JP2002300887A - 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌 - Google Patents
発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミンの生産
において、生産性を向上させ、グルタミン酸の副生の抑
制する。 【解決手段】 Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ細胞
内のグルタミンシンテターゼ活性が増強され、好ましく
はさらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され
たコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタ
ミンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより、Ｌ
−グルタミンを製造する。
において、生産性を向上させ、グルタミン酸の副生の抑
制する。 【解決手段】 Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ細胞
内のグルタミンシンテターゼ活性が増強され、好ましく
はさらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され
たコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタ
ミンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより、Ｌ
−グルタミンを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌のＬ
−グルタミン生産菌およびＬ−グルタミンの製造法に関
する。Ｌ−グルタミンは、調味料、肝機能促進薬、アミ
ノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤などの成分として、
産業上有用なアミノ酸である。
−グルタミン生産菌およびＬ−グルタミンの製造法に関
する。Ｌ−グルタミンは、調味料、肝機能促進薬、アミ
ノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤などの成分として、
産業上有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造する
には、微生物の育種改良法が多用されてきた。すなわ
ち、野生株そのもののＬ−アミノ酸生産の生産能は極め
て低い場合が多いので、突然変異により栄養要求性、ア
ナログ耐性、もしくは代謝調節変異を付与したり、又は
これらを組み合わせる方法が知られている。上述の方法
によれば、それなりの収量でＬ−グルタミンは得られる
が、工業的に安価にＬ−グルタミンを製造する為には、
さらに発酵収率を向上させることが不可欠である。
には、微生物の育種改良法が多用されてきた。すなわ
ち、野生株そのもののＬ−アミノ酸生産の生産能は極め
て低い場合が多いので、突然変異により栄養要求性、ア
ナログ耐性、もしくは代謝調節変異を付与したり、又は
これらを組み合わせる方法が知られている。上述の方法
によれば、それなりの収量でＬ−グルタミンは得られる
が、工業的に安価にＬ−グルタミンを製造する為には、
さらに発酵収率を向上させることが不可欠である。
【０００３】また、Ｌ−グルタミン発酵においては、Ｌ
−グルタミン酸が副生するという問題がある。この問題
を解決する方法が、例えば特開平3-232497号公報に提案
されている。この方法によれば、ある程度Ｌ−グルタミ
ン酸の生成を抑えることができるが、依然としてＬ−グ
ルタミン酸の副生があると同時に、Ｌ−グルタミンの収
量が不十分である。
−グルタミン酸が副生するという問題がある。この問題
を解決する方法が、例えば特開平3-232497号公報に提案
されている。この方法によれば、ある程度Ｌ−グルタミ
ン酸の生成を抑えることができるが、依然としてＬ−グ
ルタミン酸の副生があると同時に、Ｌ−グルタミンの収
量が不十分である。
【０００４】上記のようなＬ−グルタミン生産菌の改良
においては、変異処理剤などで宿主菌を処理し、ランダ
ムに変異が入った菌からＬ−グルタミンの生産性が向上
した株を選択する方策が用いられていたため、大きな労
力と困難を伴っていた。
においては、変異処理剤などで宿主菌を処理し、ランダ
ムに変異が入った菌からＬ−グルタミンの生産性が向上
した株を選択する方策が用いられていたため、大きな労
力と困難を伴っていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌のＬ−グルタミンの生産性向上、及びグルタミン酸の
副生の抑制に至る特性を見出し、当該特性を有する菌株
を用いたＬ−グルタミンの製造法を提供することを課題
とする。
菌のＬ−グルタミンの生産性向上、及びグルタミン酸の
副生の抑制に至る特性を見出し、当該特性を有する菌株
を用いたＬ−グルタミンの製造法を提供することを課題
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞中のグルタ
ミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌の菌株
が、該活性が野生株並である菌株に比べて、Ｌ−グルタ
ミン生産能において優れていると同時に、Ｌ−グルタミ
ン酸の副生が大幅に抑制できることを見出した。また、
グルタミンシンテターゼ活性とグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を同時に増強させることにより、Ｌ−グルタ
ミンの生産速度が向上することを見出した。さらに、新
規なグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子、及び
グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通りで
ある。
点を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞中のグルタ
ミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌の菌株
が、該活性が野生株並である菌株に比べて、Ｌ−グルタ
ミン生産能において優れていると同時に、Ｌ−グルタミ
ン酸の副生が大幅に抑制できることを見出した。また、
グルタミンシンテターゼ活性とグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を同時に増強させることにより、Ｌ−グルタ
ミンの生産速度が向上することを見出した。さらに、新
規なグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子、及び
グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通りで
ある。
【０００７】（１）Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ
細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリ
ネ型細菌。 （２）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、グルタミ
ンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数を高める
こと、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼを
コードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の
発現調節配列を改変することによるものである(1）記載
の細菌。 （３）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、細胞内の
グルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節
が解除されたことによるものである(1)記載の細菌。 （４）細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化
による活性調節の解除が、アデニリル化による活性調節
が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細菌に保持
させること、前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼ
・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下したこと、
又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低下したこ
とのいずれか一つ又は２以上によるものである(3)記載
の細菌。 （５）さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強
された(1)〜(4)のいずれかに記載の細菌。 （６）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピ
ー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシ
ンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるよう
に同遺伝子の発現調節配列を改変することによるもので
ある(5)記載の細菌。
細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリ
ネ型細菌。 （２）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、グルタミ
ンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数を高める
こと、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼを
コードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の
発現調節配列を改変することによるものである(1）記載
の細菌。 （３）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、細胞内の
グルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節
が解除されたことによるものである(1)記載の細菌。 （４）細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化
による活性調節の解除が、アデニリル化による活性調節
が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細菌に保持
させること、前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼ
・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下したこと、
又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低下したこ
とのいずれか一つ又は２以上によるものである(3)記載
の細菌。 （５）さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強
された(1)〜(4)のいずれかに記載の細菌。 （６）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピ
ー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシ
ンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるよう
に同遺伝子の発現調節配列を改変することによるもので
ある(5)記載の細菌。
【０００８】（７）（１）〜（６）いずれか一項に記載
の細菌を培地に接種し、該培地中に生成蓄積したＬ−グ
ルタミンを採取することを特徴とするＬ−グルタミンの
製造法。
の細菌を培地に接種し、該培地中に生成蓄積したＬ−グ
ルタミンを採取することを特徴とするＬ−グルタミンの
製造法。
【０００９】（８）下記（Ａ）または（Ｂ）に示すたん
ぱく質をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
たんぱく質。 （Ｂ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ
グルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質。 （９）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである(8)記
載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有す
るたんぱく質をコードするＤＮＡ。 （１０）下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すたんぱく質をコ
ードするＤＮＡ。 （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質 （Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有
するたんぱく質。 （１１）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである(10)
記載のＤＮＡ。 （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列又は同塩基配列から
調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニ
リルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコー
ドするＤＮＡ。
ぱく質をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
たんぱく質。 （Ｂ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ
グルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質。 （９）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである(8)記
載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有す
るたんぱく質をコードするＤＮＡ。 （１０）下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すたんぱく質をコ
ードするＤＮＡ。 （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質 （Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有
するたんぱく質。 （１１）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである(10)
記載のＤＮＡ。 （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列又は同塩基配列から
調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニ
リルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコー
ドするＤＮＡ。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】（１）本発明のコリネ型細菌 本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバ
クテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリ
ウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacter
iol., 41, 255(1981)）、またコリネバクテリウム属と
非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このよ
うなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
クテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリ
ウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacter
iol., 41, 255(1981)）、またコリネバクテリウム属と
非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このよ
うなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１２】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム ブレビバクテリウム・フラバム ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム ブレビバクテリウム・フラバム ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
【００１３】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13
032, ATCC13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FER
M BP-1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067,
AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATC
C6872 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13
032, ATCC13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FER
M BP-1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067,
AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATC
C6872 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
【００１４】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号
が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受け
ることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付
けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託セン
ター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１
番地１ 中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418
株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号
が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受け
ることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付
けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託セン
ター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１
番地１ 中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418
株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダ
ペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１５】本発明において、「Ｌ−グルタミン生産
能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培
地中にＬ−グルタミンを蓄積する能力をいう。このＬ−
グルタミン生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質とし
て有するものであってもよく、育種によって付与または
増強された性質であってもよい。
能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培
地中にＬ−グルタミンを蓄積する能力をいう。このＬ−
グルタミン生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質とし
て有するものであってもよく、育種によって付与または
増強された性質であってもよい。
【００１６】育種によってＬ−グルタミン生産能を付与
または増強するには、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン
耐性を付与する方法（特開平3-232497）、プリンアナロ
グ耐性および／またはメチオニンスルホキサイド耐性を
付与する方法（特開昭61-202694）、α-ケトマロン酸耐
性を付与する方法（特開昭56-151495）、グルタミン酸
を含有するペプチドに耐性を付与する方法（特開平2-18
6994）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有す
るコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が
挙げられる。
または増強するには、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン
耐性を付与する方法（特開平3-232497）、プリンアナロ
グ耐性および／またはメチオニンスルホキサイド耐性を
付与する方法（特開昭61-202694）、α-ケトマロン酸耐
性を付与する方法（特開昭56-151495）、グルタミン酸
を含有するペプチドに耐性を付与する方法（特開平2-18
6994）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有す
るコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が
挙げられる。
【００１７】ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573(FE
RM P-5492) 特開昭56-151495公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205)
特開平2-186994公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特
開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117)
特開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-549
3) 特開昭56-151495公報参照
RM P-5492) 特開昭56-151495公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123)
特開昭61-202694公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205)
特開平2-186994公報参照 ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特
開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117)
特開平3-232497公報参照 コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-549
3) 特開昭56-151495公報参照
【００１８】「細胞内のグルタミンシンテターゼ（以
下、「GS」ともいう）活性が増強された」とは、細胞当
たりのGS活性が野生型のコリネ型細菌のそれよりも高く
なったことをいう。例えば、細胞当たりのGS分子の数が
増加した場合や、GS分子当たりのGS活性が上昇した場合
などが該当する。また、比較対象となる野生型のコリネ
型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・フラバム ATC
C14067である。細胞内のGS活性が増強された結果、培地
中のＬ−グルタミン蓄積量が上昇するという効果や、Ｌ
−グルタミン酸の副生が減少するという効果がある。
下、「GS」ともいう）活性が増強された」とは、細胞当
たりのGS活性が野生型のコリネ型細菌のそれよりも高く
なったことをいう。例えば、細胞当たりのGS分子の数が
増加した場合や、GS分子当たりのGS活性が上昇した場合
などが該当する。また、比較対象となる野生型のコリネ
型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・フラバム ATC
C14067である。細胞内のGS活性が増強された結果、培地
中のＬ−グルタミン蓄積量が上昇するという効果や、Ｌ
−グルタミン酸の副生が減少するという効果がある。
【００１９】コリネ型細菌細胞内のGS活性の増強は、GS
をコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達
成される。例えば、GSをコードする遺伝子断片を、該細
菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベ
クターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−グル
タミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよ
い。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導
入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−グ
ルタミン生産能を付与してもよい。
をコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達
成される。例えば、GSをコードする遺伝子断片を、該細
菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベ
クターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−グル
タミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよ
い。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導
入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−グ
ルタミン生産能を付与してもよい。
【００２０】GS遺伝子は、コリネ型細菌由来の遺伝子お
よびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のい
ずれも使用することができる。このうち、発現の容易さ
の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子が好ましい。
よびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のい
ずれも使用することができる。このうち、発現の容易さ
の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００２１】コリネ型細菌のGSをコードする遺伝子とし
て、既にglnAが明らかにされている(FEMS Microbiology
Letters 81-88, (154) 1997)ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号４お
よび５に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色
体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reac
tion； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (19
89)参照）によって、GS遺伝子を取得することができ
る。他の微生物のGSをコードする遺伝子も、同様にして
取得され得る。
て、既にglnAが明らかにされている(FEMS Microbiology
Letters 81-88, (154) 1997)ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号４お
よび５に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色
体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reac
tion； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (19
89)参照）によって、GS遺伝子を取得することができ
る。他の微生物のGSをコードする遺伝子も、同様にして
取得され得る。
【００２２】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２３】一方、アミノ酸生合成系に関与する酵素に
はアイソザイムが存在することが多い。本発明者らは、
前述のglnA遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コ
リネ型細菌のGSのアイソザイムをコードする遺伝子の単
離およびクローン化に成功した。この遺伝子を「glnA
2」とする。その取得工程は後述する。glnA2も、glnAと
同様に、コリネ型細菌のGS活性の増強に利用することが
できる。
はアイソザイムが存在することが多い。本発明者らは、
前述のglnA遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コ
リネ型細菌のGSのアイソザイムをコードする遺伝子の単
離およびクローン化に成功した。この遺伝子を「glnA
2」とする。その取得工程は後述する。glnA2も、glnAと
同様に、コリネ型細菌のGS活性の増強に利用することが
できる。
【００２４】PCR法により増幅されたGS遺伝子は、エシ
ェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを
調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、
後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内に
おいて自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC1
8、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pAC
YC184, pMW219等が挙げられる。
ェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを
調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、
後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内に
おいて自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC1
8、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pAC
YC184, pMW219等が挙げられる。
【００２５】コリネ型細菌で機能するベクターとは、例
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照 また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ
ドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出
し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入する
と、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律
複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用するこ
とができる。
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照 また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ
ドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出
し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入する
と、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律
複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用するこ
とができる。
【００２６】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛
ルタミクムSR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
【００２７】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２８】GS遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクタ
ーを連結して組換えDNAを調製するには、GS遺伝子の末
端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は
T4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
ーを連結して組換えDNAを調製するには、GS遺伝子の末
端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は
T4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
【００２９】上記のように調製した組換えDNAをコリネ
型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質
転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コ
リＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に
導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質
転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公
報）によっても行うことができる。
型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質
転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コ
リＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に
導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質
転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公
報）によっても行うことができる。
【００３０】GS遺伝子のコピー数を高めることは、GS遺
伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在させ
ることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DN
A上にGS遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上
に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えに
より行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列として
は、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するイ
ンバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開
平2-109985号公報に開示されているように、GS遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA
上に多コピー導入することも可能である。
伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在させ
ることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DN
A上にGS遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上
に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えに
より行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列として
は、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するイ
ンバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開
平2-109985号公報に開示されているように、GS遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA
上に多コピー導入することも可能である。
【００３１】GS活性の増強は、上記の遺伝子増幅による
以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のGS遺伝子の
プロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する
ことによっても達成される。例えば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロ
モーターとして知られている。また、国際公開WO00/189
35に開示されているように、GS遺伝子のプロモーター領
域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変
することも可能である。これらのプロモーター置換また
は改変によりGS遺伝子の発現が強化され、GS活性が増強
される。これら発現調節配列の改変は、GS遺伝子のコピ
ー数を高めることと組み合わせてもよい。
以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のGS遺伝子の
プロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する
ことによっても達成される。例えば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロ
モーターとして知られている。また、国際公開WO00/189
35に開示されているように、GS遺伝子のプロモーター領
域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変
することも可能である。これらのプロモーター置換また
は改変によりGS遺伝子の発現が強化され、GS活性が増強
される。これら発現調節配列の改変は、GS遺伝子のコピ
ー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３２】発現調節配列の置換は、例えば後述の温度
感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行う
ことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドと
しては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公
報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公
報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これら
のプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では
自律複製することができるが、37℃では自律複製できな
い。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を
置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC
4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができ
る。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、19
90年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生
物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市
東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763
として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄
託されている。
感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行う
ことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドと
しては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公
報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公
報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これら
のプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では
自律複製することができるが、37℃では自律複製できな
い。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を
置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC
4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができ
る。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、19
90年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生
物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市
東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763
として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄
託されている。
【００３３】GS活性の増強は、上記のようなGS遺伝子の
発現量を増強する以外に、細胞内のGSのアデニリル化に
よる活性調節が解除されることによっても達成される。
GSは、そのアミノ酸配列中のチロシン残基をアデニリル
化されることにより不活性型に変化する（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 642-649, (58) 1967）（J. Biol. Che
m., 3769-3771, (243) 1968)。したがって、このGSのア
デニリル化を解除することによって、細胞内のGS活性を
増強することができる。ここで、アデニリル化の解除と
は、アデニリル化が実質的に完全に解除されることに加
えて、細胞内のGS活性が増強されるようにアデニリル化
が低減されることを含む。
発現量を増強する以外に、細胞内のGSのアデニリル化に
よる活性調節が解除されることによっても達成される。
GSは、そのアミノ酸配列中のチロシン残基をアデニリル
化されることにより不活性型に変化する（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 642-649, (58) 1967）（J. Biol. Che
m., 3769-3771, (243) 1968)。したがって、このGSのア
デニリル化を解除することによって、細胞内のGS活性を
増強することができる。ここで、アデニリル化の解除と
は、アデニリル化が実質的に完全に解除されることに加
えて、細胞内のGS活性が増強されるようにアデニリル化
が低減されることを含む。
【００３４】GSのアデニリル化は、一般にアデニリルト
ランスフェラーゼによって行われる（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 1703-1710, (58) 1967）。コリネ型細菌
においては、Genebank accession Y13221の配列に示さ
れるglnA遺伝子産物の405位のチロシン残基がアデニリ
ル化されることが示唆されている（FEMS Microbiology
Letters, 303-310,(173)1999）。このチロシン残基を他
のアミノ酸残基に置換するようにglnA遺伝子に変異を導
入することによってGSのアデニリル化による不活性化を
解除できる。
ランスフェラーゼによって行われる（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 1703-1710, (58) 1967）。コリネ型細菌
においては、Genebank accession Y13221の配列に示さ
れるglnA遺伝子産物の405位のチロシン残基がアデニリ
ル化されることが示唆されている（FEMS Microbiology
Letters, 303-310,(173)1999）。このチロシン残基を他
のアミノ酸残基に置換するようにglnA遺伝子に変異を導
入することによってGSのアデニリル化による不活性化を
解除できる。
【００３５】また、細胞内のグルタミンシンテターゼ・
アデニリルトランスフェラーゼ（ATase）の活性を低下
させることによっても、GSのアデニリル化による不活性
化を解除できる。コリネ型細菌のアデニリルトランスフ
ェラーゼは未知であったが、本発明者らは、コリネ型細
菌のアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
glnEの単離に成功した。その工程については後述する。
アデニリルトランスフェラーゼ（ATase）の活性を低下
させることによっても、GSのアデニリル化による不活性
化を解除できる。コリネ型細菌のアデニリルトランスフ
ェラーゼは未知であったが、本発明者らは、コリネ型細
菌のアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
glnEの単離に成功した。その工程については後述する。
【００３６】コリネ型細菌の細胞内のATase活性を低下
させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射または
N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、ATase活性が低下した変異株を
選択する方法が挙げられる。また、ATase活性が低下し
たコリネ型細菌は、変異処理の他に、ATaseをコードす
る遺伝子（glnE）の部分配列を欠失し、正常に機能する
ATaseを産生しないように改変したglnE遺伝子（欠失型g
lnE）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失
型glnEと染色体上のglnEとの間で組換えを起こさせるこ
とにより、染色体上のglnEを破壊することができる。こ
のような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子
破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温
度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などが
ある。
させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射または
N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、ATase活性が低下した変異株を
選択する方法が挙げられる。また、ATase活性が低下し
たコリネ型細菌は、変異処理の他に、ATaseをコードす
る遺伝子（glnE）の部分配列を欠失し、正常に機能する
ATaseを産生しないように改変したglnE遺伝子（欠失型g
lnE）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失
型glnEと染色体上のglnEとの間で組換えを起こさせるこ
とにより、染色体上のglnEを破壊することができる。こ
のような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子
破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温
度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などが
ある。
【００３７】欠失型glnEを、宿主染色体上のglnEと置換
するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性
複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬剤
に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡ
を調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換
し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株
を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養すること
により、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形
質転換株が得られる。
するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性
複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬剤
に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡ
を調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換
し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株
を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養すること
により、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形
質転換株が得られる。
【００３８】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するglnE配列との組
換えを起こし、染色体glnEと欠失型glnEとの融合遺伝子
２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感
受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染
色体に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnEが優性であるので、形質転換株は正常なATaseを
発現する。
れた株は、染色体上にもともと存在するglnE配列との組
換えを起こし、染色体glnEと欠失型glnEとの融合遺伝子
２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感
受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染
色体に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnEが優性であるので、形質転換株は正常なATaseを
発現する。
【００３９】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型glnEのみを
残すために、２個のglnEの組換えにより１コピーのglnE
を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マ
ーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。
その際、正常なglnEが染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型
glnEが切り出される場合と、反対に欠失型glnEが染色体
ＤＮＡ上に残され、正常なglnEが切り出される場合があ
る。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温
度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で
細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能
しない温度で培養すると、プラスミド上のglnEは、プラ
スミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたは
サザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠
失型glnEが残った株を選択することによって、glnEが破
壊された株を取得することができる。
残すために、２個のglnEの組換えにより１コピーのglnE
を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マ
ーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。
その際、正常なglnEが染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型
glnEが切り出される場合と、反対に欠失型glnEが染色体
ＤＮＡ上に残され、正常なglnEが切り出される場合があ
る。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温
度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で
細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能
しない温度で培養すると、プラスミド上のglnEは、プラ
スミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたは
サザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠
失型glnEが残った株を選択することによって、glnEが破
壊された株を取得することができる。
【００４０】また、細胞内のPIIたんぱく質の活性を低
下させることによっても、GSのアデニリル化による不活
性化を解除できる。ATaseによるGSのアデニリル化にはP
IIたんぱく質も関与することが知られている。PIIたん
ぱく質とは、GS活性を調節するためのシグナル伝達たん
ぱく質であり、ウリジリルトランスフェラーゼ(UTase)
によるウリジリル化を受けることが知られている。ウリ
ジリル化されたPIIたんぱく質は、ATaseによるGSの脱ア
デニリル化を促進し、脱ウリジリル化されたPIIたんぱ
く質はATaseによるGSのアデニリル化を促進する。
下させることによっても、GSのアデニリル化による不活
性化を解除できる。ATaseによるGSのアデニリル化にはP
IIたんぱく質も関与することが知られている。PIIたん
ぱく質とは、GS活性を調節するためのシグナル伝達たん
ぱく質であり、ウリジリルトランスフェラーゼ(UTase)
によるウリジリル化を受けることが知られている。ウリ
ジリル化されたPIIたんぱく質は、ATaseによるGSの脱ア
デニリル化を促進し、脱ウリジリル化されたPIIたんぱ
く質はATaseによるGSのアデニリル化を促進する。
【００４１】UTaseの欠損株においてはGSが高度にアデ
ニリル化されることが報告されている（J. Bacteriolog
y, 569-577, (134) 1978）。過剰にアデニリル化される
この表現形は、PIIたんぱく質の変異によって抑制され
る（J.Bacteriology, 816-822,(164)1985）。すなわちP
IIたんぱく質の活性低下によっても、GSのアデニリル化
による不活性化を解除できる。PIIたんぱく質の活性低
下とは、ATaseによるアデニリル化を促進する機能が低
下することをいう。コリネ型細菌のPIIたんぱく質をコ
ードするglnB遺伝子は既に単離されており、その欠失に
よりGSのアデニリル化による抑制が解除されることが示
唆されている（FEMS Microbiology Letters, 303-310,
(173) 1999）。
ニリル化されることが報告されている（J. Bacteriolog
y, 569-577, (134) 1978）。過剰にアデニリル化される
この表現形は、PIIたんぱく質の変異によって抑制され
る（J.Bacteriology, 816-822,(164)1985）。すなわちP
IIたんぱく質の活性低下によっても、GSのアデニリル化
による不活性化を解除できる。PIIたんぱく質の活性低
下とは、ATaseによるアデニリル化を促進する機能が低
下することをいう。コリネ型細菌のPIIたんぱく質をコ
ードするglnB遺伝子は既に単離されており、その欠失に
よりGSのアデニリル化による抑制が解除されることが示
唆されている（FEMS Microbiology Letters, 303-310,
(173) 1999）。
【００４２】コリネ型細菌のPIIたんぱく質の活性を低
下させるためには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射
またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、PIIたんぱく質の活性が低下し
た菌株を選択する方法が挙げられる。また、PIIたんぱ
く質の活性が低下したコリネ型細菌は、変異処理の他
に、PIIたんぱく質をコードする遺伝子glnBの部分配列
を欠失し、正常に機能するPIIたんぱく質を産生しない
ように改変したglnB遺伝子（欠失型glnB遺伝子）を含む
DNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型glnBと染色体
上のglnBとの間で組換えを起こさせることにより、染色
体上のglnBを破壊することができる。このような相同組
換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立
されており、直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製起
点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
下させるためには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射
またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理し、PIIたんぱく質の活性が低下し
た菌株を選択する方法が挙げられる。また、PIIたんぱ
く質の活性が低下したコリネ型細菌は、変異処理の他
に、PIIたんぱく質をコードする遺伝子glnBの部分配列
を欠失し、正常に機能するPIIたんぱく質を産生しない
ように改変したglnB遺伝子（欠失型glnB遺伝子）を含む
DNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型glnBと染色体
上のglnBとの間で組換えを起こさせることにより、染色
体上のglnBを破壊することができる。このような相同組
換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立
されており、直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製起
点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００４３】欠失型glnBを宿主染色体上のglnBと置換す
るためには、例えば以下のようにすればよい。温度感受
性複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬
剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮ
Ａを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転
換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換
株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養するこ
とにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた
形質転換体が得られる。
るためには、例えば以下のようにすればよい。温度感受
性複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬
剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮ
Ａを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転
換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換
株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養するこ
とにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた
形質転換体が得られる。
【００４４】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するglnB配列との組
換えを起こし、染色体glnBと欠失型glnBとの融合遺伝子
２個が組換えDNAの他の部分（ベクター部分、温度感受
性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色
体上に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnBが優性であるので、形質転換体は正常なglnBを発
現する。
れた株は、染色体上にもともと存在するglnB配列との組
換えを起こし、染色体glnBと欠失型glnBとの融合遺伝子
２個が組換えDNAの他の部分（ベクター部分、温度感受
性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色
体上に挿入されている。したがって、この状態では正常
なglnBが優性であるので、形質転換体は正常なglnBを発
現する。
【００４５】次に、染色体DNA上に欠失型glnBのみを残
すために、２個のglnBの組換えにより１コピーのglnB
を、ベクター部分（温度感受性複製起点および薬剤耐性
マーカーを含む）とともに染色体DNAから脱落させる。
その際、正常なglnBが染色体上に残され、欠失型glnBが
切り出される場合と、反対に欠失型glnBが染色体DNA上
に残され、正常なglnBが切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に安
定に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しな
い温度で培養すると、プラスミド上のglnBは、プラスミ
ドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザ
ンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型
glnEが残った株を選択することによって、glnBが破壊さ
れた株を取得することができる。
すために、２個のglnBの組換えにより１コピーのglnB
を、ベクター部分（温度感受性複製起点および薬剤耐性
マーカーを含む）とともに染色体DNAから脱落させる。
その際、正常なglnBが染色体上に残され、欠失型glnBが
切り出される場合と、反対に欠失型glnBが染色体DNA上
に残され、正常なglnBが切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に安
定に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しな
い温度で培養すると、プラスミド上のglnBは、プラスミ
ドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザ
ンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型
glnEが残った株を選択することによって、glnBが破壊さ
れた株を取得することができる。
【００４６】GSのアデニリル化の解除は、上記のアデニ
リル化を受けないようなGSの変異、ATaseの活性低下、
及びPIIたんぱく質の活性低下から選ばれる２つ、又は
３つの手段を組み合わせることよっても、達成すること
ができる。
リル化を受けないようなGSの変異、ATaseの活性低下、
及びPIIたんぱく質の活性低下から選ばれる２つ、又は
３つの手段を組み合わせることよっても、達成すること
ができる。
【００４７】GS活性の増強は、上述のようなATaseによ
るGSのアデニリル化の解除によっても可能であるが、前
述のGS遺伝子のコピー数を高める手段や、発現調節配列
の改変をする手段と組み合わせて行ってもよい。
るGSのアデニリル化の解除によっても可能であるが、前
述のGS遺伝子のコピー数を高める手段や、発現調節配列
の改変をする手段と組み合わせて行ってもよい。
【００４８】本発明のコリネ型細菌を用いてＬ−グルタ
ミンを効率よく生産するには、GS活性と同時にグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）活性
が高められた菌株を用いるのが好ましい。
ミンを効率よく生産するには、GS活性と同時にグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）活性
が高められた菌株を用いるのが好ましい。
【００４９】「細胞内のGDH活性が増強された」とは、
細胞当たりのGDH活性が野生型のコリネ型細菌のそれよ
りも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのGDH
分子の数が増加した場合や、GDH分子当たりのGDH活性が
上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野
生型のコリネ型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・
フラバム ATCC14067である。細胞内のGDH活性が増強さ
れた結果、Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌
の培養時間が短縮されるという効果がある。
細胞当たりのGDH活性が野生型のコリネ型細菌のそれよ
りも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのGDH
分子の数が増加した場合や、GDH分子当たりのGDH活性が
上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野
生型のコリネ型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・
フラバム ATCC14067である。細胞内のGDH活性が増強さ
れた結果、Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌
の培養時間が短縮されるという効果がある。
【００５０】コリネ型細菌細胞内のGDH活性の増強は、G
DHをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって
達成される。例えば、GDHをコードする遺伝子断片を、
該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型
のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−
グルタミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すれ
ばよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNA
を導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ
−グルタミン生産能を付与してもよい。
DHをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって
達成される。例えば、GDHをコードする遺伝子断片を、
該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型
のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−
グルタミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すれ
ばよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNA
を導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ
−グルタミン生産能を付与してもよい。
【００５１】GDHをコードする遺伝子は、コリネ型細菌
の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の
生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。発
現容易の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子を用い
ることが好ましい。
の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の
生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。発
現容易の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子を用い
ることが好ましい。
【００５２】コリネ型細菌のGDHをコードする遺伝子（g
dh遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（Mo
lecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）ので、
その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配
列表配列番号12及び13に示すプライマーを用いて、コリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、
gdh遺伝子を取得することができる。コリネ型細菌等の
他の微生物のGDHをコードする遺伝子も、同様にして取
得され得る。gdhのコリネ型細菌への導入は、前記のGS
遺伝子と同様にして行うことができる。
dh遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（Mo
lecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）ので、
その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配
列表配列番号12及び13に示すプライマーを用いて、コリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、
gdh遺伝子を取得することができる。コリネ型細菌等の
他の微生物のGDHをコードする遺伝子も、同様にして取
得され得る。gdhのコリネ型細菌への導入は、前記のGS
遺伝子と同様にして行うことができる。
【００５３】また、本発明のコリネ型細菌は、GSおよび
GDH以外のＬ−グルタミン生合成を触媒する酵素の活性
が増強されていてもよい。例えばグルタミン生合成を触
媒する酵素としては、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ等がある。
GDH以外のＬ−グルタミン生合成を触媒する酵素の活性
が増強されていてもよい。例えばグルタミン生合成を触
媒する酵素としては、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ等がある。
【００５４】さらに、Ｌ−グルタミンの生合成経路から
分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を
触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。
このような反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸
リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒロゲナーゼ、グルタ
ミン酸シンターゼ等が挙げられる。
分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を
触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。
このような反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸
リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒロゲナーゼ、グルタ
ミン酸シンターゼ等が挙げられる。
【００５５】（２）本発明の微生物を用いたＬ−グルタ
ミンの生産 上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養
し、該培地中にＬ−グルタミンを生成蓄積せしめ、該培
地からＬ−グルタミンを採取することにより、Ｌ−グル
タミンを効率よく製造することができ、かつ、Ｌ−グル
タミン酸の副生を抑制することができる。
ミンの生産 上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養
し、該培地中にＬ−グルタミンを生成蓄積せしめ、該培
地からＬ−グルタミンを採取することにより、Ｌ−グル
タミンを効率よく製造することができ、かつ、Ｌ−グル
タミン酸の副生を抑制することができる。
【００５６】本発明のコリネ型細菌を用いてＬ−グルタ
ミンを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて常法により行うことがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌
株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いても
よい。
ミンを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて常法により行うことがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌
株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いても
よい。
【００５７】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。
【００５８】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
【００５９】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
【００６０】無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培
養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウ
ムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和す
る。かくして10時間〜120時間程度培養することによ
り、培養液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培
養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウ
ムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和す
る。かくして10時間〜120時間程度培養することによ
り、培養液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
【００６１】培養終了後の培養液からＬ−グルタミンを
採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。
例えば、培養液から菌体を除去した後に、濃縮晶析する
ことによって採取される。
採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。
例えば、培養液から菌体を除去した後に、濃縮晶析する
ことによって採取される。
【００６２】（３）本発明のグルタミンシンテターゼ活
性を有するたんぱく質をコードするDNA（glnA2遺伝子）
および、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランス
フェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA（g
lnE遺伝子）
性を有するたんぱく質をコードするDNA（glnA2遺伝子）
および、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランス
フェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA（g
lnE遺伝子）
【００６３】本発明の第一のＤＮＡは、GSをコードする
遺伝子である。また、本発明の第二のＤＮＡは、ATase
をコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、公知の
glnA遺伝子の部分断片をプローブとするハイブリダイゼ
ーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの染色体ＤＮＡライリブラリーから取得するこ
ともできる。公知のglnA遺伝子の部分断片は、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム、例えばブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体
ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１８および１９に示すプ
ライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅することによっ
て取得される。
遺伝子である。また、本発明の第二のＤＮＡは、ATase
をコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、公知の
glnA遺伝子の部分断片をプローブとするハイブリダイゼ
ーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの染色体ＤＮＡライリブラリーから取得するこ
ともできる。公知のglnA遺伝子の部分断片は、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム、例えばブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体
ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１８および１９に示すプ
ライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅することによっ
て取得される。
【００６４】本発明のＤＮＡの取得、及び、前記のGS活
性及びGDH活性の増強に際して、ゲノムＤＮＡライブラ
リーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラス
ミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等
の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,
T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1.21 (1989)に記載されている。
性及びGDH活性の増強に際して、ゲノムＤＮＡライブラ
リーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラス
ミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等
の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,
T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1.21 (1989)に記載されている。
【００６５】上記プライマーの塩基配列は、それぞれコ
リネバクテリウム・グルタミカムのglnA遺伝子（GenBan
k ACCESSION Y13221）の塩基配列に基づいて設計された
ものであり、これらのプライマーを用いれば、glnA遺伝
子（GenBank ACCESSION Y13221）の塩基番号1921〜2282
に相当する領域を含むＤＮＡ断片が得られる。
リネバクテリウム・グルタミカムのglnA遺伝子（GenBan
k ACCESSION Y13221）の塩基配列に基づいて設計された
ものであり、これらのプライマーを用いれば、glnA遺伝
子（GenBank ACCESSION Y13221）の塩基番号1921〜2282
に相当する領域を含むＤＮＡ断片が得られる。
【００６６】上記のようにして得られる本発明のglnA2
を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得
るアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。また、glnA
2がコードするグルタミンシンテターゼ活性を有するた
んぱく質のアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得
るアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。また、glnA
2がコードするグルタミンシンテターゼ活性を有するた
んぱく質のアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００６７】また、前記のＤＮＡ断片中には、glnA2遺
伝子のＯＲＦのすぐ下流に別のＯＲＦが見出された。既
知の配列との相同性比較の結果、当該ＯＲＦはグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質（ATase）をコードする遺伝子（gln
E）であると予想された。ATase活性を有するたんぱく質
のアミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
伝子のＯＲＦのすぐ下流に別のＯＲＦが見出された。既
知の配列との相同性比較の結果、当該ＯＲＦはグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質（ATase）をコードする遺伝子（gln
E）であると予想された。ATase活性を有するたんぱく質
のアミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
【００６８】本発明のglnA2又はglnEを含むＤＮＡ断片
は、本発明によりその塩基配列が明らかになったので、
同塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたPCR
法により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の染色体ＤＮＡから単離することができる。
は、本発明によりその塩基配列が明らかになったので、
同塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたPCR
法により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００６９】本発明の第一のＤＮＡは、コードされるた
んぱく質のグルタミンシンテターゼ活性が損なわれない
限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミ
ノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタ
ミンシンテターゼをコードするものであってもよい。こ
こで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱく質の立体
構造における位置や種類によっても異なるが、具体的に
は２から９０個、好ましくは、２から５０個、より好ま
しくは２から２０個である。
んぱく質のグルタミンシンテターゼ活性が損なわれない
限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミ
ノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタ
ミンシンテターゼをコードするものであってもよい。こ
こで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱく質の立体
構造における位置や種類によっても異なるが、具体的に
は２から９０個、好ましくは、２から５０個、より好ま
しくは２から２０個である。
【００７０】本発明の第二のＤＮＡは、コードされるた
んぱく質のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトラン
スフェラーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数
の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むグルタミンシンテターゼ・ア
デニリルトランスフェラーゼをコードするものであって
もよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱ
く質の立体構造における位置や種類によっても異なる
が、具体的には２から３５０個、好ましくは、２から５
０個、より好ましくは２から２０個である。グルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性を
損なう場合においても、相同組換えを起こす限り本発明
に含まれる。
んぱく質のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトラン
スフェラーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数
の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むグルタミンシンテターゼ・ア
デニリルトランスフェラーゼをコードするものであって
もよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱ
く質の立体構造における位置や種類によっても異なる
が、具体的には２から３５０個、好ましくは、２から５
０個、より好ましくは２から２０個である。グルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性を
損なう場合においても、相同組換えを起こす限り本発明
に含まれる。
【００７１】上記のようなGS又はATaseと実質的に同一
のたんぱく質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的
変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むように、glnA2又はgln
Eの塩基配列を改変することによって得られる。また、
上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変
異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変
異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ
処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生
物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理する方法が挙げられる。
のたんぱく質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的
変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むように、glnA2又はgln
Eの塩基配列を改変することによって得られる。また、
上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変
異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変
異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ
処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生
物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理する方法が挙げられる。
【００７２】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることによ
り、グルタミンシンテターゼ、または、グルタミンシン
テターゼ・アデニリルトランスフェラーゼと実質的に同
一のたんぱく質をコードするＤＮＡが得られる。また、
変異を有するグルタミンシンテターゼ、もしくは、グル
タミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例え
ば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号
659〜1996または2066〜5200からなる塩基配列又はその
一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、グルタミンシンテターゼ活性を
有するたんぱく質をコードするDNA、または、グルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、GS又はATaseと実質的に同一のたんぱく質を
コードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５
０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％
ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
に相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられ
る。
な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることによ
り、グルタミンシンテターゼ、または、グルタミンシン
テターゼ・アデニリルトランスフェラーゼと実質的に同
一のたんぱく質をコードするＤＮＡが得られる。また、
変異を有するグルタミンシンテターゼ、もしくは、グル
タミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例え
ば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号
659〜1996または2066〜5200からなる塩基配列又はその
一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、グルタミンシンテターゼ活性を
有するたんぱく質をコードするDNA、または、グルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を
有するたんぱく質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、GS又はATaseと実質的に同一のたんぱく質を
コードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５
０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％
ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
に相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられ
る。
【００７３】プローブとして、配列番号１の塩基配列の
一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブ
は、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を
含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製するこ
とができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さの
ＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーション
の洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
が挙げられる。
一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブ
は、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を
含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製するこ
とができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さの
ＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーション
の洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
が挙げられる。
【００７４】上記のような条件でハイブリダイズする遺
伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、
活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、
それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグ
ルタミンシンテターゼ活性、または、グルタミンシンテ
ターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を、例えば
グルタミンシンテターゼ活性についてはMethods in Enz
ymology, Vol.XVIIA,910-915, ACADEMIC PRESS (1970)
記載の方法で、グルタミンシンテターゼ・アデニリルト
ランスフェラーゼ活性についてはMethods in Enzymolog
y Vol.XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970)記載の
方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別す
ることができる。活性が低下あるいは欠失したグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコー
ドするＤＮＡも本発明においては利用可能である。
伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、
活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、
それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグ
ルタミンシンテターゼ活性、または、グルタミンシンテ
ターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を、例えば
グルタミンシンテターゼ活性についてはMethods in Enz
ymology, Vol.XVIIA,910-915, ACADEMIC PRESS (1970)
記載の方法で、グルタミンシンテターゼ・アデニリルト
ランスフェラーゼ活性についてはMethods in Enzymolog
y Vol.XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970)記載の
方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別す
ることができる。活性が低下あるいは欠失したグルタミ
ンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコー
ドするＤＮＡも本発明においては利用可能である。
【００７５】GSと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡとして具体的には、配列番号２に示すアミノ酸
配列と、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、
さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつGS活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
また、ATaseと実質的に同一のタンパク質をコードする
ＤＮＡとして具体的には、配列番号３に示すアミノ酸配
列と、好ましくは65%以上、より好ましくは80%以上、さ
らに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつATase活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
るＤＮＡとして具体的には、配列番号２に示すアミノ酸
配列と、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、
さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつGS活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
また、ATaseと実質的に同一のタンパク質をコードする
ＤＮＡとして具体的には、配列番号３に示すアミノ酸配
列と、好ましくは65%以上、より好ましくは80%以上、さ
らに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつATase活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００７６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００７７】
【実施例１】GS遺伝子増幅株の評価 （１）コリネ型細菌のglnA遺伝子のクローニング コリネバクテリウム・グルタミカムのglnA配列は既に明
らかにされている(FEMS Microbiology Letters 81-88,
(154) 1997)。報告されている塩基配列に基づいて、配
列表配列番号４および５に示すプライマーを合成し、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型にしてPCR法によりglnA断片を増幅した。
らかにされている(FEMS Microbiology Letters 81-88,
(154) 1997)。報告されている塩基配列に基づいて、配
列表配列番号４および５に示すプライマーを合成し、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型にしてPCR法によりglnA断片を増幅した。
【００７８】ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067
株の染色体DNAの調製は、BacterialGenome DNA Purific
ation Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用
いて行った。また、PCR反応は、Pyrobest DNA Polymera
se（宝酒造）を用い、変性94℃ 30秒、会合55℃ 15秒、
伸長72℃ 2分の条件で30サイクル行った。
株の染色体DNAの調製は、BacterialGenome DNA Purific
ation Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用
いて行った。また、PCR反応は、Pyrobest DNA Polymera
se（宝酒造）を用い、変性94℃ 30秒、会合55℃ 15秒、
伸長72℃ 2分の条件で30サイクル行った。
【００７９】生成したPCR産物を常法により精製後、制
限酵素SalIで切断し、SalIで切断したpMW219（ニッポン
ジーン）とライゲーションキット（宝酒造）を用いて連
結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセ
ル（宝酒造）を形質転換し、IPTG 10μg/ml, X-Gal 40
μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むＬ培地に塗布
し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。
限酵素SalIで切断し、SalIで切断したpMW219（ニッポン
ジーン）とライゲーションキット（宝酒造）を用いて連
結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセ
ル（宝酒造）を形質転換し、IPTG 10μg/ml, X-Gal 40
μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むＬ培地に塗布
し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。
【００８０】形質転換体からアルカリ法によりプラスミ
ドを調製した後、ベクターにglnA遺伝子が挿入されてい
るプラスミドをpMW219GSと名付けた。
ドを調製した後、ベクターにglnA遺伝子が挿入されてい
るプラスミドをpMW219GSと名付けた。
【００８１】（２）glnAとコリネ型細菌の複製起点を有
するプラスミドの構築 さらに、glnA遺伝子とコリネ型細菌の複製起点を有する
プラスミドを構築するために、既に取得されているコリ
ネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric.
Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点
を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号公報参照）を制
限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺
伝子断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キッ
ト（宝酒造）を用い平滑末端化した後、KpnIリンカー
（宝酒造）を用いてpMW219GSのKpnI部位に挿入した。本
プラスミドをpGSと名付けた。
するプラスミドの構築 さらに、glnA遺伝子とコリネ型細菌の複製起点を有する
プラスミドを構築するために、既に取得されているコリ
ネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric.
Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点
を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号公報参照）を制
限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺
伝子断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キッ
ト（宝酒造）を用い平滑末端化した後、KpnIリンカー
（宝酒造）を用いてpMW219GSのKpnI部位に挿入した。本
プラスミドをpGSと名付けた。
【００８２】（３）コリネ型細菌へのpGSの導入と培養
評価 Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ
12418（FERM BP-2205：特開平2-186994号公報参照）を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpGSで形質転換し、形質転換体を得た。得られた
形質転換体AJ12418/pGSを用いてＬ−グルタミン生産の
ための培養を以下のように行った。
評価 Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ
12418（FERM BP-2205：特開平2-186994号公報参照）を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpGSで形質転換し、形質転換体を得た。得られた
形質転換体AJ12418/pGSを用いてＬ−グルタミン生産の
ための培養を以下のように行った。
【００８３】25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレー
ト培地にて培養して得たAJ12418/pGS株の菌体を、グル
コース100ｇ、(NH4)2SO4 60g、KH2PO4 2.5g、MgSO4・7H2
O 0.4g、FeSO4・7H2O 0.01g、VB1-HCl 350μg、ビオチン
4μg、大豆加水分解物200mg、CaCO3 50gを純水1Lに含む
培地（NaOHでpH6.8に調整されている）に接種し、31.5
℃にて培地中の糖が消費されるまでしんとう培養した。
ト培地にて培養して得たAJ12418/pGS株の菌体を、グル
コース100ｇ、(NH4)2SO4 60g、KH2PO4 2.5g、MgSO4・7H2
O 0.4g、FeSO4・7H2O 0.01g、VB1-HCl 350μg、ビオチン
4μg、大豆加水分解物200mg、CaCO3 50gを純水1Lに含む
培地（NaOHでpH6.8に調整されている）に接種し、31.5
℃にて培地中の糖が消費されるまでしんとう培養した。
【００８４】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン蓄
積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラ
フィーにより分析した。カラムはCAPCELL PAK C18（資
生堂）を用い、サンプルは0.095％リン酸、3.3mMヘプタ
ンスルホン酸、5%アセトニトリルを蒸留水１Ｌに含む溶
離液で溶出し、210nMの吸光度の変化によりＬ−グルタ
ミン蓄積量を分析した。このときの結果を表１に示し
た。
積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラ
フィーにより分析した。カラムはCAPCELL PAK C18（資
生堂）を用い、サンプルは0.095％リン酸、3.3mMヘプタ
ンスルホン酸、5%アセトニトリルを蒸留水１Ｌに含む溶
離液で溶出し、210nMの吸光度の変化によりＬ−グルタ
ミン蓄積量を分析した。このときの結果を表１に示し
た。
【００８５】
【表１】 表１ ──────────────────────────── 菌株 L-Gln(g/L) L-Glu(g/L) 培養時間(hr) ──────────────────────────── AJ12418 38.4 0.7 70 AJ12418/pGS 45.1 0.02 82 ────────────────────────────
【００８６】pGS導入株ではＬ−グルタミン（L-Gln）の
蓄積が顕著に向上し、またＬ−グルタミン酸（L-Glu）
の副生が大幅に抑制された。これらの結果から、Ｌ−グ
ルタミンの生産において、GSの増強が収量の向上に有効
であることが示された。なお、GSの酵素活性のデータ
は、実施例２の表２に示した。
蓄積が顕著に向上し、またＬ−グルタミン酸（L-Glu）
の副生が大幅に抑制された。これらの結果から、Ｌ−グ
ルタミンの生産において、GSの増強が収量の向上に有効
であることが示された。なお、GSの酵素活性のデータ
は、実施例２の表２に示した。
【００８７】
【実施例２】GSアデニリル化部位改変株の評価 （１）アデニリル化部位改変プラスミドの構築 コリネ型細菌のglnA遺伝子産物のアデニリル化部位は、
既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters,
303-310,(173)1999）。そこで、アデニリル化部位が改
変されたglnA遺伝子で、染色体上のglnA遺伝子とを置換
することにより、アデニリル化部位改変株の取得を行っ
た。具体的な方法を以下に記す。
既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters,
303-310,(173)1999）。そこで、アデニリル化部位が改
変されたglnA遺伝子で、染色体上のglnA遺伝子とを置換
することにより、アデニリル化部位改変株の取得を行っ
た。具体的な方法を以下に記す。
【００８８】まずブレビバクテリウム・フラバムATCC14
067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号６と７
の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnA遺伝子N
末端側の増幅産物を得た。一方、glnA遺伝子C末端側の
増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号
８と９の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列
表配列番号７と８にはミスマッチが導入されているの
で、これらの増幅産物の末端には変異が導入される。次
に、変異が導入されたglnA遺伝子断片を得るために、上
記glnA N末側およびC末側の遺伝子産物を、それぞれほ
ぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表
配列番号１０と１１の合成DNAをプライマーとしてPCRを
行い、アデニリル化部位に変異導入されたglnA遺伝子増
幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後、H
incIIで消化し、pHSG299（宝酒造）のHincII部位に挿入
した。このプラスミドをpGSAと名付けた。
067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号６と７
の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnA遺伝子N
末端側の増幅産物を得た。一方、glnA遺伝子C末端側の
増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号
８と９の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列
表配列番号７と８にはミスマッチが導入されているの
で、これらの増幅産物の末端には変異が導入される。次
に、変異が導入されたglnA遺伝子断片を得るために、上
記glnA N末側およびC末側の遺伝子産物を、それぞれほ
ぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表
配列番号１０と１１の合成DNAをプライマーとしてPCRを
行い、アデニリル化部位に変異導入されたglnA遺伝子増
幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後、H
incIIで消化し、pHSG299（宝酒造）のHincII部位に挿入
した。このプラスミドをpGSAと名付けた。
【００８９】（２）アデニリル化部位改変株の構築と培
養評価 上述のpGSAは、コリネ型細菌の細胞内で自律複製可能と
する領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌
を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミ
ドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転
換体として出現する。
養評価 上述のpGSAは、コリネ型細菌の細胞内で自律複製可能と
する領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌
を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミ
ドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転
換体として出現する。
【００９０】Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム
・フラバムAJ12418を電気パルス法（特開平2-207791号
公報参照）により高濃度のプラスミドpGSAを用いて形質
転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を得
た。次にこれらの形質転換体を継代培養し、カナマイシ
ン感受性となった株を取得した。さらに、カナマイシン
感受性株のglnA遺伝子の配列を決定し、その配列中のア
デニリル化部位がpGSA由来のglnAのその領域と置換され
たものをQA-1と名付けた。AJ12418、AJ12418/pGS、QA-1
株を用いて、Ｌ−グルタミン生産のための培養を実施例
１（３）記載の方法と同様にして行った。その結果を表
２に示した。
・フラバムAJ12418を電気パルス法（特開平2-207791号
公報参照）により高濃度のプラスミドpGSAを用いて形質
転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を得
た。次にこれらの形質転換体を継代培養し、カナマイシ
ン感受性となった株を取得した。さらに、カナマイシン
感受性株のglnA遺伝子の配列を決定し、その配列中のア
デニリル化部位がpGSA由来のglnAのその領域と置換され
たものをQA-1と名付けた。AJ12418、AJ12418/pGS、QA-1
株を用いて、Ｌ−グルタミン生産のための培養を実施例
１（３）記載の方法と同様にして行った。その結果を表
２に示した。
【００９１】
【表２】 表２ ──────────────────────────── 菌株 L-Gln(g/L) GS活性(U/mg) 培養時間(hr) ──────────────────────────── AJ12418 39.0 0.030 70 AJ12418/pGS 46.1 0.067 81 QA-1 44.3 0.040 72 ────────────────────────────
【００９２】QA-1株ではAJ12418に比べ、Ｌ−グルタミ
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても、表２に示した。GS活性は、
Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.7
0, No.3, 182-184, 1990に記載の方法を参考とし、イミ
ダゾール-HCl(pH7.0)100mM, NH4Cl 0.1mM, MnCl2 1mM,
ホスホエノールピルビン酸1mM, NADH 0.3mM, ラクテー
トデヒドロゲナーゼ10U, ピルビン酸キナーゼ25U, ATP
1mM, MSG 10mMを含む溶液に、粗酵素液を加え、30℃に
おける340nMの吸光度変化を測定することによって測定
した。ブランクの測定には、上記反応液よりMSGを除い
たものを用いた。粗酵素液は、上記の培養液より遠心分
離により菌体を分離し、イミダゾール-HCl(pH7.0)100mM
で洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去
することにより、調製した。粗酵素液のたんぱく質濃度
は、牛血清アルブミンを標準試料として、ProteinAssay
（Bio-Rad）を用いて定量した。
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても、表２に示した。GS活性は、
Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.7
0, No.3, 182-184, 1990に記載の方法を参考とし、イミ
ダゾール-HCl(pH7.0)100mM, NH4Cl 0.1mM, MnCl2 1mM,
ホスホエノールピルビン酸1mM, NADH 0.3mM, ラクテー
トデヒドロゲナーゼ10U, ピルビン酸キナーゼ25U, ATP
1mM, MSG 10mMを含む溶液に、粗酵素液を加え、30℃に
おける340nMの吸光度変化を測定することによって測定
した。ブランクの測定には、上記反応液よりMSGを除い
たものを用いた。粗酵素液は、上記の培養液より遠心分
離により菌体を分離し、イミダゾール-HCl(pH7.0)100mM
で洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去
することにより、調製した。粗酵素液のたんぱく質濃度
は、牛血清アルブミンを標準試料として、ProteinAssay
（Bio-Rad）を用いて定量した。
【００９３】
【実施例３】GDH遺伝子増幅株の評価 （１）gdh増幅株の構築と培養評価 コリネ型細菌のgdh遺伝子がクローニングされたプラス
ミドpGDHの構築は、以下のように行った。まずブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色
体DNAを抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１
２と１３の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行っ
た。得られたDNA断片を平滑末端化し、これをpHSG399
（宝酒造）のSmaI部位に挿入した。このプラスミドをpH
SG399GDHと名付けた。
ミドpGDHの構築は、以下のように行った。まずブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色
体DNAを抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１
２と１３の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行っ
た。得られたDNA断片を平滑末端化し、これをpHSG399
（宝酒造）のSmaI部位に挿入した。このプラスミドをpH
SG399GDHと名付けた。
【００９４】次に、pHSG399GDHのSalI部位に、コリネ型
細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric. Biol.
Chem., 48, 2901-2903 (1984))由来の複製起点を導入
した。具体的には、前述のpHK4を制限酵素BamHIおよびK
pnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、
得られた断片を平滑末端化した後、SalIリンカー（宝酒
造）を用いてpHSG399GDHのSalI部位に挿入した。本プラ
スミドをpGDHと名付けた。
細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric. Biol.
Chem., 48, 2901-2903 (1984))由来の複製起点を導入
した。具体的には、前述のpHK4を制限酵素BamHIおよびK
pnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、
得られた断片を平滑末端化した後、SalIリンカー（宝酒
造）を用いてpHSG399GDHのSalI部位に挿入した。本プラ
スミドをpGDHと名付けた。
【００９５】Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム
・フラバムAJ12418株をpGDHで形質転換し、形質転換体
を得た。得られた形質転換体AJ12418/pGDHを用いて、Ｌ
−グルタミン生産のための培養を実施例１記載の方法で
行った。その結果を表３に示した。GDH増強株ではＬ−
グルタミンの収量が減少し、Ｌ−グルタミン酸の副生が
増加したが、培養時間は大幅に短縮された。
・フラバムAJ12418株をpGDHで形質転換し、形質転換体
を得た。得られた形質転換体AJ12418/pGDHを用いて、Ｌ
−グルタミン生産のための培養を実施例１記載の方法で
行った。その結果を表３に示した。GDH増強株ではＬ−
グルタミンの収量が減少し、Ｌ−グルタミン酸の副生が
増加したが、培養時間は大幅に短縮された。
【００９６】
【表３】 表３ ──────────────────────────── 菌株 L-Gln(g/L) L-Glu(g/L) 培養時間(hr) ──────────────────────────── AJ12418 38.8 0.7 70 AJ12418/pGDH 29.5 12.0 55 ────────────────────────────
【００９７】
【実施例４】GSおよびGDHを同時に増強した株の構築と
評価 （１）gdhプロモーター改変プラスミドの構築 ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNA
を抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１４と１
５の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行った。得ら
れたDNA断片を制限酵素StuI、PvuIIで切断し、これをpH
SG399のSmaI部位に挿入した。このプラスミドを制限酵
素SacIで処理することによりgdhプロモーターおよびgdh
遺伝子の部分断片を含むDNA断片を取得し、pKF19k（宝
酒造）のSacI部位に挿入した。このプラスミドをpKF19G
DHと名付けた。
評価 （１）gdhプロモーター改変プラスミドの構築 ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNA
を抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１４と１
５の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行った。得ら
れたDNA断片を制限酵素StuI、PvuIIで切断し、これをpH
SG399のSmaI部位に挿入した。このプラスミドを制限酵
素SacIで処理することによりgdhプロモーターおよびgdh
遺伝子の部分断片を含むDNA断片を取得し、pKF19k（宝
酒造）のSacI部位に挿入した。このプラスミドをpKF19G
DHと名付けた。
【００９８】プロモーター領域への変異の導入には、Mu
tan-Super Express Km（宝酒造）を用いた。pkF19GDHを
鋳型として、Mutan-super Express Km添付のセレクショ
ンプライマーと変異導入用のプライマーとして配列表配
列番号１６又は１７の5'末端リン酸化合成DNAを添加し
て、LA-PCRを行った。反応産物はエタノール沈殿により
精製した後、これを用いてエシェリヒア・コリJM109の
コンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、形質転換体
を得た。
tan-Super Express Km（宝酒造）を用いた。pkF19GDHを
鋳型として、Mutan-super Express Km添付のセレクショ
ンプライマーと変異導入用のプライマーとして配列表配
列番号１６又は１７の5'末端リン酸化合成DNAを添加し
て、LA-PCRを行った。反応産物はエタノール沈殿により
精製した後、これを用いてエシェリヒア・コリJM109の
コンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、形質転換体
を得た。
【００９９】形質転換体よりプラスミドを抽出し、gdh
プロモーター領域の配列を決定した。このうち、表４に
示す配列を有していたものを、pKF19GDH1, pKF19GDH4と
命名した。gdhプロモーター配列をpKF19GDH1型に置換す
ることにより、GDH活性は野生型のプロモーターを有す
るgdhに比べ約３倍、pKF19GDH4型に置換することにより
GDH活性は約５倍に向上させることができると予想され
る（国際公開WO00/18935参照）。
プロモーター領域の配列を決定した。このうち、表４に
示す配列を有していたものを、pKF19GDH1, pKF19GDH4と
命名した。gdhプロモーター配列をpKF19GDH1型に置換す
ることにより、GDH活性は野生型のプロモーターを有す
るgdhに比べ約３倍、pKF19GDH4型に置換することにより
GDH活性は約５倍に向上させることができると予想され
る（国際公開WO00/18935参照）。
【０１００】これらのプラスミドを制限酵素SacIで切断
し、gdhプロモーターおよびgdh遺伝子の部分断片を含む
DNA断片を取得し、pSFKT2（特開2000-262288号公報参
照）のSacI部位に挿入した。これらのプラスミドを、そ
れぞれpSFKTGDH1、pSFKTGDH4と名付けた。pSFKT2は、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株
由来のプラスミドpAM330の誘導体であり、コリネ型細菌
中での自律複製が温度感受性となっているプラスミドで
ある。
し、gdhプロモーターおよびgdh遺伝子の部分断片を含む
DNA断片を取得し、pSFKT2（特開2000-262288号公報参
照）のSacI部位に挿入した。これらのプラスミドを、そ
れぞれpSFKTGDH1、pSFKTGDH4と名付けた。pSFKT2は、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株
由来のプラスミドpAM330の誘導体であり、コリネ型細菌
中での自律複製が温度感受性となっているプラスミドで
ある。
【０１０１】
【表４】 表４ ─────────────────────────────── プラスミド gdhプロモーター配列 ─────────────────────────────── pKF19GDH TGGTCAtatctgtgcgacgctgcCATAAT（配列番号20） pKF19GDH1 TGGTCAtatctgtgcgacgctgcTATAAT（配列番号21） pKF19GDH4 TTGCCAtatctgtgcgacgctgcTATAAT（配列番号22） ───────────────────────────────
【０１０２】（２）gdhプロモーター変異の染色体への
導入 染色体上のgdhプロモーター配列への変異の導入は、以
下のようにして行った。まず、QA-1株を電気パルス法に
よりプラスミドpSFKTGDH1、pSFKTGDH4で形質転換し、そ
れぞれ形質転換体を得た。なお、形質転換後の培養は25
℃で行った。次に、これらの形質転換体を34℃で培養
し、34℃においてカナマイシン耐性を示す株を選択し
た。上記プラスミドは34℃では自律複製できないため
に、相同組換えにより、染色体にこれらのプラスミドが
組み込まれたもののみが、カナマイシン耐性を示す。さ
らに、これらのプラスミドが染色体上に組み込まれた株
をカナマイシン非存在下で培養し、カナマイシン感受性
となった株を選択し、そのうち染色体上のgdhプロモー
ター領域にpSFKTGDH1, pSFKTGDH4と同じ変異が導入され
た株をぞれぞれQB-1、QB-4と命名した。
導入 染色体上のgdhプロモーター配列への変異の導入は、以
下のようにして行った。まず、QA-1株を電気パルス法に
よりプラスミドpSFKTGDH1、pSFKTGDH4で形質転換し、そ
れぞれ形質転換体を得た。なお、形質転換後の培養は25
℃で行った。次に、これらの形質転換体を34℃で培養
し、34℃においてカナマイシン耐性を示す株を選択し
た。上記プラスミドは34℃では自律複製できないため
に、相同組換えにより、染色体にこれらのプラスミドが
組み込まれたもののみが、カナマイシン耐性を示す。さ
らに、これらのプラスミドが染色体上に組み込まれた株
をカナマイシン非存在下で培養し、カナマイシン感受性
となった株を選択し、そのうち染色体上のgdhプロモー
ター領域にpSFKTGDH1, pSFKTGDH4と同じ変異が導入され
た株をぞれぞれQB-1、QB-4と命名した。
【０１０３】（３）gdh遺伝子増幅株の構築とGDH活性の
測定 Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムQA
-1株を、実施例３（２）記載のプラスミドpGDHで形質転
換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体QA-1/pGD
Hを用いてＬ−グルタミン生産のための培養を実施例１
記載の方法で行った。また、GDH活性についてはMol. Mi
crobiology, 317-326(6) 1992を参考とし、Tris-HCl(pH
7.5)100mM, NH4Cl 20mM, α-ケトグルタル酸10mM, NADP
H 0.25mMを含む溶液に粗酵素液を加え、340nMにおける
吸光度の変化を測定することによって測定した。粗酵素
液は、上記の培養液より遠心分離により菌体を分離し、
Tris-HCl(pH7.5)100mMで洗浄後、超音波破砕し、未破砕
菌体を遠心分離で除去することにより調製した。粗酵素
液のたん白質濃度は牛血清アルブミンを標準試料とし
て、Protein Assay（Bio-Rad）を用いて定量した。その
結果を表５に示した。
測定 Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムQA
-1株を、実施例３（２）記載のプラスミドpGDHで形質転
換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体QA-1/pGD
Hを用いてＬ−グルタミン生産のための培養を実施例１
記載の方法で行った。また、GDH活性についてはMol. Mi
crobiology, 317-326(6) 1992を参考とし、Tris-HCl(pH
7.5)100mM, NH4Cl 20mM, α-ケトグルタル酸10mM, NADP
H 0.25mMを含む溶液に粗酵素液を加え、340nMにおける
吸光度の変化を測定することによって測定した。粗酵素
液は、上記の培養液より遠心分離により菌体を分離し、
Tris-HCl(pH7.5)100mMで洗浄後、超音波破砕し、未破砕
菌体を遠心分離で除去することにより調製した。粗酵素
液のたん白質濃度は牛血清アルブミンを標準試料とし
て、Protein Assay（Bio-Rad）を用いて定量した。その
結果を表５に示した。
【０１０４】Ｌ−グルタミンの収量においては、GDHプ
ロモーター改変株QB-1、QB-4が高い収量を示した。ま
た、QA-1/pGDH株も、AJ12418株よりも高い収量を示し
た。培養時間は、QA-1/pGDH株が最も短かった。Ｌ−グ
ルタミン酸の副生は、QB-1、QB-4株が大幅に改善され
た。これらの結果から、GSとGDHを同時に強化すること
が、Ｌ−グルタミンの収量の向上および培養時間短縮に
有効であることが示された。
ロモーター改変株QB-1、QB-4が高い収量を示した。ま
た、QA-1/pGDH株も、AJ12418株よりも高い収量を示し
た。培養時間は、QA-1/pGDH株が最も短かった。Ｌ−グ
ルタミン酸の副生は、QB-1、QB-4株が大幅に改善され
た。これらの結果から、GSとGDHを同時に強化すること
が、Ｌ−グルタミンの収量の向上および培養時間短縮に
有効であることが示された。
【０１０５】
【表５】 表５ ─────────────────────────────────── 菌株 L-Gln(g/L) L-Glu(g/L) 培養時間(hr) GDH活性(U/mg) ─────────────────────────────────── AJ12418 40.5 0.8 68 1.6 QA-1/pGDH 47.9 1.0 60 15.2 QB-1 50.5 0.1 65 4.1 QB-4 50.0 0.3 65 9.6 ───────────────────────────────────
【０１０６】
【実施例５】GSのアイソザイムをコードする遺伝子の取
得 コリネバクテリウム・グルタミカムのglnAを取得したこ
とを報告した論文（FEMS Microbiol. Letter, 154 (199
7) 81-88）には、ΔglnA破壊株がグルタミン要求とな
り、GS活性が失われることを記載されている一方、サザ
ンブロッテイングの結果、アイソザイムの存在を示唆す
るデータも報告されている。また、「アミノ酸発酵：学
会出版センター、232頁〜235頁」には、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムには２種類のGSがあることが記載さ
れている。そこで第２のGSアイソザイムをコードする遺
伝子の取得を試みた。 （１）プローブの調製 GSのアイソザイムをコードする遺伝子（glnA2）は、コ
ロニーハイブリダイゼーションにより取得した。まず、
配列表配列番号１８および１９に示すプライマーを用い
て、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、glnA遺伝子
部分断片を取得した。このDNA断片をDIG-ハイプライムD
NAラベリング＆デテクションスターターキットI（ベー
リンガー・マンハイム）を用いて標識し、プローブとし
た。
得 コリネバクテリウム・グルタミカムのglnAを取得したこ
とを報告した論文（FEMS Microbiol. Letter, 154 (199
7) 81-88）には、ΔglnA破壊株がグルタミン要求とな
り、GS活性が失われることを記載されている一方、サザ
ンブロッテイングの結果、アイソザイムの存在を示唆す
るデータも報告されている。また、「アミノ酸発酵：学
会出版センター、232頁〜235頁」には、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムには２種類のGSがあることが記載さ
れている。そこで第２のGSアイソザイムをコードする遺
伝子の取得を試みた。 （１）プローブの調製 GSのアイソザイムをコードする遺伝子（glnA2）は、コ
ロニーハイブリダイゼーションにより取得した。まず、
配列表配列番号１８および１９に示すプライマーを用い
て、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、glnA遺伝子
部分断片を取得した。このDNA断片をDIG-ハイプライムD
NAラベリング＆デテクションスターターキットI（ベー
リンガー・マンハイム）を用いて標識し、プローブとし
た。
【０１０７】（２）コロニーハイブリダイゼーション ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
株の染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素Sau3AIにより部分
分解して、得られたＤＮＡ断片をpHSG299のベクターのB
amHI部位に挿入し大腸菌JM109株を形質転換した。得ら
れた形質転換体を、Hybond-N+（アマシャムファルマシ
アバイオテク）にトランスファーし、変性、中和後、DI
G-ハイプライムDNAラベリング＆デテクションスタータ
ーキットIにしたがって、実施例５（１）で調製したプ
ローブとハイブリダイズさせた。このとき、強くハイブ
リダイズする形質転換体と弱くハイブリダイズする形質
転換体が認められた。これらの形質転換体よりプラスミ
ドDNAを調製し、挿入断片の塩基配列を決定したとこ
ろ、既知のコリネ型細菌のグルタミンシンテターゼと高
い相同性を示す遺伝子を含むクローンが取得できた。後
者の挿入断片の全塩基配列を配列表配列番号１に示し
た。
株の染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素Sau3AIにより部分
分解して、得られたＤＮＡ断片をpHSG299のベクターのB
amHI部位に挿入し大腸菌JM109株を形質転換した。得ら
れた形質転換体を、Hybond-N+（アマシャムファルマシ
アバイオテク）にトランスファーし、変性、中和後、DI
G-ハイプライムDNAラベリング＆デテクションスタータ
ーキットIにしたがって、実施例５（１）で調製したプ
ローブとハイブリダイズさせた。このとき、強くハイブ
リダイズする形質転換体と弱くハイブリダイズする形質
転換体が認められた。これらの形質転換体よりプラスミ
ドDNAを調製し、挿入断片の塩基配列を決定したとこ
ろ、既知のコリネ型細菌のグルタミンシンテターゼと高
い相同性を示す遺伝子を含むクローンが取得できた。後
者の挿入断片の全塩基配列を配列表配列番号１に示し
た。
【０１０８】オープン・リーディング・フレームを推定
し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を
配列表配列番号２と３に示した。これらのアミノ酸配列
おのおのについて既知の配列と相同性比較を行った。用
いたデータベースはGenbankである。その結果、いずれ
のオープン・リーディング・フレームにコードされるア
ミノ酸配列も、コリネ型細菌の新規なたんぱく質である
ことが明らかとなった。塩基配列及びアミノ酸配列は、
Genetyx-Mac computer program（ソフトウェア開発、東
京）により解析した。相同性解析は、LipmanとPearson
(Science, 227,1435-1441, 1985)の方法にしたがって行
った。
し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を
配列表配列番号２と３に示した。これらのアミノ酸配列
おのおのについて既知の配列と相同性比較を行った。用
いたデータベースはGenbankである。その結果、いずれ
のオープン・リーディング・フレームにコードされるア
ミノ酸配列も、コリネ型細菌の新規なたんぱく質である
ことが明らかとなった。塩基配列及びアミノ酸配列は、
Genetyx-Mac computer program（ソフトウェア開発、東
京）により解析した。相同性解析は、LipmanとPearson
(Science, 227,1435-1441, 1985)の方法にしたがって行
った。
【０１０９】配列表配列番号２に示したアミノ酸配列
は、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミ
カムのGS（FEMS Microbiology Letters 81-88,(154) 19
97）、マイコバクテリウム・ツバクロシスのGS（GenBan
k ACCESION Z70692）およびストレプトマイセス・セリ
カラーのGS(GenBank ACCESSION AL136500)と、それぞれ
34.6%、65.6％、60%の相同性を示し（表６）、コリネ型
細菌のGSのアイソザイムであることが判明した。
は、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミ
カムのGS（FEMS Microbiology Letters 81-88,(154) 19
97）、マイコバクテリウム・ツバクロシスのGS（GenBan
k ACCESION Z70692）およびストレプトマイセス・セリ
カラーのGS(GenBank ACCESSION AL136500)と、それぞれ
34.6%、65.6％、60%の相同性を示し（表６）、コリネ型
細菌のGSのアイソザイムであることが判明した。
【０１１０】一方、配列表配列番号３の配列は、既に報
告されているマイコバクテリウム・ツバクロシスのATas
e(GenBank ACCESION Z70692)およびストレプトマイセス
・セリカラーのATase(GenBank ACCESSION Y17736)と、
それぞれ51.9％、33.4%の相同性を示し（表７）、コリ
ネ型細菌のATaseであることが判明した。したがって、
配列番号１に示す塩基配列のうち、配列番号２に示すア
ミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレ
ームはglnA2であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を
コードするオープン・リーディング・フレームはglnEで
あることが判明した。
告されているマイコバクテリウム・ツバクロシスのATas
e(GenBank ACCESION Z70692)およびストレプトマイセス
・セリカラーのATase(GenBank ACCESSION Y17736)と、
それぞれ51.9％、33.4%の相同性を示し（表７）、コリ
ネ型細菌のATaseであることが判明した。したがって、
配列番号１に示す塩基配列のうち、配列番号２に示すア
ミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレ
ームはglnA2であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を
コードするオープン・リーディング・フレームはglnEで
あることが判明した。
【０１１１】
【表６】 表６ ──────────────────────────────── 菌株 遺伝子名 アミノ酸数 相同性 ──────────────────────────────── Brevibacterium lactofermentum glnA2 446A.A --. Corynebacterium glutamicum glnA 478A.A 34.6% Mycobacterium tuberculosis glnA2 446A.A 65.6% Streptomyces coelicolor glnA 453A.A 60.0% ────────────────────────────────
【０１１２】
【表７】 表７ ──────────────────────────────── 菌株 遺伝子名 アミノ酸数 相同性 ──────────────────────────────── Brevibacterium lactofermentum glnE 1045A.A --. Mycobacterium tuberculosis glnE 994A.A 51.9% Streptomyces coelicolor glnE 784A.A 33.4% ────────────────────────────────
【０１１３】
【実施例６】ATase欠損株によるＬ−グルタミンの生産 上記実施例５でATaseをコードする遺伝子glnEが明らか
にされたので、Ｌ−グルタミン生産菌AJ12418よりglnE
欠損株を構築した。具体的方法を以下に示す。まず、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型として、配列番号２３と２４の合成DNAをプライマ
ーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部分断片を得た。生
成したPCR産物を常法により精製後、平滑末端化し、pHS
G299（宝酒造）のHincII部位に挿入した。このプラスミ
ドをpGLNEと名付けた。次に、このプラスミド上のglnE
遺伝子の一部領域を欠失させる為、pGLNEをHincIIで消
化した後、セルフライゲーションを行い、得られたプラ
スミドをpΔGLNEと名付けた。このプラスミドは、配列
表配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号2341番目
から4650番目までを含んでいるが、3343番目のHincII認
識部位から3659番目のHincII認識部位までの約300bpを
欠失している。
にされたので、Ｌ−グルタミン生産菌AJ12418よりglnE
欠損株を構築した。具体的方法を以下に示す。まず、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを
鋳型として、配列番号２３と２４の合成DNAをプライマ
ーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部分断片を得た。生
成したPCR産物を常法により精製後、平滑末端化し、pHS
G299（宝酒造）のHincII部位に挿入した。このプラスミ
ドをpGLNEと名付けた。次に、このプラスミド上のglnE
遺伝子の一部領域を欠失させる為、pGLNEをHincIIで消
化した後、セルフライゲーションを行い、得られたプラ
スミドをpΔGLNEと名付けた。このプラスミドは、配列
表配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号2341番目
から4650番目までを含んでいるが、3343番目のHincII認
識部位から3659番目のHincII認識部位までの約300bpを
欠失している。
【０１１４】上述のpΔGLNEは、コリネ型細菌の細胞内
で自律複製可能とする領域を含まない為、本プラスミド
でコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であ
るが、本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込
まれた形が形質転換体として出現する。
で自律複製可能とする領域を含まない為、本プラスミド
でコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であ
るが、本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込
まれた形が形質転換体として出現する。
【０１１５】Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム
・フラバムAJ12418を電気パルス法により、高濃度のプ
ラスミドpΔGLNEを用いて形質転換し、カナマイシン耐
性を指標として形質転換体を取得した。次にこれらの形
質転換体を継代培養し、カナマイシン感受性となった株
を取得した。取得したカナマイシン感受性株より染色体
DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号２３と２４の
合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部
分断片を得た。PCR産物をHincIIで消化し、約300bpの断
片が生じないものをglnE遺伝子破壊株とした。この株を
QA-Tと名付けた。AJ12418及びQA-Tを用いて、Ｌ−グル
タミン生産の為の培養を実施例１（３）記載の方法と同
様にして行った。その結果を表８に示した。
・フラバムAJ12418を電気パルス法により、高濃度のプ
ラスミドpΔGLNEを用いて形質転換し、カナマイシン耐
性を指標として形質転換体を取得した。次にこれらの形
質転換体を継代培養し、カナマイシン感受性となった株
を取得した。取得したカナマイシン感受性株より染色体
DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号２３と２４の
合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部
分断片を得た。PCR産物をHincIIで消化し、約300bpの断
片が生じないものをglnE遺伝子破壊株とした。この株を
QA-Tと名付けた。AJ12418及びQA-Tを用いて、Ｌ−グル
タミン生産の為の培養を実施例１（３）記載の方法と同
様にして行った。その結果を表８に示した。
【０１１６】QA-T株ではAJ12418株に比べ、L-グルタミ
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても表８に示した。QA-T株ではAJ
12418株に比べ、GS活性が向上していることが確認され
た。
ン蓄積の向上が認められた。これらの株のGS活性につい
て測定した結果についても表８に示した。QA-T株ではAJ
12418株に比べ、GS活性が向上していることが確認され
た。
【０１１７】
【表８】 表８ ───────────────────────────── 菌株 L-Gln(g/L) GS活性(U/mg) 培養時間(hr) ───────────────────────────── AJ12418 39.0 0.03 70 QA-T 45.1 0.05 75 ─────────────────────────────
【０１１８】〔配列表の説明〕 配列番号１：glnA2およびglnE塩基配列 配列番号２：glnA2アミノ酸配列 配列番号３：glnEアミノ酸配列 配列番号４：glnA増幅用プライマーN 配列番号５：glnA増幅用プライマーC 配列番号６：glnA 1stPCRプライマーNN 配列番号７：glnA 1stPCRプライマーNC 配列番号８：glnA 1stPCRプライマーCN 配列番号９：glnA 1stPCRプライマーCC 配列番号１０：glnA 2ndPCRプライマーN 配列番号１１：glnA 2ndPCRプライマーC 配列番号１２：gdh増幅用プライマーN 配列番号１３：gdh増幅用プライマーC 配列番号１４：gdh増幅用プライマーN２ 配列番号１５：gdh増幅用プライマーC2 配列番号１６：gdhプロモーター変異プライマーM１ 配列番号１７：gdhプロモーター変異プライマーM4 配列番号１８：glnAプローブ調製用プライマーN 配列番号１９：glnAプローブ調製用プライマーC 配列番号２０：野生型gdhプロモーター配列 配列番号２１：変異型gdhプロモーター配列 配列番号２２：変異型gdhプロモーター配列 配列番号２３：glnE破壊用プライマーN 配列番号２４：glnE破壊用プライマーC
【０１１９】
【発明の効果】本発明によれば、コリネ型細菌を用いた
発酵法によるＬ−グルタミンの製造において、Ｌ−グル
タミン酸の副生を抑制でき、Ｌ−グルタミンの生産効率
を向上させることができる。また、本発明のＤＮＡは、
コリネ型細菌のＬ−グルタミン生産菌の育種に利用する
ことができる。
発酵法によるＬ−グルタミンの製造において、Ｌ−グル
タミン酸の副生を抑制でき、Ｌ−グルタミンの生産効率
を向上させることができる。また、本発明のＤＮＡは、
コリネ型細菌のＬ−グルタミン生産菌の育種に利用する
ことができる。
【０１２０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> 発酵法によるＬ−グルタミンの製造法及びＬ−グルタミン生産菌 <130> P-8706 <140> <141> 2001-05-30 <150> JP 2001-28163 <151> 2001-02-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.0
【０１２１】 <210> 1 <211> 5500 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (659)..(1996) <220> <221> CDS <222> (2006)..(5200) <400> 1 gatcagtgct tcggcttctt cttcgaagtt ggtggactct gcctttttca aaagtgcggt 60 gatacgatga tgcgctttgg cctgtgccgg ggtcattggg ctggtgtctt gattgtctaa 120 ggcgtggagc tctgcgagca ttgcccagtc aggcaaggta cttagcttcg gtagctcggt 180 gagaatcttc tccagggtca tcaccggcaa gtggctagtt tcggcggcac gcgttccgtt 240 cacccacagt gtgtacatct catcggagca ggagtaagca atctcaggta gcgcgtgaaa 300 caggagtgga tcaatatcgg cggaaaactc atggcggaga tcggcgggag tccacccacg 360 aagcgcacag aaacctaggt ggctgatgat gctttcttct aaaatctgac ggtaagagtc 420 ttgtgcgtcg gtgacgttgt cggagaagtg ggagagggtc attgcggttt ccttattcgt 480 aggagagttc taatttcggt gcggttctca gtgaaccacc caagctggac acctcccacc 540 cccgtgtcat caaaaaaccg cgacatcctt gagtaactct gagaaaaact acccccgatg 600 cgagtataaa agtggcaaat gcgcagtcga tgtcccatcg ctgcgtagat tagttttc 658 atg aac agc gaa cag gaa ttt gta ctc agc gcc att gaa gaa cgc gac 706 Met Asn Ser Glu Gln Glu Phe Val Leu Ser Ala Ile Glu Glu Arg Asp 1 5 10 15 att aag ttt gtg cgt cta tgg ttc act gac att ctt gga cac ttg aag 754 Ile Lys Phe Val Arg Leu Trp Phe Thr Asp Ile Leu Gly His Leu Lys 20 25 30 tca gtg gtt gtg gct cct gca gaa cta gag tct gcg ttg gaa gaa ggc 802 Ser Val Val Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 35 40 45 atc gga ttc gat ggc tca gcc att gag ggc tac gcg cgt atc tcg gaa 850 Ile Gly Phe Asp Gly Ser Ala Ile Glu Gly Tyr Ala Arg Ile Ser Glu 50 55 60 gcg gac acc att gcc cgc cca gat cca tcg aca ttc cag gtc ctc cca 898 Ala Asp Thr Ile Ala Arg Pro Asp Pro Ser Thr Phe Gln Val Leu Pro 65 70 75 80 cta gaa gcg ggc atc tca aaa ctg cag gca gca cgc ctg ttt tgc gat 946 Leu Glu Ala Gly Ile Ser Lys Leu Gln Ala Ala Arg Leu Phe Cys Asp 85 90 95 gtc acg atg ccg gac gga cag cca tct ttt tct gac ccg cgc caa gtg 994 Val Thr Met Pro Asp Gly Gln Pro Ser Phe Ser Asp Pro Arg Gln Val 100 105 110 ctg cgc agg cag gtc caa cta gct gca gat gaa ggc ttg acc tgc atg 1042 Leu Arg Arg Gln Val Gln Leu Ala Ala Asp Glu Gly Leu Thr Cys Met 115 120 125 atc tca cca gag att gag ttc tat ttg gtg caa agc ctt cgc acc aac 1090 Ile Ser Pro Glu Ile Glu Phe Tyr Leu Val Gln Ser Leu Arg Thr Asn 130 135 140 gga ctg cca cct gtg ccc act gac aac ggc gga tat ttc gac caa gcc 1138 Gly Leu Pro Pro Val Pro Thr Asp Asn Gly Gly Tyr Phe Asp Gln Ala 145 150 155 160 aca ttc aat gag gcg ccg aat ttc cgt cga aac gcg atg gta gcg ctg 1186 Thr Phe Asn Glu Ala Pro Asn Phe Arg Arg Asn Ala Met Val Ala Leu 165 170 175 gag gaa ctc ggc atc cct gtc gag ttc tcc cac cat gaa act gca cct 1234 Glu Glu Leu Gly Ile Pro Val Glu Phe Ser His His Glu Thr Ala Pro 180 185 190 ggc cag caa gaa atc gat tta cgc cat gcg gat gcg ctc acc atg gcc 1282 Gly Gln Gln Glu Ile Asp Leu Arg His Ala Asp Ala Leu Thr Met Ala 195 200 205 gac aac atc atg acc ttc cgc tac atc atg aaa cag gtg gca agg gac 1330 Asp Asn Ile Met Thr Phe Arg Tyr Ile Met Lys Gln Val Ala Arg Asp 210 215 220 caa ggc gtt ggg gca tca ttt atg ccc aag cca ttc caa gaa cat gca 1378 Gln Gly Val Gly Ala Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Gln Glu His Ala 225 230 235 240 ggc tcc gcc atg cac acg cac atg tcc tta ttt gag ggc gat acc aac 1426 Gly Ser Ala Met His Thr His Met Ser Leu Phe Glu Gly Asp Thr Asn 245 250 255 gcg ttc cac gat cca gac gat tct tac atg ctg tcc aaa acc gca aaa 1474 Ala Phe His Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Met Leu Ser Lys Thr Ala Lys 260 265 270 cag ttc atc gct gga atc ttg cat cac gct cca gaa ttc acc gct gtg 1522 Gln Phe Ile Ala Gly Ile Leu His His Ala Pro Glu Phe Thr Ala Val 275 280 285 acc aac cag tgg gtc aat tcc tac aaa cgc atc gtg tac gga aac gaa 1570 Thr Asn Gln Trp Val Asn Ser Tyr Lys Arg Ile Val Tyr Gly Asn Glu 290 295 300 gct cca act gcg gca acc tgg ggt gta tct aat cgt tct gcg ctg gtt 1618 Ala Pro Thr Ala Ala Thr Trp Gly Val Ser Asn Arg Ser Ala Leu Val 305 310 315 320 cgt gtt cct acc tac cgt ttg aat aag gag gag tcg cgc cgg gtg gag 1666 Arg Val Pro Thr Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu Ser Arg Arg Val Glu 325 330 335 gtg cgt ctt cct gat acc gct tgt aac cca tat ttg gcg ttt tca gtg 1714 Val Arg Leu Pro Asp Thr Ala Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Val 340 345 350 atg ctc ggc gct ggt ttg aaa ggt att aaa gaa ggt tat gag ctc gac 1762 Met Leu Gly Ala Gly Leu Lys Gly Ile Lys Glu Gly Tyr Glu Leu Asp 355 360 365 gag cca gct gag gac gat atc tcc aac ttg agc ttc cgg gaa cgt cgc 1810 Glu Pro Ala Glu Asp Asp Ile Ser Asn Leu Ser Phe Arg Glu Arg Arg 370 375 380 gcc atg ggc tac aac gat ctg cca aac agc ctt gat cag gca ctg cgc 1858 Ala Met Gly Tyr Asn Asp Leu Pro Asn Ser Leu Asp Gln Ala Leu Arg 385 390 395 400 caa atg gaa aag tca gag ctt gtt gct gac atc ctc ggt gag cac gtt 1906 Gln Met Glu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asp Ile Leu Gly Glu His Val 405 410 415 ttt gag ttt ttc ttg cgc aat aag tgg cgt gaa tgg cgt gac tac caa 1954 Phe Glu Phe Phe Leu Arg Asn Lys Trp Arg Glu Trp Arg Asp Tyr Gln 420 425 430 gag cag atc act ccg tgg gag ctc cga aac aat ctt gat tac tagactttt 2005 Glu Gln Ile Thr Pro Trp Glu Leu Arg Asn Asn Leu Asp Tyr 435 440 445 gcactccaat ggaaacccta cggcgaccca attgcgaccc gataaaggag gggagaagct 2065 atg tca gga ccg tta aga agt gaa cgt aaa gtc gtt ggc ttt gtc aga 2113 Met Ser Gly Pro Leu Arg Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Phe Val Arg 1 5 10 15 gac cca ctg cca aaa gtt ggt tct tta tcg ctg aaa tct gag cat gcc 2161 Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala 20 25 30 caa gca gat cta gag cat ttg ggt tgg cgc aat gtt gag tct ttg gat 2209 Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp 35 40 45 ttg ttg tgg ggc ttg tca ggt gca ggc gat ccc gat gtc gcg ctg aac 2257 Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn 50 55 60 ctt ctt att cgg ctg tat cag gca ctt gaa gca atc ggc gag gat gct 2305 Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala 65 70 75 80 cga aac gag ctt gat caa gag att cgc cag gat gaa gaa cta cga gtc 2353 Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val 85 90 95 cgc ctt ttt gca ttg ttg ggt ggt tcc tcg gct gtc ggt gat cac ttg 2401 Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu 100 105 110 gtc gcc aat cct ttg cag tgg aaa ctc tta aaa ctt gat gcg cca tcg 2449 Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser 115 120 125 agg gaa gag atg ttt cag gcg ctg ctg gaa tct gtg aaa gct cag cct 2497 Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro 130 135 140 gct gtg ctt gag gtt gag gat ttc agc gat gca cac aac att gcc cga 2545 Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg 145 150 155 160 gac gat ttg agc acg cct ggt ttt tac acg gct agt gtt acc ggg cct 2593 Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro 165 170 175 gaa gca gag cga gtc ttg aaa tgg act tat cgc acg ttg ctg acc cgg 2641 Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg 180 185 190 att gct gcg cat gat tta gcg ggt acc tat ccc acc gac atg cgg aga 2689 Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg 195 200 205 aaa ggt ggc gat cct gtt ccg ttt agc aca gtg acc atg cag ctc agc 2737 Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser 210 215 220 gac cta gct gat gct gct ttg act gct gct tta gct gtg gca att gcc 2785 Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala 225 230 235 240 aat gtt tat ggt gaa aag ccg gtt gat tca gct tta tct gtc atc gcg 2833 Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala 245 250 255 atg ggc aaa tgt ggc gcg cag gaa ttg aac tac att tca gat gtg gac 2881 Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp 260 265 270 gtg gtg ttt gtt gca gag ccg gca aac tct aaa tca aca cgc acc gca 2929 Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala 275 280 285 gca gag ctc att cgc atc ggt agc aac tcg ttc ttt gag gtg gat gca 2977 Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala 290 295 300 gca ctt cgc cca gaa ggt aaa agt ggc gct ctt gtg cgc tct ttg gat 3025 Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp 305 310 315 320 tcc cat atg gcg tat tac aag cgc tgg gcg gaa acc tgg gaa ttt cag 3073 Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln 325 330 335 gca ctg ctg aaa gct cgt ccc atg acg ggt gat att gac ctt ggg cag 3121 Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln 340 345 350 tcc tat gtg gat gct ctt tca ccg ttg att tgg gcg gct agc cag cgg 3169 Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg 355 360 365 gaa tca ttt gtc aca gat gtc caa gct atg cgc cgt cga gtg ttg gac 3217 Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp 370 375 380 aat gtt ccg gaa gac ttg cgt gat cgt gag ctg aag ctt ggt cgc ggt 3265 Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly 385 390 395 400 ggt ttg agg gat gtg gag ttt gct gtc cag ctc ctt cag atg gtg cat 3313 Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His 405 410 415 ggt cgc att gat gag acg ttg cgg gtt cgg tca acg gta aat gct ttg 3361 Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu 420 425 430 cat gtg ttg gtt gat cag gga tat gtg ggt cgt gaa gac ggg cat aat 3409 His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn 435 440 445 ctc att gag tcg tat gag ttt ttg cgc ctg ttg gag cat cgc ctt caa 3457 Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln 450 455 460 ttg gag cgg atc aag cgc act cac ttg tta ccg aaa cct gat gac cga 3505 Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg 465 470 475 480 atg aat atg cgc tgg ttg gcg cgc gct tct ggg ttt act ggt tcg atg 3553 Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met 485 490 495 gag caa agt tcg gcc aaa gct atg gaa cgg cat ttg cgt aag gtt cgt 3601 Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg 500 505 510 ttg cag att cag tcg ttg cat agt cag ctg ttt tat cgg cca ctg ctg 3649 Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu 515 520 525 aac tct gtg gtc aac ttg agc gcg gat gcc atc aga ttg tct ccg gat 3697 Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp 530 535 540 gct gca aag cta caa ttg ggg gca ttg gga tac ctg cat cca tca cgt 3745 Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg 545 550 555 560 gct tat gaa cac ctg act gct ctt gca tca gga gct agc cgt aaa gcc 3793 Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala 565 570 575 aag att cag gcg atg ttg ctg ccc acg ttg atg gag tgg ctg tct caa 3841 Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln 580 585 590 aca gct gaa cca gat gcg gga ttg ctg aat tac cgc aag ctt tct gat 3889 Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp 595 600 605 gct tcc tat gat cgc agc tgg ttt ttg cgc atg ctg cgt gat gag ggc 3937 Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly 610 615 620 gta gtg ggg cag cgg ttg atg cgt att ttg gga aat tct ccc tat att 3985 Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile 625 630 635 640 tct gaa ctg att atc tcc act ccg gac ttt gtg aaa cag ctg ggt gat 4033 Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp 645 650 655 gcg gcg tct ggt cct aaa ttg ctt gct act gca ccg act cag gtt gtg 4081 Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val 660 665 670 aaa gca atc aag gcg acg gtg tcg cgt cat gag tca cct gat cgg gcg 4129 Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala 675 680 685 atc cag gct gca cga tcg ctg agg agg cag gag ctg gca cgc att gcc 4177 Ile Gln Ala Ala Arg Ser Leu Arg Arg Gln Glu Leu Ala Arg Ile Ala 690 695 700 tct gct gat ttg ctc aac atg ctc act gtt cag gaa gta tgc caa agc 4225 Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser 705 710 715 720 ttg tca cta gtc tgg gat gcg gtg ttg gat gct gcc ttg gat gcg gaa 4273 Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu 725 730 735 atc cgt gct gca ctt aac gat cca cag aaa cca gat cag cct ctg gcc 4321 Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala 740 745 750 aat att tct gtg atc ggc atg ggc cgt ttg ggt gga gca gaa ctt gga 4369 Asn Ile Ser Val Ile Gly Met Gly Arg Leu Gly Gly Ala Glu Leu Gly 755 760 765 tac ggt tct gat gcc gat gtg atg ttt gta tgc gag ccg gta gcc ggt 4417 Tyr Gly Ser Asp Ala Asp Val Met Phe Val Cys Glu Pro Val Ala Gly 770 775 780 gtg gaa gag cat gag gcc gtc aca tgg tct att gcg atc tgt gat tcc 4465 Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser 785 790 795 800 atg cgg tcg agg ctt gcg cag cct tcc ggt gat cca cct ttg gag gtg 4513 Met Arg Ser Arg Leu Ala Gln Pro Ser Gly Asp Pro Pro Leu Glu Val 805 810 815 gat ctg ggg ctg cgt cct gaa ggg aga tct ggt gcg att gtg cgc acc 4561 Asp Leu Gly Leu Arg Pro Glu Gly Arg Ser Gly Ala Ile Val Arg Thr 820 825 830 gtt gat tcc tat gtg aag tac tac gaa aag tgg ggt gaa act tgg gag 4609 Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu 835 840 845 att cag gcg ctg ctg agg gct gcg tgg gtt gct ggt gat cgt gag ctg 4657 Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu 850 855 860 ggc att aag ttc ttg gag tcg att gat cgt ttc cgc tac cca gtt gac 4705 Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp 865 870 875 880 ggg gca acg cag gcg cag ctt cgt gaa gtt cgt cga att aag gcg agg 4753 Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg 885 890 895 gtg gat aat gag agg ctt ccg cgc ggg gct gat cga aat acc cat acc 4801 Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr 900 905 910 aag ctg ggt cgg gga gcg tta act gac atc gag tgg act gtg cag ttg 4849 Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu 915 920 925 ttg acc atg atg cat gct cat gag att ccg gag ctg cac aat acg tcg 4897 Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser 930 935 940 acg ttg gaa gtt ctt gaa gtg ctg gaa aag cat cag att att aac cct 4945 Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro 945 950 955 960 gtg cag gtg cag acg ctt cgg gaa gcg tgg ctg acg gca acg gct gct 4993 Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala 965 970 975 agg aat gcg ctt gtg ctg gtc agg ggt aag aga tta gat cag tta cct 5041 Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro 980 985 990 act cct ggt ccg cac ctt gcg cag gtg gct ggt gcg tct ggt tgg gat 5089 Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp 995 1000 1005 cca aat gag tac cag gag tat ttg gaa aac tat ctg aaa gtg acc agg 5137 Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr Arg 1010 1015 1020 aag agt cgt cag gtt gtt gat gaa gtc ttc tgg ggt gtg gac tct atg 5185 Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met 1025 1030 1035 1040 gag caa cgt gag ttt taggtaggtg gtgggagccc caaagttgcg gaaaattgtt c 5241 Glu Gln Arg Glu Phe 1045 caactaaggg actatatgta ggtgtggata acctaagtta atcttttgtg agcgtgagga 5301 tttctctgag gaatctagac gcagattaac ttccgcttgg cagcgaccgg gataacaccg 5361 cggttgcggc cacgcaggct cacaaaggac accactatga caagcattat tgcaagcaac 5421 agcgacctat cggaggagct gcgcacccac actgcgcggg cacatgaaga ggccgagcac 5481 tcaacgttta tgaatgatc 5500
【０１２２】 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 2 Met Asn Ser Glu Gln Glu Phe Val Leu Ser Ala Ile Glu Glu Arg Asp 1 5 10 15 Ile Lys Phe Val Arg Leu Trp Phe Thr Asp Ile Leu Gly His Leu Lys 20 25 30 Ser Val Val Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 35 40 45 Ile Gly Phe Asp Gly Ser Ala Ile Glu Gly Tyr Ala Arg Ile Ser Glu 50 55 60 Ala Asp Thr Ile Ala Arg Pro Asp Pro Ser Thr Phe Gln Val Leu Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Gly Ile Ser Lys Leu Gln Ala Ala Arg Leu Phe Cys Asp 85 90 95 Val Thr Met Pro Asp Gly Gln Pro Ser Phe Ser Asp Pro Arg Gln Val 100 105 110 Leu Arg Arg Gln Val Gln Leu Ala Ala Asp Glu Gly Leu Thr Cys Met 115 120 125 Ile Ser Pro Glu Ile Glu Phe Tyr Leu Val Gln Ser Leu Arg Thr Asn 130 135 140 Gly Leu Pro Pro Val Pro Thr Asp Asn Gly Gly Tyr Phe Asp Gln Ala 145 150 155 160 Thr Phe Asn Glu Ala Pro Asn Phe Arg Arg Asn Ala Met Val Ala Leu 165 170 175 Glu Glu Leu Gly Ile Pro Val Glu Phe Ser His His Glu Thr Ala Pro 180 185 190 Gly Gln Gln Glu Ile Asp Leu Arg His Ala Asp Ala Leu Thr Met Ala 195 200 205 Asp Asn Ile Met Thr Phe Arg Tyr Ile Met Lys Gln Val Ala Arg Asp 210 215 220 Gln Gly Val Gly Ala Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Gln Glu His Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Met His Thr His Met Ser Leu Phe Glu Gly Asp Thr Asn 245 250 255 Ala Phe His Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Met Leu Ser Lys Thr Ala Lys 260 265 270 Gln Phe Ile Ala Gly Ile Leu His His Ala Pro Glu Phe Thr Ala Val 275 280 285 Thr Asn Gln Trp Val Asn Ser Tyr Lys Arg Ile Val Tyr Gly Asn Glu 290 295 300 Ala Pro Thr Ala Ala Thr Trp Gly Val Ser Asn Arg Ser Ala Leu Val 305 310 315 320 Arg Val Pro Thr Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu Ser Arg Arg Val Glu 325 330 335 Val Arg Leu Pro Asp Thr Ala Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Val 340 345 350 Met Leu Gly Ala Gly Leu Lys Gly Ile Lys Glu Gly Tyr Glu Leu Asp 355 360 365 Glu Pro Ala Glu Asp Asp Ile Ser Asn Leu Ser Phe Arg Glu Arg Arg 370 375 380 Ala Met Gly Tyr Asn Asp Leu Pro Asn Ser Leu Asp Gln Ala Leu Arg 385 390 395 400 Gln Met Glu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asp Ile Leu Gly Glu His Val 405 410 415 Phe Glu Phe Phe Leu Arg Asn Lys Trp Arg Glu Trp Arg Asp Tyr Gln 420 425 430 Glu Gln Ile Thr Pro Trp Glu Leu Arg Asn Asn Leu Asp Tyr 435 440 445
【０１２３】 <210> 3 <211> 1045 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 3 Met Ser Gly Pro Leu Arg Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Phe Val Arg 1 5 10 15 Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala 20 25 30 Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp 35 40 45 Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn 50 55 60 Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala 65 70 75 80 Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val 85 90 95 Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu 100 105 110 Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser 115 120 125 Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro 130 135 140 Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg 145 150 155 160 Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro 165 170 175 Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg 180 185 190 Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg 195 200 205 Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser 210 215 220 Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala 225 230 235 240 Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala 245 250 255 Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp 260 265 270 Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala 275 280 285 Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala 290 295 300 Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp 305 310 315 320 Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln 325 330 335 Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln 340 345 350 Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg 355 360 365 Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp 370 375 380 Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly 385 390 395 400 Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His 405 410 415 Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu 420 425 430 His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn 435 440 445 Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln 450 455 460 Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg 465 470 475 480 Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met 485 490 495 Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg 500 505 510 Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu 515 520 525 Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp 530 535 540 Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg 545 550 555 560 Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala 565 570 575 Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln 580 585 590 Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp 595 600 605 Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly 610 615 620 Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile 625 630 635 640 Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp 645 650 655 Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val 660 665 670 Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala 675 680 685 Ile Gln Ala Ala Arg Ser Leu Arg Arg Gln Glu Leu Ala Arg Ile Ala 690 695 700 Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser 705 710 715 720 Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu 725 730 735 Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala 740 745 750 Asn Ile Ser Val Ile Gly Met Gly Arg Leu Gly Gly Ala Glu Leu Gly 755 760 765 Tyr Gly Ser Asp Ala Asp Val Met Phe Val Cys Glu Pro Val Ala Gly 770 775 780 Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser 785 790 795 800 Met Arg Ser Arg Leu Ala Gln Pro Ser Gly Asp Pro Pro Leu Glu Val 805 810 815 Asp Leu Gly Leu Arg Pro Glu Gly Arg Ser Gly Ala Ile Val Arg Thr 820 825 830 Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu 835 840 845 Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu 850 855 860 Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp 865 870 875 880 Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg 885 890 895 Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr 900 905 910 Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu 915 920 925 Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser 930 935 940 Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro 945 950 955 960 Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala 965 970 975 Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro 980 985 990 Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp 995 1000 1005 Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr Arg 1010 1015 1020 Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met 1025 1030 1035 1040 Glu Gln Arg Glu Phe 1045
【０１２４】 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 ggggtcgacg gatcgacagg taatgcatt 29
【０１２５】 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 ggggtcgacg gatccaccat gatggagga 29
【０１２６】 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 cttcccagta gcaccatacg ac 22
【０１２７】 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 ctggtggcag ttcgaagagg tccttg 26
【０１２８】 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 ggacaaggac ctcttcgaac tgccag 26
【０１２９】 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 cggcgagacc gtcgattggg aggagc 26
【０１３０】 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 gtagcacctt acgaccaaac cg 22
【０１３１】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 ggagccggtc gacgaggagc 20
【０１３２】 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 gctagcctcg ggagctctct aggag 25
【０１３３】 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 gatctttccc agactctggc cacgc 25
【０１３４】 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 cagttgtggc tgatccg 17
【０１３５】 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 ctttcccaga ctctggcc 18
【０１３６】 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 16 cgctgctata attgaacgtg ag 22
【０１３７】 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 ctttgttgcc atatctgtgc gacgctgcta taattgaacg tgag 44
【０１３８】 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 ccaccacgaa gtcggtggcg g 23
【０１３９】 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 19 ttggagcctc gaagcctgga a 21
【０１４０】 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum <400> 20 tggtcatatc tgtgcgacgc tgccataat 29
【０１４１】 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: sequence of promoter <400> 21 tggtcatatc tgtgcgacgc tgctataat 29
【０１４２】 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: sequence of promoter <400> 22 ttgccatatc tgtgcgacgc tgctataat 29
【０１４３】 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 agacctacga gtccgccttt ttg 23
【０１４４】 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 cgatcaccag caacccacgc a 21
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 泉井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 川嶋 伸樹 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社川崎工場内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA10 BA74 CA04 DA05 EA04 FA13 GA14 4B050 CC03 DD02 LL02 LL05 4B064 AE19 CA19 CA21 CC24 DA10 4B065 AA24X AA24Y AA27X AA27Y AB01 BA02 CA17 CA29 CA41
Claims (11)
- 【請求項１】 Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ細胞
内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型
細菌。 - 【請求項２】 グルタミンシンテターゼ活性の増強が、
グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数
を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテ
ターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同
遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである
請求項１記載の細菌。 - 【請求項３】 グルタミンシンテターゼ活性の増強が、
細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化による
活性調節が解除されたことによるものである請求項１記
載の細菌。 - 【請求項４】 細胞内のグルタミンシンテターゼのアデ
ニリル化による活性調節の解除が、アデニリル化による
活性調節が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細
菌に保持させること、前記細菌細胞内のグルタミンシン
テターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下し
たこと、又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低
下したことのいずれか一つ又は２以上によるものである
請求項３記載の細菌。 - 【請求項５】 さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性が増強された請求項１〜４のいずれか一項に記載の細
菌。 - 【請求項６】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増
強が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグル
タミンシンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強さ
れるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによ
るものである請求項５記載の細菌。 - 【請求項７】 請求項１〜６いずれか一項に記載の細菌
を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミ
ンの製造法。 - 【請求項８】 下記（Ａ）または（Ｂ）に示すたんぱく
質をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質。 （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ活性を有するたんぱく質。 - 【請求項９】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項８記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
５９〜１９９６からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有す
るたんぱく質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１０】 下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すたんぱ
く質をコードするＤＮＡ。 （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するたんぱ
く質 （Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミン
シンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有
するたんぱく質。 - 【請求項１１】 下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡで
ある請求項１０記載のＤＮＡ。 （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
００６〜５２００からなる塩基配列又は同塩基配列から
調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニ
リルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコー
ドするＤＮＡ。
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