CN117701489A - 一种提高大肠杆菌生产1,3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种提高大肠杆菌生产1,3‑丁二醇的方法。本发明通过对大肠杆菌底盘进行系统改造的方法，通过抑制或消除丙酮酸甲酸裂解酶的表达或活性增强NADH的合成、通过抑制或消除细胞色素氧化酶提高ATP的合成、通过抑制或消除葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的表达或活性，减少碳损失增加代谢前体的供给，从而提高了大肠杆菌合成1,3‑丁二醇的能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种提高大肠杆菌生产1,3-丁二醇的方法。
背景技术
1,3-丁二醇具有单醇和二元醇的性质，普遍用于聚酯、溶剂、化妆品、医药等领域。在聚酯方面，1,3-丁二醇可与顺酐、苯酐等发生聚合反应，用于制备不饱和的聚酯树脂、聚氨酯涂料，并可作为增塑剂提高聚酯性能。在化妆品领域，1,3-丁二醇具备较好的水溶性和低毒性，可作为保湿剂。
在大肠杆菌中，以葡萄糖为原料，基于反向脂肪酸β-氧化的非天然合成途径，以乙酰CoA为代谢前体，在乙酰CoA乙酰转移酶和乙酰乙酰CoA还原酶催化下合成3-羟基丁酰CoA，后者在3-羟基丁酰CoA脱氢酶和醇脱氢酶催化下可生成1,3-丁二醇。
如何提高大肠杆菌生产1,3-丁二醇的产量和/或得率，成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
为解决上述技术难题，特提出本发明。
首先，本发明提供了一种提高大肠杆菌1,3-丁二醇合成能力的方法，包括以下至少一项操作：
（1）抑制或消除丙酮酸甲酸裂解酶在大肠杆菌中的表达或活性；
（2）抑制或消除细胞色素氧化酶在大肠杆菌中的表达或活性；
（3）抑制或消除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达或活性。
在上述大肠杆菌合成1,3-丁二醇的途径中，有很多的调控因子均可以直接或间接地调控糖酵解途径中的NADH或NADPH，本发明通过大量筛选验证后发现，通过抑制或消除丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的表达或活性能够有效地通过提高NADH的产生从而促进1,3-丁二醇的合成。
此外，提高1,3-丁二醇合成过程的能量供应水平，控制电子传递链中的能量效率也可能是提高大肠杆菌1,3-丁二醇合成能力的策略之一。在大肠杆菌电子传递链中存在几类不同的同工酶，其产生质子梯度的能力存在显著的差异。本发明发现，抑制或消除细胞色素氧化酶的表达或活性，能够显著提高大肠杆菌合成1,3-丁二醇途径中的ATP供应水平，从而提高1,3-丁二醇的合成效率。
进一步，本发明还发现，通过抑制或消除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达或活性，能够降低戊糖磷酸循环途径的碳通量，提高流向1,3-丁二醇途径的碳通量，从而显著降低碳源的损失，提高大肠杆菌合成1,3-丁二醇的得率。
在本发明中，所述大肠杆菌为任意能够合成1,3-丁二醇的大肠杆菌。
优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）。
优选地，所述大肠杆菌表达乙酰CoA乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA还原酶、醇脱氢酶以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶。
优选地，所述三项操作一起执行。
通过一起执行所述三项操作，能够平衡能量的供给以及还原力的提供并降低碳损失，产生协同提高大肠杆菌合成1,3-丁二醇能力的作用，使得大肠杆菌合成1,3-丁二醇的能力大幅提升。
优选地，丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示；细胞色素氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.29（cydA）和SEQ ID No.30（cydB）所示；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示。
优选地，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶由zwf基因编码。
优选地，丙酮酸甲酸裂解酶由pflB基因编码。
优选地，细胞色素氧化酶由cydAB基因编码。
在一些实施方案中，所述方法包括在大肠杆菌中进行以下至少一项操作：
（1）敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因；
（2）敲除编码细胞色素氧化酶的cydAB基因；
（3）敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因；
可选地，所述丙酮酸甲酸裂解酶基因序列的反义链如SEQ ID No.1所示；
可选地，所述cydAB基因序列如SEQ ID No.2所示；
可选地，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因序列的反义链如SEQ ID No.3所示。
在一些实施方案中，所述敲除是使用任意一种已知的敲除方法。
在一些实施方案中，所述敲除是使用同源重组的方法进行敲除。
在一些实施方案中，所述敲除是使用二类内含子基因(例如Targetron或Clostron)插入失活或者CRISPR-Cas系统编辑。
在一些实施方案中，所述敲除是使用无痕敲除。
进一步，本发明提供了一种合成1,3-丁二醇的方法，包括以所述操作处理后获得的重组大肠杆菌进行发酵生产1,3-丁二醇。
优选地，所述发酵生产的条件包括：发酵温度为35~39℃；和/或，
每L发酵培养基包括如下组分：
葡萄糖18~22g，七水硫酸镁0.5~1g，磷酸氢二胺0.8~1.2g，磷酸二氢钾6~7g，柠檬酸钾1~1.5g，3-吗啉丙磺酸20~22g，酵母粉2~3g，七水硫酸亚铁45~55mg，二水氯化钙8~12mg，七水硫酸锌8~13mg，四水硫酸锰2~3mg，五水硫酸铜3~8mg，钼酸铵0.2~0.8mg，十水硼酸钠0.05~0.15mg。
优选地，在发酵生产前采用LB培养基对重组大肠杆菌进行预培养。
优选地，所述发酵生产过程中重组大肠杆菌的接种量为4%~6%。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌中表达乙酰CoA乙酰转移酶（由phaA编码）、乙酰乙酰CoA还原酶（由phaB编码）、醇脱氢酶（由yqhD编码）以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶（由bld编码）。
进一步，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其在出发大肠杆菌的基础上敲除了丙酮酸甲酸裂解酶基因、编码细胞色素氧化酶的cydAB基因以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因。
可选地，所述丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）序列的反义链如SEQ ID No.1所示；
可选地，所述cydAB基因序列如SEQ ID No.2所示；
可选地，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（zwf）序列的反义链如SEQ ID No.3所示。
在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌表达乙酰CoA乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA还原酶、醇脱氢酶以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶。
优选地，编码所述乙酰CoA乙酰转移酶（由phaA编码）、乙酰乙酰CoA还原酶（由phaB编码）、醇脱氢酶（由yqhD编码）以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶（由bld编码）的基因序列如SEQID No.4和SEQ ID No.5所示。
其中，phaA、phaB和bld的基因序列如SEQ ID No.4所示；yqhD的基因序列如SEQ IDNo.5所示。
在一些实施方案中，所述出发大肠杆菌为任意能够合成1,3-丁二醇的大肠杆菌。
优选地，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）。
进一步，本发明提供了上述任一实施方案中的方法或重组大肠杆菌在食品、保健品、化妆品、饲料、制备药品、化工领域中的应用。
优选地，本发明提供了上述任一实施方案中的方法或重组大肠杆菌在合成1,3-丁二醇中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过对大肠杆菌底盘进行系统改造的方法，通过抑制或消除丙酮酸甲酸裂解酶的表达或活性增强NADH的合成、通过抑制或消除细胞色素氧化酶提高ATP的合成、通过抑制或消除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达或活性，减少碳损失增加代谢前体的供给，从而提高了大肠杆菌合成1,3-丁二醇的能力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例一、敲除大肠杆菌中基因pflB
本实施例将大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）的丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）关键酶pflB进行敲除（敲除基因序列的反义链如SEQ ID No.1所示）。具体步骤如下：
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以pflB-UP-F（ATATGACCGCAAATGGTCAATGGGGACTAA，SEQ ID No.6）和pflB-UP-R（ACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAAGTAACACCTACCTTCTTAAGTGGATTT，SEQ ID No.7）为引物进行PCR（体系包括：模板1μL、上下游引物各2μL、高保真酶Phanta Max Master Mix（Vazyme）25μL、水20μL；程序为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15sec，退火56℃ 15sec，变性95℃ 15sec，延伸72℃ 30s/kb，30个循环，彻底延伸72℃ 5min），获得基因片段pflB-UP约500bp并进行PCR产物纯化。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以pflB-DOWN-F（GGTAGGTGTTACTTAGATTTGACTGAAATCGTACAGTAA，SEQ ID No.8）和pflB-DOWN-R（ACAGGTATGAATGCCTTCTTTTTTGCAGGCG，SEQ ID No.9）为引物进行PCR（体系和程序同pflB-UP），获得基因片段pflB-DOWN约500bp并进行PCR产物纯化。
将片段pflB-UP、pflB-DOWN进行重叠PCR（体系包括：模板各1μL、上下游引物各2μL、高保真酶Phanta Max Master Mix（Vazyme）25μL、水20μL；程序为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15sec，退火56℃ 15sec，变性95℃ 15sec，延伸72℃ 30s/kb，30个循环，彻底延伸72℃ 5min），获得打靶片段。
以质粒pTarget为模板（质粒pTarget公开于Jiang, Y., Chen, B., Duan, C.L.,Sun, B.B., Yang, J.J., and Yang, S. (2015) Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol81: 2506–2514.），以引物pflB-N20-F（CAGCGATTTCTTCGCGCAGAgttttagagctagaaatagcaagttaaaa，SEQ ID No.10）和pflB-N20-R（TCTGCGCGAAGAAATCGCTGactagtattatacctaggactgagctag，SEQ ID No.11）进行PCR扩增（体系和程序同pflB-UP）以获得pTarget-pflB。
利用电穿孔仪（伯乐）将打靶片段、质粒pTarget-pflB和质粒pCas9（质粒pCas9公开于Jiang, Y., Chen, B., Duan, C.L., Sun, B.B., Yang, J.J., and Yang, S.(2015) Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system. Appl Environ Microbiol 81: 2506–2514.）通过电转化转入到大肠杆菌MG1655中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF（电击杯宽度为2mm），筛选获得重组菌，该菌株命名为E.coli-△pflB。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以yqhD-F(tcgccggttaaAACTTTAAGAAGGAGATATACatgAACAACTTTAATCTGCAC，SEQ ID No.12)和yqhD-R（ccaaaacagccaagcttgcatgcctgcattaGCGGGCGGCTTCGTATATAC，SEQ ID No.13）为引物进行PCR（体系和程序同pflB-UP），获得基因片段yqhD。
以合成基因为模板（SEQ ID No.5），以phaA-F(acagaccatggAACTTTAAGAAGGAGATATACatgactgacgttgtcatcgtat，SEQ ID No.14)和bld-R（cttaaagttttaaccggcgagtacacatcttctttgtc，SEQ ID No.15）为引物进行PCR（体系和程序同yqhD），获得基因片段phaAB-bld。
将片段yqhD、phaAB-bld进行重叠PCR（体系和程序同上重叠PCR条件），所得片段通过酶切位点NcoI和HindIII连接到载体pTrc99a上，获得的重组质粒的名称为pTrc99a-phaAB-bld-yqhD。将重组质粒pTrc99a-phaAB-bld-yqhD通过电转化（条件如上）转入到大肠杆菌MG1655和E.coli-△pflB中，获得的重组菌株命名为E.coli MG1655/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD和E.coli-△pflB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD。
实施例二、敲除大肠杆菌中基因cydAB
本实施例将大肠杆菌MG1655 （ATCC 700926）和E.coli-△pflB的细胞色素氧化酶cydAB基因进行敲除（敲除序列如SEQ ID No.2所示）。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以cydAB-UP-F（AAGAATTAAGGTCAACCGTGCTGTTTT，SEQ ID No.16）和cydAB-UP-R（TTAGCTCCTTACCATGACTCCTTGCTCATCGCATGAAGAC，SEQ ID No.17）为引物进行PCR（体系和程序同pflB-UP），获得基因片段cydAB-UP约500bp并进行PCR产物纯化。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以cydAB-DOWN-F（ATGAGCAAGGAGTCATGGTAAGGAGCTAAAAATGTGGTATTTC，SEQ ID No.18）和cydAB-DOWN-R（TGGGAATGAGGGCAAGTTAAGGGAGCG，SEQ ID No.19）为引物进行PCR（体系和程序同cydAB-UP），获得基因片段cydAB-DOWN约500bp并进行PCR产物纯化。
将片段cydAB-UP、cydAB-DOWN进行重叠PCR（体系和程序同上重叠PCR条件），获得打靶片段。
以质粒pTarget为模板，以引物cydAB-N20-F（GGCGTCTTTGTTCTTCCGTCgttttagagctagaaatagcaagttaa，SEQ ID No.20）和cydAB-N20-R（GACGGAAGAACAAAGACGCCactagtattatacctaggactgagctag，SEQ ID No.21）进行PCR扩增（体系和程序同pflB-UP）以获得pTarget-cydAB。
利用电穿孔仪（伯乐）将打靶片段、质粒pTarget-cydAB和质粒pCas9通过电转化转入到大肠杆菌MG1655和E.coli-△pflB中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF（电击杯宽度为2mm），筛选获得重组菌，该菌株命名为E.coli-△cydAB和E.coli-△pflB-△cydAB。
将重组质粒pTrc99a-phaAB-bld-yqhD通过电转化（条件如上）转入到大肠杆菌E.coli-△cydAB和E.coli-△pflB-△cydAB中，获得的重组菌株命名为E.coli-△cydAB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD和E.coli-△pflB-△cydAB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD。
实施例三、敲除大肠杆菌中基因zwf
本实施例将大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）和E.coli-△pflB-△cydAB的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf进行敲除（敲除基因序列的反义链如SEQ ID No.3所示）。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以zwf-UP-F（TCTGGATAGTGTTCATAAGGCTGGTGCGC，SEQ ID No.22）和zwf-UP-R（ACTTAAGGAGAATGACTATCTGCGCTTATCCTTTATGGTTATT，SEQ ID No.23）为引物进行PCR（体系和程序同pflB-UP），获得基因片段zwf-UP约500bp并进行PCR产物纯化。
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以zwf-DOWN-F（TAAGCGCAGATAGTCATTCTCCTTAAGTTAACTAA，SEQ ID No.24）和zwf-DOWN-R（AGAAACGATTCACCGTCGGTTCGCTAA，SEQ IDNo.25）为引物进行PCR（体系和程序同zwf-UP），获得基因片段zwf-DOWN约500bp并进行PCR产物纯化。
将片段zwf-UP、zwf-DOWN进行重叠PCR（体系和程序同上重叠PCR），获得打靶片段。
以质粒pTarget为模板，以引物zwf-N20-F（GTCCCAGTTATTCACAAACAgttttagagctagaaatagcaagttaaaa，SEQ ID No.26）和zwf-N20-R（TGTTTGTGAATAACTGGGACactagtattatacctaggactgagctag，SEQ ID No.27）进行PCR扩增（体系和程序同pflB-UP）以获得pTarget-zwf。
利用电穿孔仪（伯乐）将打靶片段、质粒pTarget-zwf和质粒pCas9通过电转化转入到大肠杆菌MG1655和E.coli-△pflB-△cydAB中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF（电击杯宽度为2mm），筛选获得重组菌，该菌株命名为E.coli-△zwf和E.coli-△pflB-△cydAB-△zwf。
将重组质粒pTrc99a-phaAB-bld-yqhD通过电转化（条件如上）转入到大肠杆菌E.coli-△zwf和E.coli-△pflB-△cydAB-△zwf中，获得的重组菌株命名为E.coli-△zwf/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD和E.coli-△pflB-△cydAB-△zwf /pTrc99a-phaAB-bld-yqhD。
实施例四、重组大肠杆菌发酵培养生产1,3-丁二醇
将重组菌株E.coli MG1655/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD、E.coli-△pflB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD、E.coli-△cydAB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD、E.coli-△zwf/pTrc99a-phaAB-bld-ydhD和E.coli-△pflB-△cydAB-△zwf /pTrc99a-phaAB-bld-yqhD在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有5mL LB培养基的试管中，37℃，200rpm培养12小时。
以5%的接种量接种到含有50 mL发酵培养基的500mL摇瓶中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6，加入0.1mM IPTG，共培养48h。
每L的发酵培养基配方包括：葡萄糖20g，七水硫酸镁0.8g，磷酸氢二胺1g，磷酸二氢钾6.67g，柠檬酸钾1.35g，3-吗啉丙磺酸20.9g，酵母粉2.5g，七水硫酸亚铁50mg，二水氯化钙10mg，七水硫酸锌11mg，四水硫酸锰2.5mg，五水硫酸铜5mg，钼酸铵0.5mg，十水硼酸钠0.1mg。
发酵过程中通过液相色谱检测产物浓度以及菌株的生长情况，结果如表1和表2所示。由表1和表2可以看出，分别敲除pflB、cydAB、zwf后，菌株E.coli-△pflB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD、E.coli-△cydAB/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD、E.coli-△zwf/pTrc99a-phaAB-bld-ydh与对照菌株E.coli MG1655/pTrc99a-phaAB-bld-yqhD相比，1,3-丁二醇的产量和生产效率均得到了提升。在敲除pflB的基础上，继续敲除cydAB和zwf的1,3-丁二醇产量和生产效率得到了进一步的提升。
表1 不同菌株的生长情况（OD600）
表2 不同菌株的1,3-丁二醇产量情况（g/L）
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种提高大肠杆菌1,3-丁二醇合成能力的方法，其特征在于，包括以下至少一项操作：
（1）抑制或消除丙酮酸甲酸裂解酶在大肠杆菌中的表达或活性；
（2）抑制或消除细胞色素氧化酶在大肠杆菌中的表达或活性；
（3）抑制或消除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达或活性。
2.一种提高大肠杆菌1,3-丁二醇合成能力的方法，其特征在于，包括在大肠杆菌中进行以下至少一项操作：
（1）敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因；
（2）敲除编码细胞色素氧化酶的cydAB基因；
（3）敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因；
所述丙酮酸甲酸裂解酶基因序列的反义链如SEQ ID No.1所示；
所述cydAB基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因序列的反义链如SEQ ID No.3所示。
3.一种合成1,3-丁二醇的方法，其特征在于，包括：以权利要求1或2所述操作处理后获得的重组大肠杆菌进行发酵生产1,3-丁二醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产的条件包括：发酵温度为35~39℃；和/或，
每L发酵培养基包括如下组分：
葡萄糖18~22g，七水硫酸镁0.5~1g，磷酸氢二胺0.8~1.2g，磷酸二氢钾6~7g，柠檬酸钾1~1.5g，3-吗啉丙磺酸20~22g，酵母粉2~3g，七水硫酸亚铁45~55mg，二水氯化钙8~12mg，七水硫酸锌8~13mg，四水硫酸锰2~3mg，五水硫酸铜3~8mg，钼酸铵0.2~0.8mg，十水硼酸钠0.05~0.15mg。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌中表达乙酰CoA乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA还原酶、醇脱氢酶以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，其在出发大肠杆菌的基础上敲除了丙酮酸甲酸裂解酶基因、编码细胞色素氧化酶的cydAB基因以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因；
所述丙酮酸甲酸裂解酶基因序列的反义链如SEQ ID No.1所示；
所述cydAB基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因序列的反义链如SEQ ID No.3所示。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达乙酰CoA乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA还原酶、醇脱氢酶以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述乙酰CoA乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA还原酶、醇脱氢酶以及3-羟基丁酰CoA脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示。
9.权利要求1~5中任一项所述的方法或权利要求6~8中任一项所述的重组大肠杆菌在食品、保健品、化妆品、饲料、制备药品、化工领域中的应用。
10.权利要求1~5中任一项所述的方法或权利要求6~8中任一项所述的重组大肠杆菌在合成1,3-丁二醇中的应用。
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| Publication number | Publication date |
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| CN117701489B (zh) | 2024-05-10 |
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