CN113337546A - 一种(s)-1，2，4-丁三醇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种(S)‑1，2，4‑丁三醇的制备方法。所述方法包括步骤：使含有1,4‑二羟基‑2‑丁酮或其类似物与酮还原酶‑葡萄糖脱氢酶共固定化酶的混合体系反应得到(S)‑1，2，4‑丁三醇。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种以1,4-二羟基-2-丁酮为底物，采用酮还原酶高效催化合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法。
背景技术
(S)-1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol，简称BT)是一种手性多元醇类化合物(见式1)。
由于其手性结构，(S)-1,2,4-丁三醇可作为多种天然产物合成中的重要砌块和手性化合物的合成前体。它是药物传递的阳离子脂质体的合成前体，也能用于降胆固醇类药物Lipitor、治疗皮肤病药物羟基二十碳四烯酸(12-HETE)、抗癌药物Compatin和艾滋病药物Agenerase等多种重要药物的合成。
(S)-1,2,4-丁三醇在军工方面可被用于合成1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butanetriol trinitrate)，是硝化甘油理想的且安全的替代品，可用作飞机、火箭、导弹等军事武器的推进剂。1,2,4-丁三醇与其它增塑剂混合使用显著提高以硝化纤维素为基火药的低温力学性能。此外，(S)-1,2,4-丁三醇还可用于制备卷烟添加剂、生物活性剂、抗菌防腐剂、合成聚氨酯泡沫的交联剂和彩色显影剂等。在市场需求量方面，丁三醇的市场需求量逐年增加，目前潜在需求量达百万吨。然而，(S)-1,2,4-丁三醇现有的生产水平限制了它的推广应用。
目前，自然界中尚未发现天然的(S)-1,2,4-丁三醇的生物合成途径。虽然微生物发酵法和体外多步酶催化法合成丁三醇研究的较为广泛，但是由于微生物的代谢途径复杂，且发酵过程不易调控，副产物多等多种因素，涉及酶催化步骤多，导致丁三醇的产量、产率低且产物分离工艺复杂，产品成本高，不能达到大规模生产水平。另外，以上方法生产1,2,4-丁三醇的过程中，不能有效控制1,2,4-丁三醇的手性，限制了(S)-1,2,4-丁三醇的后续应用范围。
已有报道采用纳米粒子和活化醇盐水解法将酮还原酶和甲酸脱氢酶进行共固定化，催化羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇，产物浓度为35.6g/L，固定化酶重复使用12批次等。然而目前国内外还没有高效催化生产手性1,2,4-丁三醇的相关酶的报道，限制手性1,2,4-丁三醇的产业化进程及其作为药物中间体的应用开发。
发明内容
本发明旨在提供一种以1,4-二羟基-2-丁酮为底物，采用共固定化酮还原酶和辅酶高效生产手性(S)-1,2,4-丁三醇的方法。
在本发明的第一方面，提供一种(S)-1，2，4-丁三醇的制备方法，所述方法包括步骤：使含有1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物与酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的混合体系反应得到(S)-1，2，4-丁三醇。
在另一实施方式中，所述混合体系的pH为6-7.5；优选为6-7；更优选为6.5-7.0。
在另一实施方式中，所述反应温度为25-45℃；优选为30-45℃；更优选为35-40℃。
在另一实施方式中，以混合体系的总体积计，所述1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物浓度为10-250g/L；优选浓度不超过200g/L。
在另一实施方式中，所述1,4-二羟基-2-丁酮类似物，例如包括碳1或者碳4位置上含有2-3个碳原子的化合物；指碳1或者碳4除了连接有羟基，还可连接有2-3个碳原子的基团，如乙基、丙基等。
在另一实施方式中，所述混合体系中还含有磷酸缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、葡萄糖脱氢酶、酮还原酶固定化酶和葡萄糖。
在另一实施方式中，所述酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶通过下述步骤制备得到：
(i)将酮还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶混合得到酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液；
(ii)将酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液和预处理的载体树脂混合，得到酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
在本发明的第二方面，提供一种酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)将酮还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶混合得到酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液；和
(2)将酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液和预处理的载体树脂混合，得到酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
在另一实施方式中，所述酮还原酶粗酶液通过下述步骤制备得到：使酮还原酶基因工程菌进行发酵培养得到的菌体裂解得到酮还原酶粗酶液。
在另一实施方式中，所述预处理的载体树脂通过下述步骤制备得到：将载体树脂与缓冲液混合后过滤抽干，然后加入含有戊二醛的缓冲液，混合后得到预处理的载体树脂。
在另一实施方式中，所述载体树脂经过戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸衍生物等试剂处理得到含有醛基、氨基、羟基和羧基的载体，含有这些基团的载体以共价键与酶连接，形成固定化酶。
在本发明的第三方面，提供一种通过如上所述的本发明提供的制备方法得到的(S)-1，2，4-丁三醇。
在本发明的第四方面，提供一种如上所述的本发明提供的(S)-1，2，4-丁三醇的应用。
在本发明的第五方面，提供一种通过如上所述的本发明提供的制备方法得到的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
在本发明的第六方面，提供一种如上所述的本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶在合成(S)-1，2，4-丁三醇中的应用。
据此，本发明提供了一种高效简单的(S)-1,2,4-丁三醇合成工艺，从而解决了现有生物法合成工艺中产物浓度低，生产成本高，分离纯化难等问题。
附图说明
图1是酮还原酶表达载体构建图谱。
图2是(S)-1,2,4-丁三醇酶法合成反应式。
图3是本发明实施例获得的(S)-1,2,4-丁三醇HPLC检测图谱。
图4是本发明实施例获得的(S)-1,2,4-丁三醇NMR检测图谱。
图5是实施例1提供的羰基还原酶DNA片段序列。
具体实施方式
发明人经过广泛深入的研究，发现可以使用1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物为底物酶催化生产(S)-1,2,4-丁三醇或其类似物，原料价格低廉，成本低。进一步地，发明人还发现可以通过酮还原酶和辅酶(葡萄糖脱氢酶)的共固定化，实现酮还原酶和辅酶的循环利用，降低酶制剂成本和产物分离难度，有效地降低了(S)-1,2,4-丁三醇的生产成本，推动了(S)-1,2,4-丁三醇的绿色生物合成技术走向产业应用。在此基础上完成了本发明。
酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶
本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的酶活以其中酮还原酶酶活计为100-500U。
在本发明中，酮还原酶酶活定义：在30℃、250rpm条件下，以1,4-二羟基-2-丁酮为底物催化反应30min，每分钟内催化生成1μmol的(S)-1,2,4-丁三醇所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶可具有多种形状，如颗粒、线条、薄膜、酶管等。
本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶可耐受温度为20-50℃，适合的pH为5-8。
本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶可以通过下述步骤制备得到：
第一步，将酮还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶混合得到酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液；
第二步，将酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液和预处理的载体树脂混合，得到酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
上述第一步中使用的酮还原酶粗酶液通过下述方法得到：将酮还原酶基因工程菌(上海生工生物工程有限公司)接种至培养基诱导表达酮还原酶，收集湿菌体后经细胞破碎、离心，得到酮还原酶粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，将含有酮还原酶核苷酸序列转入表达质粒，得到重组质粒，然后将重组质粒分别转化宿主菌，得到酮还原酶基因工程菌；将工程菌进行发酵培养，并在工程菌中诱导表达酮还原酶；离心收集酮还原酶基因工程菌湿菌体，将获得的湿菌体悬浮于的pH 6.0-7.0的缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到酮还原酶粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒为pET28a，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述酮还原酶基因工程菌可通过下述方法构建：将含有目的酮还原酶基因的片段插入到大肠杆菌表达载体获得重组载体，将重组载体引入大肠杆菌形成重组大肠杆菌，即酮还原酶基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，酮还原酶基因工程菌湿菌体可以通过下述方法得到：将酮还原酶基因工程菌接种至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基(可根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)配制)，培养后再以一定的比例将培养液接种至新鲜的LB液体培养基中，使培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养后收集湿菌体。
在上述第一步中，以所获得的酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液的总体积计，其中酮还原酶粗酶液的用量为5-50v/v％(优选10-30v/v％)，葡萄糖脱氢酶的用量为1-10v/v％(优选2-8v/v％)。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步可以将市售的葡萄糖脱氢酶干粉，以一定浓度(例如但不限于，30v/v％)溶解于酮还原酶粗酶液中，制备得到葡萄糖脱氢酶和酮还原酶的混合液。
上述第二步中预处理的载体树脂可通过下述方法得到：将载体树脂与缓冲液混合后过滤抽干，然后加入含有戊二醛的缓冲液，混合后得到预处理的载体树脂。
在本发明的一种实施方式中，将树脂加入pH7.0-8.0的磷酸缓冲液，置于25-30℃摇床，震荡后室温静置，过滤后加入磷酸缓冲液重悬；再加入戊二醛溶液；缓慢震荡后用过滤，去离子水洗涤，得到预处理后的载体树脂。
如本发明所用，“室温”是指15-40℃，优选20-30℃。
如本发明所用，“载体”、“树脂”或“载体树脂”可以互换使用，都是指固定化酶中用于束缚酶的固体材料。
本发明使用的树脂可以选自环氧树脂、氨基树脂、聚丙烯腈、大孔树脂、聚乙二醇、环氧氯丙烷、纤维素等。
本发明使用的树脂可以用戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸衍生物等试剂进行处理，得到含有醛基、氨基、羧基、羟基等官能团的载体。
在本发明的一种实施方式中，上述第二步在酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液中加入预处理的载体树脂，预处理的载体树脂的添加量为1-50g/L酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液，在20-35℃振荡结合一定时间，过滤分离清液和固体，将固体用水清洗，收集固体，即得酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
(S)-1,2,4-丁三醇合成方法
发明人使用上述发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶高效催化合成(S)-1,2,4-丁三醇。
本发明提供的酶催化合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法以本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶为催化剂，在反应体系中催化1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物生成(S)-1,2,4-丁三醇或其类似物。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系还包括如下组分：PBS(NaHPO4、NaH2PO4)、NADP+、NAD+和葡萄糖。
在本发明的一种对比实施例中，以所述反应体系的总体积计，底物(1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物)浓度为10-250g/L(优选10-200g/L)；所述反应体系中酮还原酶的重组表达湿菌体含量为10-120g/L；PBS(NaHPO4、NaH2PO4)的用量为20-100mM；NADP+的用量为0.1-1.0mM；NAD+的用量为0.1-1.0mM；葡萄糖脱氢酶的含量为0.1-5g/L；葡萄糖的含量为20-200g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应的温度为25-45℃，反应时间为5-48小时。
在本发明的一种实施方式中，以本发明提供的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶为催化剂，加入1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NAD+和/或NADP+为辅因子，以pH值为7.0的磷酸钾缓冲液为溶剂，在15-50℃、200-500rpm条件(优选30℃、250rpm)下反应5-24小时后，将混合液抽滤回收固定化酶，滤液分离纯化，得到(S)-1,2,4-丁三醇溶液。
较佳地，所述催化剂用量为以固定化酶载体计为15-100g/L(优选50g/L)反应体系，葡萄糖用量(以反应溶液体积计)为5-30wt％(优选2-20wt％)，底物终浓度10-200g/L反应体系。
在本发明的一个实施例中，所述滤液分离纯化方法为当反应介质为磷酸钾缓冲液或其他缓冲液溶液，例如Tris缓冲液，磷酸二氢钠缓冲液，甘氨酸缓冲液等，将混合液抽滤回收酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，滤液先旋蒸至无液体流出，获得浓缩物，将浓缩物用乙酸乙酯萃取，合并有机层并用无水硫酸钠干燥、过滤获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获(S)-1,2,4-丁三醇。
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征，如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，只要这些特征的组合不存在矛盾，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明首次提供了以1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物为底物，制备手性(S)-1,2,4-丁三醇的工艺路线，避免了目前手性丁三醇生产工艺中用到的硼氢化钠等环境污染很大的化学试剂，同时也显著降低了生产成本；
2、本发明首次提供了一种适合于1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物的酮还原酶，并以单一酶体外高效催化酮化合物直接生成生成手性(S)-1,2,4-丁三醇及其类似物的方法，产物S构型e.e值大于99％，产物产率大于99％，底物浓度大于100g/L。
3、本发明提供了一种酮还原酶和辅酶共固定化工艺，提高了酮还原酶和辅酶的使用次数，降低产物生产成本，简化产物分离工艺；极大的降低了生物催化生产手性(S)-1,2,4-丁三醇的成本，推进工业化生产进程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中获得的(S)-1,2,4-丁三醇(产品)含量、手性及结构测定和鉴定方法：
1、产品含量检测方法：采用气相色谱检测，色谱柱为column DB-wax30m*0.32mm；程序升温：50℃2min后到220℃，维持10min，流速为1.0ml/min。
2、产品手性检测方法：采用气相色谱检测，色谱柱为cyc-β，30m*0.25mm，160℃恒温30min，流速1.0ml/min。
3、产品结构鉴定：采用核磁共振仪HNMR鉴定产品结构；Bruker 400M，溶剂为CD3OD。
实施例1
酮还原酶基因工程菌细胞的培养及粗酶液制备
(1)、酮还原酶基因工程菌的构建：将具有酮还原功能的一株白地霉，进行物理突变，筛选得到对目的底物转化率和手性值显著提高的突变株，通过NCBI序列比对，与常规设计引物，PCR扩增和蛋白质电泳回收得到此酮还原酶片段，将此片段连接至克隆载体pUC18上，测序，序列见附图5；将此DNA片段酶切连接至商业化载体pET28a进行连接，构建表达载体pET28a-A(图1)。将构建的表达载体pET28a-A转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取单克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28a-A的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-A。
(2)、酮还原酶细胞制备：将酮还原酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-A接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，250rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，即获得酮还原酶基因工程菌湿菌体。
(3)酮还原酶粗酶液制备：取1g湿菌体，悬浮于10mL磷酸盐缓冲液中(pH＝7.0,100mM)，在冰浴中超声破碎20min，功率400W，破2S停2S，破碎后将上述破碎液于4℃，12000rpm条件下离心10min，取上清液即为酮还原酶粗酶液。
实施例2
酮还原酶和共固定化酶酶活测定
酶活测定体系及条件如下：100mM葡萄糖，2mM NADPH，100mM、pH7.0磷酸钾盐缓冲液，固定化酶制剂(相当于湿菌体30g/L)，100g/L的底物。30℃，250rpm条件下反应30min，取样检测酶活。同样条件下，以酮还原酶粗酶液作为对照。
酶活单位(U)定义为：在30℃、250rpm、pH 7.0条件下，1min内生成1μmol产物所需的酶量定义为1U。根据产物的生成量计算共固定化酮还原酶的酶活。
实施例3
载体预处理
(1)、配制0.1M pH8.0的缓冲溶液配制(1L)：1L去离子水加入一定量KH2PO4和K2HPO4，定容到1000mL，调节pH至7.5-8.0；
(2)、配制2％的戊二醛磷酸缓冲溶液(1L)：80mL戊二醛(25％)，加入920mL H2O，定容至1L；
(3)、将10g固定化载体加入100mL，0.1M pH8.0的缓冲液，25℃摇床震荡15min后，测pH，维持pH7.5-8.0，震荡1h后过滤抽干，然后再将前面的10g载体，加入50mL 2％的戊二醛磷酸缓冲液，控温25℃摇床震荡1h，过滤，用去离子水洗涤载体至水清，抽滤得到预处理固定化载体。
实施例4
酮还原酶和辅酶的共固定化
(1)葡萄糖脱氢酶溶液配制：称取0.2g市售的葡萄糖脱氢酶干粉加入至100mL pH7.0的磷酸盐缓冲液(摩尔浓度为100mM)中，搅拌溶解均匀。
(2)量取20mL实施例1方法制备的酮还原酶粗酶液和10mL葡萄糖脱氢酶溶液加入到70mL、pH 7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，得到混合液100mL。准确称取10g(干重)实施例3预处理后的载体添加到100mL混合液中进行混合，在室温(25℃)，低速水浴搅拌固定化12-24h；抽滤除去上清液，所得滤饼用100mM pH7.0磷酸缓冲溶液清洗两次，后抽滤除去多余水分，获得共固定化酮还原酶和辅酶，置4℃冰箱保存备用。
实施例5
共固定化酶催化底物反应pH优化
取10mL浓度为100mM磷酸钾盐缓冲液，分别加入终浓度为100mM的葡萄糖、2mM的NAD+、0.5mM的NADPH和50g/L的底物，溶解均匀，调溶液pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，分别加入0.5g实施例4方法制备的共固定化酶，在35℃，250rpm摇床反应，反应结果见表1，结果表明pH6-7条件下，产物产率较高。产物检测方法同实施例2。
表1、不同pH条件下固定化酶催化结果
| 实验组 | 反应初始pH | 产率(％) | S构型e.e值(％) |
| 1 | 4.5 | 5％ | >99％ |
| 2 | 5.0 | 20％ | >99％ |
| 3 | 5.5 | 60％ | >99％ |
| 4 | 6.0 | 80％ | >99％ |
| 5 | 6.5 | 95％ | >99％ |
| 6 | 7.0 | 99％ | >99％ |
| 7 | 7.5 | 86％ | >99％ |
| 8 | 8.0 | 70％ | >99％ |
| 9 | 8.5 | 60％ | >99％ |
| 10 | 9.0 | 20％ | >99％ |
实施例6
共固定化酶催化温度优化
取6份10mL浓度为100mM磷酸钾盐缓冲液，分别加入终浓度为100mM的葡萄糖、2mM的NAD+、0.5mM的NADPH和50g/l的底物，溶解均匀，调溶液pH为7.0，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃水浴中搅拌预热10min，分别加入0.5g实施例4方法制备的共固定化酶，反应24h，反应结果见表2，结果表明共固定化酶在温度为35-40℃时，酶的活力较高，产物产率较高。
表2、不同温度条件下固定化酶催化结果
| 实验组 | 反应温度(℃) | 产率(％) | S构型e.e值(％) |
| 1 | 25 | 55％ | >99％ |
| 2 | 30 | 85％ | >99％ |
| 3 | 35 | 99％ | >99％ |
| 4 | 40 | 95％ | >99％ |
| 5 | 45 | 60％ | >99％ |
| 6 | 50 | 20％ | >99％ |
实施例7
共固定化酶催化底物浓度优化
取6份10mL浓度为100mM磷酸钾盐缓冲液，分别加入终浓度为100mM的葡萄糖、2mM的NAD+、0.5mM的NADPH，分别加入底物至终浓度为20、50、80、120、150和200g/L，溶解均匀，调溶液pH为7.0，置于35℃摇床振荡搅拌预热10min，分别加入5g实施例4方法制备的共固定化酶，反应24h，反应结果见表3，结果表明添加50％的共固定化酶，在底物浓度低于200g/L的条件下，产物产率都大于99％，e.e值都大于99％。产物检测方法同实施例2。
表3、不同底物浓度下条件下固定化酶催化结果
| 实验组 | 底物浓度(g/L) | 产率(％) | S构型e.e值(％) |
| 1 | 50 | >99％ | >99％ |
| 2 | 80 | >99％ | >99％ |
| 3 | 120 | >99％ | >99％ |
| 4 | 150 | >99％ | >99％ |
| 5 | 200 | >89％ | >99％ |
实施例8
共固定化酶重复使用次数优化
取10mL浓度为100mM磷酸钾盐缓冲液，分别加入终浓度为100mM的葡萄糖、2mM的NAD+、0.5mM的NADPH和100g/l的底物，溶解均匀，在优化后的最适pH7.0和最适温度35℃时，加入0.5g实施例4方法制备的共固定化酶，在250rpm摇床反应24h后，过滤分离反应液并收集固定化酶，在固定化酶中再加入10ml底物溶液，继续催化反应24h；固定化酶连续重复使用10批，产物产率见表4，结果表明前5批固定化酶使用效率稳定，产物产率无显著下降，5批到10批反应，产率下降约10-30％。产物检测方法同实施例2。
表4、固定化酶重复使用结果
实施例9
产物提取及结构鉴定
称取一定量的实施例5-8中的反应液，离心除去沉淀，得到清液1；采用膜过滤除去清液1中蛋白质，得到清液2；然后将清液2旋蒸至无液体流出，获得浓缩物1，将浓缩物用体积比为1:3的乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥、过滤获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，得到产物固体，将此固体经过HNMR检测，图谱见图4，确定产品结构式为
化学名称为(S)-1,2,4-丁三醇；HNMR检测结果如表5所示：
| 化学位移(ppm) | 峰类型 | 归属 |
| 3.76-3.71 | m,1H | H-2 |
| 3.69-3.66 | m,2H | H-1 |
| 3.49-3.40 | m,2H | H-4 |
| 1.75-1.53 | m,2H | H-3 |
对比实施例1
游离态酶催化试验
取10mL浓度为100mM磷酸钾盐缓冲液，分别加入终浓度为100mM的葡萄糖、2mM的NAD+、0.5mM的NADPH、2g/L的葡萄糖脱氢酶、100g/L的底物，调溶液pH为7.0，最后加入50g/L酮还原酶粗酶液(以湿菌体计)，溶解均匀，在35℃，250rpm摇床反应，反应24h，产物产率达到99％，ee值达到99％；但是反应液中酶蛋白不能收集重复利用，反应只进行一批，成本较高及后处理蛋白质导致气泡严重，产物提取困难；另外，反应液中提取产物后所得水溶液中含有NADPH和NADP，也不能重复利用；而采用固定化酶，反应体系提取了产物后可再加入底物进行催化，降低生产过程废水量，能缓解目前化学制药生产关键问题。
对比实施例2
市售酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的共固定化
(1)葡萄糖脱氢酶溶液配制：称取0.2g市售的葡萄糖脱氢酶干粉(简称葡萄糖脱氢酶)加入至100mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液(摩尔浓度为100mM)中，搅拌溶解均匀。
量取20mL市售酮还原酶酶液和10mL葡萄糖脱氢酶溶液加入到70mL、pH 7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，得到混合液100mL。准确称取10g(干重)实施例3预处理后的载体添加到100mL混合液中进行混合，在室温(25℃)，低速水浴搅拌固定化12-24h；抽滤除去上清液，所得滤饼用100mM pH7.0磷酸缓冲溶液清洗两次，后抽滤除去多余水分，获得共固定化酮还原酶和辅酶，加入到实施例7的反应体系中，在35℃催化24h后，测定得到反应液中产物转化率10％，ee值56％。说明只有本发明所提供的酮还原酶和葡萄糖脱氢酶共固定化催化底物，所得产物的转化率和手性值能大于99％，满足医药级产品生产质量标准。
对比实施例3
固定化载体不预处理进行酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的共固定化效果
直接称取10g干重的树脂(不经过载体预处理)，加入到含有20mL酮还原酶酶液和10mL葡萄糖脱氢酶溶液的70mL、pH 7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，得到混合液100mL，在室温(25℃-30℃)，低速水浴搅拌固定化12-24h；抽滤除去上清液，所得滤饼用100mM pH7.0磷酸缓冲溶液清洗两次，后抽滤除去多余水分，获得共固定化酮还原酶和辅酶，加入到实施例7的反应体系中，在35℃催化24h后，测定得到反应液中产物转化率30％，ee值99％。说明不经过预处理的载体所带官能团较少，单位质量载体不能充分的与酶形成共价键结合，所得固定华酶活力较低，不能有效的催化底物生成产物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
序列表
<110> 上海启讯医药科技有限公司
<120> 一种(S)-1，2，4-丁三醇的制备方法
<130> 203999
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> 白地霉(Geotrichum candidum)
<400> 1
caaaccgcct ttgtcttcaa gaacggatcc tttgcattgg aaaagaagga aatcgaagtt 60
cctaaaccag atgctggcaa agttctctta aaggtcgccg ccgctggtgt ctgccactca 120
gatctccacg tcctccacgg aggtctccca tacccagacg gtctcatttt gggacacgaa 180
attgctggtc acattgtcgc ttacggtgac ggtgtcgaca aggccgcttt cccatcagac 240
gctctctacg ctgttgtcgg accaaatcca tgcggtatgt gcaaggcatg ccgaactggc 300
gctgacaatg tctgtgaaga cccctcccgt actcacatgg gtctcggttc cccaggtgga 360
tacgaacaat acacacaagt ctcagcacgc aatattacca aagtaccaga aggtattcca 420
gcagctgtag ccgctgcctc tactgacgca gttcttactc cataccacgc tctcaagcgt 480
gccggtatta acggtatgac cagactcttg attgttggtc tcggaggtct cggtatcaac 540
gccgttcaaa ttgcaaaggc ttttggcagt tacgtcattg ctgtcgatcc aaaggaatct 600
tcccgtgacc ttgctaagca atacggtgcc aacgaagttt acgccaaact cccagaagaa 660
tctctcgacg tcgacgttgc tgctgatttc tacggttccc aaggtacctt tgacttgtgc 720
caaaagcacg tcaaggccca aggtattctt ctcccagtcg gtctccaaga tccaaagatc 780
acttttgact tgaaccacct tgctttcaga gaatacacaa tcattggtaa cttctggggt 840
acttcccaag atcaaactga agtctttgaa ttggtcaaga agggattggt cactccacaa 900
gtcgaaacca cttcttggtt gaacgttaac aaggttctta aggatttgga tgaaggaaag 960
atcaaatctc gtatggtttt ggtccacaat 990
Claims (14)
1.一种(S)-1，2，4-丁三醇的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：使含有1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物与酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的混合体系反应得到(S)-1，2，4-丁三醇。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合体系的pH为6-7.5；优选为6-7；更优选为6.5-7.0。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为25-45℃；优选为30-45℃；更优选为35-40℃。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以混合体系的总体积计，所述1,4-二羟基-2-丁酮或其类似物浓度为10-250g/L；优选浓度不超过200g/L。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合体系中还含有磷酸缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、葡萄糖脱氢酶、酮还原酶固定化酶和葡萄糖。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶通过下述步骤制备得到：
(i)将酮还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶混合得到酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液；
(ii)将酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液和预处理的载体树脂混合，得到酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
7.一种酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将酮还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶混合得到酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液；
(2)将酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的混合液和预处理的载体树脂混合，得到酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶粗酶液通过下述步骤制备得到：使酮还原酶基因工程菌进行发酵培养得到的菌体裂解得到酮还原酶粗酶液。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的载体树脂通过下述步骤制备得到：将载体树脂与缓冲液混合后过滤抽干，然后加入含有戊二醛的缓冲液，混合后得到预处理的载体树脂。
10.如权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述载体树脂经过戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸衍生物等试剂处理得到含有醛基、氨基、羟基和羧基的载体，含有这些基团的载体以共价键与酶连接，形成固定化酶。
11.一种通过如权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的(S)-1，2，4-丁三醇。
12.一种如权利要求11所述的(S)-1，2，4-丁三醇的应用。
13.一种通过如权利要求7-10任一项所述的制备方法得到的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
14.一种如权利要求13所述的酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶在合成(S)-1，2，4-丁三醇中的应用。
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Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1705468A (zh) * | 2002-10-24 | 2005-12-07 | 宝洁公司 | 核激素受体化合物、产品以及它们的使用方法 |
| US7122331B1 (en) * | 1999-08-04 | 2006-10-17 | Wolfgang Eisenreich | Isoprenoid biosynthesis |
| JP2008109922A (ja) * | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Nara Institute Of Science & Technology | 新規な（ｓ）−ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用したアルコールの製造方法 |
| WO2008127291A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-10-23 | Los Alamos National Security, Llc | Advanced drug development and manufacturing |
| CN101512004A (zh) * | 2006-07-19 | 2009-08-19 | 密歇根州州立大学托管委员会 | D-1,2,4-丁三醇的微生物合成 |
| US20110165641A1 (en) * | 2006-03-31 | 2011-07-07 | The Board Of Trustees Of Michigan State University | Synthesis of 1,2,4-Butanetriol Enantiomers from Carbohydrates |
| CN103756949A (zh) * | 2014-01-15 | 2014-04-30 | 盐城工学院 | 一种产超高光学纯度r,r-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN104988133A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法 |
| CN104988132A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 |
| CN108148796A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-12 | 北京理工大学 | 一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成d-1,2,4-丁三醇的方法 |
| WO2019008131A1 (en) * | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | PSEUDOMONAS PUTIDA RECOMBINANT FOR THE PRODUCTION OF D-XYLONATE FROM D-XYLOSE |
| CN110129307A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-16 | 南京趣酶生物科技有限公司 | 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 |
| CN111378695A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-07 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 合成r-3-(2-氯-1-羟基乙基)苯酚的方法、去氧肾上腺素、滴眼剂 |
| CN111592495A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-08-28 | 上海启讯医药科技有限公司 | 一种2-正丁基-4-氯-5甲酰基咪唑的制备方法 |
| CN112941114A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-06-11 | 江苏惠利生物科技有限公司 | 一种酶法合成(s)-1,2,4-丁三醇的方法 |
| CN114317127A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-12 | 嘉庚创新实验室 | 一种无氟清洗剂、其制备方法及应用 |
| CN115108963A (zh) * | 2021-03-19 | 2022-09-27 | 上海启讯医药科技有限公司 | 一种化合物及其制备方法和用途 |
-
2021
- 2021-06-04 CN CN202110623606.0A patent/CN113337546B/zh active Active
Patent Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7122331B1 (en) * | 1999-08-04 | 2006-10-17 | Wolfgang Eisenreich | Isoprenoid biosynthesis |
| CN1705468A (zh) * | 2002-10-24 | 2005-12-07 | 宝洁公司 | 核激素受体化合物、产品以及它们的使用方法 |
| US20110165641A1 (en) * | 2006-03-31 | 2011-07-07 | The Board Of Trustees Of Michigan State University | Synthesis of 1,2,4-Butanetriol Enantiomers from Carbohydrates |
| CN101512004A (zh) * | 2006-07-19 | 2009-08-19 | 密歇根州州立大学托管委员会 | D-1,2,4-丁三醇的微生物合成 |
| US20110076730A1 (en) * | 2006-07-19 | 2011-03-31 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Microbial synthesis of d-1,2,4-butanetriol |
| JP2008109922A (ja) * | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Nara Institute Of Science & Technology | 新規な（ｓ）−ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用したアルコールの製造方法 |
| WO2008127291A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-10-23 | Los Alamos National Security, Llc | Advanced drug development and manufacturing |
| CN103756949A (zh) * | 2014-01-15 | 2014-04-30 | 盐城工学院 | 一种产超高光学纯度r,r-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN104988133A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法 |
| CN104988132A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 |
| WO2019008131A1 (en) * | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | PSEUDOMONAS PUTIDA RECOMBINANT FOR THE PRODUCTION OF D-XYLONATE FROM D-XYLOSE |
| CN108148796A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-12 | 北京理工大学 | 一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成d-1,2,4-丁三醇的方法 |
| CN110129307A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-16 | 南京趣酶生物科技有限公司 | 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 |
| CN111378695A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-07 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 合成r-3-(2-氯-1-羟基乙基)苯酚的方法、去氧肾上腺素、滴眼剂 |
| CN111592495A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-08-28 | 上海启讯医药科技有限公司 | 一种2-正丁基-4-氯-5甲酰基咪唑的制备方法 |
| CN115108963A (zh) * | 2021-03-19 | 2022-09-27 | 上海启讯医药科技有限公司 | 一种化合物及其制备方法和用途 |
| CN112941114A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-06-11 | 江苏惠利生物科技有限公司 | 一种酶法合成(s)-1,2,4-丁三醇的方法 |
| CN114317127A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-12 | 嘉庚创新实验室 | 一种无氟清洗剂、其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FEDERICA DALLOGLIO: "Flow-based stereoselective reduction of ketones using an immobilized ketoreductase/glucose dehydrogenase mixed bed system", 《CATALYSIS COMMUNICATIONS》, vol. 93, pages 29 - 32, XP029949402, DOI: 10.1016/j.catcom.2017.01.025 * |
| 杨套伟等: "一种转化4-羟基-2-丁酮为1, 3-丁二醇微生物的筛选及鉴定", 《工业微生物》, no. 5, pages 39 - 43 * |
| 马鹏飞等: "重组大肠杆菌利用D-木糖合成D-1, 2, 4-丁三醇", 《化工学报》, vol. 66, no. 7, pages 2620 - 2627 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113337546B (zh) | 2023-09-12 |
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