CN108148796A - 一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成d-1,2,4-丁三醇的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成d-1,2,4-丁三醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成D‑1，2，4‑丁三醇的方法，属于生物技术领域。在大肠杆菌中敲除xylA、yjhH和yagE，过表达mdlC和xdh的基础上，进一步敲除2‑酮酸还原酶基因、丙酮醛合酶基因、转氨酶基因、转氢酶基因、乙酸激酶基因和磷酸转乙酰基酶基因中的一种以上；和/或过量表达木糖酸脱水酶基因、醇脱氢酶基因和6‑磷酸‑葡萄糖脱氢酶基因中的一种以上，得到重组大肠杆菌。以木糖为基础底物，还可添加葡萄糖、乙酸、甘油形成复合底物，重组大肠杆菌生物合成D‑1，2，4‑丁三醇副产物极少。所述制备方法简单，生产周期短，成本较低，具有很好的工业开发和应用前景。

Description

一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成D-1，2，4-丁三醇的 方法
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成D-1，2，4-丁三醇的方法，属于生物技术领域。
背景技术
D-1，2，4-丁三醇是一种重要的精细化工产品，广泛应用于军工、医药、烟草、化妆品、造纸、农业和高分子材料等领域。在军工领域，D-1，2，4-丁三醇的硝基化合物1，2，4-丁三醇三硝酸酯是一种良好的含能增塑剂，可替代硝化甘油作为硝酸酯增塑的聚醚推进剂(NEPE)推进剂及高能、高新配方推进剂。1，2，4-丁三醇三硝酸酯的冲击感、毒性、挥发性和吸湿性均比硝化甘油小，而且热稳定性好，能和其他含能增塑剂混合使用。1，2，4-丁三醇三硝酸酯分子结构中存在不对称碳原子，具有两个对应异构物。通常合成的1，2，4-丁三醇三硝酸酯是外消旋的，因此它的低温性能特别好，能显著的提高以硝化纤维为基础的火药低温力学性能。1，2，4-丁三醇三硝酸酯冰点为-11℃，在纯态下难于冻结，用它作增塑剂对于防止推进剂低温脆变是非常有效的。在医药领域，D-1，2，4-丁三醇可作为一些新型药物合成的关键前体物，如阳离子脂质体，3-羟基四氢呋喃和安瑞那韦(抗艾滋病药物)。作为卷烟添加剂，它可消除硝基化合物对人体的毒害，减少焦油成分的危害；作为抗微生物的重要组成部分，可有效阻止微生物生长；在彩色显影液中，它可增加色彩度和黏着力；在材料领域，可作为单体物质合成聚氨酯泡沫，具有比自然纤维更好的弹性和压折特征；另外D-1，2，4-丁三醇在日常生活中也有着广泛应用，可用作高级墨水的防干剂、高级服装的表面处理剂、陶瓷加工助剂、特殊用途包装与储运等。
目前，1，2，4-丁三醇的工业合成主要采用化学合成法，高温高压下D，L-苹果酸可被NaBH4催化氢化，一步合成D，L-1，2，4-丁三醇。化学合成中，约25％的初始反应物转化为副产品，不仅限制了丁三醇的产率，也加大了后续提纯工序的难度。随着生物技术的不断进步，许多具有高价值的商品，如药物化合物和生物炼制等，都可通过在微生物中构建相关代谢通路，进而实现高水平的生产。作为新一代的合成技术，生物代谢工程相比传统的化学工程具有明显的优势，即低污染，低成本和高效率。因此，丁三醇的微生物合成法逐渐得到了广泛研究。
2003年，美国Frost实验室(Niu W，Molefe M N，Frost J W.Microbial synthesisof the energetic material precursor 1，2，4-butanetriol[J].Journal of theAmerican Chemical Society，2003，125(43)：12998-12999.)首次报道出利用“双菌法”以D-木糖和L-阿拉伯糖为底物生物合成1，2，4-丁三醇外消旋体。该合成过程包括两步，首先利用莓实假单胞菌将木糖和阿拉伯糖转化为各自的糖酸，而重组大肠杆菌将糖酸最终转化为丁三醇。该报道也首次采用来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶基因(mdlC)催化2-酮基-3-脱氧-木糖酸脱羧基形成3，4-二羟基丁醛。2008年，美国Frost实验室申报了首个利用微生物合成D-1，2，4-丁三醇的技术专利。专利中，该研究团队以D-木糖为底物，通过在大肠杆菌中异源表达来自新月柄杆菌的木糖脱氢酶(xylBcc)和来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)，首次在大肠杆菌中直接合成了丁三醇(Frost JW，Niu W.Microbialsynthesis of D-1，2，4-butanetriol.Patent，Pub.No.：WO 2008/091288 A2(2008).)。
在Frost实验室研究基础上，后续很多国内外研究团队对丁三醇生物合成途径及宿主代谢网络进行优化，但是仍然存在以下主要缺点：
(1)丁三醇生物合成途径本身还需进一步的优化。所述生物代谢途径中木糖酸脱水酶(yjhG和yagF)和苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)活性较低，是途径中的潜在限速步骤，需对其进行酶活性改造或替换更高活性的异源酶；此外，低于30％的丁三醇转化率或许归因于潜在的旁支途径，新的旁支途径还需进一步发掘；
(2)过多关注丁三醇生物合成通路，忽略了宿主菌的生长。对大肠杆菌自身木糖同化途径(xylA)的失活，使丁三醇生产菌株丧失了在木糖为唯一碳源的培养基中的生长，需添加第二碳源来改善菌株生长状况；
(3)未考虑到胞内还原型辅酶I(NADH)/还原型辅酶II水平对丁三醇合成的影响。丁三醇合成途径包含辅酶I(NAD+)依赖的木糖脱氢酶(xylBcc)，和辅酶II(NADP+)依赖的醇脱氢酶(yqhD)，途径的高效运行势必对宿主胞内的氧化还原状态产生大的影响。通过调控胞内NADH/NADPH水平，可缓解宿主由丁三醇合成途径的运行所带来的氧化还原压力。
2015年，北京理工大学的高海军等(马鹏飞，蒙坚，周静，高海军.重组大肠杆菌利用D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇.化工学报Vol.66 No.7.2015.7：2620-2627.)通过克隆表达恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)2-酮酸脱羧酶基因mdlC和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)D-木糖脱氢酶基因xdh，敲除木糖利用和D-1，2，4-丁三醇合成中间代谢物分解途径中关键基因木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE，重构大肠杆菌代谢网络，得到了能够将D-木糖转化为D-1，2，4-丁三醇的大肠杆菌菌株MJ133K-1，还在此基础上探讨了葡萄糖利用与丁三醇合成的关系，通过敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG改造重组菌株的磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶(phosphoenolpyruvate：sugar phosphotransferase system，PTS)系统，得到的重组大肠杆菌菌株MJ134K-1可以在利用葡萄糖生长的同时进行木糖的转化，具有更高的合成能力；但是仍然需要进一步提高丁三醇的合成量和转化率。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种重组大肠杆菌。
本发明的目的之二在于提供一种本发明所述重组大肠杆菌的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种本发明所述重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种重组大肠杆菌，由如下方法制得：
通过在大肠杆菌中敲除木糖利用和D-1，2，4-丁三醇合成中间代谢物分解途径中关键基因木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE，克隆表达恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)2-酮酸脱羧酶基因mdlC和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)D-木糖脱氢酶基因xdh得到的重组大肠杆菌菌株基础上，进行操作如下：
敲除2-酮酸还原酶基因、丙酮醛合酶基因、转氨酶基因、转氢酶基因、乙酸激酶基因和磷酸转乙酰基酶基因中的一种以上；和/或
过量表达木糖酸脱水酶基因、醇脱氢酶基因和6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因中的一种以上，得到重组大肠杆菌I，为本发明所述的一种重组大肠杆菌。
更优选在重组大肠杆菌I的基础上，进一步敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，得到重组大肠杆菌II，为本发明所述的一种重组大肠杆菌。
基因敲除顺序没有限制，优选采用Red同源重组技术进行基因敲除；过表达基因顺序也没有限制。
优选大肠杆菌为K12系列；更优选为K12系列中的MG1655。
木糖异构酶基因xylA在美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)中的基因登录号为948141，来源于大肠杆菌，进行敲除是为了阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
2-酮酸醛缩酶基因yjhH在NCBI中的基因登录号为948825，来源于大肠杆菌，进行敲除是为了阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
2-酮酸醛缩酶基因yagE在NCBI中的基因登录号为944925，来源于大肠杆菌，进行敲除是为了阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
2-酮酸脱羧酶基因mdlC在NCBI中的基因登录号为AY143338.1，来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)，可催化2-酮酸3-脱氧D-戊酮糖酸转化成3，4-二羟基丁醛，过量表达载体为pTrc99a。
D-木糖脱氢酶基因xdh在NCBI中的基因登录号为941308，来源于新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)，可催化的D-木糖转变成D-木糖酸，过量表达载体为pTrc99a。
优选2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE，在NCBI中的基因登录号为3798160，来源于大肠杆菌，可将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源。
优选丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA，在NCBI中的基因登录号为945574，来源于大肠杆菌，催化产生的丙酮醛会增大葡萄糖对木糖利用的抑制作用，敲除mgsA可一定程度促进葡萄糖和木糖同时利用。
优选所述转氨酶基因为转氨酶基因aspC，在NCBI中的基因登录号为945553，来源于大肠杆菌，可将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源。
优选转氢酶基因为转氢酶基因pntA，在NCBI中的基因登录号为946628，来源于大肠杆菌，可将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源。
优选乙酸激酶基因为乙酸激酶基因ackA，在NCBI中的基因登录号为946775，来源于大肠杆菌，可用于合成乙酸，可将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源，同时生成的乙酸对菌株生长产生抑制。
优选磷酸转乙酰基酶基因为磷酸转乙酰基酶基因pta，在NCBI中的基因登录号为946778，来源于大肠杆菌，可用于合成乙酸，可将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源，同时生成的乙酸对菌株生长产生抑制。
优选木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD，在NCBI中的基因登录号为7329902，来源于新月柄杆菌，相应的酶具有高效的催化木糖酸转变为2-酮-3-脱氧-D-戊酮糖酸的活性，优选过量表达载体为pTrc99a。
优选醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD，在NCBI中的基因登录号为947493，来源于大肠杆菌，可以催化中间物3，4-二羟基丁醛转化为产物D-1，2，4-丁三醇，过量表达可以进一步强化D-1，2，4-丁三醇的合成，优选过量表达载体为pTrc99a。
优选6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因为6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf，在NCBI中的基因登录号为946370，该酶过量表达后可增强大肠杆菌的磷酸戊糖途径，使细胞内产生更多的NADPH，促进丁三醇的合成，优选过量表达载体为pBBR1MCS。
葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG在NCBI中的基因登录号为945651，来源于大肠杆菌，可转移性向细胞内转运葡萄糖，敲除ptsG可一定程度促进葡萄糖和木糖同时利用。
一种本发明所述重组大肠杆菌的制备方法，所述方法可采用如下步骤：
步骤一、制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心(CGSC)购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，提取其基因组为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，即获得打靶片段DNA；优选PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应扩增体系
表2 PCR反应条件
上游引物为xylA-S：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3’，为核苷酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ ID No.1(以下简称SEQ ID No.1，其余引物序列依次顺序命名)，下游引物为xylA-AN：5’-TACGCCCGAGGTGCCAAGAT-3’(SEQ ID No.2)。
2.感受态细胞制备
将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞。
3.目的基因的敲除
将打靶片段DNA转入感受态细胞中，加入SOC培养基培养，然后在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证，所述验证一般采用测定DNA序列的方法进行，比如用所述的引物xylA-S，xylA-AN，以基因组DNA为模板，扩增出新的DNA片段，将DNA片段送到测序公司测定序列后，与目标序列进行比对，符合预期即为敲除成功，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1。
4.卡那霉素抗性基因的去除
接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，再转接至新鲜LB培养基培养，然后制成感受态细胞，转入pCP20质粒，在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，挑取单菌落，在LB液体培养基培养后，在LB固体培养基培养；分别挑取LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌生长，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因。
步骤二、制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物为yjhH-S：5’-AACTATGCAATCTCACTTTCTGGC-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为yjhH-AN：5’-CATCTCTGCGGTTAATGGGAGTTCG-3’(SEQ ID No.4)，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤三、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物为yagE-S：5’-AGTATGATCGTTAAATAAACGAACG-3’(SEQ ID No.5)，下游引物为yagE-AN：5’-TTTCTCAATGGTCATCGTTATCGTC-3’(SEQ ID No.6)，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤四、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和2-酮酸还原酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B系列(B-X)
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除2-酮酸还原酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株B系列，缩写为B-X，X代表该系列中具体一种重组大肠杆菌菌株，取值为正整数，如X为1时，就是B系列中的B-1，下文涉及X处含义相同。
优选2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE。
当2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物为yiaE-S：5’-GCGCGACAAAATGCGCGGCACTGGT-3’(SEQ ID No.7)，下游引物为yiaE-AN：5’-CTGTCTACAACCGGGCGCAGA-3’(SEQ ID No.8)；其余方法同步骤一。
步骤五、制备丙酮醛合酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株C-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3或B-X的基础上进一步敲除丙酮醛合酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株C-X。
优选丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA。
当丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物为mgsA-S：5’-TAATGGACCGCATCAGTTA-3’(SEQ ID No.9)，下游引物为mgsA-AN：5’-GTGATTTAGACACGAC-3’(SEQ ID No.10)；其余方法同步骤一。
步骤六、制备转氨酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株D-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氨酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X或C-X的基础上进一步敲除转氨酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株D-X。
优选转氨酶基因为转氨酶基因aspC。
当转氨酶基因为转氨酶基因aspC时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氨酶基因aspC缺陷型大肠杆菌菌株JW0911-1，上游引物为aspC-S：5’-TTTTCAGCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCACTGCCACAATCGC-3’(SEQ ID No.11)，下游引物为aspC-AN：5’-TACCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATG-3’(SEQ ID No.12)；其余方法同步骤一。
步骤七、制备转氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株E-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X或D-X的基础上进一步敲除转氢酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株E-X。
优选转氢酶基因为转氢酶基因pntA。
当转氢酶基因为转氢酶基因pntA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氢酶基因pntA缺陷型大肠杆菌菌株JW1595-1，上游引物为pntA-S：5’-CTGACACAGGCAAACCATCATCAATAAAACCGATGGAAGGGAATATCATG-3’(SEQ ID No.13)，下游引物为pntA-AN：5’-TAACTAATCCTCCAGACATATGTTACCCCTTAATTTTTGCGGAACATTTT-3’(SEQ ID No.14)；其余方法同步骤一。
步骤八、制备乙酸激酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株F-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的乙酸激酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X、D-X或E-X的基础上进一步敲除乙酸激酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株F-X。
优选乙酸激酶基因为乙酸激酶基因ackA。
当乙酸激酶基因为乙酸激酶基因ackA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的乙酸激酶基因ackA缺陷型大肠杆菌菌株JW2293-1，上游引物为ackA-S：5’-TGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCATG-3’(SEQ ID No.15)，下游引物为ackA-AN：5’-GCACCGCCAGCTGAGCTGGCGGTGTGAAATCAGGCAGTCAGGCGGCTCGC-3’(SEQ ID No.16)；其余方法同步骤一。
步骤九、制备磷酸转乙酰基酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株G-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的磷酸转乙酰基酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X、D-X、E-X或F-X的基础上进一步敲除磷酸转乙酰基酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株G-X。
优选磷酸转乙酰基酶基因为磷酸转乙酰基酶基因pta。
当磷酸转乙酰基酶基因为磷酸转乙酰基酶基因pta时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的磷酸转乙酰基酶基因pta缺陷型大肠杆菌菌株JW2294-1，上游引物为pta-S：5’-GCTGTTTTGTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTG-3’(SEQ ID No.17)，下游引物为pta-AN：5’-GCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATTACTGCTGCTGTGCAGACTG-3’(SEQ ID No.18)；其余方法同步骤一。
步骤十、制备葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG敲除的重组大肠杆菌菌株H-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG缺陷型大肠杆菌JW1087-2，上游引物为ptsG-S：5’-GCGTGAGAACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATG-3’(SEQ ID No.19)，下游引物为ptsG-AN：5’-CTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGATTAGTGGTTACGGATGTACTC-3’(SEQ ID No.20)；在重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X或G-X的基础上进一步敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株H-X。
其余方法同步骤一。
步骤十一、构建过表达2-酮酸脱羧酶基因mdlC和D-木糖脱氢酶基因xdh的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株I-X
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)基因组为模板，用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物为mdlC-S：5’-GGACGCCCATGGCTTCGGTACACGGCA-3’(SEQ ID No.21)，mdlC-S序列中加粗斜体为限制性内切酶Nco I的酶切位点，下游引物为mdlC-AN：5’-ACGTCAGGATCCTCACTTCACCGGGCTTACG-3’(SEQID No.22)，mdlC-AN序列中加粗斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点，PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTrM；
(3)将重组载体质粒pTrM，采用限制性内切酶BamHI和Hind III处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)基因组为模板，用PCR扩增D-木糖脱氢酶基因xdh的基因片段，添加了核糖体结合位点(RBS)的上游引物为xdh-S：5’-CATGCTGGATCCTAATTTTGTTTAACTTTAAGtaaggaggATATATTATGTCCTCAGCCATCTATCC-3’(SEQ ID No.23)，xdh-S序列中加粗斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点，小写字母为RBS；下游引物为xdh-AN：5’-AAGTGACTCAAGCTTCCTGCAGGAATTCTAGATCTTAGGTCAACGCCAGCCG-3’(SEQ ID No.24)，xdh-AN序列中加粗斜体为限制性内切酶Hind III的酶切位点，PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶BamHI和Hind III处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(4)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMX；
(5)将重组载体质粒pTMX转化入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMX的重组大肠杆菌菌株I-X。
步骤十二、构建过表达木糖酸脱水酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株J-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTMX采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖酸脱水酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXD-Y-X，其中，Y表示质粒中新增的基因个数，取值为正整数，如Y为1时，表示质粒中新增1个基因，下文涉及Y处含义相同，本步骤重组载体质粒为pTMXD-1-X；
(3)将重组载体质粒pTMXD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-1-X的重组大肠杆菌菌株J-X。
优选木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD。
当木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD时：
限制性内切酶为NcoI和BamHI；以新月柄杆菌CB15(ATCC)基因组为模板，采用PCR方法扩增木糖酸脱水酶基因xylD的基因片段，上游引物为xylD-S：5’-GCGTTGACCTAAGATCTAGATCTAGAGtcacacaggaaagATGAGTTCTCTAACCGCACGCC-3’(SEQ ID No.25)，xylD-S中的小写字母代表RBS，下游引物为xylD-AN：5’-CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTGCGGCCGCAGAATTCAGCGC-3’(SEQ ID No.26)。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十二1构建的重组载体质粒pTMXD-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTMXD-1-X中没有的另一个木糖酸脱水酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXD-2-X；
(3)将重组载体质粒pTMXD-2-X转化入大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-2-X的重组大肠杆菌菌株J-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十二2类似。
步骤十三、构建过表达醇脱氢酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株K-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTMXD-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醇脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醇脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXDE-Y-X，本步骤重组载体质粒为pTMXDE-1-X；
(3)将重组载体质粒pTMXDE-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-1-X的重组大肠杆菌菌株K-X。
优选醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD。
当醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD时：
限制性内切酶为XbaI和HindIII；以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR方法扩增醇脱氢酶基因yqhD的基因片段，上游引物为yqhD-S：5’-AACCACTGATGCGAATCACACAGGAAAGATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3’(SEQ ID No.27)，yqhD-S中的斜体字母代表与载体序列同源，下游引物为yqhD-AN：5’-TCATCCGCCAAAACAGCCATTAGCGGGCGGCTTCGTATAT-3’(SEQ IDNo.28)，yqhD-AN中的斜体字母代表与载体序列同源。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十三1构建的重组载体质粒pTMXDE-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTMXDE-1-X中没有的另一个醇脱氢酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXDE-2-X；
(3)将重组载体质粒pTMXDE-2-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-2-X的重组大肠杆菌菌株K-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十三2类似。
步骤十四、构建过表达6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株L-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pBBR1MCS采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pBZ-Y-X，本步骤重组载体质粒为pBZ-1-X；
(3)将重组载体质粒pBZ-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株I-X、J-X或K-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pBZ-1-X的重组大肠杆菌菌株L-X。
优选6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因为6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf。
当6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因为6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf时：
限制性内切酶为salI和HindIII；以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR方法扩增6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf的基因片段，上游引物为zwf-S：5’-GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGATGGCGGTAACGCAAACAG-3’(SEQ ID No.29)，zwf-S中的斜体字母代表与载体序列同源，下游引物为zwf-AN：5’-GGGCTGCAGGAATTCGATATCACATAAAGGATAAGCGCAGATA-3’(SEQ ID No.30)，zwf-AN中的斜体字母代表与载体序列同源。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十四1构建的重组载体质粒pBZ-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pBZ-1-X中没有的另一个6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pBZ-2-X；
(3)将重组载体质粒pBZ-2-X转化入大肠杆菌菌株I-X、J-X或K-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pBZ-2-X的重组大肠杆菌菌株L-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十四2类似。
所述重组大肠杆菌菌株B-X、重组大肠杆菌菌株C-X、重组大肠杆菌菌株D-X、重组大肠杆菌菌株E-X、重组大肠杆菌菌株F-X、重组大肠杆菌菌株G-X、重组大肠杆菌菌株H-X、重组大肠杆菌菌株I-X、重组大肠杆菌菌株J-X、重组大肠杆菌菌株K-X和重组大肠杆菌菌株L-X为本发明所述的一种重组大肠杆菌。
所述制备方法中，主要涉及以下方法：
方法1：重组大肠杆菌的基因敲除方法
使微生物基因不能表达或表达出不具有正常功能蛋白的方法有多种，如传统的物理或化学诱变、基因敲除法、转座子插入失活、RNA干扰法、CRASPA/CAS9等，这些方法均可用于本发明申请中，实现目标基因的敲除。
其中，优选采用Red同源重组技术进行基因敲除，技术原理如下：
Red同源重组技术是在λ噬菌体Red重组酶(Exo、Beta、Gam三种蛋白)的作用下，线性标记片段与染色体的特定靶序列进行同源重组从而使靶基因被标记基因置换，以达到基因敲除的目的。通常线性标记片段两端与靶基因的两端为同源序列，同源臂序列的加长有利于同源重组的进行，本发明设计的同源臂均为30bp以上。
Red同源重组技术进行基因敲除可参考文献(Datsenko KA，Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A.2000，97(12)：6640-6645.)的操作步骤。
方法2：基因扩增方法
采用聚合酶链式反应(PCR)方法进行基因扩增。
方法3：重组质粒构建方法
重组质粒的构建主要是为了让基因在微生物菌株细胞中进行表达。可以通过现有技术中的全基因合成方法、与现有载体连接方法等构建。
方法4：Gibson DNA或T4DNA酶连接方法。
是一种将不同的DNA(基因、质粒)片段相连接的方法。主要用于构建重组质粒在大肠杆菌中表达本发明中不同的基因。
一种本发明所述重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取本发明所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，得到活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；
(2)挑取单菌落接种于种子培养基，即普通LB培养基中，于30℃～40℃培养，摇床转速100r/min～250r/min，过夜培养；
(3)发酵培养基采用LB液体培养基，根据重组大肠杆菌中重组载体质粒的抗性，加入相应抗生素，加入CaCO3以调节发酵过程中的pH＞5；将步骤(2)培养好的菌液转接于发酵培养基，在30℃～35℃，100r/min～250r/min条件下进行发酵，转接6h后加入终浓度为5g/L～50g/L的底物以及终浓度为0.1mmol/L～10mmol/L IPTG诱导，发酵48h～72h发酵结束；所述底物为D-木糖，或D-木糖、葡萄糖、乙酸或甘油中的一种以上。
有益效果
1.本发明提供了一种重组大肠杆菌及其制备方法，所述重组大肠杆菌是携带丁三醇合成途径并经过改造的重组大肠杆菌，最终优化的重组菌已具备工业生产的潜质，可合成8g/L以上的D-1，2，4-丁三醇，摩尔转化率达到55％，为丁三醇的工业化大规模生产奠定了坚实的基础；
2.本发明提供了一种重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，首次将优化重点放在丁三醇合成途径与宿主生长的相适性上，区别于其他研究主要集中在途径本身，而忽略宿主生长情况；通过在生物合成途径、细胞内NADH/NADPH水平，底物利用等三个方面对丁三醇的生物合成进行全方位多角度优化，通过设计合理实验方案，提高了丁三醇的产量及转化率，为丁三醇的工业化生产奠定坚实的理论基础；
3.本发明提供了一种重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，所述方法在Frost构建的合成途径基础上重新提出了一条更高效的丁三醇生物合成通路，提高了丁三醇产量及转化率，还发现了两个主要旁支途径，深度优化了丁三醇生物合成通路；
4.本发明提供了一种重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，探索了丁三醇合成与胞内辅因子水平的相关性。PPP途径是丁三醇合成所需NADPH的重要来源，表达6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf，可加强PPP途径通量，更有利于胞内丁三醇合成；敲除转氢酶pntA，阻止了胞内NADH向NADPH的转化，可使宿主细胞达到新的NADH/NADPH平衡，通过调控优化了细胞内NADH/NADPH的水平，使其更有利于丁三醇合成，提高了丁三醇产量；
5.本发明提供了一种重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，所述方法首次应用葡萄糖-木糖双底物合成体系合成丁三醇，以木糖作为合成底物，专一负责丁三醇的转化；而葡萄糖、乙酸或甘油等作为生长底物，负责菌体自身生长和合成途径还原力供应，既实现的丁三醇的高效合成，同时有效兼顾了宿主菌的生长，真正达到了生长和合成的“双赢”，通过敲除丙酮醛合酶mgsA、葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG等，可使菌株同时利用木糖、葡萄糖、乙酸或甘油作为底物利用，实现了丁三醇产量及转化率的大幅度提升。
具体实施方式
以下实施例中，
使用的主要工具酶及试剂盒如表3所示。
表3 主要试剂
主要试剂 来源
PCR扩增试剂盒PrimerSTAR HS TaKaRa
限制性内切酶 Fermentas
质粒提取试剂盒 Omega
DNA胶回收试剂盒 Omega
主要使用培养基、试剂及配制方法：
Gibson DNA组装试剂盒：
(a)配置5×(表示5倍浓缩，下同)等温(ISO)缓冲液，其组成为：浓度为1M，pH值为7.5的Tris-HCl 200μL；浓度为2M的MgCl2 10μL；dNTP(其中ATP、TTP、GTP、CTP浓度为分别为100mM)4μL；浓度为1M的二硫苏糖醇(DTT)20μL；PEG-8000 0.12g；浓度为100mM的NAD 20μL；加超纯水至400μL；
(b)配置Gibson连接体系。其组成为：(1)中配制的5×ISO缓冲液320μL；浓度为10U/μL的T5外切酶0.64μL，浓度为2U/μL DNA聚合酶20μL；浓度为40U/μL的Taq DNA连接酶160μL；加入超纯水至1200μL；
SOB培养基200ml：蛋白胨4g，酵母粉1g，氯化钠0.1g，0.25mol/l氯化钾2ml，加水至总体积为199ml；灭菌后加入2mol/l氯化镁1ml，即得SOB培养基。
SOC培养基800μl：792μl SOB培养基+8μl 500g/L的葡萄糖溶液。
LB液体培养基100ml：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，氯化钠1g，调pH为7.5，加水至总体积为100ml，即得LB液体培养基。
LB固体培养基100ml：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，氯化钠1g，琼脂粉1.5g，加水至总体积为100ml，凝固后得LB固体培养基。
LB发酵培养基100ml：蛋白胨1.5g，酵母粉0.75g，氯化钠1.5g，加水至总体积为100ml，得到发酵培养基。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranos，IPTG)、氨苄青霉素钠(Ampicillin)、硫酸卡那霉素(Kanamycin)和氯霉素(ChlorampHenicol)购自sigma公司。
酵母提取物和胰蛋白胨为Oxoid公司产品；其中，常用抗生素浓度为氨苄青霉素100μg/mL；卡那霉素50μ/mL；氯霉素25μ/mL。
主要生物材料：
质粒pDHC29(空)见文献Phillips GJ，Park SK，Huber D.High copy numberplasmids compatible with commonly used cloning vectors.Biotechniques.2000；28：400-406；
质粒pTrc99a(空)在NCBI中的登录号为U13872.1、含有RED重组酶的pKD46和含有翻转酶重组酶(FLP)的pCP20购自于耶鲁大学菌种保藏中心；
质粒pBBR1MCS在NCBI中的登录号为U02374.1，氯霉素抗性。
本发明所用大肠杆菌K12系列的MG1655(CGSC 6300)菌株购自于耶鲁大学菌种保藏中心，恶臭假单胞菌ATCC12633和新月柄杆菌CB15购自美国典型微生物菌种保藏中心。
实施例1
步骤一、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，将购买的菌株进行活化后挑取单菌落于LB液体培养基中过夜培养，取1.5mL培养好的菌液于离心管中，12000r/min离心1min得到菌体后，用1/3菌液体积的无菌水重悬；于干式恒温器99℃裂解10min后作为打靶片段DNA的模板，使用Takara公司的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，即获得打靶片段DNA；PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表4所示。
表4 PCR反应条件
上游引物为xylA-S：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为xylA-AN：5’-TACGCCCGAGGTGCCAAGAT-3’(SEQ ID No.2)。
2.感受态细胞制备
将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞，具体步骤如下：
(1)取500μL转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌菌液，转接于50mL新鲜SOB培养基中，于30℃摇瓶培养至菌液的OD600＝0.2；
(2)向步骤(1)培养的菌液中加入阿拉伯糖诱导Red重组酶的表达，阿拉伯糖的终浓度为10mmol/L，转到37℃继续培养至菌液的OD600＝0.5；
(3)取1.5mL步骤(2)培养的菌液于离心管中，冰浴15min，于4℃，4000×g离心5min，弃上清，用-20℃预冷，用1mL体积分数为10％的甘油重悬离心管中菌体，再在4000×g离心5min，弃上清，重复离心、弃上清和甘油重悬离聚菌体，然后采用体积分数为10％的甘油清洗菌体3次，最后用200μL体积分数为10％的甘油重悬菌体制成感受态细胞。
重组大肠杆菌菌株的感受态细胞的制备方法如下：
(1)挑取重组大肠杆菌菌株，在LB固体培养基上划线活化，37℃，恒温培养14h；
(2)挑取LB固体培养基上长出的单菌落，转入50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养12h；
(3)吸取步骤(2)培养的菌液500μL，转接至50mL LB液体培养基中，加入1mL浓度为1mol/L的MgSO4，MgSO4终浓度为20mmol/L，在37℃，200rpm，振荡培养2h至OD590＝0.4；
(4)将步骤(3)培养得到的菌液分装至2个30mL离心管中，4℃，5000rpm离心5min，弃上清液；
(5)向每个离心管中加入10mL，-20℃预冷的转化缓冲液(TFB)I，重悬菌体，冰浴5min；
(6)将步骤(5)中冰浴后的离心管在4℃，5000rpm离心5min，弃上清液，每个离心管加入1mL，-20℃预冷的转化缓冲液(TFB)II，重悬菌体，冰浴1h；
(7)将步骤(6)重悬冰浴后的菌液分装至20个1.5mL离心管中，每管100μL，在-40℃保存备用；
所述TFB I的组成为：浓度为30mmol/的KaOAC，浓度为100mmol/L的RbCl，浓度为10mmol/L的CaCl2，浓度为50mmol/L的MnCl2，体积分数为10％的甘油，用乙酸调节至pH值为5.8。
缓冲液TFB II的组成为：浓度为10mM的NaMOPS，浓度为75mM的CaCl2，浓度为10mM的RbCl，体积分数为10％的甘油，用3mol/L的盐酸或氢氧化钠调节pH值为7.0。
以下实施例中涉及的重组大肠杆菌菌株感受态细胞均采用相同制备方法。
3.目的基因的敲除
将打靶片段DNA与感受态细胞中充分混匀，转移到2cm的电击杯中，1860V 5ms完成电转化，加入800μl SOC培养基并将离心管置于37℃、190r/min下震荡培养2h。最后5000r/min，1min离心，弃上清液，取剩余菌液200μL重悬菌体涂于含有卡那霉素LB固体培养基筛选平板上，37℃过夜培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证。所述验证一般采用测定DNA序列的方法进行，比如用所述的引物xylA-S，xylA-AN，与卡那霉素抗性基因内部上游引物pKD13-k1-S：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’(SEQ ID No.31)，卡那霉素抗性基因内部下游引物pKD13-k1-AN：5’-GTAGCCAACGCTATGTCCTGA-3’(SEQ ID No.32)，组成交叉引物对进行PCR扩增验证，以基因组DNA为模板，扩增出新的DNA片段，将DNA片段送到测序公司测定序列后，与目标的序列进行比对，扩增条带为1500bp上下的两条带，符合预期，敲除成功，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1；验证PCR反应扩增体系1如表5所示，验证PCR反应扩增体系2如表6所示，PCR反应条件如表4所示。
表5 验证PCR反应扩增体系1
ddH2O 33μL
dNTP混和液 8μL
pKD13-k1-S 2μL
xylA-AN 2μL
PCR扩增缓冲液 50μL
DNA聚合酶PrimerSTAR 1μL
扩增用DNA模板 4μL
合计 100μL
表6 验证PCR反应扩增体系2
ddH2O 33μL
dNTP混和液 8μL
pKD13-k1-AN 2μL
xylA-S 2μL
PCR扩增缓冲液 50μL
DNA聚合酶PrimerSTAR 1μL
扩增用DNA模板 4μL
合计 100μL
4.构建多基因敲除菌株时，卡那霉素抗性基因的消除
若要该构建多基因敲除菌株，则必须将上一次敲除基因得到的菌株的相应抗生素的抗性去除，因为最后需用所述抗性做为筛选标记来筛选成功敲除菌株。pCP20质粒可用来进行菌株的卡那霉素抗性基因消除，pCP20质粒同pKD46质粒一样含有温度敏感型的复制起点，在高温下会丢失。除了氨苄青霉素抗性，pCP20质粒还具有氯霉素抗性。pCP20是敲除实验的常用质粒，这是因为其上含有一个翻转酶重组酶(FLP)基因，FLP重组酶可以与FRT位点结合，在FLP重组酶的作用下，FRT位点自身发生同源重组，从而消除一个FRT位点及抗性基因，在同源区内只残留34bp FRT位点。具体步骤如下：
(1)接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；
(2)将体积分数为1％的步骤(1)培养的菌液转接至新鲜LB液体培养基中，37℃培养至菌液的OD600≈0.6，制备感受态细胞，并转入pCP20质粒；均匀涂布转入pCP20质粒的菌液于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，30℃培养过夜；
(3)挑取在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上生长的单菌落，在LB液体培养基培养后，划线于LB固体培养基中，42℃培养过夜；
(4)分别挑取步骤(3)LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37℃培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因。
步骤二、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物为yjhH-S：5’-AACTATGCAATCTCACTTTCTGGC-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为yjhH-AN：5’-CATCTCTGCGGTTAATGGGAGTTCG-3’(SEQ ID No.4)，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上采用Red同源重组技术敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤三、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物为yagE-S：5’-AGTATGATCGTTAAATAAACGAACG-3’(SEQ ID No.5)，下游引物为yagE-AN：5’-TTTCTCAATGGTCATCGTTATCGTC-3’(SEQ ID No.6)，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤四、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和2-酮酸还原酶基因yiaE敲除的重组大肠杆菌菌株B-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物为yiaE-S：5’-GCGCGACAAAATGCGCGGCACTGGT-3’(SEQ ID No.7)，下游引物为yiaE-AN：5’-CTGTCTACAACCGGGCGCAGA-3’(SEQ ID No.8)，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除2-酮酸还原酶基因yiaE，制备得到重组大肠杆菌菌株B-1。
其余方法同步骤一。
步骤五、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE、2-酮酸还原酶基因yiaE和丙酮醛合酶基因mgsA敲除的重组大肠杆菌菌株C-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物为mgsA-S：5’-TAATGGACCGCATCAGTTA-3’(SEQ ID No.9)，下游引物为mgsA-AN：5’-GTGATTTAGACACGAC-3’(SEQ ID No.10)，在重组大肠杆菌菌株B-1的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除丙酮醛合酶基因mgsA，制备得到重组大肠杆菌菌株C-1。
其余方法同步骤一。
步骤六、采用Red同源重组技术制备转氨酶基因aspC敲除的重组大肠杆菌菌株D-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氨酶基因aspC缺陷型大肠杆菌菌株JW0911-1，上游引物为aspC-S：5’-TTTTCAGCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCACTGCCACAATCGC-3’(SEQ ID No.11)，下游引物为aspC-AN：5’-TACCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATG-3’(SEQ ID No.12)，在重组大肠杆菌菌株C-1的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除转氨酶基因aspC，制备得到重组大肠杆菌菌株D-1。
其余方法同步骤一。
步骤七、采用Red同源重组技术制备转氢酶基因pntA敲除的重组大肠杆菌菌株E-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氢酶基因pntA缺陷型大肠杆菌菌株JW1595-1，上游引物为pntA-S：5’-CTGACACAGGCAAACCATCATCAATAAAACCGATGGAAGGGAATATCATG-3’(SEQ ID No.13)，下游引物为pntA-AN：5’-TAACTAATCCTCCAGACATATGTTACCCCTTAATTTTTGCGGAACATTTT-3’(SEQ ID No.14)，在重组大肠杆菌菌株D-1的基础上进一步敲除转氢酶基因pntA，制备得到重组大肠杆菌菌株E-1。
其余方法同步骤一。
步骤八、采用Red同源重组技术制备乙酸激酶基因ackA敲除的重组大肠杆菌菌株F-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的乙酸激酶基因ackA缺陷型大肠杆菌菌株JW2293-1，上游引物为ackA-S：5’-TGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCATG-3’(SEQ ID No.15)，下游引物为ackA-AN：5’-GCACCGCCAGCTGAGCTGGCGGTGTGAAATCAGGCAGTCAGGCGGCTCGC-3’(SEQ ID No.16)，在重组大肠杆菌菌株E-1的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除乙酸激酶基因ackA，制备得到重组大肠杆菌菌株F-1。
步骤九、采用Red同源重组技术制备磷酸转乙酰基酶基因pta敲除的重组大肠杆菌菌株G-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的磷酸转乙酰基酶基因pta缺陷型大肠杆菌菌株JW2294-1，上游引物为pta-S：5’-GCTGTTTTGTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTG-3’(SEQ ID No.17)，下游引物为pta-AN：5’-GCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATTACTGCTGCTGTGCAGACTG-3’(SEQ ID No.18)，在重组大肠杆菌菌株F-1的基础上进一步敲除磷酸转乙酰基酶基因pta，制备得到重组大肠杆菌菌株G-1。
其余方法同步骤一。
步骤十、采用Red同源重组技术制备葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG敲除的重组大肠杆菌菌株H-1
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG缺陷型大肠杆菌JW1087-2，上游引物为ptsG-S：5’-GCGTGAGAACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATG-3’(SEQ ID No.19)，下游引物为ptsG-AN：5’-CTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGATTAGTGGTTACGGATGTACTC-3’(SEQ ID No.20)；在重组大肠杆菌菌株G-1的基础上进一步敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株H-1。
其余方法同步骤一。
步骤十一、构建过表达2-酮酸脱羧酶基因mdlC和D-木糖脱氢酶基因xdh的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株I-1
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)基因组为模板，用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物为mdlC-S：5’-GGACGCCCATGGCTTCGGTACACGGCA-3’(SEQ ID No.21)，mdlC-S序列中加粗斜体为限制性内切酶Nco I的酶切位点，下游引物为mdlC-AN：5’-ACGTCAGGATCCTCACTTCACCGGGCTTACG-3’(SEQ ID No.22)，mdlC-AN序列中加粗斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点，PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用T4 DNA连接酶将PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段与线性化载体质粒pTrc99a进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTrM，采用NEB公司生产的T4 DNA连接酶试剂盒完成，具体操作如下：
将2μL的PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段25ng、2μL的线性化载体质粒pTrc99a约100ng，1μL连接缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，与4μL水混合均匀，37℃孵育2h，转化入大肠杆菌菌株JM109(ATCC 53323)的感受态细胞，PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段插入线性化载体质粒pTrc99a的Nco I和BamH I位点，筛选，测序验证结果正确，获得正确连接的重组载体质粒pTrM。
(3)将重组载体质粒pTrM采用限制性内切酶BamHI和Hind III处理成线性化载体质粒pTrM，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)基因组为模板，用PCR扩增D-木糖脱氢酶基因xdh的基因片段，添加了核糖体结合位点(RBS)的上游引物为xdh-S：5’-CATGCTGGATCCTAATTTTGTTTAACTTTAAGtaaggaggATATATTATGTCCTCAGCCATCTATCC-3’(SEQ IDNo.23)，xdh-S序列中加粗斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点，小写字母为RBS；下游引物为xdh-AN：5’-AAGTGACTCAAGCTTCCTGCAGGAATTCTAGATCTTAGGTCAACGCCAGCCG-3’(SEQ IDNo.24)，xdh-AN序列中加粗斜体为限制性内切酶Hind III的酶切位点，其余与步骤一1中的PCR扩增体系和反应条件相同；将PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶BamHI和HindIII处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(4)采用T4DNA连接酶将PCR扩增得到的D-木糖脱氢酶基因xdh的基因片段与步骤(3)制得的线性化载体质粒pTrM进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTMX，具体采用试剂盒及操作方法同步骤十一(2)；
(5)将重组载体质粒pTMX转化入重组大肠杆菌菌株B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMX的重组大肠杆菌菌株I-1。
步骤十二、构建过表达木糖酸脱水酶基因xylD的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株J-1
(1)将重组载体质粒pTMX采用限制性内切酶NcoI和BamHI处理成线性化载体质粒pTMX，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以新月柄杆菌CB15(ATCC)基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶xylD基因片段，上游引物为xylD-S：5’-GCGTTGACCTAAGATCTAGATCTAGAGtcacacaggaaagATGAGTTCTCTAACCGCACGCC-3’(SEQ ID No.25)，xylD-S中的小写字母代表RBS，下游引物为xylD-AN：5’-CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTGCGGCCGCAGAATTCAGCGC-3’(SEQ ID No.26)，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的木糖酸脱水酶xylD基因片段与线性化载体质粒pTMX进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTMXD-1-1，采用Gibson连接法完成，具体操作如下：
(a)配置5×(表示5倍浓缩，下同)等温(ISO)缓冲液，其组成为：浓度为1M，pH值为7.5的Tris-HCl 200μL；浓度为2M的MgCl2 10μL；dNTP(其中ATP、TTP、GTP、CTP浓度为分别为100mM)4μL；浓度为1M的二硫苏糖醇(DTT)20μL；PEG-8000 0.12g；浓度为100mM的NAD 20μL；加超纯水至400μL；
(b)配置Gibson连接体系。其组成为：(1)中配制的5×ISO缓冲液320μL；浓度为10U/μL的T5外切酶0.64μL，浓度为2U/μL DNA聚合酶20μL；浓度为40U/μL的Taq DNA连接酶160μL；加入超纯水至1200μL；
(c)DNA连接：2.5μL的DNA片段100ng、2.5μL的线性化的载体与15μL的Gibson连接体系混合，在50℃温育1h，转化入感受态细胞筛选获得正确连接的重组载体。
(3)将重组载体质粒pTMXD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-1-1的重组大肠杆菌菌株J-1。
步骤十三、构建过表达醇脱氢酶基因yqhD的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株K-1
(1)将重组载体质粒pTMXD-1-1采用限制性内切酶XbaI和HindIII处理成线性化载体质粒pTMXD-1-1，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增醇脱氢酶基因yqhD，上游引物为yqhD-S：5’-AACCACTGATGCGAATCACACAGGAAAGATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3’(SEQ ID No.27)，yqhD-S中的斜体字母代表与载体序列同源，下游引物为yqhD-AN：5’-TCATCCGCCAAAACAGCCATTAGCGGGCGGCTTCGTATAT-3’(SEQ ID No.28)，yqhD-AN中的斜体字母代表与载体序列同源；PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的醇脱氢酶基因yqhD基因片段与线性化载体质粒pTMXD-1-1进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTMXDE-1-1，具体采用试剂盒及操作方法同步骤十二(2)；
(3)将重组载体质粒pTMXDE-1-1转化进入重组大肠杆菌菌株B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-1-1的重组大肠杆菌菌株K-1。
步骤十四、构建过表达6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株L-1
(1)将重组载体质粒pBBR1MCS采用限制性内切酶salI和HindIII处理成线性化载体质粒pBBR1MCS，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以大肠杆菌基因组为模板，用PCR扩增6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf片段，上游引物为zwf-S：5’-GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGATGGCGGTAACGCAAACAG-3’(SEQ ID No.29)，zwf-S中的斜体字母代表与载体序列同源，下游引物为zwf-AN：5’-GGGCTGCAGGAATTCGATATCACATAAAGGATAAGCGCAGATA-3’(SEQ ID No.30)，zwf-AN中的斜体字母代表与载体序列同源；PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf基因片段与线性化载体质粒pBBR1MCS进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pBZ-1-1，具体采用试剂盒及操作方法同步骤十二(2)；
(3)将重组载体质粒pBZ-1-1转化进入重组大肠杆菌菌株I-1、J-1或K-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pBZ-1-1的重组大肠杆菌菌株L-1。
本实施例制备得到的主要重组质粒载体如表7所示：
表7 主要重组质粒载体
质粒名称 基因型
pTMX pTrc99a，harboring mdlC，xdh，AmpR
pTMXD-1-1 pTrc99a，harboring mdlC，xdh，xylD，AmpR
pTMXDE-1-1 pTrc99a，harboring mdlC，xdh，xylD，yqhD，AmpR
pBZ-1-1 pBBR1MCS，harboring zwf，CmR
其中，Harboring表示携带相应的基因，AmpR表示质粒中携带氨苄青霉素抗性基因，CmR表示质粒中携带氯霉素抗性基因。
制备得到的优选重组大肠杆菌菌株编号及其主要基因型如表8-1和表8-2所示：
表8-1 优选重组大肠杆菌菌株编号及其主要基因型
菌株编号 基因型
B-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE
C-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA
D-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA ΔaspC
E-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA ΔaspC ΔpntA
F-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA ΔaspC ΔpntA ΔackA
G-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA ΔaspC ΔpntA ΔackA Δpta
H-1 MG1655，ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔyiaE ΔmgsA ΔaspC ΔpntA ΔackA Δpta ΔptsG
I-1 B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1，pTMX
J-1 B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1，pTMXD-1-1
K-1 B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1或H-1，pTMXDE-1-1
其中，MG1655表示大肠杆菌MG1655，Δ表示后面基因被敲除。
表8-2 优选重组大肠杆菌菌株编号及其主要基因型
L-1 I-1、J-1或K-1，pBZ-1-1
表8-2中I-1为将重组载体质粒pTMX转化入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMX的重组大肠杆菌菌株I-1；
表8-2中J-1为将重组载体质粒pTMXD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-1-1的重组大肠杆菌菌株J-1。
表8-2中K-1为将重组载体质粒pTMXDE-1-1转化进入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-1-1的重组大肠杆菌菌株K-1。
实施例2
一种实施例1制备得到的重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取实施例1制备得到的所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，以得到充分活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；实施例1制备得到的重组大肠杆菌为表8中所述的重组大肠杆菌菌株；
(2)挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，于37℃，转速为190r/min的摇床中培养18h至细胞OD600nm达到5～6，用于接种发酵培养基的种子；
(3)发酵培养基采用1.5倍浓度的液体LB培养基，加入氨苄青霉素，如发酵菌株同时包含pBBR1MCS系列质粒还需要加入氯霉素，10g/L CaCO3以调节发酵过程中的pH＞5；将步骤(2)培养好的种子以10％体积的接种量转接于50mL发酵培养基，用规格为250mL三角瓶于33℃，转速190r/min条件下进行发酵，所有发酵均设置三个平行实验。接种6h后加入终浓度为20g/L D-木糖，终浓度为5g/L葡萄糖以及终浓度为0.8mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(PTGI)诱导，记为发酵0时，每12h取样一次，直到48h发酵结束。
发酵检测方法如下：
(1)菌体干重测定
发酵结束后，取样5mL用于干重测定。在样品中加入0.64M的盐酸2.5mL，摇动混合，直至离心管底部白色沉淀物消失，10000rpm离心5min，弃上清液。沉淀用蒸馏水悬浮，离心，弃上清。重复以上操作2次，将细胞沉淀物放入80℃烘箱烘2h左右，操作前称量空离心管重量。
(2)发酵代谢物分析
利用实验室高效液相色谱(HPLC)测定，色谱柱为Hamilton HC-75H+(7.8mm×305mm，5μm)，流动相为2.5mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温55℃，检测时样品的进样量20μL，LC solution 15C工作站。
(3)木糖酸浓度测定
木糖酸由于受到发酵液中木糖酸内酯的影响，无法在液相色谱中准确定量。本实施例采用异羟肟酸盐法测定木糖酸。具体方法为：发酵液离心后取上层清液450μL，加入3.2M盐酸50μL，煮沸15min，依次加入1mL混合液(2M氢氧化钠∶2M盐酸羟胺的体积比＝1∶1)，3.2M盐酸650μL，氯化铁500μL(0.1M盐酸+100g/L氯化铁)，于550nm测定吸光度值。
每组发酵三个平行，最终数据取平均值。
检测结果如表9-1和表9-2所示：
表9-1 优选菌株发酵后发酵液中D-1，2，4-丁三醇合成量(g/L)
表9-2 优选菌株发酵后发酵液中D-1，2，4-丁三醇合成量(g/L)
表9-2中I-1为将重组载体质粒pTMX转化入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMX的重组大肠杆菌菌株I-1；
表9-2中J-1为将重组载体质粒pTMXD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-1-1的重组大肠杆菌菌株J-1。
表9-2中K-1为将重组载体质粒pTMXDE-1-1转化进入重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-1-1的重组大肠杆菌菌株K-1。

Claims (9)

1.一种重组大肠杆菌，在所述大肠杆菌中敲除木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE，克隆表达恶臭假单胞菌2-酮酸脱羧酶基因mdlC和新月柄杆菌D-木糖脱氢酶基因xdh得到重组大肠杆菌菌株，其特征在于：进一步敲除2-酮酸还原酶基因、丙酮醛合酶基因、转氨酶基因、转氢酶基因、乙酸激酶基因和磷酸转乙酰基酶基因中的一种以上；和/或
过量表达木糖酸脱水酶基因、醇脱氢酶基因和6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因中的一种以上，得到重组大肠杆菌I，为所述的一种重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：在重组大肠杆菌I的基础上，进一步敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，得到重组大肠杆菌II，为所述的一种重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌中的MG1655；采用Red同源重组技术进行基因敲除。
4.根据权利要求1或2所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE，丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA，转氨酶基因为转氨酶基因aspC，转氢酶基因为转氢酶基因pntA，乙酸激酶基因为乙酸激酶基因ackA，磷酸转乙酰基酶基因为磷酸转乙酰基酶基因pta；
木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD，过量表达载体为pTrc99a；醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD，过量表达载体为pTrc99a；6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因为6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf，过量表达载体为pBBR1MCS。
5.一种如权利要求1或2所述重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤一、制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，提取其基因组为模板，采用PCR分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，获得打靶片段DNA；上游引物xylA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1，下游引物xylA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2；
2.感受态细胞制备
将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞；
3.目的基因的敲除
将打靶片段DNA转入感受态细胞中，加入SOC培养基培养，然后在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证，验证结果正确即为敲除成功，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1；
4.卡那霉素抗性基因的去除
接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，再转接至新鲜LB培养基培养，然后制成感受态细胞，转入pCP20质粒，在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，挑取单菌落，在LB液体培养基培养后，在LB固体培养基培养；分别挑取LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌生长，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因；
步骤二、制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物yjhH-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，下游引物yjhH-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.4，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因；
其余方法同步骤一；
步骤三、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物yagE-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.5，下游引物yagE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.6，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因；
其余方法同步骤一；
步骤四、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和2-酮酸还原酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除2-酮酸还原酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株B-X，X代表该系列中具体一种重组大肠杆菌菌株，取值为正整数；
当2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物yiaE-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.7，下游引物yiaE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.8；
其余方法同步骤一；
步骤五、制备丙酮醛合酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株C-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3或B-X的基础上进一步敲除丙酮醛合酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株C-X；
当丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物mgsA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.9，下游引物mgsA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.10；
其余方法同步骤一；
步骤六、制备转氨酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株D-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氨酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X或C-X的基础上进一步敲除转氨酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株D-X；
当转氨酶基因为转氨酶基因aspC时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氨酶基因aspC缺陷型大肠杆菌菌株JW0911-1，上游引物aspC-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.11，下游引物aspC-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.12；
其余方法同步骤一；
步骤七、制备转氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株E-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X或D-X的基础上进一步敲除转氢酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株E-X；
当转氢酶基因为转氢酶基因pntA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的转氢酶基因pntA缺陷型大肠杆菌菌株JW1595-1，上游引物pntA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.13，下游引物pntA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.14；
其余方法同步骤一；
步骤八、制备乙酸激酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株F-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的乙酸激酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X、D-X或E-X的基础上进一步敲除乙酸激酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株F-X；
当乙酸激酶基因为乙酸激酶基因ackA时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的乙酸激酶基因ackA缺陷型大肠杆菌菌株JW2293-1，上游引物ackA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.15，下游引物ackA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.16；
其余方法同步骤一；
步骤九、制备磷酸转乙酰基酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株G-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的磷酸转乙酰基酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物，在重组大肠杆菌菌株A3、B-X、C-X、D-X、E-X或F-X的基础上进一步敲除磷酸转乙酰基酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株G-X；
当磷酸转乙酰基酶基因为磷酸转乙酰基酶基因pta时：
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的磷酸转乙酰基酶基因pta缺陷型大肠杆菌菌株JW2294-1，上游引物pta-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.17，下游引物pta-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.18；
其余方法同步骤一；
步骤十、制备葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG敲除的重组大肠杆菌菌株H-X
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG缺陷型大肠杆菌JW1087-2，上游引物ptsG-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.19，下游引物ptsG-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.20；在重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X或G-X的基础上进一步敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株H-X；
其余方法同步骤一；
步骤十一、构建过表达2-酮酸脱羧酶基因mdlC和D-木糖脱氢酶基因xdh的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株I-X
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以恶臭假单胞菌基因组为模板，用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物mdlC-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.21，下游引物mdlC-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.22，PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTrM；
(3)将重组载体质粒pTrM，采用限制性内切酶BamHI和Hind III处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以新月柄杆菌基因组为模板，用PCR扩增D-木糖脱氢酶基因xdh的基因片段，添加了核糖体结合位点的上游引物xdh-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.23，下游引物xdh-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.24，PCR扩增所得的基因片段采用限制性内切酶BamHI和Hind III处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(4)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMX；
(5)将重组载体质粒pTMX转化入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMX的重组大肠杆菌菌株I-X；
步骤十二、构建过表达木糖酸脱水酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株J-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTMX采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖酸脱水酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXD-Y-X，其中，Y表示质粒中新增的基因个数，取值为正整数，本步骤重组载体质粒为pTMXD-1-X；
(3)将重组载体质粒pTMXD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-1-X的重组大肠杆菌菌株J-X；
当木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD时：
限制性内切酶为NcoI和BamHI；以新月柄杆菌CB15基因组为模板，采用PCR方法扩增木糖酸脱水酶基因xylD的基因片段，上游引物xylD-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo.25，下游引物xylD-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.26；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十二1构建的重组载体质粒pTMXD-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTMXD-1-X中没有的另一个木糖酸脱水酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXD-2-X；
(3)将重组载体质粒pTMXD-2-X转化入大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXD-2-X的重组大肠杆菌菌株J-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十二2类似；
步骤十三、构建过表达醇脱氢酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株K-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTMXD-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醇脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醇脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXDE-Y-X，本步骤重组载体质粒为pTMXDE-1-X；
(3)将重组载体质粒pTMXDE-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-1-X的重组大肠杆菌菌株K-X；
当醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD时：
限制性内切酶为XbaI和HindIII；以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR方法扩增醇脱氢酶基因yqhD的基因片段，上游引物yqhD-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.27，下游引物yqhD-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.28；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十三1构建的重组载体质粒pTMXDE-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTMXDE-1-X中没有的另一个醇脱氢酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTMXDE-2-X；
(3)将重组载体质粒pTMXDE-2-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X、C-X、D-X、E-X、F-X、G-X或H-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTMXDE-2-X的重组大肠杆菌菌株K-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十三2类似；
步骤十四、构建过表达6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株L-X
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pBBR1MCS采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pBZ-Y-X，本步骤重组载体质粒为pBZ-1-X；
(3)将重组载体质粒pBZ-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株I-X、J-X或K-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pBZ-1-X的重组大肠杆菌菌株L-X；
当6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因为6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf时：
限制性内切酶为salI和HindIII；以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR方法扩增6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf的基因片段，上游引物zwf-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo.29，下游引物zwf-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.30；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤十四1构建的重组载体质粒pBZ-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pBZ-1-X中没有的另一个6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用Gibson DNA连接方法将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pBZ-2-X；
(3)将重组载体质粒pBZ-2-X转化入大肠杆菌菌株I-X、J-X或K-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pBZ-2-X的重组大肠杆菌菌株L-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十四2类似；
所述重组大肠杆菌菌株B-X、重组大肠杆菌菌株C-X、重组大肠杆菌菌株D-X、重组大肠杆菌菌株E-X、重组大肠杆菌菌株F-X、重组大肠杆菌菌株G-X、重组大肠杆菌菌株H-X、重组大肠杆菌菌株I-X、重组大肠杆菌菌株J-X、重组大肠杆菌菌株K-X和重组大肠杆菌菌株L-X均为所述的一种重组大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的一种重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于：PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示：
表1PCR反应扩增体系
ddH2O 33μL dNTP混和液 8μL 上游引物 2μL 下游引物 2μL PCR扩增缓冲液 50μL DNA聚合酶PrimerSTAR 1μL 扩增用DNA模板 4μL 合计 100μL
表2 PCR反应条件
7.根据权利要求5所述的一种重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌中的MG1655；采用Red同源重组技术进行基因敲除。
8.根据权利要求6所述的一种重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌中的MG1655；采用Red同源重组技术进行基因敲除。
9.一种如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，得到活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；
(2)挑取单菌落接种于作为种子培养基的普通LB培养基中，于30℃～40℃培养，摇床转速100r/min～250r/min，过夜培养；
(3)发酵培养基采用LB液体培养基，根据重组大肠杆菌中重组载体质粒的抗性，加入相应抗生素，加入CaCO3以调节发酵过程中的pH＞5；将步骤(2)培养好的菌液转接于发酵培养基，在30℃～35℃，100r/min～250r/min条件下进行发酵，转接6h后加入终浓度为5g/L～50g/L的底物以及终浓度为0.1mmol/L～10mmol/LIPTG诱导，发酵48h～72h发酵结束；所述底物为D-木糖，或D-木糖、葡萄糖、乙酸或甘油中的一种以上。
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