマイシン耐性を示す株を選択し
た。上記プラスミドは34℃では自律複製できないため
に、相同組換えにより、染色体にこれらのプラスミドが
組み込まれたもののみが、カナマイシン耐性を示す。さ
らに、これらのプラスミドが染色体上に組み込まれた株
をカナマイシン非存在下で培養し、カナマイシン感受性
となった株を選択し、そのうち染色体上のgdhプロモー
ター領域にpSFKTGDH1, pSFKTGDH4と同じ変異が導入され
た株をぞれぞれQB-1、QB-4と命名した。
測定 L−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムQA
-1株を、実施例3(2)記載のプラスミドpGDHで形質転
換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体QA-1/pGD
Hを用いてL−グルタミン生産のための培養を実施例1
記載の方法で行った。また、GDH活性についてはMol. Mi
crobiology, 317-326(6) 1992を参考とし、Tris-HCl(pH
7.5)100mM, NH4Cl 20mM, α-ケトグルタル酸10mM, NADP
H 0.25mMを含む溶液に粗酵素液を加え、340nMにおける
吸光度の変化を測定することによって測定した。粗酵素
液は、上記の培養液より遠心分離により菌体を分離し、
Tris-HCl(pH7.5)100mMで洗浄後、超音波破砕し、未破砕
菌体を遠心分離で除去することにより調製した。粗酵素
液のたん白質濃度は牛血清アルブミンを標準試料とし
て、Protein Assay(Bio-Rad)を用いて定量した。その
結果を表5に示した。
ロモーター改変株QB-1、QB-4が高い収量を示した。ま
た、QA-1/pGDH株も、AJ12418株よりも高い収量を示し
た。培養時間は、QA-1/pGDH株が最も短かった。L−グ
ルタミン酸の副生は、QB-1、QB-4株が大幅に改善され
た。これらの結果から、GSとGDHを同時に強化すること
が、L−グルタミンの収量の向上および培養時間短縮に
有効であることが示された。
得 コリネバクテリウム・グルタミカムのglnAを取得したこ
とを報告した論文(FEMS Microbiol. Letter, 154 (199
7) 81-88)には、ΔglnA破壊株がグルタミン要求とな
り、GS活性が失われることを記載されている一方、サザ
ンブロッテイングの結果、アイソザイムの存在を示唆す
るデータも報告されている。また、「アミノ酸発酵:学
会出版センター、232頁〜235頁」には、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムには2種類のGSがあることが記載さ
れている。そこで第2のGSアイソザイムをコードする遺
伝子の取得を試みた。 (1)プローブの調製 GSのアイソザイムをコードする遺伝子(glnA2)は、コ
ロニーハイブリダイゼーションにより取得した。まず、
配列表配列番号18および19に示すプライマーを用い
て、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、glnA遺伝子
部分断片を取得した。このDNA断片をDIG-ハイプライムD
NAラベリング&デテクションスターターキットI(ベー
リンガー・マンハイム)を用いて標識し、プローブとし
た。
株の染色体DNAを抽出し、制限酵素Sau3AIにより部分
分解して、得られたDNA断片をpHSG299のベクターのB
amHI部位に挿入し大腸菌JM109株を形質転換した。得ら
れた形質転換体を、Hybond-N+(アマシャムファルマシ
アバイオテク)にトランスファーし、変性、中和後、DI
G-ハイプライムDNAラベリング&デテクションスタータ
ーキットIにしたがって、実施例5(1)で調製したプ
ローブとハイブリダイズさせた。このとき、強くハイブ
リダイズする形質転換体と弱くハイブリダイズする形質
転換体が認められた。これらの形質転換体よりプラスミ
ドDNAを調製し、挿入断片の塩基配列を決定したとこ
ろ、既知のコリネ型細菌のグルタミンシンテターゼと高
い相同性を示す遺伝子を含むクローンが取得できた。後
者の挿入断片の全塩基配列を配列表配列番号1に示し
た。
し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を
配列表配列番号2と3に示した。これらのアミノ酸配列
おのおのについて既知の配列と相同性比較を行った。用
いたデータベースはGenbankである。その結果、いずれ
のオープン・リーディング・フレームにコードされるア
ミノ酸配列も、コリネ型細菌の新規なたんぱく質である
ことが明らかとなった。塩基配列及びアミノ酸配列は、
Genetyx-Mac computer program(ソフトウェア開発、東
京)により解析した。相同性解析は、LipmanとPearson
(Science, 227,1435-1441, 1985)の方法にしたがって行
った。
は、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミ
カムのGS(FEMS Microbiology Letters 81-88,(154) 19
97)、マイコバクテリウム・ツバクロシスのGS(GenBan
k ACCESION Z70692)およびストレプトマイセス・セリ
カラーのGS(GenBank ACCESSION AL136500)と、それぞれ
34.6%、65.6%、60%の相同性を示し(表6)、コリネ型
細菌のGSのアイソザイムであることが判明した。
告されているマイコバクテリウム・ツバクロシスのATas
e(GenBank ACCESION Z70692)およびストレプトマイセス
・セリカラーのATase(GenBank ACCESSION Y17736)と、
それぞれ51.9%、33.4%の相同性を示し(表7)、コリ
ネ型細菌のATaseであることが判明した。したがって、
配列番号1に示す塩基配列のうち、配列番号2に示すア
ミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレ
ームはglnA2であり、配列番号3に示すアミノ酸配列を
コードするオープン・リーディング・フレームはglnEで
あることが判明した。
にされたので、L−グルタミン生産菌AJ12418よりglnE
欠損株を構築した。具体的方法を以下に示す。まず、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型として、配列番号23と24の合成DNAをプライマ
ーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部分断片を得た。生
成したPCR産物を常法により精製後、平滑末端化し、pHS
G299(宝酒造)のHincII部位に挿入した。このプラスミ
ドをpGLNEと名付けた。次に、このプラスミド上のglnE
遺伝子の一部領域を欠失させる為、pGLNEをHincIIで消
化した後、セルフライゲーションを行い、得られたプラ
スミドをpΔGLNEと名付けた。このプラスミドは、配列
表配列番号1に示す塩基配列のうち、塩基番号2341番目
から4650番目までを含んでいるが、3343番目のHincII認
識部位から3659番目のHincII認識部位までの約300bpを
欠失している。
で自律複製可能とする領域を含まない為、本プラスミド
でコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であ
るが、本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込
まれた形が形質転換体として出現する。
・フラバムAJ12418を電気パルス法により、高濃度のプ
ラスミドpΔGLNEを用いて形質転換し、カナマイシン耐
性を指標として形質転換体を取得した。次にこれらの形
質転換体を継代培養し、カナマイシン感受性となった株
を取得した。取得したカナマイシン感受性株より染色体
DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号23と24の
合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部
分断片を得た。PCR産物をHincIIで消化し、約300bpの断
片が生じないものをglnE遺伝子破壊株とした。この株を
QA-Tと名付けた。AJ12418及びQA-Tを用いて、L−グル
タミン生産の為の培養を実施例1(3)記載の方法と同
様にして行った。その結果を表8に示した。
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても表8に示した。QA-T株ではAJ
12418株に比べ、GS活性が向上していることが確認され
た。
発酵法によるL−グルタミンの製造において、L−グル
タミン酸の副生を抑制でき、L−グルタミンの生産効率
を向上させることができる。また、本発明のDNAは、
コリネ型細菌のL−グルタミン生産菌の育種に利用する
ことができる。
Claims (11)
- 【請求項1】 L−グルタミン生産能を有し、かつ細胞
内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型
細菌。 - 【請求項2】 グルタミンシンテターゼ活性の増強が、
グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数
を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテ
ターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同
遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである
請求項1記載の細菌。 - 【請求項3】 グルタミンシンテターゼ活性の増強が、
細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化による
活性調節が解除されたことによるものである請求項1記
載の細菌。 - 【請求項4】 細胞内のグルタミンシンテターゼのアデ
ニリル化による活性調節の解除が、アデニリル化による
活性調節が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細
菌に保持させること、前記細菌細胞内のグルタミンシン
テターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下し
たこと、又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低
下したことのいずれか一つ又は2以上によるものである
請求項3記載の細菌。 - 【請求項5】 さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性が増強された請求項1〜4のいずれか一項に記載の細
菌。 - 【請求項6】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増
強が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグル
タミンシンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強さ
れるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによ
るものである請求項5記載の細菌。 - 【請求項7】 請求項1〜6いずれか一項に記載の細菌
を培地に培養し、該培地中にL−グルタミンを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするL−グルタミ
ンの製造法。 - 【請求項8】 下記(A)または(B)に示すたんぱく
質をコードするDNA。 (A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質。 (B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ活性を有するたんぱく質。 - 【請求項9】 下記(a)又は(b)に示すDNAであ
る請求項8記載のDNA。 (a)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号6
59〜1996からなる塩基配列を含むDNA。 (b)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号6
59〜1996からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有す
るたんぱく質をコードするDNA。 - 【請求項10】 下記(C)または(D)に示すたんぱ
く質をコードするDNA。 (C)配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質 (D)配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有
するたんぱく質。 - 【請求項11】 下記(c)又は(d)に示すDNAで
ある請求項10記載のDNA。 (c)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号2
006〜5200からなる塩基配列を含むDNA。 (d)配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号2
006〜5200からなる塩基配列又は同塩基配列から
調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニ
リルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコー
ドするDNA。
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