BR112013016373B1 - método para produzir uma substância alvo - Google Patents

método para produzir uma substância alvo Download PDF

Info

Publication number
BR112013016373B1
BR112013016373B1 BR112013016373-9A BR112013016373A BR112013016373B1 BR 112013016373 B1 BR112013016373 B1 BR 112013016373B1 BR 112013016373 A BR112013016373 A BR 112013016373A BR 112013016373 B1 BR112013016373 B1 BR 112013016373B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gene
strain
activity
xylose
acid
Prior art date
Application number
BR112013016373-9A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013016373A2 (pt
Inventor
Yousuke Nishio
Youko Yamamoto
Kazuteru Yamada
Kosuke Yokota
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc filed Critical Ajinomoto Co., Inc
Publication of BR112013016373A2 publication Critical patent/BR112013016373A2/pt
Publication of BR112013016373B1 publication Critical patent/BR112013016373B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01113—L-Xylose 1-dehydrogenase (1.1.1.113)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01026—2,5-Dioxovalerate dehydrogenase (1.2.1.26)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/05—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with a quinone or related compound as acceptor (1.3.5)
    • C12Y103/05001—Succinate dehydrogenase (ubiquinone) (1.3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01068—Xylono-1,4-lactonase (3.1.1.68)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01082—Xylonate dehydratase (4.2.1.82)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA ALVO. A invenção diz respeito a uma substância alvo que é produzida cultivando uma bactéria com uma capacidade de produzir ácido 2-cetoglutárico ou um derivado deste como uma substância alvo, e com uma capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose, que é fornecida pela atividade de xilonato desidratase, atividade de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, ou na qual estas atividades são melhores, em um meio contendo xilose como uma fonte de carbono para produzir e acumular a substância alvo no meio, e coletando a substância alvo do meio.

Description

Campo Técnico
[0001] A presente invenção diz respeito a um método para produzir uma substância alvo por fermentação, tal como L-aminoácidos, usando um microrganismo, mais precisamente um método como este para produzir uma substância alvo por fermentação usando xilose como uma matéria-prima.
Fundamentos da Técnica
[0002] Os métodos para produzir uma substância alvo por fermentação, tal como L-aminoácidos, usando uma bactéria incluem métodos de usar uma bactéria tipo selvagem (cepa tipo selvagem), métodos de usar uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa tipo selvagem, métodos de usar uma cepa mutante de regulação metabólica derivada de uma cepa tipo selvagem, tal como uma cepa resistente a vários medicamentos, métodos de usar uma cepa com propriedades tanto de cepa auxotrófica quanto de cepa mutante de regulação metabólica, entre outros.
[0003] Por exemplo, o ácido L-glutâmico é produzido principalmente por fermentação, usando uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico do grupo das assim denominadas bactérias corineformes, que pertencem ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium, ou uma cepa mutante destas (referência, por exemplo, ao documento não associado à patente 1). Como métodos para produzir ácido L-glutâmico usando outras cepas existem métodos conhecidos que utilizam um microrganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou similares (referência, por exemplo, ao documento de patente 1), métodos que utilizam um microrganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida ou similares (referência, por exemplo, ao documento de patente 2), métodos que utilizam um microrganismo pertencente ao gênero Bacillus, ou Aerobacter aerogenes (atualmente Enterobacter aerogenes) ou similares (referência, por exemplo, ao documento de patente 3), métodos que utilizam uma cepa mutante de Escherichia coli (referência, por exemplo, ao documento de patente 4), entre outros. Além disso, são também revelados os métodos de produzir ácido L-glutâmico usando um microrganismo pertencente ao gênero Klebsiella, Erwinia, Pantoea ou Enterobacter (referência, por exemplo, aos documentos de patente 5 a 7).
[0004] Nos últimos anos, as técnicas de DNA recombinante estão sendo usadas na produção de substâncias alvo por fermentação. Por exemplo, a produtividade de L-aminoácido de uma bactéria é maior melhorando a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-aminoácido (documentos de patente 8 e 9), ou melhorando a absorção de uma fonte de carbono no sistema de biossíntese de L-aminoácido (documento de patente 10).
[0005] Na produção industrial convencional de substâncias por fermentação, os sacarídeos foram usados como uma fonte de carbono, isto é, glicose, frutose, sacarose, melado, amido hidrolisado, entre outros, mas estes são relativamente caros, e o uso de matérias-primas de biomassa derivadas a partir de plantas e similares também avançou nos últimos anos.
[0006] Embora as matérias-primas incluem porções comestíveis, tais como amido, gorduras e óleos, sejam usadas principalmente como tais matérias-primas de biomassa até o momento, é necessário alterar no futuro tais matérias-primas de biomassa por aquelas às quais incluem porções não comestíveis, especificamente celulose, hemicelulose, lignina entre outros. A celulose e hemicelulose, como biomassa não comestível, são convertidas em pentoses ou hexoses por meio de um pré-tratamento usando calor ou ácido, e um tratamento de sacarificação usando uma enzima celulase, e estas podem ser usadas como matérias-primas em fermentação (documentos de patente 11 e 12). Sabe-se que se os sacarídeos mistos de tais pentoses ou hexoses forem usados como a matéria-prima para a fermentação de aminoácido etc., Escherichia coli assimila preferivelmente a glicose e, em função disso, foram observados os fenômenos de proliferação de duas etapas (diauxia), retardo no crescimento etc. (Documento não associado às patentes 2 e 3)
[0007] Em Escherichia coli, é conhecida uma via de assimilação de xilose compreendendo xilose isomerase codificada pelo gene xylA, e xiluloquinase codificada pelo gene xylB, e também sabe-se que os L- aminoácidos podem ser produzidos a partir da xilose introduzindo esta via em Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum (Documento não associado à patente 5, documento de patente 13, documento não associado à patente 7).
[0008] Relata-se também que Caulobacter crescentus e Haloferax volcanii apresentam uma via de converter a xilose em ácido 2-cetoglutárico por meio do ácido xilônico em cinco etapas, não usando uma via como esta, convencionalmente conhecida, da maneira descrita anteriormente (Documento não associado à patente 6). Além do mais, os exemplos de expressão desta via em Escherichia coli também são conhecidos (Documento não associado à patente 8, documento de patente 14).
Referências da Técnica Prévia
[0009] Documentos de patente: Documento de patente 1: patente U.S. 3.220.929. Documento de patente 2: patente U.S. 3.563.857. Documento de patente 3: Publicação de patente Japonesa (Kokoku) No. 32-9393. Documento de patente 4: Patente Japonesa submetida ao domínio público (Kokai) No. 5-244970. Documento de patente 5: Patente Japonesa submetida ao domínio público 2000-106869 Documento de patente 6: Patente Japonesa submetida ao domínio público 2000-189169. Documento de patente 7: Patente Japonesa submetida ao domínio público 2000-189175. Documento de patente 8: patente U.S. 5.168.056. Documento de patente 9: patente U.S. 5.776.736. Documento de patente 10: patente U.S. 5.906.925. Documento de patente 11: Patente Japonesa submetida ao domínio público, com base no pedido PCT (Kohyo) No. 9-507386. Documento de patente 12: Patente Japonesa submetida ao domínio público, com base no pedido PCT No. 11-506934. Documento de patente 13: Patente Europeia 1577396. Documento de patente 14: patente U.S. 7.923.226. Documento não associado às patentes: Documento não associado à patente 1: Akashi K. et al., Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, pp.195-215, 1986. Documento não associado à patente 2: Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., julho de 2001, 56(1-2):120-125. Documento não associado à patente 3: Gonzalez, R., Biotechnol. Prog., Jan-Fev de 2002, 18(1):6-20. Documento não associado à patente 4: Song S. et al., J. Bacteriol., nov de 1997, 179 (22):7025-7032. Documento não associado à patente 5: Tao H. et al., J. Bacteriol., maio de 2001, 183 (10):2979-2988. Documento não associado à patente 6: Stephens, C. et al., J. Bacteriol., março de 2007, 189 (5):2181-2185. Documento não associado à patente 7: Gopinath, V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 28 de julho de 2011 Documento não associado à patente 8: Huaiwei, L et al., Bioresour Technol., 22 de agosto de 2011.
Sumário da Invenção Objetivo a ser atingido pela invenção
[0010] Um objetivo da presente invenção é fornecer um microrganismo que pode produzir de maneira eficiente uma substância alvo, tal como ácido L-glutâmico, em um meio contendo xilose, e um método para produzir uma substância alvo usando um microrganismo como este.
Meios para Atingir o Objetivo
[0011] Os inventores da presente invenção estudaram o desenvolvimento de um microrganismo que se reproduz utilizando a via de conversão da xilose em ácido 2-cetoglutárico, por meio do ácido xilônico, com o propósito de desenvolver uma bactéria produtora de aminoácido com uma capacidade de assimilar pentose ou hexose na reprodução. Em função disso, observou-se que um microrganismo que expressa uma via como esta, da maneira descrita anteriormente, pode assimilar a xilose de maneira eficiente e realizar a presente invenção.
[0012] A presente invenção diz respeito assim ao seguinte: (1) Um método para produzir uma substância alvo, compreendendo cultivar uma bactéria com uma capacidade de produzir a substância alvo em um meio contendo xilose, como uma fonte de carbono, para produzir e acumular a substância alvo no meio, e coletar a substância alvo a partir do meio, em que: a substância alvo é ácido 2-cetoglutárico ou um derivado deste, a bactéria apresenta uma capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose, e atividade de xilonato desidratase, atividade de 2- ceto-3-desoxixilonato desidratase e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase foram transmitidas ou melhoradas na bactéria. (2) O método da maneira descrita anteriormente, em que as atividades enzimáticas de xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase foram transmitidas ou melhoradas na bactéria introduzindo genes que codificam as enzimas, respectivamente, em formas que podem ser expressas na bactéria. (3) O método da maneira descrita anteriormente, em que o gene que codifica cada uma de xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase é derivado de um microrganismo pertencente ao gênero Caulobacter, Escherichia, Agrobacterium, Herbaspirillum, Actinoplanes, Cupriavidus, Pseudomonas, Zobellia, Thermobacillus, Arthrobacter, Azospirillum, Halomonas, Bacillus ou Aspergillus. (4) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria pode produzir ácido xilônico a partir de xilose, em decorrência de cada uma das seguintes características: (A) atividade de xilose desidrogenase, ou atividade de xilose desidrogenase e atividade de xilonolactonase foram transmitidas ou melhoradas na bactéria, ou (B) a bactéria apresenta atividade de glicose desidrogenase que pode catalisar uma reação que produz ácido xilônico a partir de xilose. (5) O método da maneira descrita anteriormente, em que a glicose desidrogenase usa pirroloquinolina quinona como uma coenzima, e a bactéria exibe atividade de glicose desidrogenase em decorrência de sua capacidade de produzir pirroloquinolina quinona, ou é cultivada em um meio contendo pirroloquinolina quinona. (6) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria pode produzir ácido xilônico a partir de xilose, em decorrência de ser introduzida com um gene que codifica xilose desidrogenase, ou genes que codificam xilose desidrogenase e xilonolactonase em formas que podem ser expressas. (7) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria foi modificada de maneira tal que a atividade de 2-cetoglutarato desidrogenase seja reduzida. (8) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria foi modificada adicionalmente, de maneira tal que a atividade de succinato desidrogenase seja reduzida. (9) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é uma enterobactéria ou uma bactéria corineforme. (10) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea. (11) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é Pantoea ananatis. (12) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia. (13) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é Escherichia coli. (14) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Corynebacterium. (15) O método da maneira descrita anteriormente, em que a bactéria é Corynebacterium glutamicum. (16) O método da maneira descrita anteriormente, em que o ácido 2-cetoglutárico derivado é uma substância selecionada do grupo que consiste em ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-arginina, L-citrulina, L- ornitina, L-prolina, putrescina e ácido Y—aminobutirico.
Breve Descrição dos Desenhos
[0013] A figura 1 retrata gráficos que exibem resultados de um teste de complementação de crescimento para a cepa que expressa operon NXA derivada de C. crescentus, usando uma cepa deficiente com relação ao gene icd. E1-αKG, M9-αKG, M9-Xyl e E1-Xyl representam o meio mínimo M9 ou o meio sintético E1, contendo ácido 2-cetoglutárico ou xilose como uma única fonte de carbono, respectivamente.
[0014] A figura 2 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico por meio do cultivo da cepa de E. coli, que produz ácido L- glutâmico e que expressa o operon ccrNXA de E. coli.
[0015] A figura 3 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico por meio do cultivo de uma cepa que expressa o operon ccrNXA, usando uma cepa deficiente na via de assimilação de xilose, característico em E. coli como um hospedeiro.
[0016] A figura 4 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico por meio do cultivo de uma cepa que expressa o operon ccrNXA, utilizando um tipo de plasmídeo com número médio de cópias.
[0017] A figura 5 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico por meio do cultivo de cepas que expressão o gene homólogo xylD, derivadas de vários tipos de microrganismos. Atu, Hse, Amis e Aor representam Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirillum seropedicae, Actinoplanes missouriensis, e Aspergillus oryzae, respectivamente.
[0018] A figura 6 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico pelo cultivo de cepas que expressam o homólogo xylX, derivadas de vários tipos de microrganismos. Art, Atu, Cne, Zga, Tco e Selo representam Arthrobacter globiformis, Agrobacterium tumefaciens, Cupriavidus necator, Zobellia galactanivorans, Thermobacillus composti, e Pseudomonas elodea, respectivamente.
[0019] A figura 7 retrata gráficos que exibem resultados da produção de ácido L-glutâmico pelo cultivo de cepas que expressam o homólogo xylA, derivadas de vários tipos de microrganismos. Hbo e Abr representam Halomonas boliviensis e Azospirillum brasilense, respectivamente.
Modalidades para Realizar a Invenção:
[0020] O método da presente invenção é um método para produzir uma substância alvo, compreendendo cultivar uma bactéria com uma capacidade de produzir a substância alvo, em um meio contendo xilose como uma fonte de carbono, para produzir e acumular a substância alvo no meio, e coletar a substância alvo a partir do meio, em que: a substância alvo é ácido 2-cetoglutárico ou um derivado deste, e a bactéria apresenta uma capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose, e a atividade de xilonato desidratase, atividade de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase foram transmitidas ou melhoradas na bactéria.
[0021] A substância alvo é ácido 2-cetoglutárico (a-cetoglutárico ácido, αKG) ou um derivado deste. Exemplos do derivado de ácido 2-cetoglutárico incluem ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-arginina, L-citrulina, L-ornitina, L-prolina, putrescina e ácido Y-aminobutírico.
[0022] A “capacidade de produzir uma substância alvo” significa uma capacidade da bactéria usada pela presente invenção de produzir uma substância alvo, em um grau tal que a substância alvo possa ser coletada das células ou meio, quanto é cultivada no meio, preferivelmente uma capacidade de produzir a substância alvo em uma quantidade maior, comparada àquela obtida com uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada cultivada nas mesmas condições. A bactéria pode apresentar uma capacidade de produzir dois ou mais tipos de substâncias alvo.
[0023] A substância alvo inclui um composto como a substância alvo em uma forma livre e/ou um sal deste, por exemplo, sulfato, cloridrato, carbonato, sal de amônio, sal de sódio, sal de potássio, entre outros.
[0024] 1. Bactéria da presente invenção
[0025] A bactéria da presente invenção é uma bactéria com uma capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose, cuja atividade de xilonato desidratase, atividade de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase foram transferidas, ou em que estas atividades foram melhoradas.
[0026] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que não é inerente com a atividade de xilonato desidratase, atividade de 2-ceto-3- desoxixilonato desidratase, e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, mas recebeu a informação destas atividades enzimáticas, ou uma bactéria com estas atividades enzimáticas inerentes, nas quais estas atividades enzimáticas são melhoradas.
[0027] A capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose é atingida, por exemplo, por um ou ambos de: 1) fornecimento ou melhoria da atividade de xilose desidrogenase, e 2) posse de atividade de glicose desidrogenase que pode catalisar a reação que produz ácido xilônico a partir de xilose.
[0028] Exemplos de microrganismo para os quais os significados de 1) podem ser aplicados incluem as bactérias do gênero Escherichia e bactérias corineformes, e exemplos de microrganismo com a propriedade de 2) incluem bactérias do gênero Pantoea, entre outros.
[0029] Quanto aos significados de 1), além da atividade de xilose desidrogenase, a atividade de xilonolactonase também pode ser melhorada.
[0030] As bactérias que pertencem a estes gêneros serão explicadas posteriormente.
[0031] O ácido xilônico produzido a partir da xilose é convertido em ácido 2-cetoglutárico por xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase. A via na qual a xilose é convertida em ácido 2-cetoglutárico por xilonato desidratase, 2-ceto- 3-desoxixilonato desidratase e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase também é denominada via de Weimberg (J. Biol. Chem., 236:629-636). Nesta especificação, ao via Weimberg e, além da via Weimberg, a via na qual a xilose é convertida em ácido xilônico por xilose desidrogenase e/ou xilonolactonase, podem ser referidas coletivamente como via NXA (assimilação de xilose inédita).
[0032] Se uma bactéria apresenta a via Weimberg, ou esta via for introduzida em uma bactéria, esta pode ser determinada medindo as atividades enzimáticas de xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase em um extrato da bactéria, ou confirmando a assimilação de ácido xilônico, que é acumulado em uma cepa que não apresenta a via Weimberg. Além disso, se uma bactéria apresenta a via NXA, ou esta via foi introduzida em uma bactéria, esta pode ser determinada medindo as atividades enzimáticas de xilose desidrogenase e/ou xilonolactonase, além das enzimas mencionadas anteriormente. Além disso, estas atividades enzimáticas também podem ser determinadas medindo o ácido xilônico produzido a partir da xilose.
[0033] Na presente invenção, a xilonato desidratase é uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC4.2.1.82), e também é denominada D-xilo-aldonato desidratase, D-xilonato desidratase, ou D- xilonato hidrolase. Ácido D-xilônico -> 2-desidro-3-desoxi-D-xilonato + H2O
[0034] A atividade de xilonato desidratase pode ser medida, por exemplo, misturando uma solução de ácido D-xilônico e uma amostra de teste para permitir a reação, finalizando a reação a seguir com a adição de uma solução de parada que compreende solução aquosa a 1 % de cloridrato de semicarbazida e uma solução aquosa a 1,5 % de acetato de sódio, e medindo a absorbância de uma solução de reação diluída em 250 nm (Dahms, A.S., et al., Methods Enzymol., 1982, 90 Pt E:302-5).
[0035] Na presente invenção, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase (2- ceto-3-desoxi-xilonato desidratase) é uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC4.2.1-). 2-Desidro-3-desoxi-D-xilonato -> 2-semialdeído oxoglutárico + H2O
[0036] A atividade de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase pode ser medida, por exemplo, misturando uma solução de ácido 2-ceto-3- desoxixilônico como o substrato e uma amostra de teste para permitir a reação, e medindo a seguir a diminuição de ácido 2-ceto-3-desoxixilônico.
[0037] Na presente invenção, 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase é uma oxidorredutase que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC1.2.1.26). 2-Semialdeído oxoglutárico + NAD(P) -> ácido 2-oxoglutárico + NAD(P)H
[0038] A atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase pode ser medida, por exemplo, medindo a redução de NAD(P). Por exemplo, a atividade desta enzima pode ser medida adicionando 2-semialdeído cetoglutárico a uma mistura de ácido fosfórico (pH 8,5), NAD(P) e uma amostra de teste, e medindo a absorbância da mistura de reação em 340 nm (Adams, E., et al., J. Biol. Chem., 1967, 242, 1802-1814).
[0039] A xilose desidrogenase (D-xilose-1-desidrogenase) é uma das dismutases para uma pentose e ácido glucurônico, e é uma oxidorredutase que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC1.1.1.175). D-Xilose + NAD(P)+ -> D-xilonolactona + NAD(P)H + H+
[0040] A atividade de D-xilose-1-desidrogenase pode ser medida, por exemplo, misturando xilose, uma amostra de teste e NAD(P) para permitir a reação, e medindo a absorbância da mistura de reação em 340 nm (Stephens, C. et al., J. Bacteriol., 2007, 189(5):181-2185).
[0041] A xilose desidrogenase de Caulobacter crescentus pode catalisar a reação que converte D-xilose em ácido xilônico.
[0042] Na presente invenção, xilonolactonase é uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC3.1.1.68). D-xilonolactona -> ácido D-xilônico
[0043] A atividade de xilonolactonase pode ser medida, por exemplo, misturando xilonolactona e uma amostra de teste para permitir a reação, e quantificando a xilonolactona restante, de acordo com o método de hidroxamato (Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:375-379, 1988; Appl. Microbiol., Biotechnol., 27:333-336, 1988).
[0044] Os genes que codificam as enzimas, xilonato desidratase, 2-ceto- 3-desoxixilonato desidratase, e 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, podem ser aqueles de qualquer microrganismo com a via Weimberg e os exemplos incluem, por exemplo, genes derivados de um microrganismo tal como uma bactéria que pertence ao gênero Caulobacter, Escherichia, Agrobacterium, Herbaspirillum, Actinoplanes, Cupriavidus, Pseudomonas, Zobellia, Thermobacillus, Arthrobacter, Azospirillum, Halomonas, Bacillus, ou fungos filamentosos que pertencem ao gênero Aspergillus.
[0045] Os exemplos da bactéria Caulobacter incluem Caulobacter crescentus.
[0046] Assim como Caulobacter crescentus, a cepa CB-15 e a cepa CB- 13 são conhecidas e armazenadas no American Type Culture Collection (Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América) como ATCC 19089 e ATCC 33532, respectivamente. Além disso, a cepa NA- 1000 (J. Bacteriol., 192:3678-88, 2010) e a cepa K31 também podem ser usadas.
[0047] As sequências do genoma das cepas de Caulobacter crescentus CB15, NA1000, e K31 são registradas como os números de acesso ao GenBank AE005673, CP001340 e CP000927, respectivamente.
[0048] Os genes das enzimas das cepas de Caulobacter crescentus CB15, NA1000, e K31 são registrados no GenBank com os símbolos de gene a seguir. Tabela 1
Figure img0001
[0049] Além disso, o gene da xilose desidrogenase e o gene da 2- semialdeído cetoglutárico desidrogenase de Caulobacter crescentus podem ser referidos como ccrxylB e ccrxylA, respectivamente.
[0050] Além disso, os exemplos das enzimas da via NXA (assimilação da xilose inédita) via incluem, além daquelas das bactérias do gênero Caulobacter, por exemplo, xilose desidrogenase de Hypocrea jecorina (Trichoderma ressei) (FEMS Microbiol. Lett., 277, 249-254, 2007); ycbD de Bacillus subtilis (2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, tipo III); 2- semialdeído cetoglutárico desidrogenase (tipo II) de Pseudomonas putida; 2- semialdeído cetoglutárico desidrogenase, tipo I, tipo II, tipo III de Azospirillum brasilense (J. Bac. Chem., 282, 6685-6695, 2007 para estas) e homólogos destas.
[0051] Em particular, assim como o gene de xilonato desidratase, o gene de yjhG e o gene de yagF de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia, tal como Escherichia coli, podem ser usados. O gene yjhG de Escherichia coli é mostrado em SEQ ID NO: 34, e o gene yagF de Escherichia coli é mostrado em SEQ ID NO: 36. Além disso, quanto à xilonato desidratase, os homólogos do gene xylD de microrganismos que pertencem ao gênero Agrobacterium, Herbaspirillum, Actinoplanes, ou Aspergillus, tais como Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirillum seropedicae, Actinoplanes missouriensis e Aspergillus oryzae, também podem ser usados.
[0052] Além disso, quanto à 2-ceto-desoxixilonato desidratase, os homólogos do gene xylX de bactérias que pertencem ao gênero Agrobacterium, Pseudomonas, Zobellia, Thermobacillus, ou Arthrobacter, tais como Agrobacterium tumefaciens, Cupriavidus necator, Pseudomonas elodea, Zobellia galactanivorans, Thermobacillus composti, e Arthrobacter globiformis, também podem ser usados.
[0053] Além disso, quanto a 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, os genes de bactérias que pertencem ao gênero Azospirillum, Halomonas, ou Bacillus, tais como os homólogos do gene xylA de Azospirillum brasilense e Halomonas boliviensis e ycbD de Bacillus subtilis, também podem ser usados.
[0054] As sequências de nucleotídeos dos genes anteriormente mencionados e sequências de aminoácidos codificadas por estes são mostradas a tabela 11.
[0055] Em Caulobacter crescentus, os genes das cinco enzimas da via NXA constituem uma estrutura de operon da maneira descrita anteriormente. A sequência de nucleotídeos deste operon é registrada no GenBank como o número de acesso AAK22808_Caulobacter_crescentus. A sequência de nucleotídeos deste operon é mostrada em SEQ ID NO: 23. As sequências de aminoácidos de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase, xilose desidrogenase e xilonolactonase codificadas por este operon são mostradas em SEQ ID NOS: 24 a 27, respectivamente. Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene xylD neste operon, e as sequências de aminoácidos de xilonato desidratase codificadas por ele são mostradas em SEQ ID NOS: 28 e 29, respectivamente. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 28 corresponde às posições 5.509 a 7.296 da sequência de SEQ ID NO: 23.
[0056] Embora dois sítios sejam sugeridos como o códon inicial de xylX, as posições 1.175 a 1.177 são descritas como o códon inicial em SEQ ID NO: 23. Dois códons iniciais também são sugeridos para xylD, e as posições 1 a 3 ou as posições 13 a 15 de SEQ ID NO: 28 pode ser usadas como o códon inicial. Quando as posições 13 a 15 são consideradas como o códon inicial, a sequência de aminoácidos de xilonato desidratase de SEQ ID NO: 29 inicia a partir de Leu da posição 5.
[0057] Embora a glicose desidrogenase seja originalmente uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir (EC1.1.1.119), a “glicose desidrogenase que pode catalisar a reação que produz ácido xilônico a partir de xilose” significa uma enzima que pode converter D-xilose em D- xilonolactona usando pirroloquinolina quinona como uma coenzima. β-D-Glicose + NADP -> D-glucono-1,5-lactona + NADPH + H+
[0058] A pirroloquinolina quinona pode ser produzida por uma capacidade que o microrganismo possui originalmente, ou pode ser adicionada ao meio (Appl. Environ. Microbiol., 2009 May, 75(9) 2784-2791).
[0059] Na presente invenção, assim como a bactéria que produz ácido 2- cetoglutárico ou um derivado deste, é desejável que a decomposição por meio do ácido 2-cetoglutárico seja atenuada ou eliminada. Assim como atenuação ou eliminação da decomposição por meio do ácido 2-cetoglutárico, é desejável que as atividades ou a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou succinato desidrogenase sejam(seja) atenuadas ou eliminadas. Na presente invenção, a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (de agora em diante também referida como “α-KGDH”) significa uma atividade de catalisar a reação descarboxilando de maneira oxidativa o ácido a-cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico) para gerar succinil-CoA. A reação anteriormente mencionada é catalisada por três tipos de enzimas, α-KGDH (E1o, α-cetoglutarato desidrogenase, EC:1.2.4.2), diiodrolipoamida S-succiniltransferase (E2o, EC: 2.3.1.61), e diiodrolipoamida desidrogenase (E3, EC:1.8.1.4). Isto é, estes três tipos de subunidades catalisam as reações a seguir, respectivamente, e a atividade para catalisar uma reação que consiste em uma combinação destes três tipos de reações é denominada a atividade de α-KGDH. A atividade de α- KGDH pode ser confirmada por medições de acordo com o método de Shiio et al. (Isamu Shiio e Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44 (8), 1897-1904, 1980). E1o: 2-oxoglutarato + [succiniltransferase do resíduo de diidrolipoilisina] lipoilisina = [succiniltransferase do resíduo de diidrolipoilisina] S-succinildiidrolipoilisina + CO2 E2o: CoA + enzima N6-(S-succinildiidrolipoil)lisina = succinil- CoA + enzima N6-(diidrolipoil)lisina E3: proteína N6-(diidrolipoil)lisina + NAD+ = proteína N6- (lipoil)lisina + NADH + H+ α-KGDH também é denominada oxoglutarato desidrogenase ou 2-oxoglutarato desidrogenase.
[0060] Em bactérias da família Enterobacteriaceae, tal como Pantoea ananatis, as subunidades proteicas com estes três tipos de atividades enzimáticas, respectivamente, formam um complexo. As subunidades são codificadas pelos genes sucA, sucB e lpd, respectivamente, e os genes sucA e sucB existem à jusante do gene da proteína de ferro-enxofre e succinato desidrogenase (sdhB) (patente U.S. 6.331.419). Embora estes genes sejam descritos como os genes de Enterobacter agglomerans AJ13355 na patente anteriormente mencionada, esta cepa foi reclassificada recentemente em Pantoea ananatis.
[0061] Assim como os genes que codificam α-KGDH de enterobactérias, as sequências de nucleotídeos do gene sucA, do gene sucB e do gene sucC que existem em uma região à jusante, e as sequências de aminoácidos das subunidades de Pantoea ananatis, são reveladas no pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 2100957 A1. Além disso, os genes sucA, sucB e sucC que codificam α-KGDH de Escherichia coli foram submetidos ao domínio público como Genbank NP_415254 e NP_415255, respectivamente.
[0062] Em bactérias corineformes, a subunidade E1o é codificada pelo gene odhA (registrado como NCgl1084 no número de acesso ao GenBank NC_003450, que também é denominado gene sucA), e a subunidade E3 é codificada pelo gene lpd (número de acesso ao GenBank Y16642). por outro lado, estima-se que a subunidade E2o é codificada pelo gene odhA junto com a subunidade E1o como uma proteína bifuncional (Usuda et al., Microbiology, 142, 3347-3354, 1996), ou codificada pelo gene registrado como NCgl2126, no número de acesso ao GenBank NC_003450, que é diferente do gene odhA. Portanto, na presente invenção, embora o gene odhA seja um gene que codifica a subunidade E1o, este também pode codificar E2o.
[0063] A sequência de nucleotídeos do gene odhA de Brevibacterium lactofermentum e a sequência de aminoácidos da subunidade E1o assim codificada (WO2006/028298), a sequência de nucleotídeos de NCgl2126 anteriormente mencionada com o número de acesso ao GenBank NC_003450, e a sequência de aminoácidos da subunidade E2o assim codificada, bem como a sequência de nucleotídeos de NCgl1084 anteriormente mencionada com o número de acesso ao GenBank NC_003450, e a sequência de aminoácidos da subunidade E1o assim codificada são reveladas no pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 2100957 A1.
[0064] Na presente invenção, os genes que codificam cada uma das subunidades de α-KGDH, e o agrupamento do gene contendo-os, podem ser denominados genericamente como os “genes que codificam α-KGDH”.
[0065] A succinato desidrogenase (de agora em diante também referida como “SDH”) é uma enzima de EC:1.3.99.1, que catalisa reversivelmente a reação a seguir. Na presente invenção, a atividade de SDH significa a atividade para catalisar esta reação. Ácido succínico + FAD -> ácido fumárico + FADH2
[0066] A SDH é composta por três ou quatro estruturas de subunidade que dependem do tipo de microrganismo, e a atividade desta pode ser diminuída ou eliminada modificando pelo menos uma destas proteínas, de maneira tal que não funcionem normalmente. Especificamente, a SDH é composta nas subunidades a seguir (os nomes dos genes que codificam as subunidades são descritas entre parênteses), e a proteína de ancoragem de membrana é codificada apenas por sdhC ou por sdhC e sdhD, dependendo da espécie. SDHA: subunidade de flavoproteína (sdhA) SDHB: subunidade de proteína Fe-S (sdhB) SDHC: proteína de ancoragem de membrana (sdhC) SDHD: proteína de ancoragem de membrana (sdhD)
[0067] Além disso, o complexo de subunidade de SDH pode apresentar as atividades tanto de SDH quanto de fumarato redutase. Por exemplo, o complexo de subunidade de SDH das bactérias corineformes apresenta as atividades tanto de SDH quanto de fumarato redutase (WO2005/021770).
[0068] A atividade de SDH pode ser confirmada medindo a redução de 2,6-dicloroindofenol (DCIP) como um índice indicativo. Um método específico é descrito em Tatsuki Kurokawa e Junshi Sakamoto, Arch. Microbiol., (2005) 183:317-324.
[0069] Na presente invenção, os genes que codificam as subunidades de SDH, e o operon contendo as mesmas, podem ser denominados genericamente como os “genes que codificam SDH.”
[0070] Assim como os genes que codificam SDH de enterobactérias, as sequências de nucleotídeos de tais genes de Pantoea ananatis e as sequências de aminoácidos das subunidades são reveladas em WO2008/075483.
[0071] Assim como os genes que codificam SDH de bactérias corineformes, por exemplo, são reveladas as sequências do operon sdh de Corynebacterium glutamicum (número de acesso ao GenBank NCgl0359 (sdhC) NCgl0360 (sdhA) NCgl0361 (sdhB)), e do operon sdh de Brevibacterium flavum (patente Japonesa submetida ao domínio público 2005-095169, pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 1672077 A1, WO2008/075483).
[0072] Para reduzir ou eliminar as atividades de α-KGDH e SDH, podem ser usados os métodos recentemente descritos para a redução da atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica a partir da via de biossíntese do ácido L-glutâmico, e produz outros compostos.
[0073] Além disso, no microrganismo da presente invenção, a atividade de uma enzima que incorpora xilose nas células pode ser adicionalmente melhorada.
[0074] Os exemplos da enzima que incorpora xilose nas células incluem D-xilose permease, e exemplos de gene que codifica D-xilose permease incluem o gene xylE. A sequência de nucleotídeos do gene xylE de Escherichia coli que codifica a D-xilose permease, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 30 e 31, respectivamente.
[0075] Além disso, é desejável que, no microrganismo da presente invenção, a xilose isomerase (xylA) e xilulose quinase (xylB) sejam atenuadas. O gene da xilose isomerase (xylA) e o gene da xilulose quinase (xylB) de Escherichia coli são revelados como NC000913.1 gi:16131436 e 16131435, respectivamente.
[0076] Na presente invenção, o ácido xilônico pode ser acumulado no meio e, especialmente em Escherichia coli, é desejável que a atividade de xilonato desidratase seja adicionalmente melhorada. Por exemplo, é preferivelmente melhor, de maneira tal que mostre a atividade desta em 10 μmol/min/mg de proteína ou mais, desejavelmente 15 μmol/min/mg proteína ou mais, mais desejavelmente 17 μmol/min/mg proteína ou mais.
[0077] Os métodos para fornecer a atividade de uma enzima alvo para um microrganismo, ou para aumentar a atividade de uma enzima alvo de um microrganismo serão explicados a seguir.
[0078] Quando o microrganismo não apresenta originalmente a atividade de uma enzima alvo, a atividade de uma enzima alvo pode ser fornecida para o microrganismo introduzindo um gene de enzima alvo no microrganismo. Além disso, quando o microrganismo apresenta atividade de uma enzima alvo, introduzindo um gene estrangeiro de enzima alvo, aumentando o número de cópias do gene de enzima alvo endógena, ou modificando uma sequência de controle de expressão, tal como o promotor do gene de enzima alvo para aumentar a expressão do gene, a atividade de uma enzima alvo pode ser maior. Na presente invenção, a expressão “introduzir um gene de enzima alvo” significa não apenas introduzir um gene de enzima alvo em um microrganismo que não apresenta originalmente a atividade da enzima alvo, mas também introduzir um gene estrangeiro de enzima alvo em um microrganismo com atividade da enzima alvo, e introduzir um gene de enzima alvo endógeno em um microrganismo com atividade da enzima alvo para alimentar a expressão do gene de enzima alvo endógeno.
[0079] A fim de introduzir um gene de enzima alvo, por exemplo, o gene de enzima alvo é clonado em um vetor apropriado, e um microrganismo hospedeiro é transformado com o vetor obtido.
[0080] Os exemplos do vetor usado para transformação incluem um plasmídeo que pode se replicar autonomamente em um microrganismo de escolha. Os exemplos de plasmídeo que se replicam autonomamente em um microrganismo pertencente à família Enterobacteriaceae incluem pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pTWV228, pTWV229 (os vetores da série pHSG, pSTV e pTWV são disponíveis pela Takara Bio), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (os vetores da série pMW são disponíveis pela Nippon Gene) entre outros. Além disso, os plasmídeos das bactérias corineformes incluem pAM330 (patente Japonesa submetida ao domínio público 58-67699), pHM1519 (patente Japonesa submetida ao domínio público 58-77895), pSFK6 (patente Japonesa submetida ao domínio público 2000-262288), pVK7 (pedido de patente publicada U.S. 2003/0175912), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (patente Japonesa submetida ao domínio público 58-192900), pCG1 (patente Japonesa submetida ao domínio público 57-134500), pCG2 (patente Japonesa submetida ao domínio público 58-35197), pCG4, pCG11 (patente Japonesa submetida ao domínio público 57-183799), pHK4 (patente Japonesa submetida ao domínio público 5-7491) entre outros.
[0081] Os exemplos de métodos de transformação incluem tratar as células receptoras com cloreto de sódio para aumentar a permeabilidade com relação ao DNA, que foi relatada em Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162), preparar as células competentes a partir das células que estão na fase de crescimento, seguido por transformação com DNA, que foi relatada em Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., 1977, Gene, 1:153-167), entre outros. Alternativamente, um método de preparar as células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem capturar facilmente o DNA recombinante, seguido pela introdução de um DNA recombinante nas células receptoras de DNA, que é conhecida por ser aplicável em Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Sci., USA, 75:19291933) também pode ser empregado. Além disso, a transformação de microrganismos também pode ser realizada pelo método de pulso elétrico (patente Japonesa submetida ao domínio público 2-207791).
[0082] O gene de enzima alvo também pode ser introduzido pela introdução do gene em um cromossomo do microrganismo hospedeiro. O gene de enzima alvo pode ser introduzido em um cromossomo de um microrganismo por um método de introduzir aleatoriamente em um cromossomo, usando um transposon ou Mini-Mu (patente Japonesa submetida ao domínio público 2-109985, patente U.S. 5.882.888, publicação de patente Europeia 805867 B1), ou por recombinação homóloga usando uma sequência presente em um DNA cromossômico em um número múltiplo de cópias como um alvo. Assim como uma sequência presente em um DNA cromossômico em um número múltiplo de cópias, o DNA repetitivo e localizado invertido e repetido na extremidade de um elemento de transposição pode ser usado. Alternativamente, usando o método de integração direcionada por Red (WO2005/010175), também é possível introduzir um gene alvo em um cromossomo. Além do mais, um gene alvo também pode ser introduzido em um cromossomo por transdução usando fagos tal como fago P1, ou usando um vetor de transferência conjugativo. Além disso, também é possível introduzir um gene de enzima alvo usando um gene não necessário para a produção de substância alvo como um alvo, da maneira descrita em WO03/040373. Uma ou várias cópias do gene de enzima alvo podem ser introduzidas em uma sequência alvo por tais métodos da maneira descrita anteriormente.
[0083] A transferência de um gene alvo em um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern, usando uma sonda com uma sequência complementar ao gene alvo ou uma parte deste.
[0084] Embora seja suficiente que o número de cópias do gene alvo introduzido não seja menor que 1, o número de cópias é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 3 ou mais, ainda mais preferivelmente 5 ou mais. Quanto ao gene de xilonato desidratase como o gene alvo, em particular, é preferível introduzir 2 ou mais cópias do gene.
[0085] Além disso, a atividade de um gene de enzima alvo pode ser otimizada usando substituição ou mutação de uma sequência de controle de expressão, tal como um promotor do gene de enzima alvo em combinação, da maneira descrita anteriormente. Em particular, é preferível que o gene de xilonato desidratase seja superexpresso por substituição ou mutação de uma sequência de controle de expressão em vez de, ou junto com, o número de cópias anteriormente mencionado.
[0086] Os exemplos do método para aumentar a expressão de um gene de enzima alvo incluem substituir uma sequência de controle de expressão, tal como um promotor do gene de enzima alvo, por uma com um intervalo apropriado em um DNA cromossômico ou um plasmídeo para melhorar a expressão do gene. Por exemplo, sabe-se que o promotor thr, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor pL, promotor tac, entre outros, são frequentemente usados como promotores. Além disso, os variantes do promotor tac usados no exemplos descritos a seguir (promotor PtacA, promotor PtacB) também podem ser usados. Os métodos para avaliar o intervalo dos promotores e promotores fortes são descritos no artigo de Goldstein e Doi (Goldstein, M.A. e Doi R.H., 1995, Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128), entre outros.
[0087] Além disso, também é possível introduzir a substituição de nucleotídeo para vários nucleotídeos, em uma região promotora de um gene, para modificá-los em um promotor com um intervalo adequado, da maneira revelada na publicação internacional WO00/18935. A substituição da sequência de controle de expressão pode ser realizada da mesma maneira, por exemplo, que aquela da substituição de gene que usa um plasmídeo sensível à temperatura. Exemplos de vetores com uma origem de replicação sensível à temperatura e usados para Escherichia coli e Pantoea ananatis incluem, por exemplo, o plasmídeo sensível à temperatura pMAN997 descrito na publicação internacional WO99/03988, derivados deste, entre outros. Além disso, a substituição de uma sequência de controle de expressão também pode ser realizada por um método que utiliza um DNA linear, tal como o método denominado “integração direcionada por Red” usando recombinase Red do fago À. (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6640-6645), e o método que usa uma combinação do método de integração direcionada por Red e o sistema de excisão do fago À. (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)) (referência a WO2005/010175). A modificação de uma sequência de controle de expressão pode ser combinada com o maior número de cópias de gene.
[0088] Além disso, sabe-se que a substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon de início de tradução, especialmente uma sequência imediatamente à montante do códon de início, afeta acentuadamente a eficiência de tradução de RNAm e, portanto, esta sequência pode ser modificada para melhorar a quantidade de tradução.
[0089] Quando um gene alvo é introduzido no plasmídeo de amplificação ou cromossomo anteriormente mencionados, qualquer promotor pode ser usado para expressar o gene, contanto que o promotor escolhido funcione em um microrganismo usado. O promotor pode ser o promotor natural para o gene usado ou um promotor modificado. A expressão de um gene também pode ser controlada escolhendo adequadamente um promotor que age de maneira forte em um microrganismo usado, ou deixando as regiões -35 e -10 do promotor mais próximas da sequência consensual.
[0090] Quer a atividade de uma enzima alvo seja melhor ou não, isto pode ser confirmado comparando a atividade da enzima alvo de uma cepa modificada e de uma cepa parental ou não modificada. Se a atividade da enzima alvo da cepa modificada for maior, comparada à cepa parental ou não modificada, a atividade da enzima alvo é melhorada. Além disso, quando a cepa parental não apresenta a atividade de enzima alvo, se a atividade da enzima alvo puder ser detectada na cepa modificada, a atividade da enzima alvo é melhorada.
[0091] O gene de enzima alvo pode ser obtido por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base na informação da sequência anteriormente mencionada, ou informação da sequência de gene ou proteína conhecida pelo microrganismo como oligonucleotídeos iniciadores, ou hibridização usando um oligonucleotídeo preparado com base na informação de sequência anteriormente mencionada como uma sonda, a partir de um DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico de um microrganismo com a enzima alvo.
[0092] Além do mais, a enzima alvo e o gene que codifica a mesma podem ser um homólogo ou modificação artificial destes, ou uma proteína com uma mutação conservativa ou um gene que codifica a mesma, contanto que a atividade enzimática seja mantida.
[0093] Um homólogo como este, a modificação artificial deste, ou uma proteína com uma mutação conservativa ou genes que codificam esta são referidos como variante conservativo.
[0094] O variante conservativo de uma enzima alvo pode ser, por exemplo, uma proteína com a sequência de aminoácidos de cada enzima anteriormente mencionada, mas que inclui substituição, eliminação, inserção, adição ou similares de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições.
[0095] Embora o número de “um ou vários” resíduos de aminoácido possa diferir dependendo da posição na estrutura tridimensional ou dos tipos de resíduos de aminoácido da proteína, especificamente, é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5. A mutação conservativa é tipicamente uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação, na qual a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Val, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se o sítio de substituição for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se o sítio de substituição for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o sítio de substituição for um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se o sítio de substituição for um aminoácido com um grupo hidroxila. As substituições consideradas substituição conservativa incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Val. As substituições, eliminações, inserções, adições, inversões de aminoácido, ou similares anteriormente mencionadas, podem ser um resultado de uma mutação ou variação de ocorrência natural, ou uma variação em virtude de uma diferença individual ou diferença de espécies de um microrganismo, a partir do qual os genes são derivados (mutante ou variante). Tais proteínas podem ser obtidas, por exemplo, modificando uma sequência de nucleotídeos de um gene de enzima alvo tipo selvagem por mutagênese sítio-específica, de maneira tal que os resíduos de aminoácido nos sítios específicos da proteína codificada incluam substituições, eliminações, inserções ou adições de resíduos de aminoácido.
[0096] Além disso, uma proteína como esta com uma mutação conservativa, da maneira descrita anteriormente, pode ser uma proteína que exibe uma homologia de, por exemplo, 80 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 97 % ou mais, preferivelmente de maneira adicional 98 % ou mais, particularmente de maneira preferível 99 % ou mais, com a sequência total de aminoácidos, e com uma função equivalente àquela da proteína tipo selvagem. Nesta especificação, “homologia” pode significar “identidade”.
[0097] Contanto que o gene tipo selvagem de enzima alvo codifique uma sequência de aminoácidos como esta, da maneira descrita anteriormente, este não limita-se aos genes de Caulobacter crescentus, Haloferax volcanii e similares, mas pode ser qualquer daqueles com um códon equivalente a um códon arbitrário.
[0098] O gene tipo selvagem também pode ser um DNA que é capaz e hibridizar em uma sequência de nucleotídeos complementara à sequência de nucleotídeos de cada gene de enzima, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência complementar em condições severas, e codifica uma proteína com funções equivalentes àquelas da enzima alvo tipo selvagem. As “condições estritas” referem-se às condições nas quais um assim denominado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições estritas incluem aquelas nas quais os DNAs muito homólogos hibridizam um no outro, por exemplo, os DNAs não menos que 80 % homólogos, preferivelmente não menos que 90 % homólogos, mais preferivelmente não menos que 95 % homólogos, ainda mais preferivelmente não menos que 97 % homólogos, preferivelmente de maneira adicional não menos que 98 % homólogos, particularmente de maneira preferível não menos que 99 % homólogos hibridizam um no outro, e os DNAs menos homólogos que os anteriores não hibridizam um no outro, ou as condições que correspondem à lavagem de hibridização Southern típica, isto é, condições de uma lavagem, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração de sal e temperatura de SSC 1 x, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente SSC 0,1 x, 0,1 % de SDS a 60°C, mais preferivelmente SSC 0,1 x, 0,1 % de SDS a 68°C.
[0099] Assim como a sonda, uma parte de uma sequência que é complementar a um gene de enzima alvo também pode ser usada. Uma sonda como esta pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base na sequência conhecida de um gene, com oligonucleotídeos iniciadores e um fragmento DNA contendo a sequência de nucleotídeos como um molde. Por exemplo, quando um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, SSC 2 x e 0,1 % de SDS.
[00100] As descrições anteriormente mencionadas, com relação aos variantes conservativos das proteínas e genes que codificam os mesmos anteriormente mencionados, são aplicadas similarmente aos outros genes descritos a seguir para as bactérias que produzem substâncias alvo.
[00101] O microrganismo usado na presente invenção pode apresentar inerentemente uma capacidade de produzir uma substância alvo, ou a capacidade pode ser fornecida na reprodução usando um método de mutação, uma técnica de DNA recombinante ou similares.
[00102] Os microrganismos usados na presente invenção incluem, mas sem limitação, bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, tais como aquelas dos gêneros Escherichia, Pantoea, e Enterobacter, bactérias corineformes tais como Corynebacterium glutamicum e Brevibacterium lactofermentum e bactérias do gênero Bacillus tal como Bacillus subtillis.
[00103] Na presente invenção, as bactérias corineformes incluem aquelas bactérias que eram classificadas até aqui no gênero Brevibacterium, mas atualmente são classificadas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), e incluem bactérias que pertencem ao gênero Brevibacterium muito relacionadas ao gênero Corynebacterium. Exemplos de tais bactérias corineformes são listados a seguir. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum Os exemplos específicos das bactérias incluem os seguintes. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP- 1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
[00104] Estas cepas são disponíveis a partir de American Type Culture Collection (ATCC) (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, Estados Unidos). Isto é, um número de registro é determinado para cada uma das cepas. As cepas podem ser classificadas usando este número de registro (http://www.atcc.org/). “Registration numbers assigned to strains listed in the catalogue of the ATCC”. A cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) com o número de acesso FERM BP-1539, baseado no Budapest Treaty.
[00105] Os microrganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae usados na presente invenção incluem, mas sem limitação, bactérias que pertencem aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella ou similares, e com uma capacidade de produzir substância alvo. Especificamente, as bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, de acordo com a classificação mostrada na base de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin- post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1 &unlock), podem ser usadas. Entre as bactérias da família Enterobacteriaceae, as bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, Enterobacter ou Pantoea são preferivelmente usadas como a cepa parental.
[00106] As bactérias do gênero Escherichia que podem ser usadas como a cepa parental incluem, mas sem limitação, bactérias do gênero Escherichia relatadas por Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 tabela 1), tal como Escherichia coli. Os exemplos específicos de Escherichia coli incluem a cepa de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) e a cepa MG1655 (ATCC 47076), que é derivada da cepa tipo selvagem de Escherichia coli K12 (protótipo), entre outros.
[00107] Em particular, bactérias dos gêneros Pantoeas, Erwinia e Enterobacter são classificadas como Y-proteobactérias, e são taxonomicamente muito próximas umas das outras (J. Gen. Appl. Microbiol., Dec. 1997, 43(6), 355-361; International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pp.1061-1067). Nos últimos anos, algumas bactérias que pertencem ao gênero Enterobacter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa ou similares, com base nos experimentos de hibridização de DNA-DNA, etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, julho de 1989, 39(3).p.337-345). Além disso, algumas bactérias que pertencem ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (referência a International Journal of Systematic Bacteriology, janeiro de 1993, 43(1), pp.162-173). Além disso, Pantoea ananas foi então reclassificada adicionalmente como Pantoea ananatis.
[00108] Os exemplos das bactérias do gênero Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans (atualmente reclassificada como Pantoea ananatis etc.), Enterobacter aerogenes, entre outros. Especificamente, as cepas exemplificadas no pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 952221 podem ser usadas. Uma cepa típica do gênero Enterobacter é Enterobacter agglomeranses ATCC 12287 (atualmente reclassificada como Pantoea ananatis).
[00109] As cepas típicas das bactérias do gênero Pantoeas incluem Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans e Pantoea citrea. Os exemplos específicos incluem as cepas a seguir:
[00110] Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 0952221)
[00111] Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 0952221)
[00112] Embora estas cepas sejam descritas como Enterobacter agglomerans no pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 0952221, elas são atualmente classificadas como Pantoea ananatis, com base na análise de sequência de nucleotídeos do RNAr 16S etc., da maneira descrita anteriormente.
[00113] A cepa Pantoea ananatis AJ13355 foi isolada do solo em Iwata- shi, Shizuoka no Japão, como uma cepa que pode se proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em pH baixo. A cepa SC17 foi selecionada como uma cepa mutante que produz substância pouco viscosa, a partir da cepa AJ13355 (patente U.S. 6.596.517). A cepa Pantoea ananatis AJ13355 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e determinada com um número de acesso de FERM P-16644. O depósito foi então convertido em um depósito internacional nas condições do Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999, e é determinada com um número de acesso de FERM BP-6614. A cepa Pantoea ananatis SC17 foi fornecida com um número próprio de AJ416 e depositada em 4 de fevereiro de 2009 no National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depository (endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), e determinada com um número de acesso de FERM BP-11091.
[00114] Os exemplos de bactérias Pantoea ananatis que produzem ácido L-glutâmico incluem as cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJ13601, NP106 e NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obida introduzindo o plasmídeo RSFCPG contendo o gene de citrato sintase (gltA), o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (prpC), e o gene de glutamato desidrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli, e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene de citrato sintase (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum, na cepa SC17sucA, que é uma cepa deficiente com relação ao gene sucA, derivada da cepa SC17 (patente U.S. 6.596.517). A cepa AJ13601 foi selecionada a partir da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB por sua resistência ao ácido L- glutâmico em concentração elevada, um pH baixo. Além disso, a cepa NP106 foi derivada da cepa AJ13601 eliminando o plasmídeo RSFCPG+pSTVCB (WO2010/027045). A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) em 18 de agosto de 1999, e determinada com um número de acesso FERM P-17516. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional nas condições de Budapest Treaty em 6 de julho de 2000, e determinado com um número de acesso FERM BP-7207. Esta cepa foi identificada originalmente como Enterobacter agglomerans quando foi isolada, e depositada como Enterobacter agglomerans. Entretanto, foi facilmente reclassificada como Pantoea ananatis, com base no sequenciamento de nucleotídeo do RNAr 16S, entre outros.
[00115] A cepa NA1 é uma cepa que corresponde à cepa NP106 com RSFPPG (WO2008/020654), em que o gene gltA de RSFCPG descrito anteriormente é substituído pelo gene metil citrato sintase (prpC) (WO2010/027045).
[00116] Os exemplos das bactérias do gênero Erwinia incluem Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e os exemplos das bactérias do gênero Klebsiella incluem Klebsiella planticola. Os exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia carotovora ATCC 15713 Klebsiella planticola AJ13399 (FERM BP-6600, patente Europeia submetida ao domínio público 955368) Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, patente Europeia submetida ao domínio público 955368).
[00117] A partir daqui, são descritos os métodos para fornecer uma capacidade de produzir uma substância alvo para tais microrganismos, da maneira descrita anteriormente, ou os métodos para melhorar uma capacidade de produzir uma substância alvo em tais microrganismos.
[00118] Para fornecer uma capacidade de produzir uma substância alvo, os métodos convencionalmente empregados no cultivo de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (ver “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a Edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser usados. Tais métodos incluem a aquisição de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente ao análogo de substância alvo, ou um mutante de regulação metabólica, construção de uma cepa recombinante, na qual a expressão da enzima de biossíntese de uma substância alvo é melhor, entre outros. Durante a reprodução de bactérias que produzem substância alvo, as propriedades fornecidas tais como uma mutação auxotrófica, resistência análoga, ou mutação na regulação metabólica podem ser uma ou mais. A(s) enzima(s) de biossíntese de expressão de substância alvo pode(m) ser melhor(es) sozinha(s) ou em combinações de duas ou mais. Além disso, o fornecimento das propriedades, tal como uma mutação auxotrófica, resistência análoga ou mutação na regulação metabólica, pode ser combinado com a melhora das enzimas de biossíntese.
[00119] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente análoga, ou cepa mutante de regulação metabólica, com uma capacidade de produzir uma substância alvo, pode ser obtida submetendo uma cepa parental ou cepa tipo selvagem à mutagênese convencional, tal como exposição aos raios-X ou irradiação UV, ou tratamento com uma substância mutagênica, tal como N- metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, etc., e a seguir selecionando aquelas que exibem autotrofia, resistência análoga, ou uma mutação de regulação metabólica e que também apresenta uma capacidade de produzir uma substância alvo. Além do mais, uma bactéria que produz substância alvo também pode ser obtida melhorando a atividade de uma enzima de biossíntese da substância alvo por recombinação gênica.
[00120] A partir daqui, serão explicados os exemplos de método para fornecer uma capacidade de produzir uma substância alvo, e os microrganismos nos quais uma capacidade de produzir uma substância alvo é fornecida.
[00121] Os exemplos de método para fornecer ou melhorar uma capacidade de produzir uma substância alvo no cultivo incluem, por exemplo, um método de modificar um microrganismo, de maneira tal que a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância alvo seja melhor. Por exemplo, os exemplos de enzima envolvidas na biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltBD), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi), metil citrato sintase (prpC), entre outros. Os nomes dos genes são descritos entre parênteses após os nomes das enzimas (o mesmo formato se aplica às descrições a seguir).
[00122] A expressão dos genes anteriormente mencionados pode ser melhorada pelo método descrito para a melhoria das atividades das enzimas da via NXA anteriormente mencionada.
[00123] Os exemplos de microrganismos modificados, de maneira tal que a expressão do gene de citrato sintase, gene de piruvato desidrogenase e/ou gene de glutamato desidrogenase entre os genes das enzimas anteriormente mencionados sejam melhores, incluem os microrganismos descritos em WO00/18935, pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 1010755, entre outros.
[00124] Além do mais, a modificação para fornecer a capacidade de produzir ácido L-glutâmico também pode ser realizada reduzindo ou eliminando a atividade de uma enzima que catalisa uma reação, a qual é ramificada a partir da via biossintética do ácido L-glutâmico, e produz um composto sem ser ácido L-glutâmico. Os exemplos de enzimas que catalisam uma reação, que se ramifica a partir da via biossintética do ácido L-glutâmico, e produzem um composto sem ser ácido L-glutâmico incluem 2- oxocetoglutarato desidrogenase, succinato desidrogenase, isocitrato liase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato decarboxilase, 1-pirrolina desidrogenase, acetil-CoA hidrase (publicação de patente internacional WO2006/057450), entre outros.
[00125] A fim de reduzir ou eliminar a atividade de uma enzima alvo, uma mutação pode ser introduzida em um gene da enzima em um genoma por um método de mutagênese usual, ou técnica de recombinação genética, de maneira tal que a atividade intracelular da enzima seja reduzida ou eliminada. Tal introdução de uma mutação pode ser atingida, por exemplo, usando recombinação genética para eliminar o gene que codifica a enzima no genoma ou modificar uma sequência de controle de expressão, tal como um promotor ou a sequência de Shine-Dalgarno (SD). Também pode ser atingida introduzindo uma mutação por substituição de aminoácidos (mutação com sentido incorreto), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação por deslocamento de quadro adicionando ou eliminando um ou dois nucleotídeos nas regiões que codificam a enzima no genoma, ou que eliminam parcial ou totalmente o gene (J. Biol. Chem., 272:8611-8617, 1997). A atividade enzimática também pode ser diminuída ou eliminada construindo um gene que codifica uma enzima mutante, cuja região codificante é total ou parcialmente eliminada, e substituindo-o por um gene normal em um genoma por recombinação homóloga ou similares, ou introduzindo um transposon ou fator IS no gene.
[00126] Por exemplo, a fim de introduzir uma mutação que diminui ou elimina as atividades das enzimas anteriormente mencionadas por recombinação genética, os métodos a seguir são usados. Um gene mutante é preparado modificando uma sequência parcial de um gene alvo, de maneira tal que não codifique uma enzima que pode funcionar normalmente, e a seguir uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para realizar a recombinação de um gene no genoma com o gene mutante, para substituir o gene mutante pelo gene alvo no genoma. Exemplos de tal substituição de gene que usa a recombinação homóloga incluem métodos de usar um DNA linear tal como o método denominado integração direcionada por Red (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:66406645), e o método que utiliza a integração direcionada por Red em combinação com um sistema excessivo, direcionado a partir do fago À (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203, referência a WO2005/010175, pedido de patente Russa 2006134574), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (patente U.S. 6.303.383, patente Japonesa submetida ao domínio público 05-007491), entre outros. Além disso, tal mutagênese sítio-específica baseada na substituição de gene, usando recombinação homóloga, também pode ser realizada usando um plasmídeo que não é capaz de se replicar em um hospedeiro.
[00127] Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico em bactérias corineformes também pode ser atingida por um método de amplificar o gene yggB (NCgl 1221;NP_600492. Relatos de pouca condutância. [gi:19552490], WO2006/070944), e um método de introduzir um gene mutante yggB, em que uma mutação é introduzida na região codificante.
[00128] Os exemplos de métodos para melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem a introdução de genes que codificam D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase (estas são coletivamente denominadas fosfocetolase). Exemplos de microrganismos que apresentaram melhor atividade de fosfocetolase incluem os microrganismos a seguir (WO2006/016705): Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869ΔsucA (pVK9- xfp) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869ΔsucA (pVK9- PS2_xpkA)
[00129] A capacidade de produzir ácido L-glutâmico também pode ser fornecida melhorando a atividade de 6-fosfogluconato desidratase, a atividade de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase, ou ambas as atividades. Exemplos de microrganismo cuja atividade de 6-fosfogluconato desidratase e a atividade de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase são maiores incluem o microrganismo revelado na patente Japonesa submetida ao domínio público 2003-274988. Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico também pode ser fornecida amplificando os genes yhfK e ybjL, que são genes associados à secreção de ácido L-glutâmico (WO2005/085419, WO2008/133161).
[00130] Assim como um microrganismo que produz ácido L-glutâmico é usado na presente invenção, um microrganismo com uma capacidade de acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido, em uma quantidade que excede a concentração de saturação do ácido L-glutâmico quando cultivado em uma condição acídica (de agora em diante também referida como uma capacidade de acúmulo de ácido L-glutâmico em condição acídica), pode ser usado. Por exemplo, obtendo uma cepa na qual a resistência ao ácido L- glutâmico em um ambiente em pH baixo é fornecida, de acordo com o método descrito no pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 1078989, a capacidade de acumular o ácido L-glutâmico em uma quantidade que excede a concentração de saturação pode ser fornecida.
[00131] Assim como os métodos para fornecer ou melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico, também podem ser mencionados os métodos de fornecer resistência a um análogo de ácido orgânico, inibidor respiratório ou similares, e métodos de fornecer sensibilidade a um inibidor de síntese da parede celular. Os exemplos incluem, por exemplo, o método de fornecer resistência ao ácido monofluoracético (patente Japonesa submetida ao domínio público 50-113209), o método de fornecer resistência à adenina ou resistência à timina (patente Japonesa submetida ao domínio público 57065198), o método de atenuar a urease (patente Japonesa submetida ao domínio público 52-038088), o método de fornecer resistência ao ácido malônico (patente Japonesa submetida ao domínio público 52-038088), o método de fornecer resistência aos benzopironas ou naftoquinonas (patente Japonesa submetida ao domínio público 56-1889), o método de fornecer resistência a HOQNO (patente Japonesa submetida ao domínio público 56140895), o método de fornecer resistência ao ácido a-cetomalônico (patente Japonesa submetida ao domínio público 57-2689), o método de fornecer resistência à guanidina (patente Japonesa submetida ao domínio público 56- 35981), o método de fornecer sensibilidade à penicilina (patente Japonesa submetida ao domínio público 4-88994), entre outros.
[00132] Os exemplos específicos de tais bactérias resistentes incluem as cepas a seguir:
[00133] Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 50-113209)
[00134] Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 57-065198)
[00135] Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-1889)
[00136] Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-1889)
[00137] Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 57-2869)
[00138] Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 57-2869)
[00139] Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM BP-5472, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-140895)
[00140] Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM BP-5136, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-35981)
[00141] Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 04-88994)
[00142] Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P-5123, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-048890)
[00143] Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-048890)
[00144] Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P-6402, referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 58-158192)
[00145] Os exemplos preferidos de microrganismos com capacidade de produzir L-glutamina são as bactérias cuja atividade de glutamato desidrogenase é melhorada, bactérias cuja atividade de glutamina sintetase (glnA) é melhorada, e bactérias cujo gene de glutaminase é interrompido (pedidos de patente Europeia submetidos ao domínio público 1229121 e 1424398). A melhoria da atividade de glutamina sintetase também pode ser atingida por interrupção da glutamina adenililtransferase (glnE) ou interrupção da proteína de controle de PII (glnB). Além disso, uma cepa que pertence ao gênero Escherichia e com uma glutamina sintetase mutante, em que o resíduo de tirosina da posição 397 é substituído por um outro resíduo de aminoácido, também pode ser exemplificada como uma bactéria que produz L-glutamina preferida (pedido de patente publicada U.S. 2003/0148474).
[00146] Outros métodos para fornecer ou melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico são o método de fornecer resistência à 6-diazo-5- oxo-norleucina (patente Japonesa submetida ao domínio público 3-232497), o método de fornecer resistência ao análogo de purina e resistência ao sulfóxido de metionina (patente Japonesa submetida ao domínio público 61-202694), o método de fornecer resistência à a-cetomalônico (patente Japonesa submetida ao domínio público 56-151495), entre outros. Os exemplos específicos de bactérias corineformes com capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem as cepas a seguir.
[00147] Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, Patente Japonesa submetida ao domínio público 56-161495)
[00148] Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381, Patente Japonesa submetida ao domínio público 56-151495)
[00149] Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, Patente Japonesa submetida ao domínio público 61-202694)
[00150] Os exemplos de microrganismos com capacidade de produzir L- prolina incluem, por exemplo, bactérias com Y-glutamil quinase que é insensível à inibição de resposta por L-prolina, e bactérias cujo sistema de decomposição de L-prolina é atenuado. O método de modificar bactérias usando um DNA que codifica Y-glutamil quinase insensível à inibição de resposta por L-prolina é revelado em Dandekar, A.M., Uratsu S.L., J. Bacteriol., 170, 12:5943-5 (1988). Além disso, exemplos do método para obter uma bactéria cujo sistema de decomposição de L-prolina é atenuado incluem, por exemplo, um método de introduzir uma mutação em um gene de prolina desidrogenase para reduzir a atividade enzimática. Exemplos de bactérias com capacidade de produzir L-prolina incluem a cepa Escherichia coli NRRL B-12403 e a cepa NRRL B-12404 (patente Inglesa 2075056), a cepa Escherichia coli VKPM B-8012 (pedido de patente publicada U.S. 2002/0058315), e as cepas com o plasmídeo mutante revelado na patente Alemã 3127361 ou com o plasmídeo mutante revelado na referência de Bloom F.R. et al. (The 15° Miami Winter Symposium, 1983, p.34).
[00151] Além disso, os microrganismos com capacidade de produzir L- prolina preferidos também incluem a cepa Escherichia coli 702 (VKPMB- 8011), que é uma cepa resistente à 3,4-desidroxiprolina e azetidina-2- carboxilato, a cepa 702ilvA (cepa VKPMB-8012), que é uma cepa deficiente em ilvA da cepa 702, as cepas de E. coli cuja atividade de proteína codificada pelos genes b2682, b2683, b1242 ou b3434 é melhorada (patente Japonesa submetida ao domínio público 2002-300874), entre outros.
[00152] Os exemplos de cepas de bactérias corineformes que produzem L-prolina incluem a cepa resistente em DL-3,4-desidroprolina (FERM BP- 1219, patente U.S. 4.224.409), as cepas cuja atividade de citrato sintetase aumentam 1,4 vezes ou mais, comparadas às cepas parentais destas (FERM P5332, FERM P-5333, FERM P-5342, FERMP-5343, patente Japonesa 1426823), e a cepa na qual a auxotrofia para ácido acético é fornecida (FERM P-5931).
[00153] Os exemplos de microrganismo com uma capacidade de produzir L-arginina incluem cepas mutantes de Escherichia coli com resistência à α- metilmetionina, p-fluorfenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, AEC (S-(2-aminoetil)-cisteína), α-metilserina, β-2-tienilalanina, ou sulfaguanidina (referência à patente Japonesa submetida ao domínio público 56-106598). A cepa de Escherichia coli 237, que é uma cepa que produz L- arginina e carrega N-acetilglutamato sintase muito ativa, com uma mutação para resistência à inibição de resposta por L-arginina (pedido de patente Russo 2000117677), também é uma bactéria que produz L-arginina preferida. A cepa 237 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII Genetika) em 10 de abril de 2000 com um número de acesso de VKPM B-7925, e o depósito original foi convertido em um depósito internacional baseado no Budapest Treaty em 18 de maio de 2001. A cepa Escherichia coli 382, que é um derivado da cepa 237 e é uma cepa que produz L-arginina com melhor capacidade para assimilar ácido acético (patente Japonesa submetida ao domínio público 2002-017342), também pode ser usada. A cepa de Escherichia coli 382 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 10 de abril de 2000 com o número de acesso de VKPM B-7926.
[00154] Assim como o microrganismo com uma capacidade de produzir L-arginina, também podem ser usados os microrganismos nos quais a quantidade de expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética L-arginina é maior. Os exemplos da enzima biossintética L- arginina incluem uma ou mais enzimas selecionadas de N-acetilglutaminato sintetase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina deacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininosuccínico sintetase (argG), ácido argininosuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintase (carAB). É mais preferível usar um gene de N-acetilglutamato sintase mutante (argA) que codifica a enzima, na qual a sequência de aminoácidos que corresponde às posições 15 a 19 de uma enzima tipo selvagem é substuituída, e a inibição de resposta por L-arginina é por meio disso cancelada (pedido de patente Europeia submetido ao domínio público 1170361).
[00155] Embora as bactérias corineformes que produzem L-arginina não sejam particularmente limitadas, contanto que uma bactéria corineforme com uma capacidade de produzir L-arginina seja escolhida, os exemplos incluem cepas de bactérias corineformes tipo selvagem; bactérias corineformes resistentes à certos agentes, incluindo medicamentos a base de sulfa, 2- tiazolalanina, ácido a-amino-e-hidroxivalérico, entre outros; bactérias corineformes que exibem auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina ou L-triptofano, além da resistência à 2- tiazolalanina (patente Japonesa submetida ao domínio público 54-44096); bactérias corineformes resistentes ao ácido cetomalônico, ácido fluormalônico ou ácido monofluoracético (patente Japonesa submetida ao domínio público 57-18989); bactérias corineformes resistentes ao argininol (patente Japonesa submetida ao domínio público 62-24075); bactérias corineformes resistentes à X-guanidina (X representa um derivado de ácido alifático ou cadeia alifática, patente Japonesa submetida ao domínio público 2-186995), entre outros.
[00156] Uma bactéria corineforme com capacidade de produzir L- arginina pode ser cultivada como uma cepa mutante resistente à 5-azauracila, 6-azauracila, 2-tiouracila, 5-fluoruracila, 5-bromouracila, 5-azacitosina, 6- azacitosina entre outros; uma cepa mutante resistente ao hidroxamato de arginina e 2-tiouracila; cepa mutante resistente ao hidroxamato de arginina e 6-azauracila (patente Japonesa submetida ao domínio público 49-126819); cepa resistente a um análogo de histidina ou análogo de triptofano (patente Japonesa submetida ao domínio público 52-114092); cepa mutante auxotrófica para pelo menos um de metionina, histidina, treonina, prolina, isoleucina, lisina, adenina, guanina e uracila (ou precursor de uracila) (patente Japonesa submetida ao domínio público 52-99289); cepa mutante resistente à hidroxamato de arginina (publicação de patente Japonesa No. 51-6754); cepa mutante auxotrófica para ácido succínico ou resistente à um análogo da base de ácido nucleico (patente Japonesa submetida ao domínio público 58-9692); cepa mutante deficiente na capacidade de decomposição de arginina, resistente a um antagonista de arginina e canavanina e auxotrófica para lisina (patente Japonesa submetida ao domínio público 52-8729); cepa mutante resistente à arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina e canavanina, ou resistente à hidroxamato de arginina e 6-azauracila (patente Japonesa submetida ao domínio público 53-143288); cepa mutante resistente à canavanina (patente Japonesa submetida ao domínio público 53-3586) ou similares.
[00157] Os exemplos específicos de bactérias corineformes com capacidade de produzir L-arginina incluem as cepas a seguir.
[00158] Brevibacterium flavum AJ11169 (FERM P-4161)
[00159] Brevibacterium lactofermentum AJ12092 (FERM P-7273)
[00160] Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM P-4939)
[00161] Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM P-4948)
[00162] Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228)
[00163] Além disso, também podem ser usadas uma cepa deficiente em ArgR, que é um repressor de arginina (pedido de patente publicado U.S. 2002/0045223), e uma cepa em que a atividade de glutamina sintetase é maior (pedido de patente publicado U.S. 2005/0014236).
[00164] A L-citrulina e L-ornitina compartilham vias biossintéticas comuns à L-arginina, e a capacidade de produzir L-citrulina e L-ornitina pode ser melhorada aumentando as atividades enzimáticas de N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamilfosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e acetilornitina deacetilase (argE) (WO2006/35831).
[00165] Assim como a bactéria que produz ácido Y-aminobutírico (GABA), uma cepa cuja atividade de glutamato descarboxilase é melhor (Microb. Cell Fact., 2010, Nov. 12;9:85; Amino Acids, 2010 Nov., 39(5):1107-16; pedido de patente publicada U.S. 2010/0324258) pode ser usada.
[00166] Assim como a bactéria que produz putrescina, uma cepa cuja 4- hidroxibutirato redutase, succinil-CoA redutase (que forma aldeído), e 4- hidroxibutirato desidrogenase são melhores (WO2011/047101), e uma cepa cuja Y-aminobutiraldeído desidrogenase é melhor (FEBS Lett., 1 de agosto de 2005, 579 (19):4107-12) pode ser usada. 2. Método para produzir substância alvo
[00167] Cultivando uma bactéria como esta, da maneira descrita anteriormente, em um meio contendo xilose como uma fonte de carbono para produzir e acumular uma substância alvo no meio, e coletando a substância alvo do meio, a substância alvo pode ser produzida.
[00168] Assim como o meio usado para a cultura, os meios comuns contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais minerais, bem como nutrientes orgânicos traço, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser usados da maneira exigida. Tanto um meio sintético quanto um meio natural podem ser usados.
[00169] Assim como a fonte de carbono, contanto que a xilose esteja presente, outras fontes de carbono, por exemplo, açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, arabinose, amidos hidrolisado e melado podem ser usados. Além disso, os ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido cítrico, e alcoóis tal como etanol também podem ser usados sozinhos ou em combinação com outras fontes de carbono.
[00170] Embora a razão de mistura de xilose e outras fontes de carbono não seja particularmente limitada, a razão de xilose:outra fonte de carbono (razão de peso) é preferivelmente 1:0,1 a 100, mais preferivelmente 1:0,1 a 10, mais preferivelmente 1:0,1 a 5, ainda mais preferivelmente 1:1 a 5, adicionalmente preferível 1:1 a 3.
[00171] A concentração da fonte de carbono no meio não é particularmente limitada, contanto que uma concentração adequada para produzir uma substância alvo seja escolhida. Entretanto, a concentração da fonte de carbono no meio é preferivelmente cerca de 0,1 a 50 % em p/v, mais preferivelmente cerca de 0,5 a 40 % em p/v, particularmente preferivelmente cerca de 1 a 30 %.
[00172] A xilose ou uma mistura de xilose e uma hexose, tal como glicose, pode ser obtida a partir de uma fonte suprimento de biomassa que não é totalmente usada. Tais pentoses e hexoses podem ser liberadas a partir da biomassa por hidrólise com vapor e/ou ácido concentrado, hidrólise com ácido diluído, hidrólise com uma enzima tal como celulase, ou um tratamento alcalino. Quando o substrato é um material do tipo celulose, a celulose é hidrolisada em sacarídeos simultaneamente ou sucessivamente, e os sacarídeos podem ser usados para a produção da substância alvo. Uma vez que a hemicelulose é em geral mais fácil de ser hidrolisada em sacarídeos comparada à celulose, é preferível hidrolisar um material do tipo celulose de antemão, separar as pentoses, e a seguir hidrolisar a celulose por um tratamento com vapor, ácido, álcali, celulase, ou uma combinação destes para produzir hexoses.
[00173] A xilose contida no meio usado na presente invenção também pode ser fornecida convertendo cada uma das hexoses em xilose (D-xilose), usando um microrganismo preparado para apresentar uma via para converter a glicose, galactose ou arabinose em xilose.
[00174] Assim como a fonte de nitrogênio, amônia, ureia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico, entre outros podem ser usados. Assim como os nutrientes orgânicos traço, os aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, aqueles contendo as substâncias anteriores tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, produto de decomposição de proteína da soja, entre outros, podem ser usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica que exige um aminoácido ou similares para seu crescimento é usada, é preferível suplementar com o nutriente exigido. Assim como os sais minerais, os sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês, entre outros, podem ser usados.
[00175] A cultura é preferivelmente realizada em condições aeróbicas, enquanto a temperatura da fermentação é controlada para ser 20 a 45°C, e o pH ser 3 a 9. Para ajuste de pH, uma substância acídica ou alcalina inorgânica ou orgânica, gás amônia, entre outros, pode ser usada. Uma quantidade substancial de uma substância alvo é acumulada no meio de cultura ou células preferivelmente após 10 a 120 horas de cultura em tais condições, da maneira descrita anteriormente.
[00176] Além do mais, quando a substância alvo é o ácido L-glutâmico, a cultura pode ser realizada para produzir e acumular ácido L-glutâmico com precipitação de ácido L-glutâmico em um meio usando, como o meio, um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição na qual o ácido L- glutâmico é precipitado. Os exemplos da condição na qual o ácido L- glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente 4,5 a 4.0, mais preferivelmente 4,3 a 4,0, particularmente de maneira preferível 4,0. A fim de obter simultaneamente tanto a melhoria do crescimento em uma condição acídica quanto a precipitação eficiente de ácido L-glutâmico, o pH é preferivelmente 5,0 a 4,0, mais preferivelmente 4,5 a 4,0, ainda mais preferivelmente 4,3 a 4,0. A cultura pode ser realizada no pH anteriormente mencionado no período total de cultivo ou uma parte deste.
[00177] A substância alvo coletada pode conter células microbianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos de subproduto do microrganismo, além da substância alvo. A pureza da substância alvo coletada é 50 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, particularmente de maneira preferível 95 % ou mais (patente Japonesa 1214636, patentes U.S. 5.431.933, 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, pedido de patente publicada U.S. 2005/0025878).
[00178] A substância alvo obtida na presente invenção pode ser coletada a partir do meio de cultura, após a finalização da cultura, por uma combinação de métodos convencionalmente conhecidos tal como o método de resina de troca iônica (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), separação de membrana (patente Japonesa submetida ao domínio público Nos. 9-164323 e 9-173792), cristalização (WO2008/078448, WO2008/078646), e outros métodos.
[00179] Além disso, quando a substância alvo se deposita no meio, esta pode ser coletada por centrifugação, filtração ou similares. Uma substância alvo depositada no meio e uma substância alvo dissolvida no meio podem ser isoladas juntas, após a substância alvo dissolvida no meio ser cristalizada. Exemplos
[00180] A partir daqui, a presente invenção será ainda mais especificamente explicada com referência aos exemplos.
[00181] As composições de meio usadas nos exemplos que seguem são mostradas a seguir. [meio LB] Bacto triptona 10 g/L Extrato de levedura 5 g/L NaCl 5 g/L pH 7,0 [LBGM9]
[00182] Os mesmos componentes do meio LB e os componentes do meio mínimo (5 g/L de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g/L de fosfato de monopotássio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 1 g/L de cloreto de amônio, 6 g/L de fosfato dissódico) [Meio MSII-Glicose] Grupo A Glicose 40 g/L MgSOr7H<) 0,5 g/L Grupo B (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 2 g/L NaCl 0,5 g/L Extrato de levedura 2 g/L CaCVVHO 0,25 g/L FeS()/7|l2() 20 mg/L MnSO4mH2O 20 mg/L Elementos traço* 4 mL/L L-Lys 200 mg/L DL-Met 200 mg/L DAP 200 mg/L
[00183] Os componentes dos grupos A e B foram autoclavados separadamente a 120°C por 20 minutos, e a seguir misturados. *Elementos traço CaCk^HO 0,66 g/L ZnSO/7||2() 0,18 g/L CuSO4^5H2O 0,16 g/L MnSO44H2O 0,15 g/L CoCMHO 0,18 g/L H3BO3 0,10 g/L Na2MoO4 0,30 g/L [Meio de MSII-Xilose]
[00184] Os mesmos componentes do meio de MSII-Glicose, com a exceção de que a glicose (40 g/L) é substituída por xilose (40 g/L) [Meio MSII-GX]
[00185] Os mesmos componentes do meio MSII-Glicose, com a exceção de que a glicose (40 g/L) é substituída por uma mistura de glicose (20 g/L) e xilose (20 g/L) [Meio de MSII-SX]
[00186] Os mesmos componentes do meio de MSII-Glicose, com a exceção de que a glicose (40 g/L) é substituída por uma mistura de sacarose (20 g/L) e xilose (20 g/L). [Meio sintético E1] Grupo A NH4Cl 20 mM MgSOrVI I2O 2 mM Na2HPO4 40 mM KH2PO4 30 mM CaCl2 0,01 mM FeSO47H2O 0,01 mM MnSO44 em 5H2O 0,01 mM Citrato 5 mM pH livre Esterilização por filtração Grupo B-1 Fonte de carbono 50 (ou 100) mM Esterilização por filtração Grupo B-2 Tiamina HCl 1 mM Este componente foi adicionado ao componente do grupo B-1 após esterilização por filtração (0,22 μm). Grupo C MES-NaOH (pH 6.8) 50 mM Esterilização por filtração (0,22 μm)
[00187] As soluções contendo os componentes dos grupos A a C em concentrações 5 vezes maior foram preparadas como soluções estoque. [Meio de CM-Dex] Polipeptona 10 g/L Extrato de levedura 10 g/L Glicose 5 g/L KH2PO4 1 g/L Ureia 3 g/L MgSO47H2O 0,4 g/L FeSO47H2O 0,01 g/L MnSO4^5H2O 0,01 g/L Soja filtrada (soja hidrolisada) 1,2 g/L (T-N) pH 7,5 ajustado com KOH [Meio Glc] Glicose 80 g/L (NH4)2SO4 30 g/L KH2PO4 1 g/L MgSO47H2O 0,4 g/L FeSO47H2O 0,01 g/L MnSO4^5H2O 0,01 g/L Vitamina B1 200 μg/L Biotina 60 μg/L Soja filtrada (soja hidrolisada) 0,48 g/L (T-N) pH 8,0 ajustado com KOH [Meio Xyl (biotina restrita)] Os mesmos componentes do meio Glc, com a exceção de que a glicose (80 g/L) é substituída por xilose (80 g/L), e a biotina não está contida. [Meio MS] Grupo A Glicose ou xilose 40 g/L Glicose e xilose (1:1) 40 g/L MgSOrVIbO 1 g/L Grupo B (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 1 g/L Extrato de levedura 2 g/L FeS()/7|l;() 10 mg/L MnSO4mH2O 10 mg/L
[00188] Os componentes dos grupos A e B foram autoclavados separadamente a 120°C por 20 minutos, e a seguir misturados, e 50 g/L de carbonato de cálcio foram adicionados, de acordo com a farmacopeia Japonesa. Exemplo 1: Introdução da via NXA em Pantoea ananatis (1) Construção de plasmídeo pTWV228Ptac_ccrNXA para introdução da via NXA
[00189] Como uma bactéria conhecida para a qual a via NXA foi relatada, C. crescentus é conhecida (Stephens, C. et al., J. Bacteriol., 189(5):181-2185, 2007). Para obter os genes que codificam as enzimas da via NXA de C. crescentu, os seguintes métodos foram empregados.
[00190] O genoma de C. crescentus apresenta um tamanho de cerca de 4 Mb, em que os cinco genes formam uma estrutura de operon (Journal of Bacteriology, 189:2181-2185, 2007). O genoma foi extraído de uma cepa de C. crescentus com genoma publicado (CB-15 (ATCC 19089), disponível como ATCC), e a clonagem dos genes e a construção do vetor de expressão para os genes foram ensaiadas.
[00191] Os vetores de expressão foram construídos usando o estojo de clonagem Clontech IN-Fusion.
[00192] Os quatro tipos de fragmentos de DNA a seguir foram amplificados por PCR usando DNA cromossômico de C. crescentus CB-15 (ATCC 19089) para os seguintes i), ii) e iii), e pMW119 para o seguinte iv) como os moldes. Os oligonucleotídeos iniciadores usados para PCR são indicados entre parênteses. i) sequência promotora tac (de agora em diante referida como “Ptac”, PtwvPtacf: SEQ ID NO: 1, 0823Ptacr: SEQ ID NO:2) ii) Fragmento contendo xylX, ccrxylA, ccrxylB e xylC (Ptac0823f: SEQ ID NO: 3, 0819r: SEQ ID NO: 4) iii) xylD e região à jusante deste, de cerca de 120 bp (0819f: SEQ ID NO: 5, 219cc0819r: SEQ ID NO: 6) iv) pMW119/SmaI (219f: SEQ ID NO: 7, 219r: SEQ ID NO:8)
[00193] A seguir, por PCR que usa os produtos purificados de PCR de i) e ii) como um molde, bem como PtwvPtacf e 0819r como os oligonucleotídeos iniciadores, foi amplificado um fragmento Ptac_xylXccrAccrBC que consiste nos produtos de PCR precedentes ligados juntos. A reação em fusão foi realizada com estes três de Ptac_xylXccrAccrBC e os produtos de PCR de iii) e iv) obtidos, usando o estojo de clonagem Clontech IN-Fusion, a cepa E. coli JM109 foi transformada com o produto de reação, e o plasmídeo alvo pMW119 Ptac_ccrNXA foi obtido a partir de um transformante.
[00194] A seguir, usando pMW119 Ptac_ccrNXA como o molde, bem como PtwvPtacf e 219CC0819r como os oligonucleotídeos iniciadores, o operon ccrNXA contendo Ptac foi amplificado. A reação em fusão foi realizada com o produto amplificado obtido e o pTWV228 é digerido com SmaI, a cepa E. coli JM109 foi transformada com o produto de reação, e o plasmídeo alvo pTWV228Ptac_ccrNXA foi obtido a partir de um transformante. (2) Construção de plasmídeo pUT-MuKm contendo pUT399 que carrega Mini-A resistente à canamicina
[00195] O pUT399 é um plasmídeo com a origem de replicação de R6K e região mob exigida para transferência conjugativa, e não é replicável em uma cepa que não apresenta o gene pir (disponível pela Biomedal, referência à R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY novembro de 1983, 784-791; patente U.S. 7.090.998).
[00196] O pCE1134 (patente Japonesa submetida ao domínio público 2-109985) é um plasmídeo contendo MudII1734, e carrega um gene de resistência à Km e o gene lacXYZ na unidade Mini-Mu. Pelo método descrito a seguir, um fragmento de DNA que não apresenta a região lacXYZ foi preparado a partir da unidade Mini-Mu de pCE1134, e clonado em pUT399.
[00197] A partir da PCR usando pCE1134 como o molde, bem como de oligonucleotídeos iniciadores attL-F (SEQ ID NO: 9) e nptII-R (SEQ ID NO: 10), foi obtido um fragmento contendo o repressor MuCts do gene MuAB, que codifica a extremidade esquerda e transposase, e o gene de resistência à Km. Além disso, usando pCE1134 como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores attR-F (SEQ ID NO: 11) e attR-R (SEQ ID NO: 12), um fragmento contendo a extremidade direita foi obtido de maneira similar. A PCR com cruzamento foi realizada usando estes 2 fragmentos como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores attL-F e attR-R, e o fragmento obtido de cerca de 2,3 kb foi introduzido em pUT399 no sítio SmaI. Desta maneira, o plasmídeo pUT-MuKm foi obtido.
[00198] Uma vez que a unidade Mini-Mu construída da maneira descrita anteriormente apresenta o gene de resistência à Km, e o sítio NotI que reconhece de 8 bases como um sítio de clonagem na unidade de transposição, vários genes podem ser clonados na mesma. (3) Substituição de gene de resistência à medicamento de pTWV228Ptac_ccrNXA
[00199] O gene de resistência à ampicilina de pTWV228Ptac_ccrNXA foi substituído pelo gene de resistência à canamicina, pelo método ÀRed.
[00200] Usando pUT_MuKm como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores Ap-Km-fw (SEQ ID NO: 13) e Ap-Km-rv (SEQ ID NO: 14), uma sequência contendo o gene de resistência à canamicina (fragmento ntpII) foi amplificada.
[00201] Esta PCR foi realizada usando a polimerase PrimeSTAR HS (Takara Bio), de acordo com o protocolo anexado a esta enzima.
[00202] Um plasmídeo auxiliar RSF_Red_TER (pedido de patente publicada U.S. 2009/0286290A1, WO2008/075483) foi introduzido em E. coli JM109 com pTWV228Ptac_ccrNXA, e as células foram cultivadas em 50 mL do meio LB (contendo IPTG 1 mM, 100 mg/L de ampicilina, e 25 mg/L de cloranfenicol) a 37°C até o valor da OD660 se tornar 0,4.
[00203] O RSF_Red_TER anteriormente mencionado é um plasmídeo auxiliar para introduzir a integração dependente de À (integração direcionada por Red, método ÀRed), e pode induzir a expressão dos genes gam, bet e exos de À com o gene lacI. Este plasmídeo também contém o gene levansucrase (sacB), e pode eliminar um plasmídeo a partir de uma célula com este gene, em um meio contendo sacarose. Além disso, este plasmídeo também contém o gene de resistência ao cloranfenicol.
[00204] As células cultivadas da maneira descrita anteriormente foram coletadas, lavadas duas vezes com uma solução de glicerol a 10 % por centrifugação, e suspensas em 1 mL de uma solução de glicerol a 10 %. A seguir, as células foram transformadas com o fragmento ntpII obtido anteriormente por eletroporação, e os transformantes foram submetidos à seleção no meio de ágar LB contendo 40 mg/L de canamicina. Os transformantes obtidos foram inoculados no meio de ágar LB (contendo IPTG 1 mM, 10 % de sacarose, e 40 mg/L de canamicina), e cultivados por toda a noite a 37°C para obter um clone único. Confirmou-se que o transformante obtido não pode creser no meio com ágar LB contendo 100 mg/L de ampicilina, e por meio disso confirmou-se que o gene de resistência à ampicilina de pTWV228Ptac_ccrNXA foi substituído pelo gene de resistência à canamicina. O plasmídeo obtido foi denominado pTWVPtac_ccrNXA_Km. (4) Construção de plasmídeo contendo xylD
[00205] A construção foi realizada usando o estojo de clonagem Clontech IN-Fusion.
[00206] Primeiro, por PCR usando um plasmídeo contendo pUC18, em que cada gene foi clonado como o molde, bem como xylD_IFS_5742-10-5 (SEQ ID NO: 15) e xylD_IFS_5742-10-6 (SEQ ID NO: 16) como os oligonucleotídeos iniciadores, um fragmento de DNA contendo xylD foi amplificado. Especificamente, foi clonado em pUC18, cuju sítio SfiI foi removido pelo método descrito a seguir.
[00207] Por PCR usando o DNA genômico da cepa C. crescentus CB-15 como o molde, CC0819-01F_4691-88-7 (SEQ ID NO: 17) e CC0819- 01R_5659-9-1 (SEQ ID NO: 18), bem como CC0819-02F_5659-9-2 (SEQ ID NO: 19) e CC0819-02R_4691-88-10 (SEQ ID NO: 20) como os oligonucleotídeos iniciadores, os fragmentos de 1.130 bp e 653 bp foram amplificados, respectivamente. A seguir, pUC18 digerido com SmaI e os dois fragmentos amplificados, anteriormente mencionados, foram montados pelo método de montagem in vitro (Nature Methods, 6(5), 343-345, 2009) para obter pUC18-xylD, em que o sítio SfiI foi removido, e o gene xylD foi inserido.
[00208] Separadamente, pSTV28-Ptac-Ttrp foi digerido com SmaI de uma maneira convencional. A reação em fusão foi realizada com o fragmento de DNA do gene xylD e o fragmento de DNA do vetor, a cepa de E. coli JM109 foi transformada com o produto de reação, e o plasmídeo alvo pSTVPtac_xylD_Ttrp foi obtido a partir de um transformante.
[00209] O pSTV28-Ptac-Ttrp foi construído da maneira a seguir.
[00210] Um fragmento de DNA (PtacTtrp), com o promotor tac (com a sequência de SEQ ID NO: 32) e a sequência do finalizador trp, foi sintetizado e ligado entre os sítios KpnI-BamHI do vetor pMW219 para obter pMW219- Ptac-Ttrp. As mesmas quantidades de pSTV28 e pMW219-Ptac-Ttrp digeridas tanto com KpnI quanto com BamHI foram misturadas e ligadas, JM109 foi transformado com o produto de ligação, e um plasmídeo foi extraído a partir de uma colônia que mostrou resistência à Cm. Confirma-se que os plasmídeo obtidos mostraram bandas de cerca de 400 bp e 3 kbp (exatamente 389 bp e 2.994 bp), que foram esperadas como um resultado da digestão dupla com KpnI e BamHI e, assim, pSTV28-Ptac-Ttrp foi obtido. (4) Produção de ácido L-glutâmico com Pantoea ananatis introduzida na via NXA
[00211] A cepa P. ananatis NA1 foi transformada com pTWVPtac_ccrNXA_Km por eletroporação (referência à patente U.S. 6.682.912). Com relação à cepa introduzida com pTWVPtac_ccrNXA_Km, foi usado um meio em placa compreendendo LBGM9 suplementado com canamicina, em uma concentração final de 40 mg/L.
[00212] As células da cepa P. ananatis NA1 e a cepa transformante, cultivada por toda a noite a 34°C na placa de LBGM9, foram cada qual raspadas em uma quantidade que corresponde a 1/6 da placa, inoculadas em 5 mL do meio de MSII-Xilose ou de MSII-GX contido em um tubo de teste grande, e cultivadas a 34°C e 120 rpm por 48 horas, e sacarídeo residual, quantidades de ácido L-glutâmico (Glu) e ácido xilônico acumulados foram medidas. Os resultados são mostrados nas tabelas 2 e 3. Tabela 2 (produção de Glu em meio de MSII-GX)
Figure img0002
Tabela 3 (produção de Glu em meio de MSII-Xilose)
Figure img0003
[00213] Quando a cepa P. ananatis NA1 foi cultivada com a fonte carbono mista de glicose e xilose (meio de MSII-GX), o rendimento do ácido glutâmico foi 25,7 % (Tabela 2). Neste caso, o acúmulo de ácido xilônico foi observado e, assim, sugere-se que a maioria da xilose foi convertida em ácido xilônico. Estima-se que o acúmulo de ácido xilônico com a cepa P. ananatis NA1 foi fornecido pela atividade de glicose desidrogenase de P. ananatis.
[00214] Por outro lado, quando a cepa P. ananatis NA1 introduzida com pTWVPtac_ccrNXA_Km foi cultivada com a fonte de carbono mista de glicose e xilose (meio de MSII-GX), esta mostrou um rendimento de ácido glutâmico muito maior comparada à cepa parental (rendimento: 69,9 %). Se for levado em consideração que a cepa parental produz muito ácido glutâmico a partir da xilose, e presume-se que o rendimento do ácido glutâmico a partir da glicose da cepa introduzida com pTWVPtac_ccrNXA_Km é equivalente àquele da cepa parental, o rendimento de ácido glutâmico produzido a partir da xilose por meio da via NXA pode ser estimado como cerca de 86 %. De fato, quando a cultura foi realizada com xilose como uma única fonte de carbono (MSII-Xilose), a cepa introduzida com pTWVPtac_ccrNXA_Km produziu Glu em um rendimento de 80 % (Tabela 3). Exemplo 2: Introdução da via NXA em Escherichia coli (1) Expressão da via NXA em E. coli
[00215] Usando uma cepa deficiente em isocitrato desidrogenase (Δicd), que é uma enzima do ciclo TCA e produz αKG a partir do ácido isocítrico, a expressão da via NXA foi ensaiada pela complementação do crescimento, em um meio mínimo contendo xilose como uma única fonte de carbono. Uma vez que a cepa deficiente em gene icd não pode produzir αKG, ela não pode crescer em um meio mínimo contendo xilose como uma única fonte de carbono, mas se a capacidade de produzir αKG a partir da xilose puder ser transmitida pela introdução a via NXA, esta cepa adquire a capacidade de crescer em um meio como este.
[00216] Especificamente a cepa JW1122 cepa, que é uma cepa deficiente com relação ao gene icd de Keio Collection (http://cgsc.biology.yale.edu/Person.php?ID99553, disponível pela E. coli Genetic Resource Center at Yale CGSC, The Coli Genetic Stock Center), foi usada como uma cepa hospedeira bacteriana e, introduzindo e expressando a via NXA nesta cepa que usa um plasmídeo, examinou-se se a via NXA pode funcionar também em E. coli.
[00217] Na tabela 4, são mostrados os plasmídeos construídos e os resultados de complementação de crescimento na cepa deficiente com relação ao gene icd. Confirmou-se que a cepa introduzida com um plasmídeo pMW119 Ptac_ccrNXA (preparado no exemplo 1), contendo o operon da via NXA (xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD) e o promotor tac em combinação, pode crescer no meio mínimo M9 (placa) (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) contendo xilose como uma única fonte de carbono.
[00218] Um estudo similar também foi realizado por cultura líquida. O crescimento (O.D.) no meio mínimo M9 e no meio sintético E1, contendo xilose ou αKG como uma única fonte de carbono, foi avaliado com o tempo usando um aparelho de cultivo para 36 amostras. Os resultados são mostrados na figura 1. Assim como a cultura na placa, a cepa introduzida na via NXA cresceu favoravelmente no meio M9 ou E1 contendo xilose como uma única fonte de carbono, ao passo que a cepa controle do vetor não cresceu em um meio como este. Considera-se que estes resultados foram obtidos em decorrência da cepa crescer assimilando xilose por meio da via NXA, isto é, a via NXA derivada de C. crescentus funcionou também em E. coli. Tabela 4
Figure img0004
Figure img0005
(2) Expressão da via NXA na cepa de E. coli que produz ácido L-glutâmico
[00219] Assim como a cepa de E. coli que produz ácido L-glutâmico, MG1655ΔsucA (pedido de patente publicada U.S. 2005/0106688), que é uma cepa deficiente com relação à αKGDH, foi usada. O pMW119 Ptac_ccrNXA ou pMW119 foi introduzido como um controle na cepa anterior para obter MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA e MG1655ΔsucA/pMW119. Estas cepas foram cada qual cultivadas com cultura e frasco no meio de cultura MS contendo glicose (40 g/L), xilose (40 g/L), ou glicose e xilose (20 g/L cada) como a fonte de carbono. O cultivo foi realizado por 24 horas no meio contendo apenas glicose como a fonte de carbono, e por 48 horas nos outros meios. Os resultados são mostrados na figura 2. Os numerais 325, 425 e 513 anexados aos nomes da cepa mostrados na figura são os números de clone.
[00220] Quando o sistema misto de glicose e xilose foi usado como a fonte de carbono, enquanto a cepa controle (MG1655ΔsucA/pMW119) acumulou 15 a 16 g/L de ácido L-glutâmico, a cepa que expressa o operon ccrNXA (MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA) mostrou o acúmulo de ácido L-glutâmico em cerca de 12 g/L e, assim, tendeu a mostrar acúmulo e rendimento reduzidos de ácido L-glutâmico. Igualmente, quando a xilose foi usada como uma única fonte de carbono, o mesmo resultado foi obtido. Assim como os subprodutos, os ácidos orgânicos e o ácido xilônico foram analisados. Como um resultado, observa-se que principalmente o ácido acético e o ácido xilônico se acumularam. (3) Análise do ponto de limitação de taxa da via NXA em E. coli
[00221] Uma vez que o ácido xilônico, que é um intermediário da via NXA, foi detectado no sobrenadante da cultura da bactéria E. coli que expressa o operon ccrNXA e é produtora de ácido L-glutâmico, da maneira descrita anteriormente, considera-se que muito provavelmente uma parte da xilose incorporada foi assimilada por meio da via NXA. Além disso, os seguintes problemas foram avaliados. i) Embora a xilose incorporada nas células possa ser assimilada tanto pelo sistema que assimila xilose, característico de E. coli, quanto pela via NXA, uma certa quantidade de xilose pode ser utilizada pelo sistema característico de E. coli, em virtude da diferença na atividade ou especificidade do substrato da primeira enzima do sistema característico de E. coli, xilose isomerase (XylA), e da primeira enzima da via NXA, xilose desidrogenase (XDH) e, assim, a vazão do fluxo metabólico que passa pela via NXA pode se tornar menor. ii) Pode ser um ponto de limitação da taxa na via NXA, ou uma via de atalho desconhecida e, portanto, αKG não pode ser produzido.
[00222] Considera-se que o problema de i) pode ser resolvido aumentando as quantidades das enzimas da via NXA pela troca do vetor de expressão do operon NXA, a partir de um vetor do tipo número de cópias baixo (pMW119) para um vetor do tipo número de cópias médio (pTWV228), e aumentando por meio disso a quantidade de consumo do substrato na via ccrNXA.
[00223] Também considera-se que o problema de ii) pode ser superado pela melhoria de uma cepa com o cultivo, com base na análise do ponto de limitação da taxa e resultados desta.
[00224] Com base na consideração anterior, o seguinte foi realizado: a) construção de uma cepa a partir de uma cepa deficiente na via de assimilação da xilose específica para E. coli, (ΔsucAΔxylA), como um hospedeiro, em que o operon ccrNXA é expresso e, assim, o fluxo de carbono é forçado através da via NXA, e avaliação da mesma por cultivo, b) construção de um vetor de expressão do operon ccrNXA usando um vetor de número de cópias médio, construção de uma cepa usando um vetor de expressão como este, e avaliação destes por cultivo, e c) análise do ponto de limitação da taxa.
[00225] Eliminando o gene xylA que assimila xilose específico de E. coli a partir de MG1655ΔsucA, de acordo com o /-Red método, e usando os oligonucleotídeos iniciadores xylA-H1P1-5742-5-1 (SEQ ID NO: 21) e xylA- H2P2-5742-5-2 (SEQ ID NO: 22), a cepa MG1655ΔsucAΔxylA foi obtida. O pMW119Ptac_ccrNXA foi introduzido nesta cepa para obter uma cepa que expressa o operon ccrNXA deficiente em xylA.
[00226] Os resultados da cultura para produção de ácido L-glutâmico, realizada cultivando a cepa que expressa o operon ccrNXA deficiente em xylA, da mesma maneira descrita na seção (3) anterior, são mostrados na figura 3. Na figura 3, “ccrNXA” representa pMW119Ptac_ccrNXA, e os números a seguir representam os números de clone.
[00227] Enquanto a cepa de controle do vetor da cepa ΔsucAΔxylA não pode assimilar a xilose, e pode formar células e produzir ácido L-glutâmico a partir apenas da glicose, a cepa que expressa o operon ccrNXA mostrou consumir xilose e produção de ácido L-glutâmico, que foi considerado como a forma derivada da xilose. Entretanto, observa-se que a quantidade de acúmulo de ácido L-glutâmico foi menor que aquele obtido com a cepa modelo (ΔsucA cepa) e acumulou ácido xilônico, que é um intermediário metabólico da via ccrNXA. A partir destes resultados, sugere-se que o fluxo metabólico da via ccrNXA pode ser insuficiente. Além disso, uma vez que a sub-produção de αKG não foi observada, considera-se que o fornecimento de NADPH exigido para a expressão da atividade de GDH não acarretou em nenhum problema neste estágio.
[00228] A seguir, um vetor de expressão do operon ccrNXA foi construído usando um vetor de número de cópias médio. O operon ccrNXA contendo a região promotora tac foi amplificado usando pMW119 Ptac_ccrNXA como o molde, bem como PtwvPtacf (SEQ ID NO: 1) e 0819r (SEQ ID NO: 4) como os oligonucleotídeos iniciadores. O pTWV228 foi digerido com SmaI e usado junto com o fragmento de PCR do operon ccrNXA, contendo a região promotora tac, para realizar a reação em fusão, a cepa E. coli JM109 foi transformada com o produto de reação, e o plasmídeo alvo pTWVPtac_ccrNXA foi obtido a partir de um transformante. Este plasmídeo foi introduzido na cepa MG1655ΔsucA, e a cepa obtida foi cultivada da mesma maneira que aquela descrita na seção (3) anterior. Os resultados são mostrados na figura 4. Na figura, “ΔsucA” representa a cepa MG1655ΔsucA, e “/pTWV” e “/v” significam que a cepa carregava pTWV228. Além disso, pTWV110 a pTWV119 indicam números de clone de pTWV228Ptac_ccrNXA.
[00229] Quando apenas a glicose foi usada como a fonte de carbono, a cepa que expressa o operon ccrNXA com número de cópias médio acumulou ácido L-glutâmico, em uma quantidade substancialmente equivalente àquela observada com a cepa controle. Entretanto, quando o sistema de cultivo misto de glicose e xilose foi usado, o acúmulo de ácido L-glutâmico tendeu a diminuir. Além disso, os resultados de cepas irmãs também variaram. Uma das possíveis razões foi a eliminação do vetor de expressão de número de cópias médio. Além disso, assim como nas cepas descritas anteriormente, o acúmulo de ácido xilônico foi observado.
[00230] A fim de confirmar se as atividades das enzimas da via ccrNXA aumentaram pelo aumento no número de cópias do operon NXA, a atividade de XDH, que é a primeira enzima da via NXA, foi avaliada. Os resultados são mostrados na tabela 5. “7513” e “1110” nos nomes da cepa mencionada na tabela 5 são os números de clone. Tabela 5: Resultados da avaliação da atividade de XDH (xilose desidrogenase)
Figure img0006
ND: não detectado Nota: A atividade relativa foi indicada como a atividade relativa com base na atividade específica de ccrNXA7513 determinada como 1.
[00231] A cepa introduzida com vetor de expressão com número de cópias médio mostrou atividade de XDH cerca de 7 vezes maior, comparada à cepa introduzida com vetor de expressão com número de cópias baixo. Não foi confirmado como a xilose foi realmente distribuída nas células a partir do ponto de derivação da xilose isomerase (XylA), característico de E. coli e XDH, e assim também considerou-se ainda que a atividade de XDH, que é a primeira enzima da via NXA, pode ser insuficiente. Entretanto, uma vez que o aumento da atividade de XDH não forneceu o efeito que melhora o acúmulo de ácido L-glutâmico, e com base no acúmulo de ácido xilônico entre outros, considera-se que qualquer uma ou mais das enzimas da via NXA podem ser limitantes da taxa.
[00232] Portanto, ponto de limitação da taxa da via NXA foi analisado. Uma vez que o ácido xilônico se acumulou como um intermediário metabólico, considerou-se pelo menos que o ponto de limitação da taxa pode existir na via de ácido xilônico até αKG, sem ser a via metabólica de xilose até ácido xilônico. Além disso, na estrutura do operon ccrNXA, enquanto as enzimas da via de xilose até ácido xilônico são codificadas pelos genes localizados na terceira e quarta posições, as enzimas da via de ácido xilônico até αKG são codificadas pelos genes localizados nas primeiras, segundas e quintas posições. A atividade de XDH, cujo gene se localiza na terceira posição no operon, foi detectada in vitro, e assim considerou-se que, se a atividade da enzima codificada pelo gene localizado na quinta posição no operon (XylD) puder ser detectada adicionalmente, esta pode funcionar como uma evidência circunstancial de transcrição e tradução do operon NXA completo. Portanto, estima-se que uma das três reações de ácido xilônico até αKG constituíram um ponto de limitação da taxa, e os experimentos a seguir foram realizados.
[00233] Os plasmídeos pSTVPtac_xylD_Ttrp, pSTVPtac_xylX_Ttrp, e pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp que expressam os genes xylD, xylX e ccrxylA, respectivamente, foram preparados da maneira a seguir.
[00234] O pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp foi preparado com preparo de um fragmento de xylX por PCR usando pUC18-xylX, que é um plasmídeo preparado clonando xylX, a partir do qual o sítio SfiI foi removido em pUC18 como o molde, bem como xylX-IFS-5742-10-1 (SEQ ID NO: 38) e xylX- IFA-5742-10-2 (SEQ ID NO: 39) como os oligonucleotídeos iniciadores, e clonando o plasmídeo obtido em pSTV28-Ptac-Ttrp digerido com SmaI pelo método de clonagem em fusão.
[00235] O pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp foi preparado com o preparo um fragmento ccrxylA por PCR usando pUC18-ccrxylA, que é um plasmídeo preparado clonando ccrxylA, a partir do qual o sítio SfiI foi removido em pUC18 como o molde, bem como xylA_IFS_5742-10-3 (SEQ ID NO: 40) e xylA_IFA_5742-10-4 (SEQ ID NO: 41) como os oligonucleotídeos iniciadores, e clonando o plasmídeo obtido em pSTV28-Ptac-Ttrp digerido com SmaI pelo método de clonagem em fusão.
[00236] O pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp foi preparado com o preparo um fragmento xylD por PCR usando pUC18-xylD, que é um plasmídeo preparado clonando xylD, a partir do qual o sítio SfiI foi removido em pUC18 como o molde, bem como xylD_IFS_5742-10-5 (SEQ ID NO: 42) e xylD_IFA_5742- 10-6 (SEQ ID NO: 43) como os oligonucleotídeos iniciadores, e clonando o plasmídeo obtido em pSTV28-Ptac-Ttrp digerido com SmaI pelo método de clonagem em fusão.
[00237] Os plasmídeos pUC18-xylX, pUC18-ccrxylA e pUC18-xylD anteriormente mencionados foram preparados da maneira descrita a seguir, respectivamente.
[00238] Por PCR que usa o DNA genômico da cepa C. crescentus CB-15 como o molde, CC0823-01F_4691-87-1 (SEQ ID NO: 44) e CC0823- 01R_4691-87-2 (SEQ ID NO: 45), bem como CC0823-02F_4691-87-3 (SEQ ID NO: 46) e CC0823-02R_4691-87-4 (SEQ ID NO: 47) como os oligonucleotídeos iniciadores, os fragmentos de 900 bp e 280 bp foram amplificados, respectivamente. A seguir, pUC18 digerido com SmaI, e dois dos fragmentos amplificados anteriormente mencionados foram montados pelo método de montagem in vitro (Nature Methods, 6(5), 343-345, 2009) para obter pUC18-xylX, em que o sítio SfiI foi removido, e o gene xylX foi inserido.
[00239] Por PCR que usa o DNA genômico da cepa C. crescentus CB-15 como o molde, CC0822-01F_4691-87-5 (SEQ ID NO: 48) e CC0822- 01R_5659-8-7 (SEQ ID NO: 49), CC0822-02F_5659-8-8 (SEQ ID NO: 50) e CC0822-02R_5659-8-9 (SEQ ID NO: 51), CC0822-03F_5659-8-10 (SEQ ID NO: 52) e CC0822-03R_5659-8-11 (SEQ ID NO: 53), CC0822-04F_5659-8- 12 (SEQ ID NO: 54) e CC0822-04R_5659-8-13 (SEQ ID NO: 55), bem como CC0822-05F_5659-8-14 (SEQ ID NO: 56) e CC0822-05R_4691-87-14 (SEQ ID NO: 57) como os oligonucleotídeos iniciadores, cinco fragmentos, 11v02 (175 bp), 12v02 (325 bp), 13v02 (260 bp), 14v02 (193 bp) e 15v02 (544 bp), foram amplificados, respectivamente. A seguir, dois dos fragmentos de 11v02 e 12v02 foram ligados por PCR com cruzamento usando estes dois fragmentos como o molde, bem como CC0822-01F_4691-87-5 e CC0822- 02R_5659-8-9 como os oligonucleotídeos iniciadores. Similarmente, dois dos fragmentos de 13v02 e 14v02 foram ligados por PCR com cruzamento usando estes dois fragmentos como o molde, bem como CC0822-03F_5659-8-12 e CC0822-04R_5659-8-13 como os oligonucleotídeos iniciadores. Estes dois fragmentos e o fragmento 15v02 anteriormente mencionado foram ligados pelo método de montagem in vitro (Nature Methods, 6(5), 343-345, 2009). O fragmento ligado obtido foi amplificado por PCR usando-o como o molde, bem como CC0822-01F_4691-87-5 e CC0822-05R_4691-87-14 como os oligonucleotídeos iniciadores. A seguir, pUC18 digerido com SmaI, e o fragmento ligado anteriormente mencionado foi montado pelo método de montagem in vitro (Nature Methods, 6(5), 343-345, 2009) para obter pUC18- ccrxylA, no qual o sítio SfiI foi removido, e o gene ccrxylA foi inserido.
[00240] Por PCR que usa o DNA genômico da cepa C. crescentus CB-15 como o molde, CC0819-01F_4691-88-7 (SEQ ID NO: 17) e CC0819- 01R_5659-9-1 (SEQ ID NO: 18), bem como CC0819-02F_5659-9-2 (SEQ ID NO: 19) e CC0819-02R_4691-88-10 (SEQ ID NO: 20) como os oligonucleotídeos iniciadores, os fragmentos de 1.130 bp e 653 bp foram amplificados, respectivamente. A seguir, pUC18 digerido com SmaI, e dois dos fragmentos amplificados anteriormente mencionados foram montados pelo método de montagem in vitro (Nature Methods, 6(5), 343-345, 2009) para obter pUC18-xylD, em que o sítio SfiI foi removido, e o gene xylD foi inserido.
[00241] Os extratos de enzima bruta foram preparados a partir da cepa que expressa o operon ccrNXA (MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA), e das cepas que carregam cada um dos plasmídeos que expressam um dos genes anteriormente mencionados xylD, xylX, e ccrxylA, respectivamente (MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylD_Ttrp, MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylX_Ttrp, e MG1655ΔsucA/pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp), e a seguir cada um dos extratos de enzima bruta da cepa que carrega apenas o vetor, ou das cepas que expressam um dos genes xylD, xylX, e ccrxylA, foi adicionado ao extrato de enzima bruta da cepa que expressa o operon ccrNXA, e a atividade para produzir αKG a partir do ácido xilônico de cada mistura foi medida. Os resultados são mostrados na tabela 6. Na tabela 6, “1.110” anexado ao nome da cepa é o número de clone. Tabela 6: Resultados da medição de atividade para produzir αKG a partir de ácido xilônico
Figure img0007
Nota: A atividade relativa é indicada como a atividade relativa com base na atividade específica do sistema misto ccrNXA1110 e pSTV28-Ptac-Ttrp determinado como 1.
[00242] Com o sistema no qual foi adicionado o extrato de enzima bruta da cepa que expressa apenas o gene xylD, o aumento da atividade que produz αKG foi observada. A partir deste resultado, sugere-se que a xilonato desidratase (XylD) codificada pelo gene xylD constituiu um ponto de limitação da taxa da via NXA, construída em E. coli por expressão heterogênea.
[00243] Uma vez que o fluxo metabólico da via completa pode ser melhor aumentando adicionalmente a expressão do gene xylD na cepa que expressa o operon ccrNXA, da maneira sugerida pela medição da atividade enzimática, uma cepa com melhor expressão do gene xylD foi construída introduzindo um vetor de expressão de gene xylD na cepa que expressa o operon ccrNXA, e foi avaliada pelo cultivo para a produção de ácido L- glutâmico usando a glicose e xilose como a fonte de carbono. Assim como a cepa que expressa o operon ccrNXA, MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA e MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA foram usados.
[00244] O cultivo foi realizado da mesma maneira que aquele descrito na seção (3) anteriormente mencionado.
[00245] Os resultados são mostrados na tabela 7. A cepa que melhora a expressão do gene xylD mostrou acúmulo e rendimento de ácido L-glutâmico muito melhores. O acúmulo de ácido L-glutâmico foi de 23 a 25 g/L, ao contrário de 15 a 16 g/L da cepa controle, e o rendimento baseado no sacarídeo consumido atingiu 57 a 60 %, ao contrário de 37 a 40 % da cepa controle. O ácido xilônico, que é um intermediário metabólico, não foi observado na cepa com melhor expressão do gene xylD. Por outro lado, o efeito de melhorar a expressão do gene xylD foi observado apenas na cepa de expressão que carrega um vetor de expressão do operon ccrNXA do tipo número de cópias médio, e o efeito não foi observado na cepa de expressão que carrega o vetor do tipo número de cópias baixo. A partir destes resultados, considera-se que a remoção do ponto de limitação da taxa desta via, aumentando a atividade da via NXA completa por meio do aumento no número de cópias dos vetores, e a melhoria adicional da expressão do gene xylD forneceram a melhoria na quantidade de produção do ácido L-glutâmico. Além disso, quando a atividade para produzir αKG a partir do ácido xilônico da cepa com melhor expressão do gene xylD foi avaliada, esta aumentou cerca de 10 vezes comparada àquela observada antes da melhoria (Tabela 8). Os números “1.110”, “17” e “19” anexados aos nomes da cepa, mencionados nas tabelas 7 e 8, são os números de clone. Tabela 7: Resultado da avaliação da cepa que expressa operon ccrNXA + xylD por cultura de produção de L-Glu
Figure img0008
Tabela 8: Resultados da melhoria da atividade para produzir αKG a partir do ácido xilônico
Figure img0009
Nota: Os resultados para MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA1110 são valores obtidos em experimentos usando lotes diferentes. ND: Não detectado Nota: A atividade relativa é indicada como atividade relativa com base na atividade específica de ccrNXA1110 determinada como 1. Exemplo 3: Introdução da via NXA em Corynebacterium glutamicum (1) Construção de plasmídeo pVK9Peftu_ccrNXA para introdução da via NXA
[00246] Um plasmídeo com uma sequência contendo a sequência promotora do gene de fator de alongamento Tu (EF-Tu), tuf (WO2008/114721, SEQ ID NO: 33, de agora em diante referido como “Peftu”) e xylD, ligados à jusante da sequência promotora, foi construído usando o estojo de clonagem HD Clontech In-Fusion (Clontech). Primeiro, a PCR foi realizada usando o DNA cromossômico da cepa C. glutamicum ATCC 13869 como o molde, bem como oligonucleotídeos iniciadores Peftu(Pst) (SEQ ID NO: 58) e Peftu_Rv (SEQ ID NO: 59) para obter um fragmento contendo a sequência Peftu. Esta PCR foi realizada usando polimerase PrimeSTAR HS, de acordo com o protocolo anexado a esta enzima.
[00247] Além disso, a PCR foi realizada usando pTWV228Ptac_ccrNXA como o molde, bem como oligonucleotídeos iniciadores Peftu_xylXABCD_fw (SEQ ID NO: 60) e Peftu_xylXABCD_rv (SEQ ID NO: 61), para obter um fragmento contendo a sequência xylXABCD de C. crescentus. Esta PCR foi realizada usando polimerase PrimeSTAR GXL, de acordo com o protocolo anexado a esta enzima.
[00248] A seguir, o fragmento Peftu e o fragmento contendo xylXABCD obtido anteriormente foram misturados com pVK9, tratado com PstI e BamHI, e usados para realizar a reação em fusão de acordo com o protocolo do estojo de clonagem Clontech In-fusion HD. O pVK9 é um vetor de transporte obtido por pHSG299 com extremidade cega (Takara Bio) no sítio AvaII, e inserindo uma região replicável de maneira autônoma em bactérias corineformes contidas em pHK4 (patente Japonesa submetida ao domínio público 05-007491), que foi excisado com BamHI e KpnI e apresentou extremidade cega (patente Japonesa submetida ao domínio público 200797573, pedido de patente publicada U.S. 2005/0196846). A E. coli JM109 foi transformada na mistura de reação em fusão. Os transformantes foram submetidos à seleção em um meio de ágar, que compreende o meio LB suplementado com canamicina em uma concentração final de 50 mg/L. O plasmídeo alvo pVK9Peftu_ccrNXA foi obtido a partir de um transformante obtido. (2) Produção de ácido L-glutâmico por Corynebacterium glutamicum introduzida com o via NXA
[00249] A cepa C. glutamicum ATCC 13869 foi transformada com o pVK9Peftu_ccrNXA anteriormente mencionado, pelo método de pulso elétrico (patente Japonesa submetida ao domínio público 2-207791). Uma cepa introduzida com pVK9Peftu_ccrNXA foi selecionada em um meio de ágar, que compreende o meio CM-Dex suplementado com canamicina em uma concentração final de 25 mg/L. Além disso, a cepa C. glutamicum ATCC13869 transformada com pVK9 também foi selecionada de uma maneira similar à uma cepa controle.
[00250] A capacidade de assimilar xilose e a capacidade de produzir ácido L-glutâmico dos transformantes obtidos foram verificadas realizando cultivo que usa um frasco de Sakaguchi. As células de cada cepa transformante, cultivada a 31,5°C por 24 horas no meio de ágar CM-Dex suplementado com canamicina em uma concentração final de 25 mg/L, foram raspadas em uma quantidade que corresponde a 1/6 da placa, e inoculadas em 20 mL do meio Glc contido em um frasco de Sakaguchi, 1 g de carbonato de cálcio previamente esterilizado com ar quente foi adicionado, e a cultura com agitação foi realizada a 31,5°C e 120 rpm por 24 horas. O meio de cultura obtido em um volume de 1 mL foi inoculado em 20 mL do meio Xyl (com biotina restrita) contido em um frasco de Sakaguchi, 1 g de carbonato de cálcio previamente esterilizado com ar quente foi adicionado, e a cultura com agitação foi realizada a 31,5°C e 120 rpm por 73 horas. Os resultados são mostrados na tabela 9.
[00251] A cepa C. glutamicum ATCC 13869 introduzida com pVK9 cresceu muito no meio Xyl, e também não mostrou a produção de ácido L- glutâmico. Por outro lado, a cepa C. glutamicum ATCC 13869 introduzida com pVK9Peftu_ccrNXA cresceu no meio Xyl e acumulou ácido L- glutâmico. A partir destes resultados, observa-se que a introdução da via NXA nas bactérias corineformes melhorou a capacidade de assimilar xilose, e uma cepa como esta produziu ácido L-glutâmico a partir da xilose. Tabela 9
Figure img0010
(3) Construção da cepa que melhora adicionalmente a expressão do gene xylD
[00252] Uma vez que a cepa C. glutamicum ATCC 13869 que carrega pVK9Peftu_ccrNXA acumulou ácido xilônico, presume-se que a atividade do produto de gene xylD foi insuficiente. Portanto, tentou-se construir um plasmídeo para a expressão da via NXA, no qual o gene xylD melhorou muito pela introdução uma ou mais cópias do gene xylD no plasmídeo pVK9 Peftu_ccrNXA. (4) Construção de plasmídeo pVS7PmsrA_xylD para a expressão do gene xylD
[00253] Um plasmídeo com uma sequência compreendendo a sequência promotora do gene msrA (peptídeo metionina sulfóxido redutase A) (de agora em diante referida como “PmsrA”), e o gene xylD de C. crescentus ligado à jusante da sequência promotora, foi construído usando estojo de clonagem Hd Clontech In-Fusion.
[00254] Primeiro, a PCR foi realizada usando o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores PmsrA(Pst) (SEQ ID NO: 62) e PmsrAR (SEQ ID NO: 63), para obter um fragmento contendo a sequência PmsrA. Além disso, a PCR foi realizada usando pTWV228Ptac_ccrNXA como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores PmsrA_xylD_fw (SEQ ID NO: 64) e Peftu_xylXABCD_rv, para obter um fragmento contendo a sequência de gene xylD de C. crescentus. Estas PCRs foram realizadas usando polimerase PrimeSTAR HS, de acordo com o protocolo anexado a esta enzima.
[00255] A seguir, os fragmentos contendo o fragmento PmsrA e o gene xylD obtido anteriormente foram misturados com o vetor de transporte pVS7 (o método de construção é mostrado a seguir), tratados com PstI e BamHI, e usados para realizar a reação em fusão de acordo com o protocolo do estojo de clonagem HD Clontech In-fusion, e a seguir a E. coli JM109 foi transformada com esta mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção em um meio de ágar, compreendendo o meio LB suplementado com espectinomicina em uma concentração final de 25 mg/L. O plasmídeo alvo pVS7PmsrA_xylD foi obtido a partir de um transformante obtido.
[00256] O pVS7 é um plasmídeo obtido substituindo o gene de resistência ao cloranfenicol de pVC7 (patente Japonesa submetida ao domínio público 2000-201692, Patente Europeia 1004671) por um gene de resistência à espectinomicina. O gene de resistência à espectinomicina pode ser obtido preparando um plasmídeo pDG1726 a partir da cepa Escherichia coli ECE101E, vendida pelo Bacillus Genetic Stock Center (BGSC), e extraindo o gene de resistência do plasmídeo como um cassete. Por meio da PCR usando pDG1726 como o molde, bem como oligonucleotídeos iniciadores SpcR-F (SEQ ID NO: 65) e SpcR-R (SEQ ID NO: 66), o gene de resistência à espectinomicina foi amplificado. O fragmento de gene obtido foi misturado com pVC7 tratado com SmaI, uma reação de ligação foi realizada de acordo com o protocolo de mistura de ligação <Mighty Mix> de Takara Bio, e a E. coli JM109 foi transformada com esta mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção em um meio com ágar, compreendendo o meio LB suplementado com espectinomicina em uma concentração final de 25 mg/L. O pVC7-spc compreendendo pVC7 inserido com o gene de resistência à espectinomicina foi obtido a partir de um transformante obtido. Além disso, a PCR foi realizada usando pVC7-spc como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores spc(GTG start)-F (SEQ ID NO: 67) e spc(stop)- R (SEQ ID NO: 68), para amplificar o gene de resistência à espectinomicina.
[00257] Separadamente, a PCR foi realizada usando pVC7 como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores Spc-pVC7-Cm-F (SEQ ID NO: 69) e Spc-pVC7-Cm-R (SEQ ID NO: 70), para obter um fragmento de DNA compreendendo pVC7, em que o gene de resistência ao cloranfenicol foi removido. Este fragmento de DNA e o fragmento de DNA do gene de resistência à espectinomicina, obtido anteriormente de pVC7-spc, foram misturados e usados para realizar a reação em fusão de acordo com o protocolo do estojo de clonagem HD de Clontech In-fusion, e a E. coli JM109 foi transformada com a mistura de reação resultante. Os transformantes foram submetidos à seleção em um meio de ágar compreendendo o meio LB suplementado com espectinomicina, em uma concentração final de 25 mg/L. O pVS7 foi obtido a partir de um transformante obtido. (5) Construção do plasmídeo pVK9Peftu_ccrNXA+D com melhoria adicional do gene xylD
[00258] O fragmento de DNA contendo o gene de resistência à espectinomicina (Spc) e PmsrA_xylD foi amplificado usando pVS7PmsrA_xylD como o molde, bem como os oligonucleotídeos iniciadores ME_Spc_fw (SEQ ID NO: 71) e ME_Peftu_xylXABCD_rv (SEQ ID NO: 72). O fragmento de DNA obtido foi inserido em pVK9Peftu_ccrNXA in vitro, de acordo com o protocolo do estojo de construção Ez-Tn5TM Custom Transposome (Epicentre), e o resultante foi usado para transformar E. coli DH5α. Os transformantes foram submetidos à seleção em um meio de ágar compreendendo o meio de ágar LB suplementado com canamicina e espectinomicina, em uma concentração final de 50 mg/L e 25 mg/L, respectivamente. Os plasmídeos foram extraídos a partir dos transformantes obtidos, e um plasmídeo para o qual confirmou-se que o sítio de inserção da sequência Spc-PmsrA_xylD não estava na sequência Peftu_ccrNXA, por análise de sequência de nucleotídeos em torno da sequência Spc- PmsrA_xylD, foi determinado pVK9Peftu_ccrNXA+D. (6) Produção de ácido L-glutâmico pela cepa introduzida na via NXA com melhoria adicional do gene xylD
[00259] pVK9Peftu_ccrNXA+D foi introduzido na cepa C. glutamicum ATCC 13869 pelo método de pulso elétrico, e as células foram aplicadas no meio de ágar CMDex, contendo 25 mg/L de canamicina. A capacidade de produzir ácido L-glutâmico, de uma cepa crescida após o cultivo a 31,5°C, foi verificada da mesma maneira que aquela da seção (2) anteriormente mencionada. Os resultados são mostrados na tabela 10.
[00260] A cepa que carrega pVK9Peftu_ccrNXA+D acumulou ácido D- xilônico em uma quantidade menor, mas acumulou ácido L-glutâmico em uma quantidade maior comparada à cepa que carrega pVK9Peftu_ccrNXA. Por este resultado, demonstrou-se que o ácido L-glutâmico pode ser mais eficientemente produzido a partir da via D-xilose a da via NXA, melhorando adicionalmente o gene xylD. Tabela 10: Produção de ácido L-glutâmico da cepa introduzida na via NXA com melhoria adicional do gene xylD
Figure img0011
Exemplo 4 (1) Substituição dos genes da via NXA
[00261] Nos exemplos anteriormente mencionados, usando os genes xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC e xylD de uma bactéria conhecida C. crescentus, para a qual a via NXA foi relatada, demonstra-se que o ácido glutâmico pode ser produzido a partir da via da xilose para a via NXA. Neste exemplo, os genes homólogo de xylD, xylX, e ccrxylA são obtidos a partir de espécies biológicas, sem ser C. crescentus, e investiga-se se estes genes podem substituir os genes de C. crescentus. Assim como as fontes de gene, as espécies biológicas descritas na tabela 11 foram escolhidas. Os símbolos de gene dos genes (GenBank) também são conhecidos. Os números de identificação de sequência das sequências de nucleotídeos dos genes, e das sequências de aminoácidos codificadas por estes, usados na listagem de sequências são mostrados na tabela 12. Na tabela 12, “original” significa sequência de nucleotídeos de gene de ocorrência natural, e “otimizado” significa sequência de nucleotídeos cujos códons são otimizados de acordo com o uso do códon em E. coli.
[00262] Nas descrições a seguir, as enzimas codificadas pelos homólogos dos genes xylD, xylX e xylA podem ser referidas como XylD, XylX e XylA, respectivamente. Tabela 11
Figure img0012
Tabela 12
Figure img0013
Figure img0014
(2) Construção de plasmídeos para detectar as atividades de XylD, XylX e XylA, pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km, pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km e pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km
[00263] A construção foi realizada usando o estojo de clonagem Clontech In-Fusion.
[00264] Primeiro, por PCR usando pTWVPtac_ccrNXA_Km como o molde, bem como Ptac_xylXABC_F (SEQ ID NO: 111) e Ptac_xylXABC_R (SEQ ID NO: 112) como os oligonucleotídeos iniciadores, foi amplificado o fragmento de DNA, exceto com relação a xylD. O produto de PCR foi usado para realizar a reação em fusão, de acordo com o protocolo do estojo de clonagem HD Clontech In-fusion, a cepa E. coli JM109 foi transformada com o produto de reação, e o plasmídeo alvo pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km foi obtido a partir de um transformante.
[00265] Da mesma maneira descrita anteriormente, pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km foi construído usando Ptac_xylABCD_F (SEQ ID NO: 113) e Ptac_xylABCD_R (SEQ ID NO: 114) como os oligonucleotídeos iniciadores, e pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km foi construído usando Ptac_xylXBCD_F (SEQ ID NO: 115) e Ptac_xylXBCD_R (SEQ ID NO: 116) como os oligonucleotídeos iniciadores. (3) Construção de Pantoea ananatis para detectar as atividades de XylD, XylX e XylA
[00266] A cepa P. ananatis NA1 foi transformada com pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km descrito anteriormente pelo método de eletroporação. A cepa construída foi referida como P. ananatis NA2 ΔxylD. Para o cultivo de P. ananatis NA2 ΔxylD, foi usado um meio com placa compreendendo LBGM9, no qual a canamicina e tetraciclina foram adicionados em concentrações finais de 40 mg/L e 12,5 mg/L, respectivamente.
[00267] Da mesma maneira, a cepa P. ananatis NA1 foi transformada com pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km ou pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km para construir a cepa P. ananatis NA2 ΔxylX e a cepa P. ananatis NA2 ΔccrxylA. (4) Construção de plasmídeos de expressão homólogos à xylD, xylX e xylA
[00268] Os plasmídeos para a expressão de yjhG ou yagF, pSTV28-Ptac- yjhG-Ttrp e pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp, foram preparados da maneira a seguir.
[00269] O pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp foi preparado amplificando um fragmento yjhG por PCR que usa o DNA genômico da cepa E. coli MG1655 como o molde, bem como yjhG_F (SEQ ID NO: 117) e yjhG_R (SEQ ID NO: 118) como os oligonucleotídeos iniciadores, e clonando o fragmento amplificado em pSTV28-Ptac-Ttrp digerido com SmaI, de acordo com o método de clonagem em fusão.
[00270] O pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp foi preparado da mesma maneira que aquela descrita anteriormente usando yagF_F (SEQ ID NO: 119) e yagF_R (SEQ ID NO: 120) como os oligonucleotídeos iniciadores.
[00271] Um plasmídeo para a expressão de xylD(Hse), pSTV28-Ptac- xylD(Hse)-Ttrp, foi preparado da maneira a seguir. Um fragmento de DNA com as sequências do promotor tac, xylD(Hse) e finalizador trp (Ptac- xylD(Hse)-Ttrp), foi sintetizado e ligado ao vetor pUC57 (obtido da Thermo Fischer Scientific) digerido com EcoRV para obter pUC57-Ptac-xylD(Hse)- Ttrp. Quando o fragmento de DNA foi sintetizado, os códons foram otimizados, de maneira tal que o fragmento fosse adequado para a expressão em E. coli. Quantidades iguais de pSTV28 e pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp, ambos os quais foram digeridos com EcoRI e KpnI, foram misturadas e a reação de ligação foi realizada. A seguir, JM109 foi transformada com o produto de ligação, e um plasmídeo foi extraído de um colônia que exibiu resistência à Cm para obter pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp.
[00272] Os plasmídeos para expressão de xylD(Amis), xylD(Aor), xylX(Cne), xylX(Zga), xylX(Tco), xylA(Abr), e ycbD, pSTV28-Ptac- xylD(Amis)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Cne)- Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp, pSTV28- Ptac-xylA(Abr)-Ttrp e pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp, respectivamente, também foram preparados da mesma maneira. A otimização do códon não foi realizada para YcbD.
[00273] Um plasmídeo para a expressão de xylD(Atu), pSTV28-Ptac- xylD(Atu)-Ttrp, foi preparado da maneira a seguir. Um fragmento de DNA com as sequências do promotor tac, xylD(Atu) e finalizador trp (Ptac- xylD(Atu)-Ttrp) foi sintetizado e ligado ao vetor pJET1.2 (obtido pela Thermo Fischer Scientific), digerido com EcoRV, para obter pJET1.2-Ptac- xylD(Atu)-Ttrp. Quando o fragmento de DNA foi sintetizado, os códons foram otimizados de maneira tal que o fragmento ficasse adequado para a expressão em E. coli. As quantidades iguais de pSTV28 e pJET1.2-Ptac- xylD(Atu)-Ttrp, ambos os quais foram digeridos com EcoRI e KpnI, foram misturadas e a reação de ligação foi realizada. A seguir, JM109 foi transformada com o produto de ligação, e um plasmídeo foi extraído a partir de uma colônia que exibe resistência à Cm para obter pSTV28-Ptac- xylD(Atu)-Ttrp.
[00274] Os plasmídeos para a expressão de xylX(Atu) ou xylA(Hbo), pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp e pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp também foram preparados da mesma maneira.
[00275] Um plasmídeo para a expressão de xylX(Art), pSTV28-Ptac- xylX(Art)-Ttrp, foi preparado da maneira a seguir. Um fragmento de DNA com as sequências do promotor tac, xylX(Art) e finalizador trp (Ptac- xylX(Art)-Ttrp) foi sintetizado e ligado ao vetor pCC1 (obtido da Epicentre), digerido com EcoRV, para obter pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp. Quando o fragmento de DNA foi sintetizado, os códons foram otimizados de maneira tal que o fragmento ficasse adequado para a expressão em E. coli. As quantidades iguais de pSTV28 e pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp, ambos os quais foram digeridos com EcoRI e KpnI, foram misturadas e a reação de ligação foi realizada. A seguir, JM109 foi transformada com o produto de ligação, e um plasmídeo foi extraído a partir de uma colônia que exibe resistência à Cm para obter pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp. (5) Detecção de atividades de homólogos de XylD
[00276] A cepa de P. ananatis NA2 ΔxylD foi transformada com pSTV28-Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp, pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp, pSTV28-Ptac-yagF- Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp ou pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp pelo método de eletroporação (referência à patente U.S. 6.682.912). Para o cultivo dos transformantes, um meio em placa compreendendo LBGM9 foi usado, no qual a canamicina, tetraciclina e cloranfenicol foram adicionados em concentrações finais de 40 mg/L, 12,5 mg/L e 25 mg/L, respectivamente.
[00277] As células de cada transformante cultivadas por toda a noite a 34°C na placa com LBGM9, na qual os medicamentos foram adicionados, foram raspadas em uma quantidade que corresponde a 1/6 das células na placa, inoculadas em 5 mL do meio MSII-SX contido em um tubo de teste grande, e cultivadas a 34°C e 120 rpm por 48 horas, e a quantidade de ácido L-glutâmico (Glu) acumulado foi avaliada. Os resultados são mostrados na figura 5.
[00278] Enquanto a cepa P. ananatis NA2 ΔxylD introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp acumulou 6,9 g/L de ácido L-glutâmico, os outros transformantes acumularam 11,1 a 23,1 g/L de ácido L-glutâmico. Na cepa introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp, o ácido L-glutâmico foi muito produzido a partir da xilose e, assim, considerou-se que o ácido L-glutâmico foi produzido a partir da xilose por meio da via NXA nos outros transformantes. Isto é, demonstrou-se que um homólogo de xylD, derivado de qualquer das espécies biológica sem ser C. crescentus, pode ser substituído por xylD. (6) Detecção das atividades dos homólogos de XylX
[00279] A cepa P. ananatis NA2 ΔxylX foi transformada com pSTV28- Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp, pSTV28- Ptac-xylX(Atu)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp, pSTV28-Ptac- xylX(Zga)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp ou pSTV28-Ptac-xylX(Selo)- Ttrp pelo método de eletroporação. Com relação ao cultivo dos transformantes, foi usado um meio em placa compreendendo LBGM9 no qual a canamicina, tetraciclina e cloranfenicol foram adicionados em concentrações finais de 40 mg/L, 12,5 mg/L e 25 mg/L, respectivamente.
[00280] As células de cada transformante cultivadas por toda a noite a 34°C na placa de LBGM9, na qual os medicamentos foram adicionados, foram raspadas em uma quantidade que corresponde a 1/6 das células na placa, inoculadas em 5 mL do meio MSII-SX contido em um tubo de teste grande, e cultivadas a 34°C e 120 rpm por 48 horas, e a quantidade de ácido L-glutâmico (Glu) acumulado foi medida. Os resultados são mostrados na figura 6.
[00281] Enquanto a cepa P. ananatis NA2 ΔxylX introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp acumulou 8,7 g/L de ácido L-glutâmico, os outros transformantes acumularam 20,5 a 27,8 g/L de ácido L-glutâmico. Na cepa introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp, o ácido L-glutâmico foi muito produzido a partir da xilose e, assim, considerou-se que o ácido L-glutâmico foi produzido a partir da xilose por meio da via NXA nos outros transformantes. Isto é, demonstrou-se que um análogo de xylX, derivado de qualquer das espécies biológicas sem ser C. crescentus, pode ser substituído por xylX. (7) Detecção das atividades dos homólogos de XylA
[00282] A cepa P. ananatis NA2 ΔccrxylA foi transformada com pSTV28-Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp, pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp ou pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp pelo método de eletroporação. Com relação ao cultivo dos transformantes, foi usado um meio em placa compreendendo LBGM9, na qual a canamicina, tetraciclina e cloranfenicol foram adicionados em concentrações finais de 40 mg/L, 12,5 mg/L e 25 mg/L, respectivamente.
[00283] As células de cada transformante cultivadas por toda a noite a 34°C na placa de LBGM9, na qual os medicamentos foram adicionados, foram raspadas em uma quantidade que corresponde a 1/6 das células na placa, inoculadas em 5 mL do meio MSII-SX contido em um tubo de teste grande, e cultivadas a 34°C e 120 rpm por 48 horas, e a quantidade de ácido L-glutâmico (Glu) que se acumulou foi medida. Os resultados são mostrados na figura 7.
[00284] Enquanto a cepa P. ananatis NA2 ΔccrxylA introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp acumulou 1,0 g/L de ácido L-glutâmico, os outros transformantes acumularam 18,1 a 30,7 g/L de ácido L-glutâmico. Na cepa introduzida com pSTV28-Ptac-Ttrp, o ácido L-glutâmico foi muito produzido a partir da xilose e, assim, considerou-se que o ácido L-glutâmico foi produzido a partir da xilose por meio da via NXA nos outros transformantes. Isto é, demonstrou-se que um homólogo de ccrxylA, derivado de qualquer das espécies biológicas sem ser C. crescentus, pode ser substituído por xylA. Aplicabilidade Industrial
[00285] De acordo com a presente invenção, uma substância alvo pode ser produzida eficientemente por fermentação usando xilose como matéria- prima.

Claims (7)

1. Método para produzir uma substância alvo compreendendo cultivar uma bactéria com uma capacidade de produzir a substância alvo, em um meio contendo xilose como uma fonte de carbono, para produzir e acumular a substância alvo no meio, e coletar a substância alvo do meio, caracterizado pelo fato de que: a substância alvo é o ácido 2-cetoglutárico ou um derivado deste, a atividade da xilose desidrogenase e a atividade da xilonolactonase foram transmitidas ou aumentadas na bactéria pela introdução do gene xylB que codifica a xilose desidrogenase e o gene xylC que codifica a xilonolactonase em formas passíveis de expressão na bactéria de modo que a bactéria apresenta uma capacidade de produzir ácido xilônico a partir de xilose, a atividade de xilonato desidratase, atividade de 2-ceto-3- desoxixilonato desidratase e atividade de 2-semialdeído cetoglutárico desidrogenase foram fornecidas ou melhoradas na bactéria pela introdução do gene xylD, yjhG ou yagF que codifica a xilonato desidratase, gene xylX que codifica a 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase e o gene xylA que codifica o 2- semialdeído cetoglutárico desidrogenase em formas passíveis de expressão na bactéria, a bactéria é uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea ou ao gênero Corynebacterium, e o derivado do ácido 2-cetoglutárico é uma substância selecionada do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- arginina, L-citrulina, L-ornitina, L-prolina, putrescina e ácido y- aminobutírico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene xylB e o gene xylC são, cada um, derivados de um microrganismo pertencente ao gênero Caulobacter.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os genes xy1D, yjhG ou yagF, gene xylX e gene xy1A são cada um derivados de um microrganismo pertencente ao gênero Caulobacter, Escherichia, Agrobacterium, Herbaspirillum, Actinoplanes, Cupriavidus, Pseudomonas, Zobellia, Thermobacillus, Arthrobacter, Azospirillum, Halomonas, Bacillus ou Aspergillus.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada adicionalmente, de maneira tal que a atividade de 2-cetoglutarato desidrogenase seja reduzida.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada adicionalmente, de maneira tal que a atividade de succinato desidrogenase seja reduzida.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Pantoea ananatis.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.
BR112013016373-9A 2011-11-11 2012-11-06 método para produzir uma substância alvo BR112013016373B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161558685P 2011-11-11 2011-11-11
US61/558685 2011-11-11
JP2011-247031 2011-11-11
JP2011247031 2011-11-11
PCT/JP2012/078725 WO2013069634A1 (ja) 2011-11-11 2012-11-06 発酵法による目的物質の製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112013016373A2 BR112013016373A2 (pt) 2016-10-04
BR112013016373B1 true BR112013016373B1 (pt) 2021-05-18

Family

ID=48290008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013016373-9A BR112013016373B1 (pt) 2011-11-11 2012-11-06 método para produzir uma substância alvo

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9045789B2 (pt)
EP (1) EP2778228B1 (pt)
JP (1) JPWO2013069634A1 (pt)
KR (1) KR20140091742A (pt)
CN (1) CN103930557A (pt)
BR (1) BR112013016373B1 (pt)
MY (1) MY173771A (pt)
PE (1) PE20141569A1 (pt)
WO (1) WO2013069634A1 (pt)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2015015336A (es) * 2013-05-17 2016-03-04 Xyleco Inc Procesamiento de biomasa.
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
EP3061828A4 (en) * 2013-10-23 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
JPWO2015080273A1 (ja) 2013-11-28 2017-03-16 味の素株式会社 イソプレンモノマーの製造方法
US10808262B2 (en) 2013-12-03 2020-10-20 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for improving product yields on methanol using acetyl-CoA synthesis
RU2014112066A (ru) 2014-03-28 2015-10-10 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения мономерного изопрена
JP2017216881A (ja) 2014-12-26 2017-12-14 味の素株式会社 ジカルボン酸の製造方法
JP6881448B2 (ja) 2015-10-27 2021-06-02 味の素株式会社 アルデヒドの製造方法
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
EP3402891A1 (en) 2016-01-12 2018-11-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing benzaldehyde
KR101774431B1 (ko) * 2016-01-28 2017-09-05 한국과학기술원 자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체의 제조방법
DE102016007810B4 (de) 2016-06-25 2023-12-07 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat
EP3530748B1 (en) 2016-10-21 2021-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for the secretory production proteins
EP3530747A4 (en) 2016-10-21 2020-07-22 Ajinomoto Co., Inc. SECRETORY PROTEIN PRODUCTION PROCESS
EP3532631A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine or metabolites requiring s-adenosylmethionine for synthesis
EP3532627A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
JP7063332B2 (ja) 2016-10-26 2022-05-09 味の素株式会社 目的物質の製造方法
EP3532629A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
JP2019536449A (ja) 2016-10-26 2019-12-19 味の素株式会社 目的物質の製造方法
CN109890960B (zh) 2016-10-27 2023-02-17 味之素株式会社 用于生产醛的方法
WO2018179834A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing rna
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
US10858676B2 (en) 2017-05-22 2020-12-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
EP3690040A4 (en) 2017-09-25 2021-09-29 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF DISACCHARIDES
US11680279B2 (en) 2017-11-29 2023-06-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
CN109971778B (zh) * 2017-12-27 2022-11-18 北京蓝晶微生物科技有限公司 一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用
WO2019156152A1 (ja) * 2018-02-08 2019-08-15 ＧｒｅｅｎＥａｒｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 アラビノース依存型遺伝子発現制御配列を含む核酸
JP7367667B2 (ja) 2018-02-20 2023-10-24 味の素株式会社 Ｒｎａサイレンシングを誘導する方法
JP7124338B2 (ja) 2018-02-27 2022-08-24 味の素株式会社 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
EP3783106A4 (en) 2018-04-20 2022-01-05 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR THE SECRETION OF A PROTEIN
WO2020027251A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
JP7375767B2 (ja) 2018-10-25 2023-11-08 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
EP3960870A4 (en) 2019-03-29 2023-06-07 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF ALLOLACTOSE
EP3967676A4 (en) 2019-05-08 2023-02-08 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF VANILLIN
WO2021085405A1 (ja) 2019-10-28 2021-05-06 味の素株式会社 ベンズアルデヒドの製造方法
JPWO2021177392A1 (pt) 2020-03-04 2021-09-10
CN116456832A (zh) 2020-09-29 2023-07-18 味之素株式会社 变异型谷氨酰胺转氨酶
WO2022092018A1 (ja) 2020-10-28 2022-05-05 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
JPWO2023282315A1 (pt) 2021-07-07 2023-01-12
CN114634890B (zh) * 2022-03-22 2023-06-02 云南中烟工业有限责任公司 一种固氮螺菌、其分离方法和应用
CN114854661B (zh) * 2022-06-01 2024-01-30 南京工业大学 一种双菌共培养体系利用混糖原料生产l-鸟氨酸的方法
CN117165504A (zh) * 2023-08-03 2023-12-05 天津世纪伟康生物科技有限公司 一种发酵法高效生产γ-氨基丁酸的工程菌及其应用

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS329393B1 (pt) 1954-12-25 1957-11-07
US3220929A (en) 1964-02-10 1965-11-30 Kyowa Hakko Kogyo Kk Microbiological production of amino acid by reductive amination
US3563857A (en) 1967-03-20 1971-02-16 Sanraku Ocean Co Process for producing l-glutamic acid by fermentation
US3919189A (en) 1973-04-09 1975-11-11 Kelco Co Decreasing bacterial contamination of xanthan gum with propylene oxide
JPS50113209A (pt) 1974-02-13 1975-09-05
JPS516754A (en) 1974-07-08 1976-01-20 Oval Eng Co Ltd Ryuryonaishiryusokukeino paajisochi
JPS528729A (en) 1975-07-11 1977-01-22 Oki Electric Ind Co Ltd Type-drum
JPS5238088A (en) 1975-09-19 1977-03-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS5299289A (en) 1976-02-18 1977-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-arginine by fermentation
JPS52114092A (en) 1976-03-19 1977-09-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-arginine by fermentation process
JPS533586A (en) 1976-06-25 1978-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-amino acid by fermentation
JPS53143288A (en) 1977-05-19 1978-12-13 Koito Kogyo Kk Photoelectric snow depth measuring device
JPS5444096A (en) 1977-09-13 1979-04-07 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine by fermentation
JPS54105293A (en) 1978-02-01 1979-08-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-proline by fermentation
JPS561889A (en) 1979-06-20 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5832596B2 (ja) 1979-08-10 1983-07-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS5810075B2 (ja) 1979-08-31 1983-02-24 味の素株式会社 新規変異株
JPS56106598A (en) 1980-01-30 1981-08-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine by fermentation method
JPS56140895A (en) 1980-04-02 1981-11-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS56144093A (en) 1980-04-14 1981-11-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-proline by fermentation
US4372753A (en) 1980-04-23 1983-02-08 Source Technology, Inc. Liquid fuel for use in internal combustion engines
JPS56151495A (en) 1980-04-25 1981-11-24 Ajinomoto Co Inc Production of l-glutamine through fermentation
JPS572691A (en) 1980-06-05 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-proline by fermentation method
JPS572869A (en) 1980-06-10 1982-01-08 Tohoku Electric Power Co Inc Austenite stainless steel for hot corrosive environment
JPS5718989A (en) 1980-07-09 1982-01-30 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation
JPS5765198A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Ajinomoto Co Inc Fermentative production of l-glutamic acid
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS572689A (en) 1981-03-23 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS589692A (ja) 1981-07-03 1983-01-20 Tanabe Seiyaku Co Ltd 発酵法によるｌ−アルギニンの製法
DE3127361A1 (de) 1981-07-08 1983-02-03 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS5867699A (ja) 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
JPS5877895A (ja) 1981-11-02 1983-05-11 Ajinomoto Co Inc プラスミドｐｈｍ１５１９
JPS58158192A (ja) 1982-03-15 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
EP0163836B1 (de) 1984-04-07 1988-10-12 Bayer Ag Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Granulaten
JPS61202694A (ja) 1985-03-07 1986-09-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
JPS6224075A (ja) 1985-07-25 1987-02-02 Toyota Motor Corp 車両用駆動装置
FR2603581B1 (fr) 1986-04-28 1993-08-13 Ajinomoto Kk Procede pour isoler et purifier des aminoacides par chromatographie
US4777051A (en) 1986-06-20 1988-10-11 Ajinomoto Co., Inc. Process for the production of a composition for animal feed
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
JP2537260B2 (ja) 1988-02-23 1996-09-25 東陶機器株式会社 和風便器の施工方法
JP2817155B2 (ja) 1989-01-12 1998-10-27 味の素株式会社 発酵法によるｌ‐アルギニンの製造法
JPH02207791A (ja) 1989-02-07 1990-08-17 Ajinomoto Co Inc 微生物の形質転換法
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
US5168056A (en) 1991-02-08 1992-12-01 Purdue Research Foundation Enhanced production of common aromatic pathway compounds
PH30131A (en) 1991-08-07 1997-01-21 Ajinomoto Kk Process for producing l-glutamic acid by fermentation
DE4130868C2 (de) 1991-09-17 1994-10-13 Degussa Tierfuttermittelsupplement auf der Basis einer Aminosäure und Verfahren zu dessen Herstellung
US5776736A (en) 1992-12-21 1998-07-07 Purdue Research Foundation Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis
BR9408408A (pt) 1993-12-23 1997-08-05 Controlled Environment Syst Processo para a produção de etanol a partir de detritos sólidos municipais processo para a remoção de metais pesados e produção de glucose a partir do componente celulósico de detritos sólidos municipais
US5571703A (en) 1993-12-23 1996-11-05 Controlled Environmental Systems Corporation Municipal solid waste processing facility and commercial ethanol production process
ES2160167T3 (es) 1994-06-14 2001-11-01 Ajinomoto Kk Gen de alfa-cetoglutarato-deshidrogenasa.
WO1996008567A1 (en) 1994-09-16 1996-03-21 Texas A & M University System Microorganisms and methods for overproduction of dahp by cloned pps gene
DK0805867T3 (da) 1995-01-23 2004-04-13 Novozymes As DNA integration ved transposition
EP0832276B1 (en) 1995-06-07 2005-03-02 Arkenol, Inc. Method of strong acid hydrolysis
JP3861341B2 (ja) 1995-10-13 2006-12-20 味の素株式会社 発酵液の膜除菌方法
JPH09173792A (ja) 1995-10-23 1997-07-08 Ajinomoto Co Inc 発酵液の処理方法
DE19621930C1 (de) 1996-05-31 1997-12-11 Degussa Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittel-Zusatzes auf Fermentationsbrühe-Basis
KR100697551B1 (ko) 1997-07-18 2007-03-21 아지노모토 가부시키가이샤 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
ID23892A (id) 1997-08-12 2000-05-25 Ajinomoto Kk Metode pembuatan asam l-glutamat melalui fermentasi
JP4066543B2 (ja) 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
AU756507B2 (en) 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
JP3921866B2 (ja) 1998-03-18 2007-05-30 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
AU746542B2 (en) 1998-03-18 2002-05-02 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
JP4144098B2 (ja) 1998-03-18 2008-09-03 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
SK7702000A3 (en) 1998-09-25 2000-10-09 Ajinomoto Kk Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity
JP4144131B2 (ja) 1998-10-19 2008-09-03 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
ATE483792T1 (de) 1998-12-18 2010-10-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur fermentativen herstellung von l- glutaminsäure
JP2000201692A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
US6238714B1 (en) 1999-05-05 2001-05-29 Degussa-Huls Ag Feedstuff additive which contains D-pantothenic acid and/or its salts and a process for the preparation thereof
JP4427878B2 (ja) 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
US7160705B2 (en) 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
JP4682454B2 (ja) 2000-06-28 2011-05-11 味の素株式会社 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法
RU2207371C2 (ru) 2000-09-26 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот семейства l-глутаминовой кислоты, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2208640C2 (ru) 2000-07-06 2003-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА
JP4560998B2 (ja) 2001-02-05 2010-10-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
BR122013017187B1 (pt) 2001-02-13 2016-03-01 Ajinomoto Kk bactéria transgênica produtora de l-aminoácido pertencente ao gênero escherichia, e, método para produzir l-aminoácido
JP2002238592A (ja) 2001-02-20 2002-08-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
EP1414970A2 (en) 2001-08-06 2004-05-06 Degussa AG Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
RU2230114C2 (ru) 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот
JP2003250544A (ja) 2002-03-04 2003-09-09 National Institute Of Technology & Evaluation タンパク質の性質を改変する方法
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2003106668A1 (ja) * 2002-06-13 2003-12-24 Sode Koji グルコース脱水素酵素
AU2003205041A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
EP1460128B1 (en) 2003-03-03 2016-11-30 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine or L-lysine by fermentation
US7468262B2 (en) 2003-05-16 2008-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding useful polypeptides in corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum
DE10331366A1 (de) 2003-07-11 2005-01-27 Degussa Ag Verfahren zur Granulation eines Tierfuttermittel-Zusatzes
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
JP4575086B2 (ja) 2003-08-28 2010-11-04 三菱化学株式会社 コハク酸の製造方法
WO2005021770A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Mitsubishi Chemical Corporation コハク酸の製造方法
WO2005068642A2 (en) 2003-10-01 2005-07-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Bacterial synthesis of 1,2,4-butanetriol enantiomers
US7344874B2 (en) * 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US8003367B2 (en) 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
US20050214913A1 (en) 2004-03-16 2005-09-29 Marchenko Aleksey N Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
ATE463564T1 (de) 2004-08-10 2010-04-15 Ajinomoto Kk Verwendung von phosphoketolase zur herstellung geeigneter metabolite
RU2004124226A (ru) 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
WO2006028298A2 (en) 2004-09-10 2006-03-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing l-glutamic acid
US7205132B2 (en) 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
CN1749390B (zh) * 2004-09-17 2011-10-19 味之素株式会社 使用木糖利用基因表达增强的细菌进行发酵以生产l—氨基酸的方法
CN101027389B (zh) 2004-09-28 2012-09-26 协和发酵生化株式会社 L-精氨酸、l-鸟氨酸或l-瓜氨酸的制备方法
US7915018B2 (en) 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
JP5343303B2 (ja) 2004-12-28 2013-11-13 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
US7794989B2 (en) 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
CN101090911B (zh) 2004-12-28 2014-05-07 味之素株式会社 产生l-谷氨酸的微生物和产生l-谷氨酸的方法
US20070004014A1 (en) 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
CN101374953B (zh) 2006-01-27 2011-09-28 味之素株式会社 用于产生l-氨基酸的方法
CN101512004A (zh) * 2006-07-19 2009-08-19 密歇根州州立大学托管委员会 D-1,2,4-丁三醇的微生物合成
EP2054500B1 (en) 2006-08-18 2016-11-23 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid
RU2418069C2 (ru) 2006-09-29 2011-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008078646A1 (ja) 2006-12-22 2008-07-03 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸又は核酸の結晶の分離方法
BRPI0703692B1 (pt) 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
JP2010130899A (ja) 2007-03-14 2010-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
WO2008133161A1 (ja) 2007-04-17 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. カルボキシル基を有する酸性物質の製造法
JP2010226956A (ja) 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2011512144A (ja) 2008-02-21 2011-04-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア γ−アミノ酪酸の生産方法
WO2010027022A1 (ja) 2008-09-05 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸生産菌及びｌ－アミノ酸の製造法
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
WO2010137130A1 (ja) 2009-05-27 2010-12-02 味の素株式会社 有機酸の製造方法
BR112012006982B1 (pt) * 2009-09-29 2021-12-21 Novozymes, Inc. Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente
CA2777459A1 (en) 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
US20130260423A1 (en) * 2010-10-26 2013-10-03 Novozymes North America, Inc. Methods of Saccharifying Sugar Cane Trash

Also Published As

Publication number Publication date
US9045789B2 (en) 2015-06-02
JPWO2013069634A1 (ja) 2015-04-02
US20130295621A1 (en) 2013-11-07
BR112013016373A2 (pt) 2016-10-04
KR20140091742A (ko) 2014-07-22
WO2013069634A1 (ja) 2013-05-16
PE20141569A1 (es) 2014-11-08
EP2778228B1 (en) 2017-05-17
EP2778228A1 (en) 2014-09-17
MY173771A (en) 2020-02-20
CN103930557A (zh) 2014-07-16
EP2778228A4 (en) 2015-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9045789B2 (en) Method for producing a target substance by fermentation
US8080396B2 (en) Microorganism producing an amino acid of the L-glutamic acid family and a method for producing the amino acid
ES2347799T3 (es) Microorganismo productor de acido l-glutamico y procedimiento para la produccion de acido l-glutamico.
JP6623690B2 (ja) グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
US8753849B2 (en) Use of phosphoketolase for producing useful metabolites
ES2341264T3 (es) El uso de fosfocetolasa para producir metabolitos utiles.
US8012722B2 (en) Method for producing L-amino acid
KR101773755B1 (ko) Ｌ-아미노산의 제조법
BRPI0518589B1 (pt) Bactéria corineforme, e, método para produzir um l-aminoácido
US20120237985A1 (en) Method for producing l-amino acid
BR112013021775B1 (pt) método para produzir um l-aminoácido
JP2009254323A (ja) Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の製造法
JP2019536449A (ja) 目的物質の製造方法
JP5157180B2 (ja) Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2015005405A1 (ja) 有用物質の製造方法
WO2022092018A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
BR102023019771A2 (pt) Método para produzir um l-aminoácido
US20240117393A1 (en) Method for producing l-amino acid

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/11/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.