CN101512004A - D-1,2,4-丁三醇的微生物合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改良的酶系统、重组细胞及采用该细胞生产生物合成的D－1，2，4－丁三醇的方法、由此制备的D－1，2，4－丁三醇及其衍生物、由其制备的D－1，2，4－丁三醇三硝酸酯以及可用于该酶系统和重组细胞中的酶和基因。

Description

D-1，2，4-丁三醇的微生物合成
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年7月19日提交的美国临时申请60/831964的优先权。上述申请的公开内容通过引用引入此处。
资助
本发明是采用海军研究局(Office of Naval Research)提供的N00014-00-1-0825合约项下的政府资助并在国家科学基金会(NationalScience Foundation)的支持下完成的。美国政府在本发明中可以具有一定的权利。
技术领域
本公开内容涉及1，2，4-丁三醇生物合成的方法和材料及由其产生1，2，4-丁三醇三硝酸酯的方法和材料，以及被确认为本发明的1，2，4-丁三醇生物合成系统的副产物的化合物的生物合成方法和材料。
背景技术
本节中的陈述只提供与本公开内容相关的背景信息且可能并不构成现有技术。
1，2，4-丁三醇是可用于形成能量化合物(energetic compound)以及生物活性剂(例如，β-螨信息素)的手性多羟基醇。外消旋的D，L-1，2，4-丁三醇可以进行硝化以形成高能材料D，L-1，2，4-丁三醇三硝酸酯，其比传统的高能塑化剂硝化甘油具有更低的冲击敏感性、更高的热稳定性和更低的挥发性(CPIA/M3 Solid Propellant Ingredients Manual；TheJohns Hopkins University，Chemical Propulsion Information Agency：Whiting School of Engineering，Columbia，Maryland，2000)。虽然1，2，4-丁三醇的单个对映异构体可以进行硝化，但D，L-1，2，4-丁三醇的外消旋混合物通常用作1，2，4-丁三醇三硝酸酯的合成前体。1，2，4-丁三醇三硝酸酯是同时具有民用和军用潜力的高能塑化剂。参见V.Lindner，Wxplosives.In Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical TechnologyOnline.(Wiley，New York，1994)。因此，用1，2，4-丁三醇三硝酸酯替代硝化甘油作为高能材料不仅能够降低与这种制造和操作方法相关的危险性，而且可提高最终产品的应用范围。
但是，1，2，4-丁三醇的有限供应限制了1，2，4-丁三醇三硝酸酯的大规模生产。1，2，4-丁三醇目前利用酯化的D，L-苹果酸(如苹果酸二甲酯)的NaBH4还原通过D，L-苹果酸在C2-6醇和四氢呋喃的混合物中进行高压催化氢化反应而进行商业生产(图1a)(美国专利6479714，Schofield等，授权日2002年11月12日；国际公开WO 99/44976，Ikai等，公开日1999年9月10日)。这一化学合成路径也产生许多种副产物，且合成每一吨1，2，4-丁三醇要产生多吨的副产物，因为这一反应对于每千克被还原的苹果酸二甲酯产生2-5kg的硼酸盐。参见，例如，国际公开WO 98/08793，Monteith等，授权日1998年3月5日；国际公开WO 99/44976，Ikai等，公开日1999年9月10日；H.Adkins & H.R.Billica，J.Am.Chem.Soc.70：3121(1948)；美国专利4973769，Mueller等，授权日1990年11月27日，和美国专利6355848，Antons等，授权日2002年3月12日。适当地处理副产物盐流的成本加上采用化学计量量的NaBH4的花费将这一反应的应用限制于小量的1，2，4-丁三醇的生产。
结果，最近开发出了更经济的和对环境更安全的用于获得D-、L-和D，L-1，2，4-丁三醇的生物合成技术，其中D-异构体通过D-木糖或D-木质酸(D-xylonic acid)的生物转化获得，而L-异构体通过L-阿拉伯糖或L-阿糖酸的生物转化获得(图1b)；且各对映异构体的生物合成已经通过D-木质酸或L-阿糖酸的中间性使用双微生物工艺成功地得到证明。参见，例如，W.Niu等，Microbial synthesis of the energeticmaterial precursor 1，2，4-butanetriol.J.Am.Chem.Soc.125：12998-12999(2003)。然而，这些生物合成路径的大规模应用受到经济上的挑战，因为它们需要采用大量的被发现对于使菌株培养最优化来说很重要的营养添加剂并且需要纯化生物合成中间体以使1，2，4-丁三醇产量最大化。因此，有利的是提供能够通过在非昂贵的培养基(例如，补充碳源的低盐培养基(minimal salts medium))上生长而生物合成1，2，4-丁三醇的一种重组细胞。
虽然木糖/木质酸和阿拉伯糖/阿糖酸两种路径都可以用于获得1，2，4-丁三醇，但是D-木糖及D-木质酸相对于例如L-阿拉伯糖或L-阿糖酸具有经济优势，部分地是由于D-木糖在低成本的碳源原料(如在木头和植物纤维废料中发现的半纤维素)中更普遍存在的事实。例如，这反映在可商购得到的戊糖的价格对比上，其显示L-阿拉伯糖价格为D-木糖的大约两倍(例如，参见Sigma-Aldrich产品号X1500，10mg的纯度>99％的D-木糖价格为6.25美元，而产品号A3256，10mg的纯度>99％的L-阿拉伯糖价格为13.00美元)。因此，理想的是获得利用D-木糖(或D-木质酸)源且可用于生产工业产量的1，2，4-丁三醇的1，2，4-丁三醇生物合成系统。
但是，最近也意外地发现，用于工业规模的1，2，4-丁三醇生物合成的各种需要的宿主细胞包含造成从D-木糖或D-木质酸获得的1，2，4-丁三醇的实际产量降低到显著低于理论产量最大值的水平的天然生物催化活性。因此，有利的是提供利用D-木糖或D-木质酸，但可以通过抑制或灭活这种碳转用(carbon-diverting)生物催化活性而提高产量的改良的1，2，4-丁三醇生物合成宿主细胞。
对于D-1，2，4-丁三醇生物合成系统进行这种进一步改良的主要挑战在于缺乏关于催化人工生物合成途径(图1b)的第一步的D-木糖脱氢酶的遗传信息和在微生物宿主细胞中存在上面所述的未阐明的分解代谢背景。
因此，更为有利的是提供编码具有将D-木糖转化为D-木质酸的有效能力的酶且可以在用于D-1，2，4-丁三醇生物合成的宿主细胞中表达的特定D-木糖脱氢酶基因，以及鉴定不希望的分解代谢反应的特性以提供控制该分解代谢反应的技术。
发明内容
在各种实施方式中，本发明提供能够将D-木糖(或D-木质酸)源生物转化为1，2，4-丁三醇，且其中一种或多种碳转用生物催化活性受到抑制或灭活的改良的宿主细胞。在一些实施方式中，受到抑制或灭活的碳转用生物催化活性是能够分裂3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸以形成丙酮酸和乙醇醛的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶。本发明还提供特定的新型D-木糖脱氢酶及其编码序列。本发明进一步提供：
制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括：(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶、(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醇脱氢酶，其中所述细胞体是经操作抑制或灭活了3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸的细胞体；和(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇；
从而制备D-1，2，4-丁三醇。
制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括：(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶、(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醇脱氢酶；和(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇；
从而制备D-1，2，4-丁三醇。
制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括：(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶，(b)D-木质酸脱水酶，其包含(i)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一个的氨基酸序列，或者(ii)莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醇脱氢酶；和(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇；
从而制备D-1，2，4-丁三醇。
制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括：(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含(a)D-木质酸脱水酶，其包含(i)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(ii)莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，(b)2-酮酸脱羧酶和(c)醇脱氢酶；和(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生1，2，4-丁三醇和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇；
从而制备D-1，2，4-丁三醇。
制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括：(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶，(b)2-酮酸脱羧酶和(c)醇脱氢酶，其中所述细胞体是经操作抑制或灭活了3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸的细胞体；和(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生1，2，4-丁三醇和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇；
从而制备D-1，2，4-丁三醇。
其中所述重组细胞体包括含有所述酶系统的单细胞的这些方法；其中所述细胞是微生物细胞或植物细胞的这些方法；进一步包括回收由此制备的D-1，2，4-丁三醇的这些方法；通过这些方法制备的D-1，2，4-丁三醇；由其制备1，2，4-丁三醇三硝酸酯的方法；通过这类方法制备的D-1，2，4-丁三醇三硝酸酯；
包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脱氢酶；编码该酶的核酸，和包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的同源多核苷酸任一项的碱基序列的核酸；
包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8的保守置换变异体或同源多肽、包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶、或者莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶氨基酸序列的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木质酸脱水酶；编码该酶的核酸，和包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的同源多核苷酸任一的碱基序列的核酸。
这种酶在D-1，2，4-丁三醇生物合成酶系统中的用途。
分离的或重组的1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包括：(A)包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脱氢酶，(B)D-木质酸脱水酶，(C)2-酮酸脱羧酶和(D)醇脱氢酶，该酶系统能够催化D-木糖转化成D-1，2，4-丁三醇。
分离的或重组的D-1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包括：(A)D-木糖脱氢酶，(B)D-木质酸脱水酶，其包含(1)SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ IDNO：10的多肽，(C)2-酮酸脱羧酶和(D)醇脱氢酶，该酶系统能够催化D-木糖转化成D-1，2，4-丁三醇。
分离的或重组的1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包括：(A)D-木质酸脱水酶，其包含(1)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓实假单胞菌(ATCC4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，(B)2-酮酸脱羧酶和(C)醇脱氢酶，该酶系统能够催化D-木质酸转化成D-1，2，4-丁三醇。
包含该酶系统的重组细胞体；包括含有所述酶系统的单细胞的这类细胞体；为重组的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶“缺失”的DgPu-细胞的这类细胞；
3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶敲除载体，其包含含有SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：11的nt55-319中任一的碱基序列的多核苷酸，其中所述载体能够以使3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因或其编码的醛缩酶失活的方式插入3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因的基因组拷贝中或与其重组。
重组DgPu-(3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶“缺失”)细胞；
制备3-脱氧-D-甘油-戊酸的方法，包括：(A)提供(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶和(c)2-酮酸还原酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生3-脱氧-D-甘油-戊酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生3-脱氧-D-甘油-戊酸和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(3)所述2-酮酸脱氢酶(还原酶)将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸；
从而制备3-脱氧-D-甘油-戊酸。
制备3-脱氧-D-甘油-戊酸的方法，包括：(A)提供(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶和(b)2-酮酸还原酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生3-脱氧-D-甘油-戊酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生3-脱氧-D-甘油-戊酸和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸脱氢酶(还原酶)将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸；
从而制备3-脱氧-D-甘油-戊酸。
制备D-3，4-二羟基-丁酸的方法，包括：(A)提供(1)包含D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶和(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醛脱氢酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生D-3，4-二羟基-丁酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生D-3，4-二羟基-丁酸和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醛脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-3，4-二羟基-丁酸；
从而制备D-3，4-二羟基-丁酸。
制备D-3，4-二羟基-丁酸的方法，包括：(A)提供(1)包含D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶、和(b)2-酮酸脱羧酶和(c)醛脱氢酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生D-3，4-二羟基-丁酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生D-3，4-二羟基-丁酸和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醛脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-3，4-二羟基-丁酸；
从而制备D-3，4-二羟基-丁酸。
制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的方法，包括：(A)提供(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶和(c)2-酮酸转氨酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和其中所述木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(3)所述2-酮酸转氨酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸；
从而制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的方法，包括：(A)提供(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶和(b)2-酮酸转氨酶，和(2)在所述酶系统可运行以产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和其中所述木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸转氨酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸；
从而制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
其中细胞体包括含有所述酶系统的单细胞的这些方法；其中细胞是重组的DgPu-细胞的这些方法；
通过这一方法制备的3-脱氧-D-甘油-戊酸、D-3，4-二羟基-丁酸和/或(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
分离的或重组的3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸还原酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
分离的或重组的3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸还原酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
分离的或重组的D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶、及(C)2-酮酸脱羧酶和(D)醛脱氢酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
分离的或重组的D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木质酸脱水酶、(B)2-酮酸脱羧酶和(C)醛脱氢酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
分离的或重组的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸转氨酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
分离的或重组的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸生物合成酶系统，其包含(A)D-木质酸脱水酶和(B)2-酮酸转氨酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
包含这一酶系统的重组细胞体；其中细胞体包括含有所述酶系统的单细胞的重组细胞体；其中所述细胞为重组的DgPu-细胞的重组细胞体；
筛选候选的酶编码多核苷酸的方法，包括：(A)提供(1)包含与编码酶多肽的编码序列大约20个或更多相连核苷酸相同的核碱基序列的核酸或核酸类似物探针，所述酶多肽具有以下任一氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(b)SEQ ID NO：12的19-319位残基的氨基酸序列，或(c)包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC4973)D-木质酸脱水酶的氨基酸序列，或(d)保持生物催化活性的上述(a)、(b)或(c)中任一项的保守置换变异体的氨基酸序列或同源氨基酸序列；和(2)包含或怀疑包含这种探针可以特异性结合的至少一种靶多核苷酸的测试样品；(B)使所述探针与测试样品在探针可以特异性地与靶多核苷酸(如果存在)杂交的条件下接触以形成探针-靶多核苷酸复合物；及(C)检测是否由此形成任何探针-靶多核苷酸复合物，其中被确认为复合物一部分的多核苷酸由此被鉴别为候选的酶编码多核苷酸。
对以下表位具有特异性的抗体：(A)具有以下任一氨基酸序列的酶多肽：(1)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(2)SEQ ID NO：12的19-319位残基的氨基酸序列，或(3)包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶的氨基酸序列，或(4)保持生物催化活性的上述(1)、(2)或(3)中任一项的保守置换变异体的氨基酸序列或同源氨基酸序列；或者(B)具有编码这种酶多肽(A)的碱基序列的多核苷酸或核酸类似物。
进一步的应用领域将通过这里提供的说明书变得很清楚。应当理解的是，本说明书和特定的实施例只是用于举例说明的目的，而不意图限制本公开的范围。
附图简要说明
这里描述的附图仅用于举例说明的目的，并不意图以任何方式限制本公开的范围。
图1显示了1，2，4-丁三醇的合成路径。(1a)当前在C2-6醇中使用硼氢化钠和四氢呋喃从苹果酸二甲酯合成1，2，4-丁三醇的工业合成方式。(1b和1c)D-和L-1，2，4-丁三醇的生物合成途径。酶：a)D-木糖脱氢酶；a’)L-阿拉伯糖脱氢酶；b)D-木质酸脱水酶；b’)L-阿糖酸脱水酶；c)2-酮酸脱羧酶；d)醇脱氢酶。
图2显示了在莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶的部分编码序列的分离中包括的步骤。(2a)从莓实假单胞菌纯化的D-木质酸脱水酶的SDS-PAGE。(2b)来自纯化的D-木质酸脱水酶的胰蛋白酶消化肽的N-末端序列。简并引物按照下划线的肽序列进行设计。(2c)D-木质酸脱水酶的部分DNA序列和翻译的氨基酸序列。标记为“3”的下划线DNA部分编码肽3的部分，标记为“4”的下划线DNA部分编码肽4的部分，且标记为“5”的下划线DNA部分编码肽5的部分。
图3显示了大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径(即丙酮酸/乙醇醛途径)及其基因的基因组结构。(3a)假定的大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径。酶：(a)D-木质酸脱水酶；(b)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶。(3b和3c)大肠杆菌yjh和yag基因簇。
图4给出了表征在单一木质酸源上生长的大肠杆菌突变体性能的棒图。(4a)大肠杆菌菌株在含有D-木质酸作为唯一碳源的M9培养基上的生长特征。培养板在37℃下孵育72小时，及在含有D-木质酸的LB培养基中培养的大肠杆菌菌株的D-木质酸脱水酶(空白柱)和3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶(点状柱)的比活性。(4b)在含有D-木质酸(65mM)的LB培养基中培养的大肠杆菌菌株的分解代谢物蓄积。D-木质酸(空白柱)，3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸(点状柱)。
图5给出了显示大肠杆菌由木糖源合成1，2，4-丁三醇的图表和曲线图，以及修订的1，2，4-丁三醇生物合成路径图。(5a)在发酵罐控制培养条件下大肠杆菌在低盐培养基中合成1，2，4-丁三醇的概要。(5b)大肠杆菌WN13/pWN7.126B在培养基中的细胞生长(空白圆圈)和1，2，4-丁三醇蓄积(条纹棒)。箭头表示D-木糖添加的时间点。(5c)在WN13/pWN7.126B培养过程中D-木糖脱氢酶(空白柱)和D-木质酸脱水酶(点状柱)的比活性。(5d)修订的D-1，2，4-丁三醇生物合成路径图，显示了可以将碳利用从主要途径转向到产生副产物化合物的潜在分解代谢途径步骤。用于标记的步骤的酶(和它们的基因)：(a)D-木糖脱氢酶(xdh)；(b)D-木质酸脱水酶(yjhG和yagF)；(c)2-酮酸脱羧酶(mdlC)；(d)醇脱氢酶(例如，adhP)；(e)2-酮酸脱氢酶(yiaE和ycdW)；(f)2-酮酸转氨酶；(g)醛脱氢酶；(h)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶(yagE和yjhH)；(k1)木糖异构酶；(k2)醛糖还原酶；(k3)木质酸脱水酶。
图6给出了生物合成路径图，其显示了步骤h和k1受到阻断的D-木糖利用实施方式中共有的D-1，2，4-丁三醇合成策略的副产物的合成。显示了在低盐培养基上生长的重组细胞的各种化合物的典型净产量，且用于显示的步骤的酶个体包括：(a)D-木糖脱氢酶(新月柄杆菌(C.crescentus)Xdh)；(b)D-木质酸脱水酶(大肠杆菌YjhG和YagF)；(c)2-酮酸脱羧酶(恶臭假单胞菌(P.putida)MdlC苯甲酰甲酸脱羧酶)；(d)醇脱氢酶(大肠杆菌AdhP)；(e)2-酮酸脱氢酶(大肠杆菌KADH)；(f)2-酮酸转氨酶(大肠杆菌KAAT)；(g)醛脱氢酶(大肠杆菌ALDH)；(h)2-酮酸醛缩酶(大肠杆菌YagE和YjhH；即灭活的yagE和yihH)；和(k1)D-木糖异构酶(大肠杆菌XylA，即灭活的xylA)。
图7给出了将编码醇脱氢酶的adhP基因插入大肠杆菌基因组中的示意图。
具体实施方式
下面的说明本质上只是示例性的，并不意图限制本公开、应用或用途。
本申请的主题涉及2006年3月31日提交的美国专利申请11/396117号、2004年9月30日提交并在2005年7月28日以公开号WO2005/068642公开的国际专利申请PCT/US2004/031997及2003年10月1日提交的美国临时专利申请60/507708号的主题，这些专利文献的公开内容在此通过引用并入。
下面的定义和非限制性的指引在审查对这里提出的本发明的说明时考虑。这里使用的标题(如“背景技术”和“发明内容”)和小标题(如“扫描分析”和“方法”)只是意图在本发明的公开范围内对主题进行大体的组织，并不意图限制本发明或其任何方面的公开范围。说明书和特定的实施例尽管表明是本发明的实施方式，但它们仅是为了举例说明的目的，而不意图限制本发明的范围。另外，对具有所述特征的多个实施方式的列举并不意味着排除具有另外的特征的其它实施方式或者引入了所述特征的不同组合的其它实施方式。
特别是，在“背景技术”中公开的主题可以包括本发明范围内的技术的某些方面，且可能并不构成对现有技术的引用。在“发明内容”中公开的主题不是本发明整个范围或其任何实施方式的详尽的或完全的公开。一种物质在本说明书的一节中被分类为或说明为具有特定的效用(如，“催化剂”)是为了方便的目的而进行的，而不应当推断为当该物质用于任何给定的组合中时必须必然地或唯一地按照这里的分类发挥作用。提供特定的实施例用于举例说明如何完成或使用本发明的组合物和方法的目的，除非另外明确地说明，它们不意图表示本发明的给定实施方式已经或没有完成或经过测试。
这里对参考文献的引用并不构成承认那些参考文献是现有技术或与这里公开的发明的专利性有任何相关性。对引文中引用的参考文献的内容的任何讨论只是意图提供参考文献的作者作出的论断的一般总结，而不构成对该文献的内容的准确性的承认。在本说明书的“详细说明”部分中引用的所有参考文献在此通过引用全文引入。
除非另外说明，如“一”和“一个”的冠词在这里用于表示“至少一个”。在这里用于描述给定实施方式的如具有、包括、含有和包含的用语是用于表示该实施方式中可以存在进一步的成分(如，组分、步骤或条件)的开放性用语。
如这里所使用的，词语“优选的”和“优选地”指的是在特定环境中提供特定优势的实施方式。但是，在相同的或其它的环境中其它实施方式也可以是优选的。另外，列举一个或多个优选的实施方式并不暗示其它的实施方式是不可用的，也不意图从本发明的范围中排除其它的实施方式。
如这里所涉及的，除非另外特别指明，所有组成百分比为按照总组合物的重量计算。
本发明提供从碳源产生D-1，2，4-丁三醇和中间体的生物工程化合成方法、材料和生物体。本发明的生物转化方法是基于生物合成途径的从头(de novo)建立，从而D-1，2，4-丁三醇从碳源合成(图2)。
如这里所使用的，一对酸指称的术语的成员(如“木质酸(xylonicacid)”和“木质酸(xylonate)”)可互换使用，除非另外明确地说明或从上下文内容显示不是如此。
如这里所使用的抗体包括天然抗体和重组抗体，如嵌合抗体和CDR-接枝抗体。如这里所使用的，“抗体片段”包括含有氨基酸序列与完整抗体相同的Fv结构(无论是天然的或重组的)且由此保持对完整抗体特异性的抗原或表位的结合特异性的任何多肽。因此，如这里所使用的抗体片段包括Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、恒定域缺失的抗体(例如，CH2-域缺失的抗体)和单链抗体(例如，scFv)。抗体或抗体片段可以是单价的或多价的，即后一类型具有至少两个Fv-型结合位点，其中至少一个是对酶多肽、核酸或其核酸类似物具有特异性的Fv结构或如其抗独特型抗体一样具有对这种Fv结构的特异性。
如这里所使用的，如“生物催化剂的基因”的术语指的是编码该生物催化剂的核酸。因此，提到如3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶核酸指的是编码该特定醛缩酶的核酸。如这里所使用的生物催化剂可以是传统多肽型的酶或基于抗体的酶(抗体酶)或者可以是基于核酸的酶(例如，DNA核酶或RNA核酶)。
如这里所使用的，“细胞体”指的是细胞，或者其原生质体或圆球质体，或者具有生物催化活性的细胞片段(例如，胞质体、细胞器或溶胞产物)；在细胞死亡后生物催化活性得到保持的情况下，可以使用死的全细胞生物催化剂，例如细胞形骸(cell ghost)。细胞体可以包括生物体、器官、组织、组织样品、细胞培养物或其它细胞集合。在一些实施方式中微生物细胞和植物细胞可能是特别有用的。
热稳定的高能材料(1，2，4-丁三醇三硝酸酯)的广泛应用受到缺乏合成其前体(1，2，4-丁三醇)的经济路径的阻碍。在各种不同实施方式中，本发明提供能够增加按照先前建立的人工生物合成途径在低盐培养基中从D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇的重组宿主细胞。本发明人关于新型D-木糖脱氢酶(Xdh)(其可以催化D-木糖氧化为D-木质酸)的发现和对野生型大肠杆菌K-12中先前未确认的D-木质酸分解代谢途径的阐明使得本发明的各种不同实施方式成为可能。
在本发明的一些实施方式中，提供了可以在低盐培养基中直接由D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇的重组的微生物宿主细胞，例如重组的细菌宿主细胞，如重组的大肠杆菌。因此，现在工业规模的D-1，2，4-丁三醇生物合成的生产是可能的，并使得例如D-1，2，4-丁三醇三硝酸酯得到更广泛的利用。实验数据表明，D-1，2，4-丁三醇三硝酸酯表现出与外消旋的1，2，4-丁三醇三硝酸酯相同的爆炸性能，并因此D-1，2，4-丁三醇是与外消旋的1，2，4-丁三醇同样有用的硝化目标(J.Salan，Pcrsonal communication.Indian Head Division，Naval Surface WarfareCenter，United States Navy.Indian Head，Maryland，2005)。
如上面所提到的，改善D-1，2，4-丁三醇生产的基于D-木糖/木质酸的生物合成途径的主要障碍包括缺乏D-木糖脱氢酶的遗传特性的知识和碳通过大肠杆菌宿主菌株中的活性而从该生物合成路径向其它途径的分解代谢转向。在本发明的各种实施方式中，现在提供和鉴定了新型的D-木质酸脱水酶及其编码序列，例如莓实假单胞菌(ATCC4973)D-木质酸脱水酶的部分编码序列和氨基酸序列，及两种新发现的细菌D-木质酸脱水酶。现在也已经发现了来自大肠杆菌的新型D-木质酸脱水酶和基因。
关于碳的分解代谢转用的问题，本发明的各种实施方式提供催化这一分解代谢作用的来自大肠杆菌的酶及其基因。因此，在各种实施方式中，现在提供了这种分解代谢转用被抑制或灭活的重组细胞。在本发明的各种实施方式中，这些细胞能够在低盐培养基中生物合成D-1，2，4-丁三醇。在本发明的各种实施方式中，提供的重组细胞为含有能够完成基于木糖源的D-1，2，4-丁三醇生物合成途径的酶系统的单细胞。在一些实施方式中，提供的重组D-1，2，4-丁三醇生物合成细胞进一步具有一个或多个碳转用分解代谢活性的敲除。
在提出的D-木质酸分解代谢途径的步骤中，脱水酶首先催化D-木质酸转化成1，2，4-丁三醇途径中间体3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，其随后通过醛缩酶催化的反应被裂解成丙酮酸和乙醇醛。因此，D-木质酸分解代谢途径的阐明导致了醛缩酶催化的丙酮酸/乙醇醛生物合成活性的确认，该活性很大程度上导致碳从1，2，4-丁三醇生物合成途径转向，因而带来产率的伴随降低。
现在采用随机转座子诱变的分析揭示，大肠杆菌的D-木质酸分解代谢作用通过分解代谢物阻遏进行调节。现在通过利用染色体敲除突变体的酶检验和表型分析已经在大肠杆菌W3110中鉴定了两套编码关键分解代谢酶的基因。基因yjhG和yagF(SEQ ID NO：5和7)编码D-木质酸脱水酶。基因yjhH和yagE(SEQ ID NO：11和13)分别编码相应的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶。
在各种不同实施方式中，现在提供重组的D-木糖-D-1，2，4-丁三醇生物转化细胞(例如，微生物细胞；大肠杆菌细胞)，其中3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性受到抑制或灭活，例如通过破坏其醛缩酶编码基因。经过操作以抑制或灭活3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸的细胞在这里可以称作重组的DgPu-细胞。
在本发明的各种实施方式中，D-木糖-D-1，2，4-丁三醇生物转化的大肠杆菌细胞经操作以将xdh基因整合到其染色体中。在其中的一些实施方式中，例如在示例性的大肠杆菌WN13/pWN7.126B中，现在已经获得了D-1，2，4-丁三醇产量的极大提高，例如在发酵罐控制的培养条件下以30％(mol/mol)的产率从D-木糖获得6.2g/L的D-1，2，4-丁三醇。现在已经在培养基中鉴定的其它有用的分子包括3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和D-3，4-二羟基丁酸。因此，现在也可以提供用于这些另外的有用分子的生物合成的酶系统和重组细胞。
D-1，2，4-丁三醇生物合成的原料。在本发明的各种实施方式中，D-木糖可以被用作本发明的D-1，2，4-丁三醇生物合成酶途径的原料。可以使用各种D-木糖源。在一些实施方式中，D-木糖源可以是或包含纯木糖或木糖与其它成分的混合物。在一些实施方式中，D-木糖源可以是或包含非木糖的碳源，其中包含本发明的酶途径的重组细胞或者包含并能够表达其基因的重组细胞能够利用该非木糖碳源以获得D-木糖。可以使用各种各样的这类替代木糖源。因此，在一些实施方式中，木糖源可以包括简单碳源，例如葡萄糖，其中细胞具有由其合成木糖的能力。在一些实施方式中，细胞可能具有通过利用细胞的核苷糖代谢、淀粉或蔗糖代谢或者蛋白聚糖代谢途径从简单碳源(例如葡萄糖)合成木糖的能力。可以基于宿主细胞将各种碳源转化成D-木糖或D-木质酸的能力而利用各种不同碳源。简单碳源的一些例子包括C1-C18的均-或杂-脂族化合物，包括C1-C8杂脂族化合物和碳氧化物，以及包含其残基的宿主细胞可水解的聚合物。在一些实施方式中，可以使用多元醇类或糖类。
在各种不同实施方式中，木糖可以通过包含以下酶的细胞从例如葡萄糖合成：(1)将D-葡萄糖转化成D-葡萄糖-6-磷酸的葡糖激酶(例如，EC 2.7.1.1)；(2)将D-葡萄糖-6-磷酸转化成D-葡萄糖-1-磷酸的葡糖磷酸变位酶(例如，EC 5.4.2.2)；(3)将D-葡萄糖-1-磷酸转化成UDP-D-葡萄糖的UTP：葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(例如，EC2.7.7.91)；(4)将UDP-D-葡萄糖转化成UDP-D-葡糖醛酸的UDP-葡萄糖-6-脱氢酶(例如，EC 1.1.1.22)和(5)将UDP-D-葡糖醛酸转化成UDP-D-木糖的UDP-葡糖醛酸脱羧酶(例如，EC 4.1.1.35)。UDP-D-木糖可以进行水解以提供D-木糖，或者可以用于生物合成含木糖残基的生物聚合物，例如通过木聚糖合酶(例如，EC 2.4.2.24)的作用，其中该生物聚合物可以随后被水解，例如如下面所描述的，以提供D-木糖。可用于本发明的各种实施方式的细胞具有从简单碳源合成D-木糖的天生的或重组的能力。在一些实施方式中，植物细胞，或者原生质体或圆球质体，可以用作能够从简单碳源合成D-木糖的宿主细胞。
在一些实施方式中，木糖源可以是或包含含木糖残基的聚合物，如含木糖残基的生物聚合物，例如任何含木糖残基的半纤维素或果胶，其中细胞具有由其合成木糖的能力。因此，木糖源可以是或包含以下物质的任何一种或多种：均-或杂-木聚糖，例如葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖-葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖或葡糖醛酸-阿拉伯糖基木聚糖；木糖葡聚糖；木糖聚半乳糖醛酸；木糖半乳聚糖；木糖脱氧半乳聚糖或木糖半乳糖脱氧半乳聚糖等等，或其任意组合。具有从含木糖残基的聚合物合成木糖的能力的细胞可能包含提供该能力的酶，如用于水解均-或杂-木聚糖骨架的木糖残基键的木聚糖酶(例如，EC 3.2.1.8、3.2.1.32、3.2.1.126、3.2.1.136或3.2.1.156)和/或用于水解侧链木糖残基键的木糖苷酶(例如，EC 3.2.1.32、3.2.1.37或3.2.1.72)。木聚糖酶和/或木糖苷酶可以单独存在或与其它非木聚糖酶/非木糖苷酶、聚合物操作或聚合物片段操作的水解酶组合，例如以下的一种或多种酶：糖苷酶；酯酶；葡糖醛酸苷酶(glycuronosidase)；聚糖酶，例如外切-或内切-葡聚糖酶、-半乳聚糖酶或-岩藻聚糖酶；葡糖醛酸酶，例如外切-或内切-半乳糖醛酸酶；或其组合。可用于本发明各种实施方式的细胞可能具有从含木糖残基的聚合物合成D-木糖的天生的或重组的能力。
在一些实施方式中，木糖源可以包含D-木酮糖或D-木糖醇，其中细胞具有由其合成木糖的能力，例如其中细胞分别包含木糖异构酶(EC 5.3.1.5)或醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)。可用于本发明各种实施方式的细胞可能具有从D-木酮糖或D-木糖醇合成D-木糖的天生的或重组的能力。
在各种不同实施方式中，D-木质酸可以用作本发明的1，2，4-丁三醇生物合成酶途径的原料。可以使用各种D-木质酸源。在一些实施方式中，D-木质酸源可以是或包含纯D-木质酸或木质酸与其它成分的混合物。在一些实施方式中，D-木质酸源可以是或包含非木质酸的碳源，其中包含本发明的酶途径的重组细胞或者包含并能够表达其基因的重组细胞能够利用该非木质酸碳源以获得D-木质酸。可以使用各种各样的这类替代木质酸源。因此，在一些实施方式中，木质酸源可以包括简单碳源，例如葡萄糖，其中细胞具有由其合成木质酸的能力。在一些实施方式中，木质酸源可以包括2-脱氢-3-脱氧-D-木质酸，其中细胞具有由其合成木质酸的能力，例如其中细胞包含木质酸脱水酶(EC 4.2.1.82)。可用于本发明各种实施方式的细胞可能具有从例如简单碳源或从2-脱氢-3-脱氧-D-木质酸合成D-木质酸的天生的或重组的能力。
在各种不同实施方式中，这里使用的木糖源或木质酸源可以包含D-木糖内酯，其中细胞能够将其分别转化为木糖或木质酸，例如其中细胞分别包含D-木糖-1-脱氢酶(EC 1.1.1.175)或木质酸-1，4-内酯酶(EC 3.1.1.68)。可用于本发明各种实施方式的细胞可能具有从D-木质酸内酯(xylonolactone)合成D-木糖或D-木质酸的天生的或重组的能力。
利用木糖源或木质酸源的能力可能是用于制备本发明的重组细胞的细胞天然具有的，或者可以重组地加入到细胞上。具有将含木糖残基的生物聚合物转化为D-木糖的天然能力的细胞的例子包括真菌细胞，如脉孢菌(Neurospora)、曲霉菌(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)，以及细菌细胞，如杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。但是，本发明的重组的1，2，4-丁三醇合成细胞可以在含木糖残基的生物聚合物存在的情况下与具有将含木糖残基的聚合物转化成D-木糖的能力的细胞(例如分泌半纤维素酶的细胞)共培养以向重组的1，2，4-丁三醇合成细胞提供木糖。在使用另一替代的木糖源或木质酸源的情况下，可以与具有分泌进行木糖或木质酸转化反应的酶的能力的细胞一起进行类似的共培养。
D-1，2，4-丁三醇生产的生物合成途径。参见图5d，在各种不同实施方式中，本发明的D-1，2，4-丁三醇生物合成途径可以利用木质酸源而采用图5d的步骤B、C和D，或者利用木糖源而采用图5d的步骤A、B、C和D。这些步骤由以下酶催化：(a)D-木糖脱氢酶(xdh)、(b)D-木质酸脱水酶(例如，yjhG或yagF)、(c)2-酮酸脱羧酶(例如，mdlC)和(d)醇脱氢酶。如这里所使用的，在该步骤(d)的上下文中，“醇脱氢酶”指的是具有将3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇的催化活性的任何醇脱氢酶，例如，AdhP或AdhE或YiaY型的醇脱氢酶。在本发明的实施例中，编码苯甲酰甲酸脱羧酶(EC 4.1.1.7)的恶臭假单胞菌mdlC编码序列用于提供2-酮酸脱羧酶活性。用于步骤A和B的酶在下面的章节中进行更详细的描述。
在本发明的实施例中，天生的大肠杆菌脱氢酶活性被用于催化1，2，4-丁三醇形成的最终步骤(d)。虽然不希望受到理论的限制，但据认为该脱氢酶活性通过一种或多种伯醇脱氢酶实现；这些也称作醛还原酶。但是，表现出这一醛还原酶活性的任何酶(即能够将3，4-二羟基丁醛还原成1，2，4-丁三醇的酶)可以被取代。其它表现出有用的醛还原酶活性的酶的例子包括例如，非大肠杆菌天生的或非本发明的体内实施方式中的宿主细胞天生的伯醇脱氢酶，和羰基还原酶。这些酶的具体例子包括NADH-依赖醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)、NADPH-依赖醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)和NADPH-依赖羰基还原酶(EC 1.1.1.184)。
可运行以实现本发明的生物催化途径的酶系统可以通过将至少一个基因插入所选择的宿主细胞中以构建未在野生型细胞中出现的途径而提供。因此，能够按照本发明的体内实施方式产生1，2，4-丁三醇的重组宿主细胞是已经过转化从而变得能够实现从D-木糖产生D-1，2，4-丁三醇或从D-木质酸产生D-1，2，4-丁三醇中的至少一种的细胞。
按照本发明的D-1，2，4-丁三醇生物合成的方法和系统可以在L-1，2，4-丁三醇生物合成的方法和系统存在或不存在的情况下运行。在D-和L-1，2，4-丁三醇被同时合成的实施方式中，所得到的异构体的混合物可以进行硝化以形成D，L-1，2，4-丁三醇三硝酸酯。
1，2，4-丁三醇的用途和衍生物。按照本发明的实施方式制备的1，2，4-丁三醇可以被分离，例如用作如血清甘油酯色谱分析的标准(参见，例如H.Li等，J Lipid Res.(2006年6月20日)[印刷之前在httpWorld-Wide-Website jlr.org/cgi/reprint/D600009-JLR200v1上电子公开])，和/或1，2，4-丁三醇可以衍生化以形成需要的产物。
在各种不同实施方式中，1，2，4-丁三醇三硝酸酯可以通过硝化而作为衍生物产生。在本发明实施方式中产生的1，2，4-丁三醇的硝化可以容易地通过使用多种可商购的硝化剂进行。常用的硝化剂包括：HNO3(或HNO3与H2SO4的混合物)、N2O4(或N2O4与NO2的混合物)、N2O5(或N2O5与HNO3的混合物)、NO2Cl、过氧亚硝酸盐(X+O＝N-O-O-，可以作为例如Na+、K+、Li+、铵或四烷基铵过氧亚硝酸盐的形式商购得到)和四硝基甲烷，及包含一种或多种这类物质的组合物。这些硝化剂可以按照现有技术中已知的各种不同的硝化条件和过程中的任一种使用以获得1，2，4-丁三醇三硝酸酯。
或者，在本发明的实施方式中产生的1，2，4-丁三醇可以通过生物合成或化学合成路径转化成其它有用的衍生化合物，参见，例如N.Shimizu等，Biosci.Biotechnol.Biochem.67(8)：1732-1736(2003年8月)。
如这里随后所描述的，发酵罐培养可以用于促进碳源转化成D-1，2，4-丁三醇。然后培养肉汤可以被硝化以从培养肉汤形成丁三醇三硝酸酯。在另一种实施方式中，丁三醇可以从培养肉汤中提取、清洗或纯化，随后进行硝化。补料分批式(fed-batch)发酵工艺、沉淀方法和纯化方法是本领域技术人员已知的。
一旦形成，1，2，4-丁三醇三硝酸酯可以用作高能(例如，爆炸性)组合物的活性成分，其可以是爆炸装置或例如火箭燃料的形式。爆炸装置包括设计为用于或用作军火、采石工程、采矿业、紧固(钉接、铆接)、金属焊接、拆除、水下爆破和焰火装置的那些装置；该装置也可以设计或用于其它目的，如破冰、树根爆破(tree root-blasting)、金属成型等等。
在形成高能(例如，爆炸性)组合物时，1，2，4-丁三醇三硝酸酯可以与进一步的爆炸性化合物及，可选择地或附加地，与进一步的非爆炸性化合物混合，例如惰性材料、稳定剂、塑化剂或燃料。进一步的爆炸性化合物的例子包括，但不限于：硝化纤维素、硝化淀粉、硝化糖、硝化甘油、三硝基甲苯、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠、三硝基苯甲硝胺、季戊四醇四硝酸酯、环三亚甲基三硝胺、环四亚甲基四硝胺、甘露糖醇六硝酸酯、苦味酸铵、重金属叠氮化物和重金属雷酸盐。进一步的非爆炸成分包括，但不限于：铝、燃料油、蜡、脂肪酸、木炭、石墨、矿脂、氯化钠、碳酸钙、硅石和硫磺。
因此，现在也可以提供含有通过本发明的方法产生的1，2，4-丁三醇三硝酸酯的组合物和含有该1，2，4-丁三醇三硝酸酯的爆炸装置。通过按照本发明的实施方式的方法制备的1，2，4-丁三醇三硝酸酯可以用于爆破或推进实物体的方法，该方法包括在所述实物体的表面上或邻近于所述实物体的表面引爆含有该1，2，4-丁三醇三硝酸酯的爆炸装置。
按照本发明和实施方式的其它物品和组合物包括以下这些。包含有按照本发明实施方式的酶系统的重组宿主细胞，和为DgPu-细胞的这类细胞。DgPu-细胞。包含编码按照本发明实施方式的酶系统的可表达核酸的重组宿主细胞。包含含有这一酶系统的组合物及利用该组合物产生1，2，4-丁三醇或其它需要的产物的使用说明的试剂盒；包含编码这一酶系统的核酸及利用该核酸形成能够产生1，2，4-丁三醇或其它需要的产物的重组细胞的使用说明的试剂盒；包含含有能够表达这一酶系统的重组宿主细胞的组合物及利用该组合物产生1，2，4-丁三醇或其它需要的产物的使用说明的试剂盒。
丁三醇以外的替代生物合成产物及其途径。作为导致本发明的工作的一部分，多种先前未识别的1，2，4-丁三醇生物合成途径的副产物在本发明的1，2，4-丁三醇合成细胞中得到确认，该细胞的丙酮酸/乙醇醛分解代谢途径(图5d的步骤h)通过灭活其3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因而受到阻断。这些副产物化合物中有：(1)通过2-酮酸还原酶活性作用而由3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸形成的3-脱氧-D-甘油-戊酸，(2)通过醛脱氢酶活性作用而由3，4-二羟基-D-丁醛形成的D-3，4-二羟基-丁酸，和(3)通过2-酮酸转氨酶活性作用而由3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸形成的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基-戊酸。
这些化合物包含手性中心且因此可以用于合成生物活性物质和其它物质，如下列实施例中的那些。3-脱氧-D-甘油-戊酸可以用于制备3-脱氧-戊酸内酯，一种可以作为生长促进剂加入牲畜饲料的养殖促进剂化合物，参见，例如美国专利5391769，Matsumoto等，1995年2月21日授权。3，4-二羟基-丁酸可用于合成抗高胆固醇血症药物，参见，例如美国专利公开2006/0040898，Puthiaparampil等，2006年2月23日出版和美国专利5998633，Jacks等，1999年12月7日授权。2-氨基-4，5-二羟基戊酸可用于形成金属蛋白酶抑制剂化合物，参见，例如D.T.Elmore，“Peptide Sythesis”，第一章，Amino Acids，Peptidesand Proteins，vol.34，(RSC，2003)(在第18页)。
因此，在各种实施方式中，本发明的3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成途径可以利用木质酸源而采用图5d的步骤b和e，或者利用木糖源而采用步骤a、b和e。在各种实施方式中，本发明的D-3，4-二羟基-丁酸生物合成途径可以利用木质酸源而采用图5d的步骤b、c和g，或者利用木糖源而采用步骤a、b、c和g。在各种实施方式中，本发明的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基-戊酸生物合成途径可以利用木质酸源而采用图5d的步骤b和f，或者利用木糖源而采用步骤a、b和f。在这些途径中任一种途径的一些实施方式中，一种或多种催化到另外两种化合物中的一种的替代转化反应的步骤b后的酶可以被抑制或灭活，并且任选地催化到1，2，4-丁三醇的转化反应的一种或多种酶和/或3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶可以被抑制或灭活，正如将木糖、木质酸或所选择的途径的其它中间体从本发明的用途转用于其它用途的任何其它酶中的一种或多种可以被抑制或灭活一样。类似地，一种或多种催化步骤e、f和/或g的酶可以在能够合成1，2，4-丁三醇的本发明酶系统的各种实施方式中被抑制或灭活。
不希望的分解代谢活性的灭活或抑制。在除木糖醇以外的木糖源被用于本发明的木糖生物转化途径的各种实施方式中，图5d步骤k2的宿主细胞醛糖还原酶和/或作用于其木糖醇产物的酶可以被抑制或灭活以防止木糖的转用；类似地，在使用D-木酮糖以外的这类木糖源的情况下，图5d步骤k1的宿主细胞木糖异构酶和/或作用于其D-木酮糖产物的酶，例如木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)，可以被抑制或灭活以帮助防止木糖的转用。在木糖源包含例如，木糖、含木糖残基的聚合物或简单碳源的情况下，这两种策略可以一起采用以帮助防止木糖的转用。
在D-木质酸以外的木质酸源被用于本发明的木质酸生物转化途径的各种实施方式中，或者在采用木糖生物转化途径的各种实施方式中，图5d步骤k3的宿主细胞木质酸脱水酶和/或作用于其2-脱氢-3-脱氧-D-木质酸产物的酶，例如图5d步骤h的2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.28)，可以被抑制或灭活以帮助防止木糖的转用。因此，可以抑制或灭活将需要的原料或中间体从按照本发明的实施方式所选择的生物合成途径转用的任一途径或所有途径。
在本发明的任一生物合成途径中，不论是采用木糖或木质酸源，作用于其2-脱氢-3-脱氧-D-木质酸产物的酶，例如图5d步骤h的2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.28)，可以被抑制或灭活以帮助防止碳从所希望的途径转用于其它途径。
参照图5d，如上面所提到的，步骤e由2-酮酸还原酶活性(或α-羟酸脱氢酶，例如EC 1.1.99.6)催化，一种2-酮酸还原酶序列是例如，Genbank登录号AAC74117..gi：87081824，由U00096...gi：48994873编码。步骤f由2-酮酸操作的转氨酶活性(例如，EC 2.6.1.21或2.6.1.67)催化，一种转氨酶序列是例如，Genbank登录号YP_556835..gi：91781629，由NC_007951..gi：91781384的nt280347-281312编码。步骤g由醛脱氢酶活性(例如，EC 1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.99.3或1.2.99.7)催化，一种醛脱氢酶序列是例如，Genbank登录号AAA23428..gi：145224，由M38433..gi：145223编码。步骤k1由木糖异构酶(EC 5.3.1.5)催化，一种木糖异构酶序列是Genbank登录号ABG71642..gi：110345405，由CP000247..gi：110341805编码。步骤k2由醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)催化，一种醛糖还原酶序列是Genbank登录号AAG54503..gi：12512935，由AE005174..gi：56384585编码。步骤k3由木质酸脱水酶(EC 4.2.1.82)催化，参见，例如AS Dahms & A Donald，＂D-xylo-Aldonatedehydratase，＂Methods Enzymol.90(Pt.E)：302-305(1982)。
图5d步骤h由3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶催化，其序列包括SEQ ID NO：12和14，分别由SEQ ID NO：11和13编码。这些序列可以例如，通过生物信息搜索或杂交分析用于在以开发成按照本发明实施方式的重组宿主细胞为目标的细胞中鉴别其它的这类不希望的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因。这些基因序列和通过其用途鉴别的这类其它的分解代谢醛缩酶的基因序列可以用于构建设计为灭活这些醛缩酶基因的多核苷酸载体，例如质粒。RNA干扰技术可以替代地用于抑制这些基因的表达。因此，3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性可以在希望的宿主细胞被抑制或灭活。
因此，这里还提供用于合成D-1，2，4-丁三醇、3-脱氧-D-甘油-戊酸、D-3，4-二羟基-丁酸或(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸中的一种或多种的新型的酶系统和单独或结合地包含酶系统的重组细胞。在各种不同实施方式中，这类酶系统或重组细胞能够从木糖源或木质酸源合成这些化合物。
3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶也可以在包含从L-阿拉伯糖或L-阿糖酸生物合成L-1，2，4-丁三醇的工程化生物途径的重组宿主细胞中受到抑制或灭活，以类似地防止3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的转用。已经操作而抑制或灭活3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸的细胞体在这里可以称作重组的DgPu-体，例如重组的DgPu-细胞。
酶多肽和编码序列。在按照本发明的一些实施方式中，提供了具有D-木糖脱氢酶活性的多肽。SEQ ID NO：2和4各代表起到催化D-木糖到D-木质酸的转化作用的野生型木糖脱氢酶(Xdh)的氨基酸序列。在按照本发明的一些实施方式中，提供了编码本发明的D-木糖脱氢酶的多核苷酸或核酸类似物。SEQ ID NO：1和3各代表野生型D-木糖脱氢酶的DNA编码序列(xdh)。
在按照本发明的一些实施方式中，提供了具有D-木质酸脱水酶活性的多肽。SEQ ID NO：6和8各代表起到催化D-木质酸到3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的转化作用的野生型D-木质酸脱水酶的氨基酸序列：大肠杆菌YjhG和YagF。在按照本发明的一些实施方式中，提供了编码本发明的D-木质酸脱水酶的多核苷酸或核酸类似物。SEQ ID NO：5和7各代表野生型D-木质酸脱水酶的DNA编码序列：大肠杆菌yjhG和yagF。
类似地，由SEQ ID NO：9编码的SEQ ID NO：10代表来自莓实假单胞菌的该莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶片段的氨基酸序列，该细菌由美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Manassas，VA，U.S.)以登录号ATCC 4973向公众提供。该D-木质酸脱水酶和其基因可以使用现有技术中已知的技术中的任何一种(例如，在下面的实施例部分中描述的技术)从细菌中分离。该酶的DNA编码序列具有大约1300nt的推定长度，且具有靠近其端部包含SEQ ID NO：9的碱基序列的3’-端部分。该编码的D-木质酸脱水酶多肽具有大约430+的推定长度、大约60kDa的近似MW，且具有靠近其端部包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的C-末端部分。该酶也能够催化D-木质酸到3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的转化。
在按照本发明的一些实施方式中，提供了编码3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的多核苷酸或者包含其编码序列的多核苷酸。SEQ IDNO：12和14各代表可以催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸到丙酮酸和乙醇醛的转化反应的野生型醛缩酶的氨基酸序列：大肠杆菌YjhH和YagE。如上所述，可以使用编码这些氨基酸序列的核酸序列构建敲除载体或RNA干扰载体。在按照本发明的一些实施方式中，提供了编码本发明的D-木质酸脱水酶的多核苷酸或核酸类似物，例如，SEQ IDNO：11和13各代表野生型3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的DNA编码序列：大肠杆菌yjhH和yagE。
同样，SEQ ID NO：12的19-319残基代表可以催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸到丙酮酸和乙醇醛的转化的野生型大肠杆菌YjhH醛缩酶的替代氨基酸序列。如上所述，可以使用编码这一氨基酸序列的核酸序列构建敲除载体或RNA干扰载体。在按照本发明的一些实施方式中，提供了编码本发明的D-木质酸脱水酶的多核苷酸或核酸类似物，例如，SEQ ID NO：11的nt55-957表示野生型大肠杆菌YjhH醛缩酶的替代氨基酸序列的DNA编码序列。SEQ ID NO：11的完全或替代核苷酸序列可以用于例如，筛选其它的这类醛缩酶和/或制备敲除载体或RNA干扰载体。SEQ ID NO：12的完全或替代氨基酸序列可以用于例如，催化所述的反应或用作产生和/或选择抗体和结合分子的表位靶标。
编码酶的核酸和多肽变异体。按照本发明的编码序列可以可操作地与转录和/或翻译控制元件连接，该元件在希望的宿主细胞，例如微生物(例如，细菌、真菌/酵母、古细菌(archaea)或原生生物)或植物(例如，双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、苔藓植物或蕨类植物)细胞中发挥功能，虽然也可以使用脊椎动物(例如，哺乳动物或人类)或非脊椎动物(例如，昆虫)细胞。本发明的核酸可以被整合到核酸载体中和/或可以用于转化宿主细胞。遗传元件、载体和转化技术的例子包括在美国专利6803501，Baerson等，2004年10月12日授权，和7041805，Baker等，2006年5月9日授权中描述的那些，其说明内容通过引用并入本文。
本发明的编码序列可以进行突变，例如通过随机或定点突变，以引入氨基酸置换、缺失或插入；可以由此引入保守氨基酸置换。有用的保守氨基酸置换包括在例如美国专利7008924，Yan等，2006年3月7日授权中描述的那些，其说明内容通过引用并入本文。在严格条件下的杂交，或者人工或自动的(例如，生物信息学的)序列的对比，可以使用本发明的多肽或核酸的序列进行，以筛选具有或编码与这里按照序列表中的序列定义的酶相同的生物催化活性的进一步的候选酶多肽或进一步的候选酶编码多核苷酸，例如同源多肽或多核苷酸。序列同源性(对齐的序列的相似性或同一性)的可用量度和用于杂交筛选的严格杂交条件包括在例如，美国专利7049488，Fischer等，2006年5月23日授权和7041805，Baker等，2006年5月9日授权中描述的那些，其说明内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，同源氨基酸序列可以是至少70％，或者大约或至少75％、80％、85％、90％或95％与给定的序列表中所列多肽同源。在一些实施方式中，同源核碱基序列可以是大约或至少90％或95％、98％与给定的序列表中所列多核苷酸同源。按照本发明的编码序列可以按照现有技术中已知的任何技术进行密码子优化以提高其在希望的细胞中的表达，例如，如在美国专利6858422，Giver等，2005年2月22日中所描述的，其说明内容通过引用并入本文。因此，保持相同类型的生物催化活性的本发明给定酶的保守置换氨基酸变异体和本发明给定酶的同源酶可以用于在本发明的酶系统、途径和方法中发挥相同的功能。
按照本发明的多核苷酸(例如包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13中任一项的碱基序列的多核苷酸)及本发明的编码相同活性的酶的其它多核苷酸，可以在用于获得在各自编码的酶的功能上的希望的增强或变化的定向进化过程中用作模板，例如通过两轮或多轮的基因重组(例如，基因改组)和/或对模板的随机突变(例如，通过易错PCR)或定点突变(例如，点突变)。编码序列和形成操作部分的基因可以进行密码子优化以在选择的宿主细胞中发挥功能或更好地发挥功能。可以使用现有技术中已知的多种密码子优化技术中的任一种。
这里可以使用的基本DNA操作和遗传技术可以按照例如，T.Maniatis等.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringIIarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982)和J.Sambrook等，Molecular cloning：A laboratory manual(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)中描述的标准方案进行，该文献通过引用并入本文。
筛选试验。在本发明的一些实施方式中，本发明的编码酶多肽的核酸或核酸类似物可以用于通过形成双链体或三链体的杂交分析筛查至少怀疑包含另一种编码同一活性的酶的核酸的样品。可用于这一目的的探针可能包含来自本发明的编码多肽的核酸的至少10个，或者大约或至少20、30、40或50个碱基的连续碱基序列。该探针可以进行可检测的标记，例如，使用显色的、非猝灭的或可逆地猝灭的荧光、发光或磷光标记，或者可以反应以产生可检测的信号(如光子信号)的标记，或者可进行反应以连接到提供可检测的信号的结构上的结合位点-或结合分子-型的标记(如生物素-或抗生物素蛋白-标记的探针)。类似地，编码酶多肽的核酸的核碱基序列信息可以用于生物信息学方法中(例如，电脑模拟(in silico)或者通过直接可视化)以识别另一核碱基序列为编码相同活性的酶的序列或候选的编码相同活性酶的序列。
可以制备具有对本发明各种实施方式的酶多肽或核酸的结合特异性的抗体。这些抗体可以用于筛查至少怀疑包含相同活性的酶或编码相同活性酶的核酸的生物分子文库、混合物等等，即其活性与提供该序列或用作抗原的生物分子为同一类型。也可以制备对这些抗体的抗独特型抗体且用于筛选目的。抗体可以可检测地标记。具有这种结合特异性的适体可以可选择地制备并用于这一目的。
实施例
莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶部分基因序列的分离。莓实假单胞菌(ATCC 4973)中的D-木糖分解代谢途径在可以利用该糖作为生长碳源时被诱导。参见，例如R.Weimberg，Pentoseoxidation by Pseudomonas fragi，J.Biol.Chem.236：629-635(1961)。因此，D-木质酸脱水酶从含木糖的培养基中培养的细胞纯化。纯化使用DE-52阴离子交换柱、羟磷灰石柱、苯基琼脂糖凝胶柱和HPLCResource Q阴离子交换柱进行。这一方法导致97倍的纯化，使得基于SDS-PAGE分析的蛋白质纯度接近均质。纯化的蛋白质的分子量在变性蛋白质凝胶中估算为60kDa(图2a)。
为分离编码纯化的D-木质酸脱水酶的基因，蛋白质通过胰蛋白酶消化进行处理且HPLC-纯化的消化产物进行N-末端序列分析。这样获得五个短肽的氨基酸序列(图2b)。对这五个肽序列的短和几乎精确匹配的NCBI数据库BLAST分析显示了几个含有对所有五项查询具有接近80％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此使用其同源体在来自NCBI数据库的母蛋白质中的相对位置来估计五个肽在莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶中的相对位置。使用按照肽3和肽5的部分氨基酸序列设计的一对简并引物，我们成功地从莓实假单胞菌的基因组DN八扩增了单DNA产物。该PCR产物克隆到pCRTOPO-2.1载体中并确认插入的DNA序列(图2c)。为进一步证明是否这一410bp的DNA片段编码纯化的D-木质酸脱水酶，我们检查了由该DNA序列“在阅读框内(in frame)”翻译的肽序列(图2c)。
该肽的N-末端包含延伸到其C-末端端部的肽3的部分氨基酸序列(图2c)。该肽的C-末端包含延伸到其N-末端端部的肽5的部分氨基酸序列(图2c)。另外，翻译的肽还包含肽4的整个氨基酸序列，肽4估计在D-木质酸脱水酶中位于肽3和肽5之间。因此我们得出结论，PCR产物是编码来自莓实假单胞菌的D-木质酸脱水酶的部分基因。
新型D-木糖脱氢酶的发现。D-1，2，4-丁三醇生物合成途径的第一步利用D-木糖脱氢酶活性以将D-木糖转化成D-木质酸(图1b)。虽然编码该酶的基因已经从古细菌和哺乳动物中分离，但这些报道的酶在大肠杆菌中的表达需要利用特殊的宿主菌株以补偿不同物种之间密码子使用上的差异。参见，例如U.Johnsen & P.Schoenheit，Novelxylose dehydrogenase in the halophilic archaeon Haloarculamarisomortui，J.Bacteriol.186：6198-6207(2004)；S.Aoki等，Identification of dimeric dihydrodiol dehydrogenase asNADP+-dependent D-xylose dehydrogenase in pigliver，Chem.Biol.Inter.130-132：775-784(2001)；和Y.Asada等，Roles of His-79 andTyr-180 of O-xylose dehydrogenase/dihydrodiol dehydrogenase incatalytic function，Biochem.Biophys.Res.Commun.278：333-337(2000)。因此，为了构建合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌，希望的是可以容易地在常规大肠杆菌菌株中表达的D-木糖脱氢酶。
在多种代谢木糖的假单胞菌菌株中，D-木糖脱氢酶和D-木质酸脱水酶都报道为D-木糖利用的关键分解代谢酶。参见，例如R.Weimberg，J.Biol.Chem.236：629-635(1961)；和A.S.Dahms，3-Deoxy-D-pentulosonic acid aldolase and its role in a new pathway ofD-xylose degradation.Biochem.Biophys.Res.Commun.60：1433-1439(1974)。我们试图通过细菌染色体的生物信息学分析鉴定编码D-木糖脱氢酶的基因。采用来自莓实假单胞菌的D-木质酸脱水酶的部分氨基酸序列进行了ERGO细菌基因组数据库的BLAST分析。
真菌伯克霍尔德菌(Burkholderia fungorum)LB400蛋白质(参见SEQ ID NO：2，由SEQ ID NO：1编码)，其由ERGO细菌基因组数据库注解为半乳糖酸脱水酶，显示出最高的同源性评分。在先前的NCBI数据库分析中，相同的蛋白质也显示为包含与对纯化的D-木质酸脱水酸进行蛋白酶消化获得的所有五个肽具有高同源性的氨基酸序列。当我们检查与建议的半乳糖酸脱水酶邻接的ORF的功能时，我们鉴定了一种推定的酶，在ERGO数据库中标明为RBU11704，属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族。因为构成SDR超家族的一个主要的酶组是糖脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶，该真菌伯克霍尔德菌蛋白质因此被认为是D-木糖脱氢酶候选物以进行进一步的鉴定，参见，例如H.Joernvall等，Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)，Biochem.34：6003-6013(1995)。
检查与其它与部分D-木质酸脱水酶具有高同源性的蛋白质邻接的ORF进一步揭示了第二种属于SDR超家族的推定蛋白质。这一新月柄杆菌CB 15蛋白质(参见SEQ ID NO：4，由SEQ ID NO：3编码)，在ERGO数据库中标明为RCO01012，由在新月柄杆菌的CauloCyc(参见http互联网站biocyc.org)途径/基因组数据库中命名为CC0821的基因编码。先前提出CC0821基因为可以潜在地编码D-木糖脱氢酶的两种基因中的一种。参见，例如A.K.Hottes等，Transcriptional profilingof Caulobacter crescentus during growth on complex and minimal media，J.Bacteriol.186：1448-1461(2004)。蛋白质序列比对表明，蛋白质RCO01012与来自真菌伯克霍尔德菌的蛋白质RBU11704具有77％的同源性。
真菌伯克霍尔德菌蛋白质RBU11704和新月柄杆菌蛋白质RCO01012的表征利用了通过镍/次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂(由QIAGEN Inc.，Valencia，CA，U.S.提供)纯化的N-末端6xHis-标记的融合蛋白。在被测试的糖中，D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡萄糖可以在两种酶的催化下氧化成相应的糖酸。另一方面，D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、2-脱氧-D-葡萄糖、D-葡萄糖-6-磷酸和D-核糖不是两种酶中任一种的底物。
与优先以NADP+作为辅因子的两种先前报道的D-木糖脱氢酶相比，在提供NAD+而非NADP+作为辅因子时，两种细菌酶显示出500倍以上的更高活性。参见，例如U.Johnsen & P.Schoenheit，J.Bacteriol.186：6198-6207(2004)；和Y.Asada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.278：333-337(2000)。在酶分析中包含二价阳离子(Zn2+或Fe2+)对纯化的酶的比活性没有影响。两种酶的最大活性在pH8.3左右观察到。酶动力学的分析揭示了两种酶相对于其它糖来说对D-木糖具有显著较低的Km，而蛋白质RCO01012的Km(D-木糖)值(0.099mM)比蛋白质RBU11704的Km(D-木糖)值(0.97mM)低10倍(表1)。另外，新月柄杆菌酶相对于真菌伯克霍尔德菌酶对C5底物L-阿拉伯糖具有更高活性，但对C6底物D-葡萄糖具有较低活性。作为D-木糖脱氢酶，新月柄杆菌酶比古细菌和哺乳动物酶效率(kcat/Km)更高，而真菌伯克霍尔德菌酶具有与报道的酶相当的催化效率(表1)。我们在这里将ERGO数据库中来自真菌伯克霍尔德菌LB400的蛋白质RBU11704和来自新月柄杆菌CB15的蛋白质RCO01012称作D-木糖脱氢酶(Xdh)。基于这两种酶的动力学数据，选择来自新月柄杆菌的D-木糖脱氢酶用于尝试构建能够从D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌菌株。
表1.D-木糖脱氢酶的动力学数据
Figure A200780032753D00511
a-辅因子为NAD+。b-辅因子为NADP+。c-酶在所有kcat值的计算中都看作单体。
大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径的阐明。我们先前已经观察到大肠杆菌K-12野生型菌株W3110可以通过未识别的分解代谢途径利用D-木质酸作为生长的唯一碳源。参见，例如W.Niu，Microbialsynthesis of chemicals from renewable feedstocks.博士论文(MichiganState University，East Lansing，MI，2004)。在如此培养的W3110的无细胞提取物中，我们检测到D-木质酸脱水酶活性和3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性(图4a)。两种活性都未在含其它常用碳源(例如D-葡萄糖)的培养基中培养的W3110细胞中检测到(参见，例如W.Niu，同前)。代谢物蓄积的1H NMR分析进一步揭示，乙二醇和甘醇酸酯由在D-木质酸上培养的W3110累积。两种分子都与大肠杆菌中的乙醇醛分解代谢有关。D-木糖分解代谢途径先前也已经在假单胞菌菌株中报道了(参见，例如R.Weimberg，J.Biol.Chem.236：629-635(1961)；和A.S.Dahms，Biochem.Biophys.Res.Commun.60：1433-1439(1974))。
利用这一信息，我们提出大肠杆菌D-木质酸分解代谢的一种假设途径(图3a)。在这一途径中，D-木质酸首先通过D-木质酸脱水酶的催化转化为3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，该酶也催化由D-木糖生物合成D-1，2，4-丁三醇的第二步骤(图1b)。该途径的第二步涉及醛缩酶催化的2-酮酸中间体的裂解以形成丙酮酸和乙醇醛。尽管提出的途径的第一反应形成本发明的D-1，2，4-丁三醇生物合成的关键中间体，但第二反应将该中间体从生物合成转用于细胞生长。因此，提高大肠杆菌的D-1，2，4-丁三醇生物合成的一种策略是使用不能表达功能活性的2-酮酸醛缩酶的大肠杆菌菌株。这样，细胞中的所有2-酮酸中间体将引入到生物合成途径。但是，这一策略的成功应用在没有对提出的途径进行确认和对编码提出的分解代谢酶的基因进行鉴定的情况下是不可能的。
我们首先试图通过随机诱变方式阐明大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径。大肠杆菌K-12野生型菌株W3110的突变体使用EZ::Tn5TM<R6Kyori/KAN-2>Tnp TransposomeTM试剂盒(EPICENTREBiotechnologies，Madison，W1，U.S.)产生。为分离包含插入到对于D-木质酸分解代谢关键的基因中的转座子的候选物，筛选丧失了在包含D-木质酸作为唯一碳源的M9培养板上生长的能力但在包含D-葡萄糖作为唯一碳源的M9培养板上培养时保持与野生型菌株相同的生长率的W3110突变体。从1200个W3110突变体中，使用这一表型分析确定了三个候选物。该候选物中的两个具有插入到编码腺苷酸环化酶的cya基因中的转座子。参见，例如M.Riley & B.Labedan，Escherichia coli gene products：physiological functions and commonancestries，In F.C.Neidhardt，(编辑)，Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology at 2118-2202(第二版)(ASM Press，Washington，DC，1996)。第三个候选物具有插入到编码环AMP受体蛋白(CRP)的crp基因中的转座子(F.C.Neidhardt，同前)。作为大肠杆菌中的全局性转录调节因子之一，CRP与其DNA靶的结合受到cAMP胞质浓度的调节。参见，例如M.H.Saier等，Regulation of carbonutilization，In F.C.Neidhardt，(编辑)，Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology at 1325-1443(第二版)(ASM Press，Washington，DC，1996)。研究也表明，缺乏腺苷酸环化酶活性的大肠杆菌菌株具有低的cAMP胞质浓度(M.H.Saier等，同前)。
cya和/或crp基因的破坏产生不能在受到分解代谢物阻遏的任何碳源上生长的分解代谢阻遏的大肠杆菌菌株(M.H.Saier等，同前)。因此，我们把不能使用D-木质酸作为生长的唯一碳源的cya和crp突变体的分离看作D-木质酸的大肠杆菌分解代谢受到分解代谢物阻遏调节的指征。为避免重复分离具有受损的分解代谢物阻遏调节的突变体，我们使用了包含甘油作为唯一碳源的第三类型的M9培养板来筛选另外的2500个W3110突变体。因为大肠杆菌的甘油分解代谢也受到分解代谢物阻遏的调节，我们改为寻找能够以D-葡萄糖和丙三醇作为唯一碳源生长但不能以D-木质酸作为唯一碳源生长的W3110突变体。但是令人惊异的是，没有观察到具有这种表型的突变体。随机诱变试验不能揭示与大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径关联的任何结构基因。
在理解大肠杆菌D-木质酸分解代谢的进一步尝试中，进行了大肠杆菌K-12基因组的生物信息学分析，其从使用莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶的部分氨基酸序列的BLAST检索开始。我们确定了四个与查询序列具有32-41％范围内的序列同一性的候选脱水酶。除了两个经过深入研究的酶(6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和二羟酸脱水酶)外，另外两个未经鉴定的推定脱水酶由基因yjhG(97.424min)和基因yagF(6.0872min)编码。对yjhG和yagF上游和下游的大肠杆菌基因组区域的检查显示了两套编码推定的DNA转录抑制蛋白(yjhI和yagI)、推定的转运蛋白质(yjhF和yagG)及推定的醛缩酶/合酶(yjhH和yagE)的基因(图3b)。另外的编码推定的P-木糖苷酶的基因(yagH)也位于yagF基因附近。两套基因的结构都与以lac操纵子为例的其它大肠杆菌分解代谢途径编码基因的结构相似。另一个引人注目的现象是两套基因都编码对于通过我们提出的途径的可调节D-木质酸分解代谢是必要的和充分的酶(图3a)。为了将来的方便性，我们将这两套基因命名为yjh基因簇和yag基因簇。
为研究yjh和yag基因簇在大肠杆菌D-木质酸分解代谢中的作用，我们首先检测了这两个推定的脱水酶和两个推定的醛缩酶/合酶的体外活性。将基因yjhG、yagF、yjhH和yagE的PCR扩增DNA产物分别克隆到蛋白质表达载体pJF118EH中。在分析中使用表达目标酶的大肠杆菌细胞的无细胞溶菌液。使用1H NMR，我们能够检测到在表达YjhG或YagF的大肠杆菌的溶菌液催化的酶反应中从D-木质酸形成了3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸。1H NMR分析还显示，yjhH和yagE编码的两个推定的醛缩酶/合酶可以催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化为丙酮酸和乙醇醛。我们进一步使用分光光度分析法证实了YjhH和YagE的醛缩酶活性。通过在酶反应中包含乳酸脱氢酶，醛缩酶催化的从3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸形成丙酮酸的反应根据NADH的氧化进行监测。这些结果表明，YjhG和YagF确实具有D-木质酸脱水酶活性；另外，YihG和YagF确实具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性。
接着，我们检查是否yjh和yag基因簇对于大肠杆菌的D-木质酸分解代谢是必要的。因为阐明大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径的目的是探究构建不能消耗3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的大肠杆菌突变体的可能性和评价这一分解代谢改变对大肠杆菌的D-1，2，4-丁三醇生物合成的影响，因此以编码两个醛缩酶的基因(yjhH和yagE)为目标进行染色体敲除试验。从野生型菌株W3110产生了四个大肠杆菌突变体。大肠杆菌WN3和WN4是两个单敲除的菌株。W3110染色体上yjhH基因的部分DNA序列替换为编码氯霉素抗性蛋白质的基因得到菌株WN3(表2)。W3110染色体上yagE基因的部分DNA序列替换为编码卡那霉素抗性蛋白质的基因得到菌株WN4(表2)。大肠杆菌W5是包含菌株WN3和WN4的两种突变的双敲除菌株(表2)。
表2.细菌菌株和质粒
 
菌株/质粒 相关特性 引用/来源
 
真菌伯克霍尔德菌LB400    野生型 ARS
新月柄杆菌CB15       野生型 ATCC
莓实假单胞菌 野生型 ATCC
DH5α lacZ Δ W5 hsdR recA Invitrogen
W3110 野生型K-12 CGSC
W3110cya W3110cya::KanR 本研究
W3110crp W3110crp::KanR 本研究
WN3 W3110yjhH::CmR 本研究
WN4 W3110yagE::KanR 本研究
WN5 W3110yjhH::CmRyagE::KanR 本研究
WN6 W3110 Δ yjhH Δ yagE 本研究
WN7 W3110 Δ yjhH Δ yagEserA 本研究
W3110serA W3110serA 本研究
WN13 WN7xylAB::xdh-CmR 本研究
pKD3 ApR，CmR 文献27
pKD4 ApR，KanR 文献27
pKD46 KanR 文献27
pCRtop02.1 KanR Invitrogen
pQE30 ApR Qiagen
pJG7.246 ApR，pQE30中的lacIO 实验室菌株
pJF118EH ApR，PtaclacIO 文献26
pRC1.55B CmR，pSU18中的serA 实验室菌株
pWN7.270A ApR，pJF118EH中的yjhG 本研究
pWN7.272A ApR，pJFI18EH中的yagF 本研究
pWN8.020A ApR，pJF118EH中的yagE 本研究
pWN8.022A ApR，pJF118EH中的yjhH 本研究
 
pWN9.044A ApR，pJG7.246中的xdh(真菌伯克霍尔德菌)                                 本研究
pWN9.046A ApR，pJG7.246中的xdh(新月柄杆菌) 本研究
pWN7.126B ApR，pWN5.238°中的serA 本研究
pWN9.068A ApR，pKD3中的xdh(新月柄杆菌) 本研究
KIT4 WN7xylAB::xdh-adhP-Ptac-FRT 本研究
KIT10 WN7xylAB::xdh-FRTadhP::FRT 本研究
KIT18 WN7xylAB::xdh-adhP-Ptac-FRTyiaE::FRTycdW::FRT                             本研究
计算机分析显示，各脱水酶编码基因与上游醛缩酶编码基因共享潜在的启动子序列(图3b)。为减轻由插入到醛缩酶编码基因中的基因引起的对脱水酶表达的潜在极性突变效应，通过从菌株WN5的染色体中去除这两个抗生素抗性基因标志而产生第四种大肠杆菌突变体WN6(表2)。然后评价这四个突变体菌株在M9固体培养基上的生长特性(图4a)。大肠杆菌野生型菌株W3110和分解代谢抑制菌株W3110crp在这些试验中作为对照。当提供葡萄糖作为唯一碳源时，所有四个突变体菌株在M9培养板上具有与菌株W3110类似的生长率。但是，当提供D-木质酸作为唯一碳源时，仅两个单敲除的突变菌株能够在M9培养板上生长，但相对于野生型对照菌株具有较低生长率(图4a)。在37℃孵育72h后在相同的培养基上未检测到大肠杆菌WN5、WN6和W3110crp的明显生长(图4a)。这些观察表明，WN3和WN4在D-木质酸上的较低生长率是由与D-木质酸利用直接相关的分解代谢蛋白质的较低活性引起的。并且因为完全缺乏这些催化活性，大肠杆菌WN5和WN6丧失了利用D-木质酸作为唯一碳源进行生长的能力。
我们进一步分析了四个突变体菌株的两种D-木质酸分解代谢酶(D-木质酸脱水酶和3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶)的表达。酶分析利用了在含有D-木质酸的LB培养基中培养的单个菌株的无细胞溶菌液。两个单敲除的大肠杆菌突变体(WN3和WN4)同时表达脱水酶和醛缩酶(图4a)。由于预计的极性突变效应，双敲除突变体WN5不表达两种分解代谢酶中的任一种(图4a)。另一方面，无标志的突变体菌株WN6恢复了表达D-木质酸脱水酶的能力，而仍然缺失3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性(图4a)。使用1H NMR，我们还监测了经过酶表达分析的细胞培养物的D-木质酸消耗和分解代谢物蓄积。在培养结束时，大肠杆菌WN5和W3310crp不消耗任何D-木质酸。野生型大肠杆菌菌株W3110消耗了培养基中的所有D-木质酸，而两个单敲除大肠杆菌突变体和WN6仅消耗掉部分的D-木质酸(图4b)。在六个菌株中，大肠杆菌WN6是唯一向培养基中分泌醛缩酶的底物(3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸)的菌株(图4b)。
至此，从体外和体内试验获得的结果都证实大肠杆菌的D-木质酸分解代谢遵循我们提出的途径(图3a)。另外，需要的分解代谢酶的两个拷贝由属于yjh和yag基因簇的基因编码。
D-1，2，4-丁三醇的微生物合成。我们首先评价消除3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性对大肠杆菌从D-木质酸合成D-1，2，4-丁三醇的影响。为此目的构建了两个大肠杆菌宿主菌株，W3110serA和WN7。W3110serA直接源自野生型菌株W3110(表2)，而WN7直接源自菌株WN6(表2)。两个宿主菌株共有位于染色体上的同一突变serA基因。该serA基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶，该酶是L-丝氨酸生物合成必需的。因此，当细胞成功地维持SerA-编码质粒时，缺少该酶活性的大肠杆菌菌株可能仅在没有补充L-丝氨酸的低盐培养基中生长。这一营养压迫策略广泛地用作质粒维持的有效手段。参见，例如K.M.Draths等，Shikimic acid and quinic acid：replacing isolation from plantsources with recombinant microbial biocatalysis，J.Am.Chem.Soc.121：1603-1604(1999)。除了serA基因外，质粒pWN7.126B也包含从恶臭假单胞菌(ATCC 12633)分离的mdlC基因(表2)。mdlC基因编码2-酮酸脱羧酶(见SEQ ID NO：44，由SEQ ID NO：43编码)，其为催化D-1，2，4-丁三醇生物合成途径中的第三步骤的酶(图1b)。
在33℃的温度和pH7.0下，微生物合成在发酵罐控制的培养条件下在低盐培养基中进行，使溶解氧水平维持在10％的空气饱和度。参见，例如K.Li等，Fed-batch fermentor synthesis of 3-dehydroshikimicacid using recombinant Escherichia coli，Biotechnol.Bioeng.64：61-73(1999)。葡萄糖作为细胞生长的唯一碳源提供。含有D-木质酸钾的溶液加入到培养基中作为生物合成原料。为避免由于培养基中的高葡萄糖浓度引起的对D-木质酸分解代谢酶表达的分解代谢物阻遏，稳态葡萄糖浓度维持在大约0.2mM。培养48h后，大肠杆菌W3110serA/pWN7.126B(其具有功能性的D-木质酸分解代谢途径)仅以0.75％的产率从18g的D-木质酸合成0.08g/L的D-1，2，4-丁三醇(图5a)。
相反，大肠杆菌WN7/pWN7.126B(其可以表达具有催化活性的D-木质酸脱水酶，但不表达3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶)以45％的产率从28g的D-木质酸合成8.3g/L的D-1，2，4-丁三醇(图5a)。因此，该结果证明3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的灭活是增加大肠杆菌在低盐培养基中从D-木质酸合成D-1，2，4-丁三醇的成功策略。
但是，大肠杆菌生物催化剂中D-木质酸分解代谢途径的破坏在理论上应导致从D-木质酸到D-1，2，4-丁三醇的100％的转化。为理解生物合成过程中源自D-木质酸的碳流，我们分析了WN7/pWN7.126B菌株发酵液的副产物形成情况。在除去细胞后，48h培养后收获的发酵液使用Dowex 1(Cl-型)和Dowex 50(H+型)离子交换树脂进行纯化。各纯化步骤的溶质含量用1H NMR进行分析。我们因此检测到3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和D-3，4-二羟基丁酸(图5b)。第一种分子是指定的生物合成中间体。第二和第三种分子可能分别是该中间体的还原和转氨产物。这三种副产物的蓄积表明D-木质酸脱水酶(其催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的形成)的体内催化活性与2-酮酸脱羧酶(其催化该2-酮酸转化成D-3，4-二羟基丁醛)的体内催化活性之间的失配(图1b)。为理解D-3，4-二羟基丁酸形成的机理，我们还分析了大肠杆菌WN7/pRC1.55B(其不表达2-酮酸脱羧酶)的发酵液。但是，该有机酸没有在纯化的发酵液中检测到。因此，D-3，4-二羟基丁酸非常可能是D-3，4-二羟基丁醛的氧化产物(图5d)。
我们通过构建宿主菌株WN13对大肠杆菌在低盐培养基中直接从D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇进行检验。大肠杆菌WN13是通过用xdh(新月柄杆菌)-CmR基因盒置换xylAxylB基因簇的基因组拷贝而由菌株WN7获得的(表2)。xylA基因编码D-木糖异构酶。xylB基因编码D-木酮糖激酶。这是大肠杆菌的D-木糖分解代谢必需的两种酶。因此WN13的染色体修饰消除了其利用D-木糖作为唯一碳源进行生长的能力。作为第二种后果，大肠杆菌WN13可以在xylA启动子的控制下表达D-木糖脱氢酶活性。对大肠杆菌WN13/pWN7.126B的D-1，2，4-丁三醇生物合成在类似于上述发酵罐控制培养条件下进行评价。唯一的改变是在所示的时间点将D-木糖而不是D-木质酸加入到培养基中作为生物合成的原料(图5b)。在培养48h后，大肠杆菌WN13/pWN7.126B以30％的产率从30g的D-木糖合成了6.2g/L的D-1，2，4-丁三醇(图5a)。在菌株WN13/pWN7.126B的培养基中也检测到与菌株WN7/pWN7.126B蓄积的生物合成副产物相同的副产物。在整个培养过程中对D-木糖脱氢酶比活性的分析表明，该酶的表达是由D-木糖诱导的(图5c)。这一结果显示，xdh基因的染色体整合获得了成功。
由于这些发现和重组菌株的构建，增强的1，2，4-丁三醇的生物催化现在有可能成为提供立体选择性、且采用温和的反应条件和该方法的环境良好特性的商业选择。D-1，2，4-丁三醇的生物合成遵循的是围绕特定革兰氏阴性细菌采用的氧化D-木糖分解代谢途径建立的这一人工生物合成途径(图1b)。参见，例如R.Weimberg，J.Biol.Chem.236：629-635(1961)和A.S.Dahms，Biochem.Biophys.Res.Commun.60：1433-1439(1974)。本发明的各种实施方式改善了这一途径和其1，2，4-丁三醇生产水平，包括单宿主细胞可以进行从木糖到1，2，4-丁三醇的合成的实施方式，且在各种实施方式中可以在低盐培养基上进行1，2，4-丁三醇的合成。
先前未报道的大肠杆菌D-木质酸分解代谢途径(图3a)的阐明现在允许在低盐培养基中实现D-1，2，4-丁三醇的生物合成。在大肠杆菌K-12野生型菌株中发现了由yjh和yag基因簇编码的两套分解代谢酶(图3b)。染色体敲除试验显示任一基因簇编码的酶足以使大肠杆菌利用D-木质酸作为唯一碳源进行生长(图4a)，另外，在突变菌株WN5中观察到的极性突变效应(图4)表明编码3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的基因(yjhH和yagE)和编码D-木质酸脱水酶的基因(yjhG和yagF)形成了两个转录操纵子。由两个基因簇编码的分解代谢酶的表达由D-木质酸诱导且受到分解代谢物阻遏的紧密调节。存在编码同一酶活性的两个基因拷贝解释了为什么一次只能有效地使一个基因产生突变的转座子随机诱变试验不能揭示D-木质酸分解代谢途径的结构基因。
编码D-木质酸脱水酶和3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的基因的确认也将有利于下一步对两种酶的动力学和结构研究。我们的初步酶分析显示，由基因yjhH和基因yagE编码的两种醛缩酶可以催化D-和L-3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸异构体的裂解(数据未显示)。因此这两种酶与从硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)分离的2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶一起为催化非立体特异性的醛反应(aldo reaction)的少数醛缩酶的成员。参见，例如A.Theodossis等，The structural basisfor substrate promiscuity in 2-keto-3-deoxygluconate aldolase from theEntner-Doudoroff pathway in Sulfolobus solfataricus，J.Biol.Chem.279：43886-43892(2004)。同样地，这些由基因yjhH和基因yagE编码的醛缩酶可以被有效地灭活或抑制以增加使用L-阿拉伯糖或L-阿糖酸源作为原料的生物合成途径中L-1，2，4-丁三醇的产量。
大肠杆菌直接从D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇也受益于新型细菌D-木糖脱氢酶(Xdh)的发现。除了具有与以前报道的酶相当的催化效率外(表1)，来自真菌伯克霍尔德菌和新月柄杆菌的新型D-木糖脱氢酶还可以在通常使用的大肠杆菌生产菌株中有效地表达为具有催化活性的形式。因此，这两种D-木糖脱氢酶可以在多种常用的细菌生产菌株中用于生产1，2，4-丁三醇或其它需要的产物。
为降低与生物催化制备相关的成本，现在已经从丧失了以D-木糖和D-木质酸作为唯一碳源生长的能力的宿主菌株构建了合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌。结果，大肠杆菌WN13/pWN7.126B在D-葡萄糖上进行培养，D-葡萄糖相对于D-木糖是一种更便宜的原料。生物催化剂仅将D-木糖用于生物合成的目的。除了产生生物合成的目标物(D-1，2，4-丁三醇)和特指的生物合成中间体(3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸)外，还发现大肠杆菌WN13/pWN7.126B合成先前并未报道为常见的细菌代谢物的其它有用分子，包括3-脱氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和D-3，4-二羟基丁酸(图5d)。在本发明的各种实施方式中，一种或多种酶可以受到抑制或灭活以减少或消除这些副产物的形成并因此进一步增加D-1，2，4-丁三醇的生物合成。
尽管如此，副产物中的多个立构中心可以用作化学合成的有价值的手性合成子。大肠杆菌WN13/pWN7.1268的遗传修饰可以潜在地导致新的菌株以将“副产物”作为目标分子合成。D-1，2，4-丁三醇生物合成途径的分子多样性的扩展显示了细菌催化网络的灵活性，这是反映自然的生物合成途径进化的“酶募集(enzyme recruitment)”理论的现象。参见，例如R.A.Jensen，Enzyme recruitment in evolution of newfunction，Ann.Rev.Microbiol.30：409-425(1976)；和S.Schmidt等，Metabolites：a helping handfor pathway evolution？Trends.Biochem.Sci.28：336-341(2003)。外源催化活性(包括D-木糖脱氢酶和2-酮酸脱羧酶)整合到大肠杆菌天然催化网络中导致碳流的重新布线和新型代谢产物的生物合成。
材料和方法
化学物质和培养基。用于发酵的木质酸钾如先前描述的进行制备。参见，W.Niu等，J.Am.Chem.Soc.125：12998-12999(2003)。化学合成的木质酸钾用于酶分析和培养基制备。参见，例如S.Morre &K.P.Link，Carbohydrate characterization：I.The oxidation of aldoses byhypoiodite in methanol；and II.The identification of sevenaldo-monosaccharides as benzimidazole derivatives，J.Biol.Chem.133：293-311(1940)。3-脱氧-D，L-甘油-戊糖酮酸被化学合成。参见，例如A.C.Stoolmiller，DL-and L-2-keto-3-deoxyarabonate-1，2.Methodsin Enzymol.41：101-103(1975)。所有其它的化学物质从商业来源购买。
所有溶液在蒸馏的去离子水中制备。LB培养基(参见，例如J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics(Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，NY，1972))(1L)包含细菌用胰蛋白胨(10g)、细菌用酵母提取物(5g)和NaCl(10g)。M9盐(1L)包含Na2HPO4(6g)、KH2PO4(3g)、NH4Cl(1g)和NaCl(0.5g)。M9基本培养基在1L的M9盐中包含D-葡萄糖(10g)、MgSO4(0.12g)和盐酸硫胺素(0.001g)。M9 D-木质酸培养基在M9低盐中包含D-木质酸钾(10g)而不是D-葡萄糖。M9甘油培养基在M9低盐中包含甘油(10g)而不是D-葡萄糖。在适当的情况下加入抗生素达到如下的终浓度：氨苄青霉素(Ap)，50μg/mL；氯霉素(Cm)，20μg/mL和卡那霉素(Kan)，50μg/mL。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)制备为500mM的原液。M9盐、MgSO4、葡萄糖和甘油的溶液单独地高压灭菌，然后混合。D-木质酸钾、盐酸硫胺素、抗生素和IPTG的溶液通过0.22-μm的滤膜除菌。固体培养基通过向液体培养基加入Difco琼脂到1.5％(w/v)的终浓度而制备。
标准发酵培养基(1L)包含K2HPO4(7.5g)、柠檬酸铁(III)铵(0.3g)、柠檬酸一水合物(2.1g)和浓硫酸(1.2mL)。发酵培养基在高压灭菌前通过加入浓NH4OH调节到pH7.0。下面的补充剂恰在开始发酵前加入：D-葡萄糖、MgSO4(0.24g)和包括(NH4)6(Mo7O24)·4H2O(0.0037g)、ZnSO4·7H2O(0.0029g)、H3BO3(0.0247g)、CuSO4·5H2O(0.0025g)和MnCl2·4H2O(0.0158g)的痕量矿物质。IPTG原液按照需要加入到标示的终浓度。葡萄糖和MgSO4(1M)溶液单独地进行高压灭菌处理。需要的话加入抗沫剂204(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，U.S.)。
核苷酸和氨基酸序列。核苷酸和氨基酸序列显示于表3中。
表3.所列序列的确认
 
SEQ ID NO 确认
SEQ ID NO：1 真菌伯克霍尔德菌LB400木糖脱氢酶的DNA编码序列(基因xdh，RBU11704)                     
SEQ ID NO：2 真菌伯克霍尔德菌LB400木糖脱氢酶的氨基酸序列(Xdh)                                      
SEQ ID NO：3 新月柄杆菌CB15木糖脱氢酶的DNA编码序列(基因xdh，RCO01012)                             
SEQ ID NO：4 新月柄杆菌CB15木糖脱氢酶的氨基酸序列(Xdh)
SEQ ID NO：5 大肠杆菌木质酸脱水酶的DNA编码序列(基因yjhG)
SEQ ID NO：6 大肠杆菌木质酸脱水酶的氨基酸序列(YjhG)
SEQ ID NO：7 大肠杆菌木质酸脱水酶的DNA编码序列(基因yagF)
SEQ ID NO：8 大肠杆菌木质酸脱水酶的氨基酸序列(YagF)
SEQ ID NO：9 莓实假单胞菌(ATCC4973)木质酸脱水酶片段的DNA编码序列                             
SEQ ID NO：10 莓实假单胞菌(ATCC4973)木质酸脱水酶片段的氨基酸序列                                      
SEQ ID NO：11 大肠杆菌3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的DNA编码序列(基因yjhH)                           
SEQ ID NO：12 大肠杆菌3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的氨基酸序列(YjhH)                                  
SEQ ID NO：13 大肠杆菌3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的DNA编码序列(基因yagE)                           
SEQ ID NO：14 大肠杆菌3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的氨基酸序列(YagE)                                  
SEQ ID NO：15 真菌伯克霍尔德菌LB400xdh基因的正向引物
SEQ ID NO：16 真菌伯克霍尔德菌LB400xdh基因的反向引物
SEQ ID NO：17 新月柄杆菌CB15xdh基因的正向引物
SEQ ID NO：18 新月柄杆菌CB15xdh基因的反向引物
 
SEQ ID NO：19 大肠杆菌W3110D-木质酸脱水酶基因(yjhG)的正向引物                                       
SEQ ID NO；20 大肠杆菌W3110D-木质酸脱水酶基因(yjhG)的反向引物                                       
SEQ ID NO：21 大肠杆菌W3110D-木质酸脱水酶基因(yagF)的正向引物                                   
SEQ ID NO：22 大肠杆菌W3110D-木质酸脱水酶基因(yagF)的反向引物                                   
SEQ ID NO：23 大肠杆菌W31103-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的正向引物                         
SEQ ID NO：24 大肠杆菌W31103-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的反向引物                         
SEQ ID NO：25 大肠杆菌W31103-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的正向引物                         
SEQ ID NO：26 大肠杆菌W31103-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的反向引物                         
SEQ ID NO：27 用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15D-木糖脱氢酶基因的正向引物                   
SEQ ID NO：28 用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15D-木糖脱氢酶基因的反向引物                   
SEQ ID NO：29 莓实假单胞菌木质酸脱水酶基因的正向引物
SEQ ID NO：30 莓实假单胞菌木质酸脱水酶基因的反向引物
SEQ ID NO：31 用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的正向引物         
SEQ ID NO：32 用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的反向引物         
SEQ ID NO：33 用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的正向引物         
SEQ ID NO：34 用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸
 
醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的反向引物
SEQ ID NO：35 用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的正向引物                           
SEQ ID NO：36 用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的反向引物                           
SEQ ID NO：37 大肠杆菌醇脱氢酶的DNA编码序列(基因adhP)
SEQ ID NO：38 大肠杆菌醇脱氢酶的氨基酸序列(AdhP)
SEQ ID NO：39 大肠杆菌2-酮酸脱氢酶的DNA编码序列(基因yiaE)
SEQ ID NO：40 大肠杆菌2-酮酸脱氢酶的氨基酸序列(YiaE)
SEQ ID NO：41 大肠杆菌2-酮酸脱氢酶的DNA编码序列(基因ycdW)
SEQ ID NO：42 大肠杆菌2-酮酸脱氢酶的氨基酸序列(YcdW)
SEQ ID NO：43 恶臭假单胞菌2-酮酸脱羧酶的DNA编码序列(基因mdlC)                                      
SEQ ID NO：44 恶臭假单胞菌2-酮酸脱羧酶的氨基酸序列(MdlC)
注意到在SEQ ID NO：11中，nt1-3显示为推定的启动密码子，而nt55-57显示为替代的启动密码子，使得nt55-960成为替代的YjhH3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶肽的编码序列。类似地，在SEQ ID NO：12中，Met(1)是推定的启动Met，且Met(19)是替代的启动Met，使得Met(19)-Val(319)成为替代的YjhH3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶肽。
细菌菌株和质粒。大肠杆菌K-12菌株W3110得自大肠杆菌遗传保藏中心(E.coli Genetic Stock Center)(Yale University，New Haven，CT，U.S.)。质粒的构建在得自Life Technologies Inc.(Rockville，MD，U.S.)的大肠杆菌DH5α中进行。莓实假单胞菌(ATCC 4973)和新月柄杆菌(ATCC 19089)得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，U.S.)。真菌伯克霍尔德菌LB400以登录号NRRL B-18064得自ARS专利培养物保藏中心(ARS Patent Culture Collection)(United StatesDepartment of Agriculture，Peoria，IL，U.S.)。质粒pJF118EH(参见，例如J.P.Furste等，Molecular cloning of the plasmid Rp4 primase region ina multi-host-range tacP expression vector，Gene 48：119-131(1986))由密执安州立大学的M.Bagdasarian教授惠赠。同源重组采用质粒pKD3、pKD4、pKD46和pCP20(参见，K.A.Datsenko & B.L.Wanner，One stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))，这些质粒得自大肠杆菌遗传保藏中心。质粒pCRTOP02.1购自Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA，U.S.)。质粒pQE30购自QIAGEN，Inc.。这里使用的所有菌株和质粒总结于表2中。
一般分子生物学和质粒构建。标准方案用于质粒DNA的构建、纯化和分析。参见，J.Sambrook & D.W.Russell，Molecular Cloning，aLaboratory Manual(第三版，2001)(Cold Spring Harbor Lab.Press，Cold Spring Harbor，NY)。大肠杆菌基因组DNA按照D.G.Pitcher等，＂Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiumthiocyanate，＂Lett.Appl.Microbiol.8：151-56(1989)中描述的过程分离。其它细菌菌株基因组DNA的分离采用K.Wilson，＂Preparation ofgenomic DNA from bacteria，＂in Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑)2.4.1-2.4.5(1987)(Wiley，NY)中先前建立的方法。Fast-LinkTM DNA连接试剂盒购自EPICENTRE Biotechnologies。DNA聚合酶I(Klenow片段)和小牛肠碱性磷酸酶购自InvitrogenCorp.。PCR扩增按照Sambrook & Russell(2001)中所述的方法进行。
Figure A200780032753D00661
 DNA聚合酶购自Stratagene Corp.(LaJolla，CA，U.S.)。引物由密执安州立大学(East Lansing，MI，U.S.)的大分子结构小组合成。DNA测序服务由密执安州立大学的基因组技术支持小组提供。
来自真菌伯克霍尔德菌LB400的xdh基因使用具有下划线的BamHI限制性酶切位点的正向和反向引物由自希望的菌株分离的基因组DNA扩增：5'-CGGGATCCATGTATTTGTTGTCATACCC(SEQIDNO：15)和5’-CGGGATCCATATCGACGAAATAAACCG(SEQ IDNO：16)。所得到的DNA用BamHI消化，然后连接到pJG7.246的BamHI位点中而得到质粒pWN9.044A。质粒pWN9.046A包含编码新月柄杆菌CB15D-木糖脱氢酶的基因。该质粒采用与pWN9.044A相同的策略构建。下面的引物用于扩增来自新月柄杆菌CB15基因组DNA的xdh基因：5’-GCGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCC(SEQ IDNO：17)和5’-GCGGATCCGATGACAGTTTTCTTAGGTC(SEQ IDNO：18)。
大肠杆菌基因由自菌株W3110分离的基因组DNA扩增。下面的引物用于扩增基因yjhG(EcoRI和HindIII限制性酶切位点以下划线表示)：5′-CGGAATTCATGTCTGTTCGCAATATT(SEQ ID NO：19)和5′-GCAAGCTTAATTCAGGTGTCTGGATG(SEQ ID NO：20)。基因yagF利用下面的引物进行扩增(EcoRI和HindIII限制性酶切位点以下划线表示)：5′-CGGAATTCGATGACCATTGAGAAAAT(SEQ IDNO：21)和5′-GCAAGCTTCAACGATATATCTCAACT(SEQ IDNO：22)。yjhG和yagF PCR片段定位于pJF118EH的EcoRI和HindIII位点之间分别产生质粒pWN7.270A和pWN7.272A。下面的引物用于扩增基因yjhH(EcoRI和BamHI限制性酶切位点以下划线表示)：5′-CGGAATTCATGGGCTGGGATACAGAAAC(SEQ ID NO：23)和5′-GCGGATCCTCAGACTGGTAAAATGCCCT(SEQ ID NO：24)。基因yagE利用下面的引物进行扩增(EcoRI和BamHI限制性酶切位点以下划线表示)：5′-CGGAATTCATGATTCAGCAAGGAGATC(SEQ IDNO：25)和5′-TAGGATCCTTATCGTCCGGCTCAGCAA(SEQ IDNO：26)。yjhH和yagE PCR片段定位于pJF118EH的EcoRI和BamHI位点之间分别产生质粒pWN8.022A和pWN8.020A。
质粒pWN7.126B源自质粒pWN5.238A。参见，W.Niu等，J.Am.Chem.Soc.125：12998-12999(2003)。通过SmaI消化从质粒pRC1.55B释放含有serA基因的1.6-kb DNA片段。serA基因座与ScaI消化的pWN5.238A连接产生质粒pWN7.126B。为产生大肠杆菌WN13的目的构建了质粒pWN9.068A。来自新月柄杆菌CB15的xdh基因利用下面具有下划线的SphI限制性酶切位点的引物扩增：5'-GCGCATGCATGTCCTCAGCCATCTATCC(SEQ ID NO：27)和5’-GCGCATGCGATGACAGTTTTCTTAGGTC(SEQ ID NO：28)。得到的PCR片段插入到质粒pKD3的SphI位点中产生pWN9.068A。
一般酶学。细胞通过在4℃下以4000g的离心进行收集。收获的细胞重悬于适宜的缓冲液中并随后用弗氏破碎仪(French press)(16,000psi或大约110.3MPa)通过两个操作过程进行破碎。细胞碎片通过以48000g离心20分钟而除去。蛋白质浓度采用Bradford染料结合方法测定。参见，M.M.Bradford，＂A rapid and sensitive method for thequantification of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding，＂Anal.Biochem.72：248(1976)。蛋白质分析溶液购自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA，U.S.)。蛋白质浓度通过与用牛血清白蛋白制得的标准曲线进行对比而确定。
D-木质酸脱水酶活性按照先前描述的方法进行分析。参见，A.S.Dahms & A.Donald，＂D-xylo-Aldonate dehydratase，＂Methods inEnzymol.90：302-305(1982)。在反应过程中形成的2-酮酸以其缩氨基脲衍生物形式进行定量。重悬缓冲液含有Tris-HCl(50mM，pH 8.0)和MgCl2(10mM)。制备了两种溶液并分别在30℃孵育3分钟。第一种溶液(150μL)含有Tris-HCl(50mM，pH 8.0)、MgCl2(10mM)和适当量的细胞溶解产物。第二种溶液(25μL)含有D-木质酸钾(0.1M)。在两种溶液混合(时间＝0)后，按时间间隔取出等分试样(30μL)并与在水中含有1％(w/v)盐酸氨基脲和0.9％(w/v)乙酸钠的氨基脲试剂(200μL)混合。在30℃孵育15分钟后，各样品用H2O稀释到1mL。沉淀的蛋白质通过微离心(microfugation)除去。在250nm测量缩氨基脲的吸光度。一个单位的D-木质酸脱水酶活性被定义为在30℃每分钟形成1μmol的2-酮酸。10200M-1cm-1的摩尔消光系统(250nm)用于2-酮酸缩氨基脲衍生物。
D-木糖脱氢酶采用先前描述的改良方法进行分析。参见，A.S.Dahms & J.Russo，＂D-Xylose dehydrogenase，＂Methods in Enzymol.89(Pt.D)：226-28(1982)。重悬缓冲液含有Tris-HCl(100mM，pH 8.3)。酶反应液(1mL)含有Tris-HCl(100mM，pH 8.3)、NAD+(2.5mM)、D-木糖(10mM)和适当量的酶。酶活性通过在340nm监测NADH的形成而用分光光度法进行测量。一个单位的D-木糖脱氢酶被定义为在33℃每分钟形成1μmol的NADH(ε＝6220M-1cm-1)。
3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性按照先前描述的改良偶联分析进行测量。参见，A.S.Dahms & A.Donald，＂2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase(3-deoxy-D-pentulosonic acidaldolase)，＂Methods in Enzymol.90(Pt.E)：269-72(1982)。在2-酮酸裂解时释放的丙酮酸在乳酸脱氢酶催化的反应中进行监测。重悬缓冲液含有HEPES(100mM，pH 7.8)。分析溶液(1mL)含有HEPES(100mM，pH7.8)、NADH(2mM)、乳酸脱氢酶(25U)、3-脱氧-D，L-甘油-戊酮糖酸(5mM)和适当量的酶。由无细胞溶胞产物中的NADH氧化酶活性和可能的内源性丙酮酸引起的NADH背景消耗通过对照试验进行校正。一个单位的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶活性被定义为在室温下每分钟形成1μmol的NAD+(ε＝6220M-1cm-1)。
莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶的部分基因序列的分离。用于蛋白质纯化的莓实假单胞菌培养使用包含KH2PO4(4.5g)、Na2HPO4(4.7g)、NH4Cl(1g)、CaCl2(0.01g)、柠檬酸铁铵(0.1g)、MgSO4(0.25g)和玉米浆(0.1g)的液体培养基(1L)。参见，例如R.Weimberg，J.Biol.Chem.236：629-635(1961)。接种菌的生长通过将莓实假单胞菌单菌落从营养琼脂培养板引入到包含D-木糖(0.25g)的100mL液体培养基中开始。细胞在30℃搅拌条件下培养24h。将所得到的细胞培养物转移到包含具有10g D-木糖的1L液体培养基的2L发酵容器中。在30℃、pH6.5条件下以650rpm的搅拌速度进行48h的发酵罐控制培养。细胞通过在4℃以8000g离心10分钟而收获。
用于纯化来自莓实假单胞菌的D-木质酸脱水酶的缓冲液包括缓冲液A：Tris-HCl(50mM，pH 8.0)、MgCl2(2.5mM)、二硫苏糖醇(DTT)(1.0mM)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(0.25mM)；缓冲液B：Tris-HCl(50mM，pH 8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM)、NaCl(500mM)；缓冲液C：磷酸钾(2.5mM，pH 8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM)；缓冲液D：磷酸钾(250mM，pH 8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM)；缓冲液E：Tris-HCl(50mM，pH 8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM)、(NH4)2SO4(1M)。
所有蛋白质纯化操作在4℃完成。在纯化过程中监测D-木质酸脱水酶比活性。将莓实假单胞菌细胞(150g，湿重)重悬于250mL缓冲液A中并用弗氏破碎仪在16,000psi(大约110.3MPa)压力下通过两次操作过程进行破碎。细胞碎片通过离心(48000g，20分钟，4℃)除去。将细胞溶解产物加到用缓冲液A平衡的DEAE柱(5 x 18cm，装填二乙氨乙基琼脂糖树脂粒)上。该柱用1L缓冲液A清洗，随后用线性梯度(1.75L+1.75L，缓冲液A/缓冲液B)洗脱。合并包含D-木质酸脱水酶的部份并浓缩到100mL。在对缓冲液C(3 x 1L)进行透析后，将蛋白质加载到用缓冲液C平衡的羟磷灰石柱(2.5 x 35cm)上。该柱用350mL的缓冲液C清洗并用线性梯度(850mL+850mL，缓冲液C/缓冲液D)洗脱。
合并含有D-木质酸脱水酶的部份并浓缩到30mL。在对缓冲液E(3 x 300mL)进行透析后，将蛋白质溶液加到用缓冲液E平衡的苯基琼脂糖凝胶柱(2.5 x 15cm)上。该柱用200mL的缓冲液E清洗，随后用线性梯度(400mL+400mL，缓冲液E/缓冲液A)洗脱。合并含有D-木质酸脱水酶的部份并浓缩到15mL。在对缓冲液A(3 x 150mL)进行透析后，将蛋白质样品(15 x 0.1mL)加载到用缓冲液A平衡的Resource Q柱(6.4mm x 30mm，1mL)(得自Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，U.S.)上。该柱用25mL的缓冲液A和缓冲液B的90：10(v/v)混合物清洗，并用20倍柱体积的缓冲液A中的线性梯度NaCl(50mM至200mM)洗脱。合并含有D-木质酸脱水酶的部份并浓缩到0.5mL。在对缓冲液A(3 x 10mL)进行透析后，酶在液氮中速冻并储存在大约-80℃。
纯化D-木质酸脱水酶的胰蛋白酶消化、消化产物的HPLC纯化和N-末端肽测序由密执安州立大学的大分子结构小组完成。编码部分莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶的DNA片段使用下面的引物由莓实假单胞菌的基因组DNA进行扩增：5′-CTGGARGAYTGGCARCGYGT(SEQ ID NO：29)和5′-GTRTARTCYTCRGGRCCYTC(SEQ IDNO：30)。PCR产物按照制造商的说明(Invitrogen Corp.)克隆到pCRTOPO2.1载体中。插入体的DNA序列使用M13正向和M13反向引物确定。
N-末端6xHis-标记的D-木糖脱氢酶的纯化和鉴定。将大肠杆菌DH5α/pWN9.044A和DH5α/pWN9.046A的单菌落分别接种在5mL的含Ap的LB培养基中。接种菌在37℃搅拌条件下培养过夜。细胞随后转移到500mL的含Ap的LB培养基中并在37℃搅拌条件下生长。当接种菌的OD600达到0.4-0.6时，细胞培养物在冰上保持10分钟。然后将IPTG溶液加入到培养基中达到0.5mM的终浓度。细胞在30℃培养另外的12h，然后通过在4℃以4000g离心5分钟收获细胞。将收获的细胞重悬在含有Tris-HCl(100mM，pH 8.0)的重悬缓冲液中。如一般酶学部分中描述的那样获得无细胞的溶胞产物。6xHis-标记的D-木糖脱氢酶的纯化使用Ni-NTA树脂按照生产商(Qiagen)提供的方案进行。
无细胞的溶胞产物(16mL)与4mL的Ni-NTA琼脂糖树脂(50％浆(w/v))混合，且混合物在4℃搅拌1小时。然后将溶胞产物树脂浆转移到聚丙烯柱上，且该柱用含有Tris-HCl(100mM，pH 8.0)、咪唑(20mM)和NaCl(300mM)的清洗缓冲液(2 x 16mL)清洗。6xHis-标记的蛋白质通过用含有Tris-HCl(100mM，pH 8.0)、咪唑(250mM)和NaCl(300mM)的洗脱缓冲液(2 x 4mL)清洗而从柱上洗脱。洗脱的蛋白质溶液对细胞重悬缓冲液进行透析以除去咪唑和NaCl。蛋白质样品使用SDS-PAGE进行分析。
D-木糖脱氢酶的pH依赖性使用下面的缓冲液中的一种在33℃下在pH4.4和pH9.0之间测量：乙酸盐(100mM，pH 4.4-5.6)、bis-Tris(100mM，pH 5.6-7.5)或Tris-HCl(100mM，pH 7.5-9.0)。酶的底物特异性在含有NAD+(2.5mM)和碳水化合物(50mM)的Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.3)中在33℃进行测试。D-木糖脱氢酶的Km和kcat值通过使用非线性回归算法(Prism 4，GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA，U.S.)分析试验数据而获得。
大肠杆菌的随机诱变。大肠杆菌菌株W3110的体外转座子诱变利用EZ::TNTM<R6Kyori/KAN-2>Tnp Transposome试剂盒(Epicentre)按照生产商提供的方案进行。EZ:TNTM<R6Kyori/KAN-2>transposon-EZ:TNTM转座酶复合体通过电穿孔引入到感受态(electrocompetent)大肠杆菌W3110中。
将电穿孔的细胞接种在含有卡那霉素的LB培养板上以选择具有插入到染色体中的转座子的突变体。在这些选择培养板上生长的菌落进一步划线作为饼板(pie plate)。对来自这些饼板的单菌落进行表型分析。从具有需要的表型的W3110分离的基因组DNA使用EcoRI或BamHI消化。内含EZ::TNTM<R6Kyori/KAN-2>转座子的染色体区域通过用消化的基因组DNA的自连接混合物电穿孔大肠杆菌TRANSFORMAX EC100D pir+感受态细胞(Epicentre)援救。侧邻转座子元件的基因组DNA的核苷酸序列通过对从含有卡那霉素的LB培养板上回收的转化株分离的质粒进行测序而确定。DNA测序试验利用生产商(Epicentre)提供的引物。
yjhH和yagE基因的位点特异性诱变。大肠杆菌W3110中yjhH和yagE基因的破坏利用先前描述的染色体修饰方法。参见，K.A.Datsenko & B.L.Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000)。在这一方法中，包含编码噬菌体λ红色同源重组机构的质粒的大肠杆菌菌株，通过使用与目标基因同源的引物和携带FLP识别靶(FRT)位点侧邻的抗生素抗性基因的模板质粒扩增的线性DNA片段转化。用于破坏yjhH基因的DNA片段使用下面的引物从模板pKD3扩增：5′-GTTGCCGACTTCCTGATTAATAAAGGGGTCGACGGGCTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO：31)和5′-AACTGTGTTGATCATCGTACGCAAGTGACCAACGCTGTCGCATATGAATATCCTCCTTAGT(SEQ ID NO：32)。用于破坏yagE基因的DNA片段使用下面的引物从模板pKD4扩增：5′-CCGGGAAACCATCGAACTCAGCCAGCACGCGCAGCACATATGAATATCCTCCTTAGT(SEQ ID NO：33)和5′-GGATGGGCACCTTTGACGGTATGGATCATGCTGCGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO：34)。PCR片段用DpnI消化并通过电泳纯化。纯化的DNA片段通过电穿孔分别引入到大肠杆菌W3110/pKD46中。在染色体上含有yjhH::CmR的候选大肠杆菌WN3在含有氯霉素的LB培养板上选择。在染色体上含有yagE::KanR的候选大肠杆菌WN4在含有卡那霉素的LB培养板上选择。候选菌株的正确基因型使用PCR进行验证。大肠杆菌WN5通过yagE::KanR经P1噬菌体介导转导(参见J.H.Miller，同上)到WN3的基因组中而产生。从大肠杆菌WN5的染色体中除去抗生素抗性基因按照先前描述的方法进行。参见，K.A.Datsenko & B.L.Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6640-6645(2000)。所获得的菌株命名为WN6。
合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌宿主菌株的构建。大肠杆菌W3110serA和WN7按照先前描述的方法(K.Li等.，Biotechnol.Bioeng.64：61-73(1999))分别从菌株W3110和WN6产生。大肠杆菌W3110xylAB::Xdh-CmR按照与菌株WN3和WN4的构建相同的过程构建。用于染色体置换的DNA片段使用下面的引物从质粒pWN9.068A扩增：5′-TACGACATCATCCATCACCCGCGGCATTACCTGATTATGTCCTCAGCCATCTATCCC(SEQ ID NO：35)和5′-CAGAAGTTGCTGATAGAGGCGACGGAACGTTTCTCATATGAATATCCTCCTTAGT(SEQ ID NO：36)。候选菌株W3110xylAB::Xdh-CmR在含有氯霉素的LB培养板上选择。大肠杆菌WN13通过xylAB::Xdh-CmR经P1噬菌体介导转导(参见J.H.Miller，同上)到WN7的基因组中而产生。
发酵罐控制培养条件。发酵采用2.0L工作容量的B.Braun M2培养容器。通过DCU-3控制的B.Braun Biostat MD提供功能。数据收集采用装有B.Braun MFCS/Win软件(v1.1)的Dell Optiplex Gs+5166M个人计算机(PC)。温度、pH和葡萄糖进料用PID控制回路控制。所有发酵维持33℃的温度。pH通过加入浓NH4OH或2N H2SO4而维持在7.0。溶解氧(D.O.)使用配备Ingold A型O2渗透膜的Mettler-Toledo 12mm可消毒式O2传感器测量。D.O.维持在10％空气饱和度。发酵培养基中的初始葡萄糖浓度为23.5g/L。
接种从琼脂培养板挑取的单菌落引入5mL的M9培养基中开始。培养物在37℃和250rpm搅拌条件下生长直到它们变混浊(大约24h)，随后转移到100mL的M9培养基中。培养物在37℃和250rpm下生长另外的10h。然后将接种菌(OD600＝1.0-3.0)转移到发酵容器中并开始批发酵(t＝0h)。
在发酵过程中下使用三阶段方法将D.O.浓度维持在10％空气饱和度。使用初始设置为0.06L/L/min的空气流，通过将搅拌速度从50rpm的初始设置点增加到预设的最大值940rpm维持D.O.浓度。使搅拌速度恒定在940rpm，然后质量流控制器通过将空气流速从0.06L/L/min增加到预设的最大值1.0L/L/min来维持D.O.浓度。在恒定的搅拌速度和恒定的空气流速下，D.O.浓度最终通过氧传感器控制的葡萄糖进料在剩下的发酵中保持在10％空气饱和度。在该阶段开始时，由于培养基中残留的初始葡萄糖导致D.O.浓度落在10％空气饱和度以下。这一过程在葡萄糖(65％w/v)进料开始以前持续大约10分钟至30分钟。葡萄糖进料PID控制参数对于微分控制(TD)设置为0.0s(关闭)，对于积分控制(TI)设置为999.9s(最小控制作用)。XP设置为950％以获得0.1的KC。IPTG原液(1.0mL)在18h加入到发酵培养基中。D-木糖或D-木质酸钾的溶液在24h、30h、36h和42h加入到发酵培养基中。
按照所示的时间间隔采集发酵液的样品(5-10mL)。通过用水稀释发酵液(1:100)随后测量OD600测定细胞密度。使用0.43g/L/OD600的转换系数计算大肠杆菌细胞的干细胞重量(g/L)。剩余的发酵液进行离心以获得无细胞发酵液。细胞团用于酶分析。
代谢物鉴定。对于1，2，4-丁三醇的生物合成，1，2，4-丁三醇在无细胞发酵液中的浓度按照W.Niu等，J.Am.Chem.Soc.125：12998-12999(2003)的方法通过GC分析进行定量。无细胞发酵液中其它分子的浓度通过1H NMR进行定量。将溶液减压浓缩至干，再一次由D2O减压浓缩至干，然后重新溶解于含已知浓度的3-(三甲硅烷基)-丙-2，2，3，3-d4酸钠盐(TSP，Lancaster Synthesis Inc.)的D2O中。所有1H NMR谱在Varian VXR-500FT-NMR能谱仪(500MHz)上记录。化合物通过使用以下共振的1H NMR进行定量：o-木质酸(δ 4.08，d，1H)；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸(δ 4.58，m，1H)。
为鉴别发酵培养基中的生物合成副产物，首先将无细胞的发酵液加到Dowex-I X4树脂(Cl-型)上。在用三倍柱体积的水清洗之后，柱子用十倍柱体积的0.1M HCl洗脱。合并流过和清洗的部份并进一步加到Dowex-50 X8树脂(H+型)上。在用三倍柱体积的水清洗之后，柱子用十倍柱体积的1M HCl洗脱。对纯化获得的部份进行中和并用1HNMR进行分析。通过将纯化样品的1H NMR谱与基准试样的1H NMR谱进行对比完成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸和D-3，4-二羟基丁酸的鉴别。为鉴别其它分子，采用以下的NMR数据：3-脱氧-D-甘油-戊酸，1HNMR(D2O，500MHz，TSP，δ＝0ppm)，δ 4.12(dd，J＝4，8Hz，1H)，3.91(m，1H)，3.67(dd，J＝3，12Hz，1H)，3.54(dd，J＝6，12Hz，1H)，1.94(ddd，J＝1，4，14Hz，1H)，1.76(ddd，J＝1，8，15Hz，1H)；(4S)2-氨基-4，5-二羟基戊酸，1H NMR(D2O，500MHz，TSP，δ＝0ppm)，δ 4.01(dd，J＝5，6Hz，1H)，3.89(m，1H)，3.64(dd，J＝4，12Hz，1H)，3.55(dd，J＝6，12Hz，1H)，2.04(dd，J＝5，7Hz，2H)。
宿主细胞醇脱氢酶活性的鉴定。进行筛选候选的大肠杆菌醇脱氢酶的尝试以确认哪一个具有将3，4-二羟基-D-丁醛还原成D-1，2，4-丁三醇的最高活性(表4)。这些尝试导致AdhP(例如，SEQ ID NO：38，由SEQ ID NO：37编码)的鉴别。
表4.用于还原3，4-二羟基-D-丁醛的大肠杆菌脱氢酶的筛选
Figure A200780032753D00761
为进一步鉴定AdhP的作用，例如确定是否它是在合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌构建体中负责3，4-二羟基-D-丁醛还原的唯一脱氢酶，删除KIT10中的adhP基因(表5)并评价这一删除对D-1，2，4-丁三醇生物合成的影响(表6)。表5中下划线表示宿主细胞基因型的变化。
表5.用于评价adhP灭活和D-1，2，4-丁三醇生物合成的菌株
 
构建体 基因型
WN13/pWN7.126B 大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-CmR/serA，lacIOPtacmdlC
WN10/pWN7.126B 大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-CmR Δ adhP/serA，lacIOPtacmdlC
表6.adhP灭活对D-1，2，4-丁三醇生物合成的影响
Figure A200780032753D00762
这些测试表明，在删除adhP后D-1，2，4-丁三醇的形成减少(表6)且3，4-二羟基-D-丁酸与D-1，2，4-丁三醇的比值增大(表6)。这些试验确认，在合成D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌构建体中adhP很可能在3，4-二羟基-D-丁醛的还原中发挥作用，但adhP不是唯一参与这一还原反应的脱氢酶，因为其它酶表现出较低水平的相同活性。
AdhP醇脱氢酶过度表达的效应。为了验证是否AdhP过度表达可以降低3，4-二羟基-D-丁酸的量并增加D-1，2，4-丁三醇的量，使用Ptac启动子之后的adhP的质粒定位表达(大肠杆菌WN13/pML6.195，表7)或者Pxyl启动子之后adhP的染色体组插入(大肠杆菌KIT4/pWN7.126B，表7)进行分析。按照图7中图示的方案进行基因组插入。表7中的下划线显示宿主细胞基因型的改变。
表7.用于评价adhP过度表达和D-1，2，4-丁三醇生物合成的菌株
 
构建体 基因型
WN13/pWN7.126B       大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-CmR/serA，lacIOPtacmdlC
KIT10/pWN7.126B        大肠杆菌W3110serA Δ yjhH Δ yagExylAB::xdh-CmR Δ adhP/serA，lacIOPtacmdlC                           
WN13/pML6.195          大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-CmR/serA，lacIOPtacmdlCP tac adhP
KIT4/pWN7.126B         大肠杆菌W3110serA Δ yjhH Δ yagExylAB::xdhΔ adhP-P tac /serA，lacIOPtacmdlC                  
结果示于表8中。这些结果表明基因组插入是最成功的策略(表8)。
表8.adhP过度表达对D-1，2，4-丁三醇生物合成的影响
Figure A200780032753D00771
在新型丁三醇生物合成途径中灭活竞争关键中间体的酶的效果。推测中间体3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸还原成副产物3-脱氧-D-甘油-戊酸是造成通过本发明的新途径合成的D-1，2，4-丁三醇产率和浓度降低的原因。参见图5d中的反应(e)。两种2-酮酸脱氢酶，YiaE(SEQ IDNO：40，由SEQ ID NO：39编码)和YcdW(SEQ ID NO：42，由SEQ IDNO：41编码)，已经确认为催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的这一还原。为确定是否可以获得丁三醇产率的提高，进行了yiaE和ycdW的基因组灭活(大肠杆菌KIT18/pWN7.126B，表9)。
表9.用于评价yiaE和ycdW敲除对D-1，2，4-丁三醇生物合成的影响的菌株
 
构建体 基因型
WN13/pWN7.126B 大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-CmR/serA，lacIOPtacmdlC
KIT18/pWN7.126B 大肠杆菌W3110serA Δ yjhH ΔyagExylAB::xdh-adhP-P tac Δ yiaE Δ ycdW/serA，lacIO P tacmdlC            
通过监测副产物形成确定从D-木糖生物合成D-1，2，4-丁三醇(表10)。
Figure A200780032753D00791
这一数据显示，基因灭活降低了副产物3-脱氧-D-甘油-戊酸的浓度并提高了生物合成的D-1，2，4-丁三醇的浓度和产率。也观察到大肠杆菌KIT18/pWN7.126B比大肠杆菌WN13/pWN7.126B继续生长更长的一段时间。这允许加入和消耗较大量的D-木糖(50g对30g，表10)，其导致D-1，2，4-丁三醇浓度的显著的提高。增加加入到大肠杆菌KIT18/pWN7.126B培养物中的D-木糖的量也导致生物合成的D-1，2，4-丁三醇相对于3，4-二羟基-D-丁酸的比值显著提高(表10)。
总之，这些结果显示通过本发明的新途径的丁三醇生物合成通过添加利用3，4-二羟基-D-丁醛的醇脱氢酶的第二拷贝，优选第二基因组拷贝或多个拷贝，如adhP(或adhE或yiaY)，而得到提高。另外，这些结果显示，2-酮酸脱氢酶活性的灭活，例如通过灭活yiaE和ycdW，独立地提高了丁三醇产量。当进行组合时，这两种增加的因素在由D-木糖生物合成的D-1，2，4-丁三醇浓度上提供了令人惊异的80％的增加。
序列表的自由文字
真菌伯克霍尔德菌LB400 RBU11704木糖脱氢酶的编码序列
新月柄杆菌CB15 RCO01012木糖脱氢酶的编码序列
大肠杆菌yjhG木质酸脱水酶的编码序列
大肠杆菌yagF木质酸脱水酶的编码序列
莓实假单胞菌ATCC 4973木质酸脱水酶片段的编码序列
n为a、c、g或t
大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码序列
推定的起始密码子
替代的起始密码子
大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽的替代编码序列
推定的起始子Met
大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽
替代的大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽
替代的起始子Met
大肠杆菌yagE 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码序列
真菌伯克霍尔德菌LB400 D-木糖脱氢酶基因(RBU11704)的正向扩增引物
真菌伯克霍尔德菌LB400 D-木糖脱氢酶基因(RBU11704)的反向扩增引物
新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因(RCO01012)的正向扩增引物
新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因(RCO01012)的反向扩增引物
大肠杆菌W3110 D-木质酸脱水酶基因(yjhG)的正向扩增引物
大肠杆菌W3110 D-木质酸脱水酶基因(yjhG)的反向扩增引物
大肠杆菌W3110 D-木质酸脱水酶基因(yagF)的正向扩增引物
大肠杆菌W3110 D-木质酸脱水酶基因(yagF)的反向扩增引物
大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的正向扩增引物
大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的反向扩增引物
大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的正向扩增引物
大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的反向扩增引物
用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因的正向扩增引物
用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因的反向扩增引物
莓实假单胞菌木质酸脱水酶基因的正向扩增引物
莓实假单胞菌木质酸脱水酶基因的反向扩增引物
用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的正向扩增引物
用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的反向扩增引物
用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的正向扩增引物
用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的反向扩增引物
用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的正向扩增引物
用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的反向扩增引物
来自GenBank U00096的大肠杆菌AdhP醇脱氢酶的编码序列
IUBM EC 1.1.1.1的AdhP 1-丙醇优先的、含两个锌离子的醇脱氢酶(GenBank登录号AAC74551)
H24-V131构成属于PfamA登录号PF08240的醇脱氢酶GroES样域
与催化锌离子结合的保守Cys
G57-V71构成划分在共有模式为“G-H-E-x-{EL}-G-(AP)-x(4)-[GA]-x(2)-[IVSAC]”的ProSite登录号PS00059下的含锌醇脱氢酶特征域(signature domain)
与催化锌离子结合的保守His
与第二锌离子结合的保守Cys
与第二锌离子结合的保守Cys
与第二锌离子结合的保守Cys
与第二锌离子结合的保守Cys
与催化锌离子结合的保守Cys
P161-E299构成属于PfamA登录号PF00107的锌结合醇脱氢酶域
G172-L260构成属于“SAM(及某些其它核苷酸)结合基序”的ProSite登录号PS50193的核苷酸结合基序
来自GenBank AE005174的大肠杆菌yiaE 2-酮酸脱氢酶的编码序列
YiaE 2-酮酸脱氢酶(GenBank登录号AAG58702)
来自GenBank AP009048的大肠杆菌ycdW 2-酮酸脱氢酶的编码序列
YcdW 2-酮酸脱氢酶(GenBank登录号BAA35814)
来自GenBank AY143338的恶臭假单胞菌mdlC 2-酮酸脱羧酶的编码序列
MdlC 2-酮酸脱羧酶(GenBank登录号AAC15502)
序列表
<110>MSU
     Frost，John W.
     Niu，Wei
<120>D-1，2，4-丁三醇的微生物合成
<130>6550-000146/PS1
<150>US 60/831,964
<151>2006-07-19
<160>44
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>807
<212>DNA
<213>真菌伯克霍尔德菌LB400
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(807)
<223>真菌伯克霍尔德菌LB400 RBU11704木糖脱氢酶的编码序列
<400>1
Figure A200780032753D00851
<210>2
<211>268
<212>PRT
<213>真菌伯克霍尔德菌LB400
<400>2
Figure A200780032753D00852
Figure A200780032753D00861
<210>3
<211>747
<212>DNA
<213>新月柄杆菌CB15
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<223>新月柄杆菌CB15 RCO01012木糖脱氢酶的编码序列
<400>3
Figure A200780032753D00871
Figure A200780032753D00881
<210>4
<211>248
<212>PRT
<213>新月柄杆菌CB15
<400>4
Figure A200780032753D00882
<210>5
<211>1968
<212>DNA
<213>大肠杆菌yihG
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1968)
<223>大肠杆菌yjhG木质酸脱水酶的编码序列
<400>5
Figure A200780032753D00892
Figure A200780032753D00901
Figure A200780032753D00911
Figure A200780032753D00921
<210>6
<211>655
<212>PRT
<213>大肠杆菌yihG
<400>6
Figure A200780032753D00922
Figure A200780032753D00941
Figure A200780032753D00951
<210>7
<211>1968
<212>DNA
<213>大肠杆菌yagF
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1968)
<223>大肠杆菌yagF木质酸脱水酶的编码序列
<400>7
Figure A200780032753D00952
Figure A200780032753D00961
Figure A200780032753D00971
Figure A200780032753D00981
<210>8
<211>655
<212>PRT
<213>大肠杆菌yagF
<400>8
Figure A200780032753D00991
Figure A200780032753D01001
<210>9
<211>411
<212>DNA
<213>莓实假单胞菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<223>莓实假单胞菌ATCC4973木质酸脱水酶片段的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(411)..(411)
<223>n为a，c，g或t
<400>9
Figure A200780032753D01011
<210>10
<211>137
<212>PRT
<213>莓实假单胞菌
<400>10
Figure A200780032753D01021
<210>11
<211>960
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(960)
<223>大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>推定的起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(57)
<223>替代的起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(960)
<223>大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的替代编码序列
<400>11
Figure A200780032753D01031
<210>12
<211>319
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(1)
<223>推定的起始Met
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(319)
<223>大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽
<220>
<221>SITE
<222>(19)..(319)
<223>替代的大肠杆菌yjhH 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽
<220>
<221>SITE
<222>(19)..(19)
<223>替代的起始Met
<400>12
Figure A200780032753D01051
<210>13
<211>930
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(930)
<223>大肠杆菌yagE 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码序列
<400>13
Figure A200780032753D01052
Figure A200780032753D01061
<210>14
<211>309
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>14
Figure A200780032753D01071
Figure A200780032753D01081
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>真菌伯克霍尔德菌LB400 D-木糖脱氢酶基因(RBU11704)的正向扩增引物
<400>15
Figure A200780032753D01082
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>真菌伯克霍尔德菌LB400 D-木糖脱氢酶基因(RBU11704)的反向扩增引物
<400>16
Figure A200780032753D01083
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因(RBO01012)的正向扩增引物
<400>17
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因(RBO01012)的反向扩增引物
<400>18
Figure A200780032753D01092
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 D-木糖酸脱水酶基因(yjhG)的正向扩增引物
<400>19
Figure A200780032753D01093
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 D-木糖酸脱水酶基因(yjhG)的反向扩增引物
<400>20
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 D-木糖酸脱水酶基因(yagF)的正向扩增引物
<400>21
Figure A200780032753D01095
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 D-木糖酸脱水酶基因(yagF)的反向扩增引物
<400>22
Figure A200780032753D01101
<210>23
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的正向扩增引物
<400>23
Figure A200780032753D01102
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的反向扩增引物
<400>24
Figure A200780032753D01103
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的正向扩增引物
<400>25
Figure A200780032753D01104
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌W3110 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的反向扩增引物
<400>26
Figure A200780032753D01111
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因的正向扩增引物
<400>27
Figure A200780032753D01112
<210>28
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建质粒pWN9.068A的新月柄杆菌CB15 D-木糖脱氢酶基因的反向扩增引物
<400>28
Figure A200780032753D01113
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>莓实假单胞菌木糖酸脱水酶基因的正向扩增引物
<400>29
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>莓实假单胞菌木糖酸脱水酶基因的反向扩增引物
<400>30
Figure A200780032753D01115
<210>31
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的正向扩增引物
<400>31
Figure A200780032753D01121
<210>32
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)的DNA片段的反向扩增引物
<400>32
Figure A200780032753D01122
<210>33
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的正向扩增引物
<400>33
<210>34
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于破坏大肠杆菌基因组3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)的DNA片段的正向扩增引物
<400>34
Figure A200780032753D01124
<210>35
<211>57
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的正向扩增引物
<400>35
<210>36
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将xdh插入大肠杆菌基因组DNA中的DNA片段的反向扩增引物
<400>36
Figure A200780032753D01132
<210>37
<211>1011
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1011)
<223>来自GenBank U00096的大肠杆菌AdhP醇脱氢酶的编码序列
<400>37
Figure A200780032753D01133
Figure A200780032753D01141
<210>38
<211>336
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(336)
<223>IUBM EC 1.1.1.1的AdhP 1-丙醇优先的、含两个锌离子的醇脱氢酶(GenBank登录号AAC74551)
<220>
<221>DOMAIN
<222>(24)..(131)
<223>H24-V131构成属于PfamA登录号PF08240的醇脱氢酶GroES样域
<220>
<221>METAL
<222>(37)..(37)
<223>与催化锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>DOMAIN
<222>(57)，.(71)
<223>G57-V71构成划分在共有模式为“G-H-E-x-{EL}-G-(AP)-x(4)-[GA]-x(2)-[IVSAC]”的ProSite登录号PS00059下的含锌醇脱氢酶特征域
<220>
<221>METAL
<222>(58)..(58)
<223>与催化锌离子结合的保守His
<220>
<221>METAL
<222>(89)..(89)
<223>与第二锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>METAL
<222>(92)..(92)
<223>与第二锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>METAL
<222>(95)..(95)
<223>与第二锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>METAL
<222>(103)..(103)
<223>与第二锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>METAL
<222>(145)..(145)
<223>与催化锌离子结合的保守Cys
<220>
<221>DOMAIN
<222>(161)..(299)
<223>P161-E299构成属于PfamA登录号PF00107的锌结合醇脱氢酶域
<220>
<221>DOMAIN
<222>(172)..(260)
<223>G172-L260构成属于“SAM(及某些其它核苷酸)结合基序”的ProSite登录号PS50193的核苷酸结合基序
<400>38
Figure A200780032753D01151
Figure A200780032753D01161
<210>39
<211>987
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(987)
<223>来自GenBank AE005174的大肠杆菌yiaE 2-酮酸脱氢酶的编码序列
<400>39
Figure A200780032753D01171
<210>40
<211>328
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(328)
<223>YiaE 2-酮酸脱氢酶(GenBank登录号AAG58702)
<400>40
Figure A200780032753D01172
Figure A200780032753D01181
Figure A200780032753D01191
<210>41
<211>939
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(939)
<223>来自GenBank AP009048的大肠杆菌ycdW 2-酮酸脱氢酶的编码序列
<400>41
Figure A200780032753D01201
<210>42
<211>312
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(312)
<223>YcdW 2-酮酸脱氢酶(GenBank登录号BAA35814)
<400>42
Figure A200780032753D01211
<210>43
<211>1587
<212>DNA
<213>恶臭假单胞菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1587)
<223>来自GenBank AY143338的恶臭假单胞菌mdlC 2-酮酸脱羧酶的编码序列
<400>43
Figure A200780032753D01212
Figure A200780032753D01221
<210>44
<211>528
<212>PRT
<213>恶臭假单胞菌
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(528)
<223>MdlC 2-酮酸脱羧酶(GenBank登录号AAC15502)
<400>44
Figure A200780032753D01222
Figure A200780032753D01241
Figure A200780032753D01251

Claims (57)

1、一种制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括
(A)提供
(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶、(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醇脱氢酶，其中所述细胞体是经操作使(e)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸、(f)2-酮酸脱氢酶多肽或其核酸或者(g)同时(e)和(f)受到抑制或灭活的细胞体；和
(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-1，2，4-丁三醇：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇。
2、一种制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括
(A)提供
(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶、(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醇脱氢酶；和
(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-1，2，4-丁三醇：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇。
3、一种制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括
(A)提供
(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：
(a)D-木糖脱氢酶，
(b)D-木质酸脱水酶，包含
(i)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者
(ii)莓实假单胞菌(ATCC4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，
(c)2-酮酸脱羧酶，和
(d)醇脱氢酶；和
(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-1，2，4-丁三醇：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇。
4、一种制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括
(A)提供
(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：
(a)D-木质酸脱水酶，包含
(i)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者
(ii)莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，
(b)2-酮酸脱羧酶，和
(c)醇脱氢酶；和
(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及
(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生1，2，4-丁三醇和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-1，2，4-丁三醇：
(1)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇。
5、一种制备D-1，2，4-丁三醇的方法，包括
(A)提供
(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶，(b)2-酮酸脱羧酶和(c)醇脱氢酶，其中所述细胞体是经操作使(d)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶多肽或其核酸、(e)2-酮酸脱氢酶多肽或其核酸或者(f)同时(d)和(e)受到抑制或灭活的细胞体；和
(2)在所述酶系统可运行以产生1，2，4-丁三醇的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及
(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生1，2，4-丁三醇和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-1，2，4-丁三醇：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醇脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-1，2，4-丁三醇。
6、根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述重组细胞体包括包含所述酶系统的单细胞。
7、根据权利要求6所述的方法，其中，所述细胞是微生物细胞或植物细胞。
8、根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述木糖源包含D-木糖。
9、根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述木糖源包括可以在所述条件下由其同化合成D-木糖的碳源。
10、根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述木糖源包括可以在所述条件下由其水解得到D-木糖残基的含D-木糖残基的聚合物。
11、根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括回收由此制备的D-1，2，4-丁三醇的步骤。
12、按照权利要求1-5任一项所述的方法制备的D-1，2，4-丁三醇。
13、一种制备1，2，4-丁三醇三硝酸酯的方法，包括
(A)提供按照权利要求1-5任一项所述的方法制备的D-1，2，4-丁三醇和硝化剂，及
(B)使所述D-1，2，4-丁三醇与硝化剂在所述硝化剂可以硝化D-1，2，4-丁三醇的条件下接触，
由此制备1，2，4-丁三醇三硝酸酯。
14、按照权利要求13所述的方法制备的D-1，2，4-丁三醇三硝酸酯。
15、一种D-木糖脱氢酶，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列。
16、根据权利要求15所述的D-木糖脱氢酶在D-1，2，4-丁三醇生物合成酶系统中的用途。
17、编码权利要求15所述的D-木糖脱氢酶的核酸。
18、根据权利要求17所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的同源多核苷酸中任一项的碱基序列。
19、根据权利要求17所述的核酸，其中，所述核酸是多核苷酸载体。
20、根据权利要求19所述的核酸，其中，所述载体是质粒。
21、一种包含以下任一的氨基酸序列的D-木质酸脱水酶：SEQ IDNO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽；包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ IDNO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶、或者莓实假单胞菌D-木质酸脱水酶氨基酸序列的保守置换变异体或同源多肽。
22、根据权利要求21所述的D-木质酸脱水酶在D-1，2，4-丁三醇生物合成酶系统中的用途。
23、编码权利要求21所述的D-木质酸脱水酶的核酸。
24、根据权利要求23所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的同源多核苷酸任一项的碱基序列。
25、根据权利要求23所述的核酸，其中，所述核酸是多核苷酸载体。
26、根据权利要求25所述的核酸，其中，所述载体是质粒。
27、一种分离的或重组的1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包括
(A)包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或者具有D-木糖脱氢酶活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脱氢酶，
(B)D-木质酸脱水酶，
(C)2-酮酸脱羧酶，和
(D)醇脱氢酶，
该酶系统能够催化D-木糖转化成D-1，2，4-丁三醇。
28、一种分离的或重组的1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包含
(A)D-木糖脱氢酶，
(B)D-木质酸脱水酶，包含
(1)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者
(2)莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，
(C)2-酮酸脱羧酶，和
(D)醇脱氢酶，
该酶系统能够催化D-木糖转化成D-1，2，4-丁三醇。
29、一种分离的或重组的1，2，4-丁三醇生物合成酶系统，包含
(A)D-木质酸脱水酶，包含
(1)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者具有D-木质酸脱水酶活性的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的保守置换变异体或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者
(2)莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶或者其保守置换的变异体或同源多肽的氨基酸序列，该酶包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，
(B)2-酮酸脱羧酶，和
(C)醇脱氢酶，
该酶系统能够催化D-木质酸转化成D-1，2，4-丁三醇。
30、一种重组细胞体，其包含权利要求27-29任一项所述的酶系统。
31、根据权利要求30所述的重组细胞体，其中，所述细胞体包括含有所述酶系统的单细胞。
32、根据权利要求31所述的重组细胞体，其中，所述细胞是重组的DgPu-细胞。
33、一种3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶敲除载体，包含具有SEQIDNO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：11的nt55-319中任一的碱基序列的多核苷酸，其中所述载体能够以使3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因或其编码的醛缩酶失活的方式插入3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因的基因组拷贝中或与其重组。
34、一种重组细胞，其为DgPu-(3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶“缺失”)、或KAD-(2-酮酸脱氢酶“缺失”)、或同时DgPu-和KAD-表型。
35、一种制备3-脱氧-D-甘油-戊酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶和(c)2-酮酸还原酶，
和
(2)在所述酶系统可运行以产生3-脱氧-D-甘油-戊酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生3-脱氧-D-甘油-戊酸和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备3-脱氧-D-甘油-戊酸：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(3)所述2-酮酸脱氢酶(还原酶)将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
36、一种制备3-脱氧-D-甘油-戊酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含(a)D-木质酸脱水酶和(b)2-酮酸还原酶，
和
(2)在所述酶系统可运行以产生3-脱氧-D-甘油-戊酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及
(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生3-脱氧-D-甘油-戊酸和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备3-脱氧-D-甘油-戊酸：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸脱氢酶(还原酶)将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
37、按照权利要求35或36所述的方法制备的3-脱氧-D-甘油-戊酸。
38、一种制备D-3，4-二羟基-丁酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶、(c)2-酮酸脱羧酶和(d)醛脱氢酶，和
(2)在所述酶系统可运行以产生D-3，4-二羟基-丁酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生D-3，4-二羟基-丁酸和其中木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-3，4-二羟基-丁酸：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，
(3)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(4)所述醛脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
39、一种制备D-3，4-二羟基-丁酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含(a)D-木质酸脱水酶、(b)2-酮酸脱羧酶和(c)醛脱氢酶，和
(2)在所述酶系统可运行以产生D-3，4-二羟基-丁酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及
(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生D-3，4-二羟基-丁酸和其中木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备D-3，4-二羟基-丁酸：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸脱羧酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基-D-丁醛，和
(3)所述醛脱氢酶将所得的3，4-二羟基-D-丁醛转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
40、按照权利要求38或39任一项所述的方法制备的D-3，4-二羟基-丁酸。
41、一种制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木糖脱氢酶、(b)D-木质酸脱水酶和(c)2-酮酸转氨酶，
和
(2)在所述酶系统可运行以产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的条件下能够向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的木糖源；及
(B)将所述细胞体和木糖源置于其中所述酶系统可以从D-木糖产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和其中所述木糖源向D-木糖脱氢酶提供D-木糖的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸：
(1)所述D-木糖脱氢酶将D-木糖转化成D-木质酸，
(2)所述D-木质酸脱水酶将所得的D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(3)所述2-酮酸转氨酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
42、一种制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的方法，包括
(A)提供
(1)包含3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统的重组细胞体，所述酶系统包含：(a)D-木质酸脱水酶和(b)2-酮酸转氨酶，
和
(2)在所述酶系统可运行以产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸的条件下能够向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的木质酸源；及
(B)将所述细胞体和木质酸源置于其中所述酶系统可以从D-木质酸产生(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸和其中所述木质酸源向D-木质酸脱水酶提供D-木质酸的条件下，所述酶系统在所述条件下通过以下作用运行从而制备(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸：
(1)所述D-木质酸脱水酶将D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸，和
(2)所述2-酮酸转氨酶将所得的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
43、按照权利要求41或42任一项所述的方法制备的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
44、根据权利要求35、36、38、39、41或42任一项所述的方法，其中，所述重组细胞体包括含有所述酶系统的单细胞。
45、根据权利要求44所述的方法，其中，所述细胞是重组的DgPu-细胞。
46、一种分离的或重组的3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸还原酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
47、一种分离的或重组的3-脱氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸还原酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成3-脱氧-D-甘油-戊酸。
48、一种分离的或重组的D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶、(C)2-酮酸脱羧酶和(D)醛脱氢酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
49、一种分离的或重组的D-3，4-二羟基-丁酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木质酸脱水酶、(B)2-酮酸脱羧酶和(C)醛脱氢酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成D-3，4-二羟基-丁酸。
50、一种分离的或重组的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木糖脱氢酶、(B)D-木质酸脱水酶和(C)2-酮酸转氨酶，所述酶系统能够催化D-木糖转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
51、一种分离的或重组的(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸生物合成酶系统，包含：(A)D-木质酸脱水酶和(B)2-酮酸转氨酶，所述酶系统能够催化D-木质酸转化成(4S)-2-氨基-4，5-二羟基戊酸。
52、包含权利要求46-51任一项的酶系统的重组细胞体。
53、根据权利要求52所述的重组细胞体，其中，所述细胞体包括含有所述酶系统的单细胞。
54、根据权利要求53所述的重组细胞体，其中，所述细胞为重组的DgPu-细胞。
55、一种筛选候选的酶编码多核苷酸的方法，包括：
(A)提供
(1)包含与编码酶多肽的编码序列大约20个或更多相连核苷酸相同的核碱基序列的核酸或核酸类似物探针，所述酶多肽具有以下任一氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或
(b)SEQ ID NO：12的19-319位残基的氨基酸序列，或
(c)包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶的氨基酸序列，或
(d)保持生物催化活性的上述(a)、(b)或(c)中任一项的保守置换变异体的氨基酸序列或同源氨基酸序列；和
(2)包含或怀疑包含这种探针可以特异性地与之结合的至少一种靶多核苷酸的测试样品；
(B)使所述探针与测试样品在探针可以特异性地与存在的靶多核苷酸杂交的条件下接触以形成探针-靶多核苷酸复合物，及
(C)检测是否由此形成任何探针-靶多核苷酸复合物，
其中被确认为复合物一部分的多核苷酸因此被鉴别为候选酶编码多核苷酸。
56、一种对以下物质的表位具有特异性的抗体：
(A)具有以下任一氨基酸序列的酶多肽：
(1)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID NO：12的19-319位残基的氨基酸序列，或
(3)包含具有大约430+残基的推定长度、大约60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽的莓实假单胞菌(ATCC 4973)D-木质酸脱水酶的氨基酸序列，或
(4)保持生物催化活性的上述(1)、(2)或(3)中任一项的保守置换变异体的氨基酸序列或同源氨基酸序列；或者
(B)具有编码这种酶多肽(A)的碱基序列的多核苷酸或核酸类似物。
57、根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述醇脱氢酶活性由至少两个可表达的编码AdhP的核酸单元表达。
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