JP7295254B2 - 高活性のリンゴ酸脱水素酵素が導入されたコハク酸生成用変異微生物及びこれを用いたコハク酸の製造方法 - Google Patents

Description

KCTC KCTC 10973BP

本発明は、高活性のリンゴ酸脱水素酵素が導入されたコハク酸生成用変異微生物及びこれを用いたコハク酸の製造方法に関し、より詳細には、主鎖（ｍａｉｎ－ｃｈａｉｎ）のアミド官能基を通じてＮＡＤＨのピロリン酸部分と相互作用するアミノ酸残基がグルタミン（Ｇｌｎ）であることを特徴とするリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、オキサロ酢酸からリンゴ酸への転換活性が向上したコハク酸生成用変異微生物及びこれを用いたコハク酸の製造方法に関する。

近年、台頭している環境問題によって、既存の化石燃料基盤の有用化合物生産を代替しようする努力が多くなされている。これによって、再生可能なバイオマスからバイオ基盤コハク酸を生産しようとする研究が全世界的に行われている。コハク酸は炭素数４個のジカルボン酸であり、１，４－ブタンジオール（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）、γ－ブチロラクトン（γ－ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、コハク酸ジエチル（ｄｉｅｔｈｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）などの産業的価値に優れた化合物の前駆体として用いられ、様々なポリマーの単量体としても使用される有用化合物である。コハク酸のこのような重要性が台頭するに伴って、アクチノバチルスサクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アネロビオスピリルム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、エシリキアコウライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、サッカロミケスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィアリポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの様々な微生物を用いてコハク酸をバイオ基盤で生産する方法が多く研究されている。

コハク酸生産菌株の改良は、コハク酸生産菌株の代謝流れを変えることからなり、その戦略は、炭素代謝を強化し、副産物の生成をなくしたり或いは減らすことによって、コハク酸への流れを増強させることであった。すなわち、コハク酸代謝流れに関与する遺伝子を導入又は強化したり、或いはコハク酸代謝流れを阻害する遺伝子を欠損又は弱化させることによって、コハク酸生産を増加させる。コハク酸代謝流れに関与する遺伝子としてリンゴ酸脱水素酵素は、コハク酸生産を増加させるために導入する酵素であり、既にこれを導入してコハク酸生産を増加させる研究が行われたことがある。例えば、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）は、オキサロ酢酸からリンゴ酸への転換を促進させ、この酵素は様々な代謝回路から伝えられてきた流れをコハク酸生産への流れに転換する重要な役割を有し、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＭＤＨ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ，１２（２）、１６００７０１．）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＤＨ（ＵＳ２０１１０２２９９４５Ａ１、ＵＳ２０１２００４０４２２Ａ１、ＵＳ２０１５００５７４２５Ａ１、ＵＳ２０１３０３０２８６６Ａ１）、Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ由来のＭＤＨ（ＵＳ２０１４０３６３８６２Ａ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭＤＨ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ ２００９，３２：７３７－７４５．，Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，３３（１２）、２４３９－２４４４．）を微生物に導入してコハク酸の生産量を増加させようとする試みがあった。しかし、前記微生物由来のＭＤＨを導入してもコハク酸の生産性が依然として低く、追加の菌株操作又はコハク酸生産発酵工程の最適化によってコハク酸の生産性を増加させるための試みがあったが（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４２：５４－６６）、さらなる改善が必要である。

そこで、本発明者らは、コハク酸の生産性を従来に比べて顕著に向上させることができる方法を模索するために、コハク酸生産に関与する主要酵素に対する反応速度及び構造の研究が未だ多く進んでいない点に着目し、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓを含むルーメンバクテリアとコハク酸生産微生物の主要酵素に対する構造分析を進行した。その結果、本発明では、基質阻害作用が緩和されたＭＤＨを導入して高生産性のコハク酸生産菌株を開発する目的で、最初にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＤＨの構造を明らかにし、これらを用いて生産性を極大化したコハク酸生産菌株を開発することが可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、コハク酸生成能が強化された変異微生物を提供し、これを用いてコハク酸生成能を極大化させることができる方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、コハク酸生成能を有する微生物にリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている変異微生物であって、前記リンゴ酸脱水素酵素は、主鎖のアミド官能基を通じてＮＡＤＨのピロリン酸部分と相互作用するアミノ酸残基がグルタミン（Ｇｌｎ）であることを特徴とする変異微生物を提供する。

本発明はまた、次の段階を含むコハク酸の製造方法を提供する。
（ａ）前記変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたコハク酸を回収する段階。

コハク酸への代謝流れを示す模式図である。 各ＭＤＨのＮＡＤＨ転換速度の相対値を示す図である。 ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨのＮＡＤＨ基質濃度によるＮＡＤＨ転換速度グラフである。 ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨのオキサロ酢酸基質濃度によるＮＡＤＨ転換速度グラフである。 各基質とポリペプチド鎖を異なる色で表したＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの基質結合結晶構造を示す図である。 各ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの構造において活性座付近のアミノ酸残基の比較を示す図である。左側がＭｓＭＤＨ、右側がＣｇＭＤＨである。ＧＯＬはグリセロールを表し、ＭＡＬはリンゴ酸イオンを表す。 各ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの構造においてＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨ結合座付近のアミノ酸残基の比較を示す図である。多くのＭＤＨにおいて保存された蓋構造を異なる色で表現した。 ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ、及びそれらの変異酵素に対するＮＡＤＨ転換速度を示す図である。 ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ、及びＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ変異酵素のｐＨによるＮＡＤＨ転換速度をそれぞれ青色、赤色、黄色で示す図である。ＢＩＳ－Ｔｒｉｓバッファーを使用した条件は四角形、Ｔｒｉｓバッファーを使用した条件は円、グリシンバッファーを使用した条件は三角で表示した。 ｐＨ ６．０、７．０、８．０に対するＣｇＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑのオキサロ酢酸基質濃度によるＮＡＤＨ転換速度グラフである。図３で既に提供されたｐＨ ７．０のＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの活性に関する情報は、点線で表示した。 Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）（Ａ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）（Ｂ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）（Ｃ）、及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）（Ｄ）菌株の、グルコースを単一炭素源として用いた流加式培養の成長及び代謝産物生産曲線であり、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株の、グルコースとグリセロールを共に炭素源として用いた（Ｅ）流加式培養の成長及び代謝産物生産曲線である。 Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）（Ａ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）（Ｂ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）（Ｃ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）（Ｄ）菌株の、グルコースを単一炭素源として用いた流加式培養の成長及び代謝産物生産曲線である。 Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株を、グルコースを単一炭素源として用いて（Ａ）グリセロールと共に用いて（Ｃ）、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株をグルコースを単一炭素源として用いて（Ｂ）、グリセロールと共に用いて（Ｄ）行った流加式培養の成長及び代謝産物生産曲線である。 Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株（Ａ）及びＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株（Ｂ）の接種量を増加させた流加式培養の成長及び代謝産物生産曲線である。

別に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

本発明では、コハク酸への代謝流れを強化し、結果的にコハク酸を過生産させるための酵素候補群のうち、ＭＤＨを選定した。ＭＤＨは、ｍｄｈ遺伝子で暗号化されており、これは、オキサロ酢酸を基質とする酵素である（図１）。コハク酸生産に用いられる菌株が有するＭＤＨの効果を調べ、それらのうち、ＭＤＨの基質であるオキサロ酢酸を最も効果的に転換するＭＤＨを見出すために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ菌株のＭＤＨ（ＭｓＭＤＨ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株のＭＤＨ（ＣｇＭＤＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株のＭＤＨ（ＥｃＭＤＨ）、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ菌株のＭＤＨ（ＡｓＭＤＨ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の細胞質、ミトコンドリア、ペルオキシソームのそれぞれのＭＤＨ（ＳｃＭＤＨｃ、ＳｃＭＤＨｍ、及びＳｃＭＤＨｐ）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ菌株のＭＤＨ（ＹｌＭＤＨ）、の総８種を選択し、それらのうち、ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＥｃＭＤＨ及びＹｌＭＤＨだけが大腸菌において成功的に発現及び精製された。４種のＭＤＨに対してオキサロ酢酸及びＮＡＤＨ １００μＭをそれぞれ基質及び補助因子として使用してそれぞれの活性を比較し、その結果、ＣｇＭＤＨが最も高いオキサロ酢酸還元速度を有することが観察された（図２）。これは、ＭｓＭＤＨの５倍に達する活性であり、次いでＹｌＭＤＨとＥｃＭＤＨの順で活性が高かったが、これらもＭｓＭＤＨに比べて２倍以上の活性を示した（図２）。興味深い点は、ＭｓＭＤＨが自然的にコハク酸を生産するＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓのＭＤＨであるにもかかわらず、自然的にコハク酸を生産するバクテリアではなくＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍとＥ．ｃｏｌｉに由来のＣｇＭＤＨとＥｃＭＤＨがより良い活性を示したということである。この結果は、ＭｓＭＤＨではなくＣｇＭＤＨとＥｃＭＤＨをＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓに導入したとき、より効果的にコハク酸を生産できるという可能性を示す。

上の酵素の活性に関する結果をさらに調べるために、最も活性が高かった／低かった２つのＭＤＨの反応速度論的分析を進行した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎモデルに基づいてＮＡＤＨ濃度に関する初期速度グラフを表現したが、これはさらに、ＣｇＭＤＨがＭｓＭＤＨよりも優れているということを示す（図３）。しかし、オキサロ酢酸の濃度に関するＭＤＨ反応速度グラフは、２つのＭＤＨ、特にＭｓＭＤＨにおいて、一般的に飽和するグラフを示さず、基質であるオキサロ酢酸から阻害作用を受けるような形態を示した（図４）。このような基質阻害作用現象は、半世紀前から様々な脱水素酵素において既に報告されたことがある（Ｒａｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２（２）：２２０－２２４．，１９６３）。様々な脱水素酵素において提示された基質阻害作用の機序としては、アロステリック制御（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、共有結合の形成、又は酵素との非生産的／吸着結合体生成などが挙げられる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８０：３９９２－４００２．，２０１４）。例えば、ブタ心臓由来のＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨ依存性ＭＤＨがエノール型オキサロ酢酸と不活性結合体を形成したり、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｃｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ由来細胞質ＭＤＨでＮＡＤＨが酵素と結合することを阻害し、結果的に酵素が作動しなくさせると知られたことがある（Ｄｅ Ａｒｒｉａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７８４：１５８－１６３．，１９８４）。ＭｓＭＤＨの酵素活性は、３０μＭの相対的に低いオキサロ酢酸濃度から阻害し始めることがわかり（図４）、このような基質阻害作用はその他ＭＤＨに比べても高いレベルと示された（図４）。このような結果から、ＭｓＭＤＨはコハク酸生産に不利であり、これら３つのＭＤＨのうちＣｇＭＤＨがコハク酸生産に最も適合する酵素であることが分かる。

分子レベルにおいてＣｇＭＤＨがＭｓＭＤＨに比べて良い酵素活性を示す理由を調べるために、２種の酵素の結晶構造を糾明し、また、基質と結合体の構造も糾明した（図５）。ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ両方ともホモダイマーを形成し、ＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸（ｍａｌａｔｅ）、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）上科に属する（図５）。ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨのＮ－末端は、α－ｈｅｌｉｃｅｓの側に並んで配列された６本のβ－ｓｈｅｅｔで構成されたロスマンフォールドを示すのに対し、Ｃ－末端はα＋βフォールドを形成する（図５）。両酵素の活性部位は、各末端の特定フォールド間に存在し、特にＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨ結合部位はロスマンフォールドと関連がある。しかし、両酵素の構造を比較した結果、Ｃα－ｂａｃｋｂｏｎｅのＲ．Ｍ．Ｓ．Ｄ．値が２．７７２に達する程度に多少大きい差を示した。このような構造比較から、特に、活性部位周囲で酵素の活性に影響を与え得る構造的差異を発見した（図６、図７）。このような差異は、細胞質のＭＤＨとミトコンドリアのＭＤＨ間の大きい差異を代弁することもある。相応のアミノ酸残基の他に、活性部位付近の環の主鎖の長さが異なることもあるが、ここでは、いくつかの核心アミノ酸残基が異なるということに重点をおいた。例えば、ＭｓＭＤＨの基質結合座の付近に位置するＡｌａ２２４とＬｅｕ１０１、そしてＧｌｙ１１に相応するアミノ酸残基がＣｇＭＤＨではそれぞれＳｅｒ２４２、Ｇｌｎ１１７、そしてＧｌｎ２０に該当する（図６、図７）。このような構造的差異が重要に働き、ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの反応速度論的活性の差異につながったと予想した。

一般に、活性の強いタンパク質の核心的な構造的特徴をターゲットに適用して酵素性能を向上させることが可能である。したがって、前記基質結合部位付近の核心アミノ酸残基を互いに置換し、活性にどのような影響を及ぼすかを調べるために、それぞれ異なる変異酵素を作製した（ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ＭｓＭＤＨ^{Ａ２２４Ｓ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）。これらをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、封入体として発現したＭｓＭＤＨ^{Ａ２２４Ｓ}以外の全ての変異酵素を成功的に精製した。ＣｇＭＤＨの全ての変異酵素（ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）は、その野生型と比較したとき、いずれも半分以下にオキサロ酢酸変換速度が減少した（図８）。ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}もＭｓＭＤＨに比べて活性が減ったが、変異酵素ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑの場合、活性が３倍程度向上したことを確認した（図８）。当該１１番部位のアミノ酸置換がどのように酵素活性に関与したかを確認するために、ＣｇＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑの３酵素を検討した。まず、それらのｐＨによる活性を測定したところ、ＣｇＭＤＨの最適ｐＨは７．０付近と示され、ＭｓＭＤＨの活性は相対的にアルカリ性であるほど増加し、最適ｐＨが９．０付近と示された（図９）。コハク酸生産において最適のｐＨは６．５程度であり、相対的に酸性を帯びるため（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：１２７５－１２８１．，２００４）、このような条件的な限界は、コハク酸生産においてＣｇＭＤＨよりもＭｓＭＤＨが不利であることことを再び立証するといえる。また、上の実験で活性が増加したＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑの最適ｐＨは８．０付近であり、当該変異によって最適ｐＨが低くなったことが分かる（図９）。さらなる反応速度論的活性を比較するために、それぞれのｐＨにおいて基質濃度に対する反応速度を測定した（図１０）。全般的にＭｓＭＤＨ及びＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ変異酵素の結果から明らかなように、ｐＨが低いほど強い基質阻害作用を示すということを確認した（図１０）。このような結果によって、ＭｓＭＤＨは最適ｐＨ９．０において基質阻害作用をほとんど受けておらず、その結果、それらの酵素のうち最も高い活性を示した（図１０）。しかし、最も注目すべきことは、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ変異酵素の基質阻害作用がＭｓＭＤＨのそれに比べて全てのｐＨにおいて大きく減少したということである（図１０）。様々な脱水素酵素において活性部位の単一変異を通じて基質阻害作用が阻害又は解消されることが報告されたことがある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８０：３９９２－４００２．，２０１４）。ＭＤＨの基質阻害作用がＮＡＤＨの結合に影響を与えるということが報告されたことがあり、当該１１番座もＮＡＤＨの結合に直接に関連しているので（図７）、恐らく１１番と相互作用するＮＡＤＨのピロリン酸（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）部分が基質阻害に密接な関連があると解釈される。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によれば、ＣｇＭＤＨの低いｐＨにおいてＭｓＭＤＨに比べて格段に高いオキサロ酢酸還元活性を有しており、コハク酸生産菌株においてＭｓＭＤＨの代わりにＣｇＭＤＨを導入したとき、コハク酸の生産量がより増加するということが予測できた。単一アミノ酸残基変異から、どのような構造的差異がこのような活性の差異をもたらしたかが把握でき、特にＭｓＭＤＨのＧｌｙ１１番残基が当該酵素タンパク質の深刻な基質阻害作用に関与したことが分かった。当該Ｇｌｙ１１番アミノ酸残基に相応するＣｇＭＤＨのＧｌｎ２０に模してＭｓＭＤＨのＧｌｙ１１番をＧｌｎに置換したＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ変異酵素が既存のＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ野生型酵素に比べて優れた活性を示したため、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ変異酵素も同様に、既存のＭｓＭＤＨの代わりにコハク酸生産菌株に導入されたとき、コハク酸の生産量が増加するということが予測できた。当該変異酵素の導入は、外部遺伝子を導入したものではなく、既存の酵素において一つのアミノ酸だけを置換したため、ＧＭＯなどの問題から自由であろう。

実際に基質阻害作用が緩和されたＭＤＨを用いてコハク酸生産を向上させるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に基づいて、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株に、既存ＭＤＨに比べて基質阻害作用が緩和されたＭＤＨが導入された。Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株は、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ野生型菌株において乳酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子、ホスホトランスアセチル化酵素を暗号化する遺伝子及び酢酸キナーゼを暗号化する遺伝子を欠失させて得られる菌株であり、嫌気的条件でコハク酸以外の他の有機酸はほとんど生成しない上に、コハク酸だけを高濃度で生産する特性を有するコハク酸生成変異微生物である。基質阻害作用が緩和されたＭＤＨを導入してコハク酸生産が向上することを確認するために、高性能のＭＤＨを導入する前にまず、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株が自然的に持つＭＤＨを過発現した菌株が開発された。このように開発されたＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）菌株は、７９．０７ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．２６ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１１；表１）。ＭｓＭＤＨが活性テスト中に最も低い活性を示したため、ＭｓＭＤＨを過発現した上記の菌株は菌株改良の効果が少なく、若干のコハク酸生産量増加だけを示した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性テスト過程においてＭＤＨのうちＣｇＭＤＨが最も高い活性と低い基質阻害作用を示したため、ＣｇＭＤＨを過発現した菌株が開発されたし、前記作製されたＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株は、流加式発酵の結果、８７．２３ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２９ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．６ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１１；表１）。前記ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）の流加式発酵結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＤＨの活性を確認した結果と一致する。特に、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に比べてＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）が示した全てのコハク酸生産指標（生産濃度、収率、生産性）における優れた向上は、オキサロ酢酸からリンゴ酸への転換向上の他にも、基質阻害作用の緩和がコハク酸生産の向上を導いたといえる。

現在まで、文献で実際にコハク酸増産のために用いられたＭＤＨ候補群のうち、ＣｇＭＤＨが最も優れていることを確認するために、文献でコハク酸増産に効果があると報告されたＭＤＨ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＥｃＭＤＨ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ由来ＺｒＭＤＨ、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＳｃＭＤＨ２及びＳｃＭＤＨ３）の効果もｉｎ ｖｉｖｏで検証した。そのために、それぞれのＭＤＨを過発現したＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株が構築された。前記構築された４種のＭＤＨ過発現菌株に対する流加式発酵の結果、それぞれ７９．０５、７６．１１、７７．３４、７５．１５ｇ／Ｌのコハク酸が、３．２７、３．１５、３．１９、３．１ｇ／Ｌ／ｈの生産性と１．２９、１．２５、１．１６、１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースの収率で生産された。このような結果は、ＭＤＨが過発現しないＰＡＬＫ（ｐＭＳ３）菌株よりは向上したコハク酸生産能であるが、ＣｇＭＤＨを過発現したＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）よりは低い数値であり、結局、ＭＤＨ候補群のうちＣｇＭＤＨが実際にコハク酸生産に最大の影響を与えるということを傍証する。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認されたＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの基質阻害作用と活性差が酵素の構造的差異から始まるということをｉｎ ｖｉｖｏ上で確認するために、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株が構築された。前記構築されたＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）菌株の流加式発酵の結果、７９．３９ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．００ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．２７ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１１；表１）。コハク酸生産能はＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株に比べて顕著に減少したが、これは、前述した２０番目位置のグルタミンがＣｇＭＤＨの活性において重要な部分であることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏ結果と一致する。

前記構築されたＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株の流加式発酵の結果、８４．１９ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．０８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．４８ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１１；表１）。ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）菌株に比べて増加したコハク酸生産濃度と生産性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果と同一に、１１番目位置のグリシンをグルタミンに替えたことが酵素の活性を高め、基質阻害作用を緩和させたということを傍証する。結局、このようなｉｎ ｖｉｖｏ結果は、構造分析に基づく酵素改良が、実際のコハク酸生産向上に役立ち得るということを示す。

特に、本発明において、コハク酸増産の方法で用いた酵素であるＭＤＨの場合は、ルーメンバクテリアであるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ属、Ｂａｓｆｉａ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属はもとより、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のいずれにおいてもコハク酸生産に重要な役割を担うものと知られているので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２０１２／０３０１３０Ａ２；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３３（１２）：２４３９－２４４４．，２０１１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：１２５０－１２５５．，２０１２）、前記菌株において、本発明で示したような遺伝的変異は、コハク酸過生産菌株構築のために共通に適用可能である。特に、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属のようにウシの反芻胃から分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）されたＢａｓｆｉａ属は、元は分離されるとき、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属と命名されたが、後でＢａｓｆｉａ属に分離され、ＭａｎｎｈｅｉｍｉａとＢａｓｆｉａ菌株は２，３１４，０７８ｂｐと２，３４０，０００ｂｐのほぼ類似な遺伝子塩基配列のサイズを有しており、塩基配列のうちＧとＣの比率が両菌株とも４２．５ｍｏｌ％であり、一致する。なお、遺伝子全般では９５％の相同性を有しており、特にＭａｎｎｈｅｉｍｉａの２，３８０個のＯＲＦとＢａｓｆｉａの２，３６３個のＯＲＦのうち２００６個のＯＲＦは相同性を有している。注目すべき点は、このように相同性を有する２００６個のＯＲＦは核心遺伝体として知られている点である。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列も９９．８％一致するなどの非常に類似する菌株であるため、この発明ではこれらをＭａｎｎｈｅｉｍｉａ属と総称する（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４２：５４－６６．，２０１６；Ｓｃｈｏｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００９／０２４２９４Ａ１；Ｋｕｈｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：４４．，２０１０）。すなわち、本発明において、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属は、最近になって実質的に同じ属とされたＢａｓｆｉａ属を含む。

実際に、本発明において最も良い効果を示したＣｇＭＤＨを、ルーメンバクテリア以外の最も代表的な産業的コハク酸生産菌株であるＥ．ｃｏｌｉとＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入してその効果を確認した結果、それぞれの菌株にＣｇＭＤＨを過発現したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）菌株とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株は、そうでない既存のＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株と野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に比べて格段に向上したコハク酸生産能を示した（表２）。このような結果は、通常のバイオ基盤コハク酸生産菌株全般にコハク酸生産能向上のために同一又は類似の方式のＣｇＭＤＨ過発現基盤エンジニアリングが可能であることを示唆する。

最後に、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株のコハク酸生産向上が、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に自然的に存在するＭＤＨの効果からもたらされていないことを確認するために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株ゲノム上に存在するＭＤＨを暗号化する遺伝子を欠失させ、その座にＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑを暗号化する遺伝子を入れて、それぞれＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株とＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株を構築した（表１）。なお、プラスミド上で発現した遺伝子の場合は、プラスミドの不安定性によって抗生剤を用いて保持してもプラスミドを失うことがあるという点が知られている（Ａｌｏｎｓｏ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１５（４）：１０００－１０１３．，２０１８）。このような観点で、遺伝子をゲノム上に直接入れることが、より安定した菌株を構築するのに役立ち得、プラスミドを保持するための高価な抗生剤を使用しなくて済むという利点から、実際に産業菌株ではこのような方法が多用される。

前記構築されたＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株の場合、流加式発酵の結果、８９．６ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．７１ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１３；表１）。ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株の場合、流加式発酵の結果、８２．７６ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．４２ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１３；表１）。

前記ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株とＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株のコハク酸生産能を、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株の生産能と比較すると、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株に自然的に存在するＭＤＨは、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株のコハク酸過生産に大きな影響を与えていないことが分かる。結局、前記Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株のコハク酸生産向上効果も、基質阻害作用が緩和されたＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑから始まったことが分かる。

前記構築されたＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株とＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株のコハク酸生産をさらに向上させるために、制限培地下でグルコースとグリセロールを共に炭素源として用いて流加式発酵を進行した。グリセロールの場合、１ｍｏｌ基準グルコースに比べて２倍の還元当量を提供する。オキサロ酢酸がＭＤＨによってリンゴ酸に転換されるためには１ｍｏｌのＮＡＤＨが必要なため、グリセロールの使用はコハク酸生産に役立ち得ると知られている（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１３（１０）：２１６８－２１７７．，２０１６）。ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株を制限培地下でグルコースとグリセロールを共に炭素源として用いて流加式発酵を進行した結果、１０１．１８ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．３７ｍｏｌ／ｍｏｌグルコース（収率比較を容易にするためにグルコースとグリセロールを共に炭素源として用いた場合、両炭素源の炭素数を計算に含めてグルコース基準で表記した。以下では、このような場合、‘ｍｏｌ／ｍｏｌグルコース’と一律に表記する。）と４．１８ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１３；表１）。この結果は、同一の培地と炭素源下で進行したＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株の流加式発酵結果と類似している（図１１；表２）。この結果は、デュアルフェーズ発酵のようなさらなる複雑な発酵工法を使用せずに行った発酵結果のうち、最も高いコハク酸生産性を示した。

ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株の場合、制限培地下でグルコースとグリセロールを共に炭素源として用いて流加式発酵を進行した結果、９２．５ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．８２ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１３；表１）。ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株に比べては良いコハク酸生産能を示すことはできなかったが、このような結果は、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株と比較してＭＤＨの基質阻害作用を緩和させることによってコハク酸生産能が向上可能であるという点を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果とも一致する（表１）。

したがって、本発明は、一観点において、コハク酸生成能を有する微生物にリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている変異微生物であって、前記リンゴ酸脱水素酵素は、最初のアルファ螺旋の末端部分に位置し、主鎖のアミド官能基を通じてＮＡＤＨのピロリン酸部分と相互作用するアミノ酸残基がグルタミン（Ｇｌｎ）であることを特徴とする変異微生物に関する。

前記相互作用とは、リンゴ酸脱水素酵素の主鎖のアミド官能基がＮＡＤＨのピロリン酸部分を電気的な引力によって安定化する結合を意味する。

本発明において、前記リンゴ酸脱水素酵素は、ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列で表されるコリネバクテリウム・グルタミカム由来リンゴ酸脱水素酵素；又はｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列で表されるマンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来リンゴ酸脱水素酵素において１１番目アミノ酸がグルタミンに置換されたリンゴ酸脱水素酵素であることを特徴とし得るが、これに限定されない。

本発明において、ｉ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム由来リンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、配列番号４１の塩基配列で表され、ｉｉ）前記マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来リンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、配列番号４３の塩基配列で表されることを特徴とし得るが、これに限定されない。

すなわち、本発明では、特定アミノ酸配列及び塩基配列を記載したが、本発明で実施しようとする酵素と実質的に同じアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が本発明の権利範囲に属することは、当業者にとって明らかであろう。“実質的に同じ”とは、アミノ酸又は塩基配列の相同性が非常に高い場合を含み、その他にも、配列の相同性とは関係なく構造的特徴を共有したり、或いは本発明で用いられたのと同じ機能を有するタンパク質を意味する。本発明の核心を構成する配列以外の他の配列が一部欠失した酵素又はこれをコードする塩基配列の断片も本発明に含まれてよく、したがって、本発明は、断片の長さに関係なく、本発明で用いられたのと同じ機能を有するいかなるアミノ酸又は塩基配列も含む。

本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のリンゴ酸脱水素酵素は、下記の配列番号４０で表示できる。

配列番号４０
ＭＮＳＰＱＮＶＳＴＫＫＶＴＶＴＧＡＡＧＱＩＳＹＳＬＬＷＲＩＡＮＧＥＶＦＧＴＤＴＰＶＥＬＫＬＬＥＩＰＱＡＬＧＧＡＥＧＶＡＭ
ＥＬＬＤＳＡＦＰＬＬＲＮＩＴＩＴＡＤＡＮＥＡＦＤＧＡＮＡＡＦＬＶＧＡＫＰＲＧＫＧＥＥＲＡＤＬＬＡＮＮＧＫＩＦＧＰＱＧＫＡ
ＩＮＤＮＡＡＤＤＩＲＶＬＶＶＧＮＰＡＮＴＮＡＬＩＡＳＡＡＡＰＤＶＰＡＳＲＦＮＡＭＭＲＬＤＨＮＲＡＩＳＱＬＡＴＫＬＧＲＧＳ
ＡＥＦＮＮＩＶＶＷＧＮＨＳＡＴＱＦＰＤＩＴＹＡＴＶＧＧＥＫＶＴＤＬＶＤＨＤＷＹＶＥＥＦＩＰＲＶＡＮＲＧＡＥＩＩＥＶＲＧＫ
ＳＳＡＡＳＡＡＳＳＡＩＤＨＭＲＤＷＶＱＧＴＥＡＷＳＳＡＡＩＰＳＴＧＡＹＧＩＰＥＧＩＦＶＧＬＰＴＶＳＲＮＧＥＷＥＩＶＥＧＬ
ＥＩＳＤＦＱＲＡＲＩＤＡＮＡＱＥＬＱＡＥＲＥＡＶＲＤＬＬ

本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、下記の配列番号４１で表示できる。

配列番号４１
ＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＣＡＴＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＴＡＡＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧＧＴＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＣＣＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＡＣＧＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＧＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＧＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＴＡＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＧＣＧＡＣＴＴＧＣＴＣＴＡＡ

本発明において、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のリンゴ酸脱水素酵素は、下記の配列番号４２で表示できる。本発明では、下記の配列番号において１１番目アミノ酸をＧｌｙからＧｌｎに置換し、ＭＤＨのオキサロ酢酸に対するリンゴ酸転換効率を改善した。

配列番号４２
ＭＫＶＡＶＬＧＡＡＧＧＩＧＱＡＬＡＬＬＬＫＬＱＬＰＡＧＳＳＬＳＬＹＤＶＡＰＶＴＰＧＶＡＫＤＬＳＨＩＰＴＤＶＶＶＥＧＦＡＧＴＤＰＳＥＡＬＫＧＡＤＩＶＬＩＳＡＧＶＡＲＫＰＧＭＴＲＡＤＬＦＧＶＮＡＧＩＩＲＳＬＴＥＫＶＡＥＱＣＰＫＡＣＶＧＩＩＴＮＰＶＮＡＭＶＡＩＡＡＥＶＬＫＫＡＧＶＹＤＫＲＫＬＦＧＩＴＴＬＤＩＬＲＡＥＴＦＩＡＥＬＫＧＬＤＰＴＲＶＴＩＰＶＩＧＧＨＳＧＶＴＩＬＰＬＬＳＱＶＱＮＶＥＷＳＳＥＥＥＩＩＡＬＴＨＲＩＱＮＡＧＴＥＶＶＥＡＫＡＧＧＧＳＡＴＬＳＭＡＱＡＡＡＲＦＡＬＡＬＶＫＡＳＱＧＡＫＶＶＥＣＡＹＶＥＧＤＧＫＹＡＲＦＦＡＱＰＶＲＬＧＴＥＧＶＥＥＹＬＴＬＧＫＬＳＡＦＥＥＫＡＬＮＡＭＬＥＴＬＱＧＤＩＫＳＧＥＤＦＩＮＧ

本発明において、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、下記の配列番号４３で表示できる。

配列番号４３
ａｔｇａａａｇｔｔｇｃａｇｔｔｃｔａｇｇｔｇｃｃｇｃａｇｇｃｇｇｃａｔｔｇｇｔｃａａｇｃｇｔｔｇｇｃｔｔｔａｔｔａｔｔａａａｇｔｔａｃａａｔｔａｃｃｇｇｃｔｇｇｔｔｃａｔｃｔｔｔａｔｃｔｃｔｇｔａｔｇａｔｇｔｃｇｃａｃｃｃｇｔｃａｃｃｃｃｇｇｇｔｇｔｔｇｃｔａａａｇａｔｃｔｔａｇｃｃａｔａｔｃｃｃａａｃａｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｔｔｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃｃｇｇｔａｃｇｇａｔｃｃｔｔｃａｇａａｇｃａｔｔａａａａｇｇｇｇｃｇｇａｔａｔｔｇｔｇｔｔａａｔｔｔｃｔｇｃｇｇｇｔｇｔｇｇｃａｃｇｔａａａｃｃｇｇｇｃａｔｇａｃａｃｇｔｇｃｇｇａｔｔｔａｔｔｃｇｇｔｇｔｔａａｔｇｃｇｇｇｔａｔｔａｔｔｃｇｔａｇｔｃｔｇａｃｃｇａａａａａｇｔｇｇｃｇｇａａｃａａｔｇｃｃｃｇａａａｇｃｃｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｔａｔｃａｃｃａａｃｃｃｇｇｔｔａａｔｇｃｇａｔｇｇｔｔｇｃｃａｔｔｇｃｇｇｃｃｇａａｇｔａｔｔｇａａａａａａｇｃｇｇｇｔｇｔｔｔａｃｇａｃａａａｃｇｔａａａｔｔａｔｔｃｇｇｃａｔｔａｃｔａｃｃｔｔａｇａｔａｔｔｃｔｔｃｇａｇｃｇｇａａａｃｃｔｔｔａｔｃｇｃｃｇａａｔｔａａａａｇｇｃｔｔａｇａｔｃｃｔａｃｔｃｇｇｇｔｔａｃａａｔｔｃｃｔｇｔｔａｔｃｇｇｃｇｇｔｃａｔｔｃｇｇｇｔｇｔａａｃｃａｔｔｃｔｔｃｃｇｔｔａｔｔｇｔｃｔｃａａｇｔｔｃａａａａｔｇｔｔｇａａｔｇｇａｇｃａｇｔｇａａｇａｇｇａａａｔｃａｔｔｇｃｔｔｔａａｃｇｃａｔｃｇｔａｔｃｃａａａａｔｇｃａｇｇｔａｃｇｇａａｇｔｇｇｔｔｇａａｇｃａａａａｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃａａｃｃｔｔａｔｃｔａｔｇｇｃｇｃａｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｇｔｔｔｔｇｃａｔｔａｇｃａｔｔａｇｔｇａａａｇｃｃｔｃｇｃａａｇｇｔｇｃｇａａａｇｔｔｇｔｔｇａａｔｇｃｇｃｔｔａｔｇｔｇｇａａｇｇｃｇａｃｇｇｃａａａｔａｔｇｃｃｃｇｔｔｔｃｔｔｔｇｃａｃａａｃｃｇｇｔｔｃｇｔｔｔａｇｇｔａｃａｇａａｇｇｔｇｔｔｇａａｇａａｔａｃｔｔａａｃｃｃｔｇｇｇｔａａａｔｔａａｇｔｇｃａｔｔｔｇａａｇａａａａａｇｃｇｔｔａａａｔｇｃｔａｔｇｔｔａｇａａａｃｔｔｔａｃａａｇｇｔｇａｃａｔｔａａｇｔｃａｇｇｔｇａａｇａｔｔｔｔａｔｔａａｃｇｇｔｔａａ

本発明において、配列番号４２のアミノ酸配列で表されるマンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のリンゴ酸脱水素酵素の１１番目アミノ酸がグルタミンに置換されたリンゴ酸脱水素酵素は、下記の配列番号４４のアミノ酸配列で表示できる。

配列番号４４
ＭＫＶＡＶＬＧＡＡＧＱＩＧＱＡＬＡＬＬＬＫＬＱＬＰＡＧＳＳＬＳＬＹＤＶＡＰＶＴＰＧＶＡＫＤＬＳＨＩＰＴＤＶＶＶＥＧＦＡＧＴＤＰＳＥＡＬＫＧＡＤＩＶＬＩＳＡＧＶＡＲＫＰＧＭＴＲＡＤＬＦＧＶＮＡＧＩＩＲＳＬＴＥＫＶＡＥＱＣＰＫＡＣＶＧＩＩＴＮＰＶＮＡＭＶＡＩＡＡＥＶＬＫＫＡＧＶＹＤＫＲＫＬＦＧＩＴＴＬＤＩＬＲＡＥＴＦＩＡＥＬＫＧＬＤＰＴＲＶＴＩＰＶＩＧＧＨＳＧＶＴＩＬＰＬＬＳＱＶＱＮＶＥＷＳＳＥＥＥＩＩＡＬＴＨＲＩＱＮＡＧＴＥＶＶＥＡＫＡＧＧＧＳＡＴＬＳＭＡＱＡＡＡＲＦＡＬＡＬＶＫＡＳＱＧＡＫＶＶＥＣＡＹＶＥＧＤＧＫＹＡＲＦＦＡＱＰＶＲＬＧＴＥＧＶＥＥＹＬＴＬＧＫＬＳＡＦＥＥＫＡＬＮＡＭＬＥＴＬＱＧＤＩＫＳＧＥＤＦＩＮＧ

本発明において、配列番号４４のアミノ酸配列で表されるマンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来のリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、下記の配列番号４５の塩基配列で表示できる。

配列番号４５
ａｔｇａａａｇｔｔｇｃａｇｔｔｃｔａｇｇｔｇｃｃｇｃａｇｇｃｃａｇａｔｔｇｇｔｃａａｇｃｇｔｔｇｇｃｔｔｔａｔｔａｔｔａａａｇｔｔａｃａａｔｔａｃｃｇｇｃｔｇｇｔｔｃａｔｃｔｔｔａｔｃｔｃｔｇｔａｔｇａｔｇｔｃｇｃａｃｃｃｇｔｃａｃｃｃｃｇｇｇｔｇｔｔｇｃｔａａａｇａｔｃｔｔａｇｃｃａｔａｔｃｃｃａａｃａｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｔｔｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃｃｇｇｔａｃｇｇａｔｃｃｔｔｃａｇａａｇｃａｔｔａａａａｇｇｇｇｃｇｇａｔａｔｔｇｔｇｔｔａａｔｔｔｃｔｇｃｇｇｇｔｇｔｇｇｃａｃｇｔａａａｃｃｇｇｇｃａｔｇａｃａｃｇｔｇｃｇｇａｔｔｔａｔｔｃｇｇｔｇｔｔａａｔｇｃｇｇｇｔａｔｔａｔｔｃｇｔａｇｔｃｔｇａｃｃｇａａａａａｇｔｇｇｃｇｇａａｃａａｔｇｃｃｃｇａａａｇｃｃｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｔａｔｃａｃｃａａｃｃｃｇｇｔｔａａｔｇｃｇａｔｇｇｔｔｇｃｃａｔｔｇｃｇｇｃｃｇａａｇｔａｔｔｇａａａａａａｇｃｇｇｇｔｇｔｔｔａｃｇａｃａａａｃｇｔａａａｔｔａｔｔｃｇｇｃａｔｔａｃｔａｃｃｔｔａｇａｔａｔｔｃｔｔｃｇａｇｃｇｇａａａｃｃｔｔｔａｔｃｇｃｃｇａａｔｔａａａａｇｇｃｔｔａｇａｔｃｃｔａｃｔｃｇｇｇｔｔａｃａａｔｔｃｃｔｇｔｔａｔｃｇｇｃｇｇｔｃａｔｔｃｇｇｇｔｇｔａａｃｃａｔｔｃｔｔｃｃｇｔｔａｔｔｇｔｃｔｃａａｇｔｔｃａａａａｔｇｔｔｇａａｔｇｇａｇｃａｇｔｇａａｇａｇｇａａａｔｃａｔｔｇｃｔｔｔａａｃｇｃａｔｃｇｔａｔｃｃａａａａｔｇｃａｇｇｔａｃｇｇａａｇｔｇｇｔｔｇａａｇｃａａａａｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃａａｃｃｔｔａｔｃｔａｔｇｇｃｇｃａｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｇｔｔｔｔｇｃａｔｔａｇｃａｔｔａｇｔｇａａａｇｃｃｔｃｇｃａａｇｇｔｇｃｇａａａｇｔｔｇｔｔｇａａｔｇｃｇｃｔｔａｔｇｔｇｇａａｇｇｃｇａｃｇｇｃａａａｔａｔｇｃｃｃｇｔｔｔｃｔｔｔｇｃａｃａａｃｃｇｇｔｔｃｇｔｔｔａｇｇｔａｃａｇａａｇｇｔｇｔｔｇａａｇａａｔａｃｔｔａａｃｃｃｔｇｇｇｔａａａｔｔａａｇｔｇｃａｔｔｔｇａａｇａａａａａｇｃｇｔｔａａａｔｇｃｔａｔｇｔｔａｇａａａｃｔｔｔａｃａａｇｇｔｇａｃａｔｔａａｇｔｃａｇｇｔｇａａｇａｔｔｔｔａｔｔａａｃｇｇｔｔａａ

本発明において、前記コハク酸生成能を有する微生物は、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｐ．）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アネロビオスピリルム属（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。

好ましくは、前記コハク酸生成能を有する微生物は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）であることを特徴とし、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓと非常に類似するＢａｓｆｉａ属菌株に乳酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子、ホスホトランスアセチル化酵素を暗号化する遺伝子及び酢酸キナーゼを暗号化する遺伝子を欠失させたＢａｓｆｉａ属変異菌株でよい。

本発明では、コハク酸生産性をさらに向上させるために、前記構築されたＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株を高濃度で接種し、嫌気条件下で向上した生産性でコハク酸を製造した。制限培地下で初期８．７ｇ ＤＣＷ／Ｌの高濃度の細胞を接種し、グルコースとグリセロールを共に炭素源として用いて流加式発酵を進行した結果、１３４．２５ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．３２ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと１０．３２ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した（図１４；表１）。このような結果は、類似の方法を用いたＥ．ｃｏｌｉ及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍで示したコハク酸生産性よりも優れた結果である。Ｌｉｔｓａｎｏｖ ｅｔ ａｌによれば、改良されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いて１２．５ｇＤＣＷ／Ｌの高濃度の細胞を接種してグルコースとギ酸を用いて１３４ｇ／Ｌのコハク酸を２．５３ｇ／Ｌ／ｈの生産性で得ることができたが、これは、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株が８．７ｇＤＣＷ／Ｌのより低い量の細胞を用いても、より高濃度のコハク酸を高生産性で製造できるという点を示す。また、Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌによれば、Ｅ．ｃｏｌｉの場合も、細胞が高農渡のとき、嫌気培養を始める流加式発酵過程によって９９．２ｇ／Ｌのコハク酸を０．１２ｇ／ｇＤＣＷ／ｈの細胞当たりの生産性で生産したが、これは、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ菌株の場合、１．１９ｇ／ｇＤＣＷ／ｈの細胞当たりの生産性でコハク酸を生産することに比しては非常に低い数値であるといえる（Ｌｉｔｓａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７８（９）：３３２５－３７．，２０１２；Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８：３２５－３３２．，２００２）。

したがって、本発明は、さらに他の観点において、
（ａ）前記変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法に関する。

本発明において、前記培養は、ｉ）グルコース、ｉｉ）スクロース、ｉｉｉ）グリセロール、ｉｖ）グルコース及びグリセロール、又はｖ）スクロース及びグリセロールを炭素源として用いることを特徴とし、前記培養は、嫌気的条件で行われることを特徴とし、前記培養は、変異微生物の初期濃度をＯＤ６００ １５～２５に濃縮して培養することを特徴とし得るが、これに限定されない。変異微生物の初期濃度を高濃度に濃縮させる方法には、接種時に高濃度の変異微生物を注入するイナキャレイション（以下、‘イノキュラム法’）又はＭＣＲＢ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）方法（以下、‘ＭＣＲＢ法’）で行われる方法を含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記変異微生物は、ｐＨ ６．０～７．０の培地で培養することを特徴とし得るが、これに限定されない。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

特に、下記実施例では、本発明に係る遺伝子を置換又は過発現させるために、宿主細胞としてコハク酸生成微生物であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ属微生物だけを例示したが、他の種類のコハク酸生成微生物を使用しても、本発明と類似のコハク酸生産能を持つ変異微生物が得られるということは、当業界における通常の知識を有する者には自明な事項であろう。

［実施例１］
ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＥｃＭＤＨ、ＳｃＭＤＨｃ、ＳｃＭＤＨｍ、ＳｃＭＤＨｐ、ＹｌＭＤＨ過発現ベクター（ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＥｃＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｃ、ｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｍ、ｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｐ、ｐＥＴ３０ａ：ＹｌＭＤＨ）の作製及び変異酵素過発現ベクター（ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^{Ａ２２４Ｓ}、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）作製
各コハク酸生産微生物のＭＤＨをＥ．ｃｏｌｉで過発現させてタンパク質を確保するためにそれぞれの過発現ベクターを作製した。配列番号１と２、３と４、５と６、７と８のプライマーを用いてそれぞれ、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ，Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型にしてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素で切った後、ｐＥＴ３０ａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にクローニングして過発現ベクターｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＥｃＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＹｌＭＤＨを完成した。

配列番号１：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣ
配列番号２：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧ ＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣ
配列番号３：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＣＧＣＡ
配列番号４：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧ ＡＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣ
配列番号５：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＣＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴ
配列番号６：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ
配列番号７：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣ
配列番号８：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴ

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の３つのＭＤＨ（ＳｃＭＤＨｃ、ＳｃＭＤＨｍ、ＳｃＭＤＨｐ）を過発現せさせるベクターを作製するためにそれぞれ、配列番号９と１０、１１と１２、１３と１４に該当するプライマーを用い、いずれもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムを鋳型にしてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素で切った後、ｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にクローニングし、過発現ベクターｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｃ、ｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｍ、ｐＥＴ３０ａ：ＳｃＭＤＨｐを作製した。

配列番号９：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡ
配列番号１０：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣ
配列番号１１：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＴＡＡＡＣＧＴＧＣＧ
配列番号１２：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＡＣＣ
配列番号１３：５’－ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣＴＴＧＧＣＧＣＴ
配列番号１４：５’－ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＧＧＡＴＧＡＡ

ＭｓＭＤＨの変異酵素を過発現させ得るベクター（ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ^{Ａ２２４Ｓ}）を作製するためにそれぞれ、配列番号１５と１６、１７と１８、１９と２０のプライマーを用い、ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨを鋳型にしてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換させ、カナマイシン含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）固体培地で選択的に育つようにして抽出した。同様に、ＣｇＭＤＨの変異酵素を過発現させ得るベクター（ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）を作製するためにそれぞれ、配列番号２１と２２、２３と２４、２５と２６のプライマーを用い、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨを鋳型にしてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換させ、カナマイシン含むＬＢ固体培地で選択的に育つようにして抽出した。最終的に、配列分析をし、成功的に変異したことを確認した。

配列番号１５：５’－ＣＴＡＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＴＴＧ
配列番号１６：５’－ＣＡＡＣＧＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＧ
配列番号１７：５’－ＧＧＴＡＴＴＡＴＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧ
配列番号１８：５’－ＣＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＣ
配列番号１９：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧ
配列番号２０：５’－ＣＧＣＣＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ
配列番号２１：５’－ＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧ
配列番号２２：５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴ
配列番号２３：５’－ＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＴＧ
配列番号２４：５’－ＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＡＴＣＴＴ
配列番号２５：５’－ＧＴＣＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡ
配列番号２６：５’－ＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＣ

［実施例２］
ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＥｃＭＤＨ、ＹｌＭＤＨ及びそれらの変異酵素タンパク質（ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）の発現及び精製
実施例１で作製した過発現ベクター（ｐＥＴ３０ａ：ＭｓＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＣｇＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＥｃＭＤＨ、ｐＥＴ３０ａ：ＹｌＭＤＨ）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｔ１Ｒに形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有しているＬＢ培地において３７℃で培養した後、ＯＤ_６００が０．６になったとき、ＩＰＴＧで発現を誘導した。発現誘導後に、さらに該当の酵素タンパク質が発現するように１８℃で２０時間培養した。このような培養液を４℃で５，０００ｇで１５分間遠心分離して細胞を収穫した後、氷中で冷たく維持されたバッファーＡ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０）にさらに入れて音波破砕で細胞を壊した。このように確保された細胞破砕物から、１時間の１１，０００ｇ遠心分離によって細胞残骸を除去した。最終的に確保された上澄液をＮｉ－ＮＴＡアガロ－スビーズに結合させ、親和性クロマトグラフィーを用いてヒスチジンタグ付きＭＤＨタンパク質を選択的に精製した。低い２０ｍＭの濃度のイミダゾールが含まれているバッファーＡで残りの非特異性結合をしたタンパク質を洗い落とした後、３００ｍＭイミダゾールが含まれているバッファーＡを用いて目的のタンパク質を溶出した。高純度のタンパク質を確保するための追加の精製のために、ＨｉＴｒａｐ Ｑを用いたイオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーを用いて９５％以上の高純度ＭＤＨタンパク質を確保することができた。以上に精製されたＭＤＨタンパク質を実施例３で記述された３ｎＭ濃度に希釈して活性測定において使用し、ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨタンパク質は、最終的にそれぞれ５４ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬに濃縮して結晶化を行った。

［実施例３］
ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＥｃＭＤＨ、ＹｌＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}のオキサロ酢酸還元活性測定
ＭＤＨのオキサロ酢酸還元活性では補助因子としてＮＡＤＨという還元力が消耗され、その結果、ＮＡＤ^＋が生成される。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける独特の吸光性質を用いて分光光度計法でＭＤＨの活性を時間別に測定することができる。比較活性測定のための最終反応溶液の組成は、次のように構成した：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ ８．０）、１００μＭ ＮＡＤＨ、１００μＭ オキサロ酢酸、最後に３ｎＭの精製されたＭＤＨ（ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＥｃＭＤＨ、ＹｌＭＤＨ）。変異酵素（ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＭｓＭＤＨ^{Ｌ１０１Ｑ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｑ１１７Ｌ}、ＣｇＭＤＨ^{Ｓ２４２Ａ}）の活性測定のための最終反応溶液の組成は、比較活性測定のための組成と同一であった。反応速度論的活性比較のための最終反応溶液では、前記の条件においてオキサロ酢酸の濃度とＮＡＤＨの濃度に変化を与えて測定し、オキサロ酢酸に対する反応速度論的活性測定時にはＮＡＤＨの濃度を２００μＭに、ＮＡＤＨに対する反応速度論的活性測定時にはオキサロ酢酸の濃度を１００μＭに固定して測定した。グラフ製図時には、酵素を投入してから初期の反応時間において減少するＮＡＤＨの量を吸光係数として計算し、分当たり転換されるオキサロ酢酸の濃度（μＭ）を初期速度として示した。ｐＨによる活性比較時には、前記最終反応溶液の組成（０．１Ｍバッファー、２００μＭ ＮＡＤＨ、１００μＭオキサロ酢酸、３ｎＭのＭＤＨ）を使用し、ｐＨ ５．０～６．０ではＢＩＳ－ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ ７．０～９．０ではＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ １０．０ではグリシンバッファーをそれぞれ使用した。

［実施例４］
ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨの結晶化及び構造分析
精製されたタンパク質の初期結晶化は、シッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ－ｄｒｏｐ）蒸気拡散方法を用いてスクリーニングキット（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２０℃で行った。各実験は、１．０μＬのＣｇＭＤＨ又はＭｓＭＤＨタンパク質と１．０μＬのｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液を混ぜて０．５ｍＬのｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液に対して平衡化させて行われた。ＣｇＭＤＨ結晶がいくつかの結晶化スクリーニング条件で発見され、ハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ－ｄｒｏｐ）蒸気拡散方法を用いて数回の最適化過程を経た後、１８％ ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍ ＭｇＣｌ_２六水和物（ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ条件で最良の質の結晶が現れた。基質結合構造を決定するために、基質であるＮＡＤ^＋、リンゴ酸と共に結晶化を行って、同じ条件で結晶を確保した。ＭｓＭＤＨの場合、１６％ ＰＥＧ３３５０と８％タクシメート（Ｔａｃｓｉｍａｔｅ）ｐＨ ６．０で０．３×０．３×０．１ｍｍサイズの良質の結晶を得、Ｘ線回折実験を行うことができた。基質結合構造を決定するために、基質であるＮＡＤ^＋と共に結晶化を行い、同じ条件でＭｓＭＤＨ基質結合結晶を確保した。結晶の低温保護のために、ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液に含まれた３０％グリセロールが使用され、０．９７９３４Å波長のＸ線回折イメージがＱＵＡＮＴＵＭ２７０ＣＣＤ検出器によってポハン加速器研究所７Åビームラインで収集された。ＣｇＭＤＨとＮＡＤ^＋、リンゴ酸結合ＣｇＭＤＨ結晶、ＭｓＭＤＨとＮＡＤ^＋結合ＭｓＭＤＨ結晶はそれぞれ、１．９５Å、２．００Å、２．３０Å、１．９８Åの解像度まで回折することを確認した。このようなデータはＨＫＬ２０００プログラムによってインデクシング、インテグレーション、スケーリングされ、ＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨデータのそれぞれは、分子置換（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）手法を用いて、探索モデルであるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＭＤＨ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ４ＴＶＯ）とＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＭＤＨ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ６ＡＯＯ）の構造によってフェイジング（ｐｈａｓｉｎｇ）された。モデル構築はＷｉｎＣｏｏｔを用いて行い、精製（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）はＲＥＦＭＡＣ５を用いて行った。

［実施例５］
ＭｓＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ過発現ベクター（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ、ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）の作製及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株の作製
各コハク酸生成微生物のＭＤＨを過発現させてその効果を調べ、構造分析に基づいて改良したＭＤＨを過発現させてその効果を調べるために、それぞれの過発現ベクターを作製した。まず、ＭｓＭＤＨ過発現ベクターｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈを得るために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓのゲノムを鋳型とし、配列番号２７と２８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７３（１７）：５４１１－５４２０．，２００７）にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングしてｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈベクターを完成した。ＣｇＭＤＨ過発現ベクターｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈを得るために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムを鋳型とし、配列番号２９と３０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングしてｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈベクターを完成した。ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ過発現ベクターｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇを得るために、ＣｇＭＤＨ^Ｑ２０Ｇ遺伝子断片を鋳型とし、配列番号２９と３０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングしてｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇベクターを完成した。ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ過発現ベクターｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑを得るために、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ遺伝子断片を鋳型とし、配列番号２７と２８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングしてｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑベクターを完成した。

配列番号２７：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧ
配列番号２８：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＣ
配列番号２９：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣ
配列番号３０：５’－ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＣＧＣＡＣ

上記のように作製されたｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ、ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１ＱをＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に導入することによって、最終的にそれぞれ、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株を完成した。上記のように過発現ベクターを導入するために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ－Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）固体培地に塗抹し、３６時間３９℃で培養した後、コロニーをＢＨＩ液体培地１０ｍＬに接種し、１２時間培養した。十分に育った細胞培養液を再びＢＨＩ液体培地１００ｍＬに１ｍＬ接種し、３９℃静置培養器で培養した。約４～５時間後、細胞成長がＯＤ_６００基準に０．３～０．５程度になった時、前記細菌培養液を０～４℃に２０分間置いて細胞成長がそれ以上進まないように防ぎ、これを４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を得た。その後、４℃の１０％グリセロール溶液２００ｍＬでセルを再懸濁した後、再び上記と同じ条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を１０％グリセロール溶液を半分に減らしながら総３回行った。最終に得られたセルは、同一体積の１０％グリセロール溶液で再懸濁し分注して－８０℃に保管した。前記得られた細胞濃縮懸濁液と本実施例で作製した過発現ベクター４種をそれぞれ混合し、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行って前記ベクターでＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）の形質転換を試みた。このように電気穿孔されたセルは、ＢＨＩ液体培地を加え、３９℃静置培養器で１時間回復培養した後、培養液を全て、抗生剤アンピシリン２．５μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩ固体培地に塗抹し、３９℃静置培養器で４８時間以上培養した。前記培地で形成された変異菌株を、抗生剤が含まれているＢＨＩ液体培地で培養し、ベクターミニプレップ（ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ）を用いて得たベクターを電気泳動することによって過発現ベクターの導入を確認した。

［実施例６］
ＥｃＭＤＨ、ＺｒＭＤＨ、ＳｃＭＤＨ２、ＳｃＭＤＨ３過発現ベクター（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）の作製及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株の作製
先行文献で報告されたＭＤＨを過発現させその効果を調べるためにそれぞれの過発現ベクターを作製した。まず、ＥｃＭＤＨ過発現ベクターｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈを得るために、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型とし、配列番号４６と４７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈベクターを完成した。ＺｒＭＤＨ過発現ベクターｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈを得るために、Ｚｒｍｄｈ遺伝子断片を鋳型とし、配列番号４８と４９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈベクターを完成した。ＳｃＭＤＨ２過発現ベクターｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２を得るために、ＳｃＭＤＨ２遺伝子断片を鋳型とし、配列番号５０と５１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２ベクターを完成した。ＳｃＭＤＨ３過発現ベクターｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３を得るために、ＳｃＭＤＨ３遺伝子断片を鋳型とし、配列番号５２と５３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＳ３にＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３ベクターを完成した。

配列番号４６：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＣＧＣＡＧＴＣＣＴＣ
配列番号４７：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣ
配列番号４８：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧ
配列番号４９：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＣＣＧＡＧ
配列番号５０：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＣ
配列番号５１：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧ
配列番号５２：５’－ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣ
配列番号５３：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣ

上記のように作製されたｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２、ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３をＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に導入することによって最終的にそれぞれＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株を完成した。上記のように過発現ベクターを導入するために、実施例５と類似に、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＢＨＩ固体培地に塗抹し、３６時間３９℃で培養した後、コロニーをＢＨＩ液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。十分に育った細胞培養液を再びＢＨＩ液体培地１００ｍＬに１ｍＬ接種し、３９℃静置培養器で培養した。約４～５時間後に、細胞成長がＯＤ_６００基準に０．３～０．５程度になった時、前記細菌培養液を０～４℃で２０分間置いて細胞成長がそれ以上進まないように防ぎ、これを４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を得た。その後、４℃の１０％グリセロール溶液２００ｍＬでセルを再懸濁した後、再び上記と同じ条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を１０％グリセロール溶液を半分に減らしながら総３回行った。最終に得られたセルは、同一体積の１０％グリセロール溶液で再懸濁し分注して－８０℃に保管した。前記得られた細胞濃縮懸濁液と本実施例で作製した過発現ベクター４種をそれぞれ混合し、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で電気穿孔を行って前記ベクターでＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）の形質転換を試みた。このように電気穿孔されたセルはＢＨＩ液体培地を加え、３９℃静置培養器で１時間回復培養した後、培養液を全て、抗生剤アンピシリン２．５μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩ固体培地に塗抹し、３９℃静置培養器で４８時間以上培養した。前記培地で形成された変異菌株を、抗生剤が含まれているＢＨＩ液体培地で培養し、ベクターミニプレップを用いて得たベクターを電気泳動することによって過発現ベクターの導入を確認した。

［実施例７］
Ｅ．ｃｏｌｉ及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用ＣｇＭＤＨ過発現ベクター（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ、ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）の作製及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株の作製
ＣｇＭＤＨの過発現効果を代表的なコハク酸生産菌株であるＥ．ｃｏｌｉとＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍで調べるために、各菌株用ＣｇＭＤＨ過発現ベクターを作製した。まず、Ｅ．ｃｏｌｉ用過発現ベクターｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈを得るために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムを鋳型とし、配列番号５４と５５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐ１００ｐｒｏ９９Ａ（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１５（４０）：Ｅ９２７１－Ｅ９２７９．，２０１８）のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ部位にクローニングしてｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈベクターを完成した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用過発現ベクターｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈを得るために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムを鋳型とし、配列番号５６と５７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように得られたＰＣＲ産物をｐＥＫＥｘ１（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４２：１５７－１６７．，２０１７）のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ部位にクローニングしてｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈベクターを完成した。

配列番号５４：５’－ＴＣＣＴＡＧＧＴＡＣＡＧＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣ
配列番号５５：５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＣＧＣＡＣ
配列番号５６：５’－ＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣ
配列番号５７：５’－ＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＣＧＣＡＣ

上記のように作製されたｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ、ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈベクターをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０と野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入することによって、最終的にそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株を完成した。上記のように過発現ベクターを導入するために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０をＬＢ固体培地に塗抹し、２４時間３７℃で培養した後、コロニーをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。十分に育った細胞培養液を再びＬＢ液体培地１００ｍＬに１ｍＬ接種し、３７℃培養器で培養した。約４～５時間後、細胞成長がＯＤ_６００基準に０．３～０．５程度になった時、前記細菌培養液を０～４℃に２０分間置いて細胞成長がそれ以上進まないように防ぎ、これを４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を得た。その後、４℃の１０％グリセロール溶液２００ｍＬでセルを再懸濁した後、再び上記と同じ条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を１０％グリセロール溶液を半分に減らしながら総３回行った。最終に得られたセルは、同一体積の１０％グリセロール溶液で再懸濁し分注して－８０℃に保管した。前記得られた細胞濃縮懸濁液と本実施例で作製した過発現ベクターｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈを混合し、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で電気穿孔を行って前記ベクターでＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０の形質転換を試みた。このように電気穿孔されたセルはＬＢ液体培地を加え、３７℃培養器で１時間回復培養した後、培養液を全て、抗生剤アンピシリン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃培養器で２４時間以上培養した。前記培地で形成された変異菌株を、抗生剤が含まれているＬＢ液体培地で培養し、ベクターミニプレップを用いて得たベクターを電気泳動することによって過発現ベクターの導入を確認した。類似の方法でＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍをＢＨＩＳ（リットル当たり３７ｇ ＢＨＩ、Ｄ－ソルビトール９１ｇ）固体培地に塗抹し、２４時間３０℃で培養した後、コロニーをＢＨＩＳ液体培地１０ｍＬに接種して１８時間培養した。十分に育った細胞培養液を再びＢＨＩＳ液体培地１００ｍＬに１ｍＬ接種し、３０℃培養器で培養した。約４～５時間後、細胞成長がＯＤ_６００基準に０．３～０．５程度になった時、前述したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０の場合と同一に細胞濃縮懸濁液を作製して－８０℃に保管した。前記得られた細胞濃縮懸濁液と本実施例で作製した過発現ベクターｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈを混合し、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で電気穿孔を行って前記ベクターでＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの形質転換を試みた。このように電気穿孔されたセルはＢＨＩＳ液体培地を加え、３０℃培養器で２時間回復培養した後、培養液を全て、抗生剤カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０℃培養器で２４時間以上培養した。前記培地で形成された変異菌株を、抗生剤が含まれているＢＨＩＳ液体培地で培養し、ベクターミニプレップを用いて得たベクターを電気泳動することによって過発現ベクターの導入を確認した。

［実施例８］
ＣｇＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ置換ベクター（ｐＩＮｃｇＭＤＨ、ｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ）の作製及びＰＡＬＫｃｇｍｄｈ、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株の作製
コハク酸生産菌株に自然的に存在するＭＤＨがＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株とＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）菌株のコハク酸生産向上にいかなる影響を与えたかを確認するために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株ゲノム上に存在するＭＤＨを暗号化する遺伝子を欠失させ、その座にＣｇＭＤＨとＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑを暗号化する遺伝子を入れるＣｇＭＤＨ、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ置換ベクターｐＩＮｃｇＭＤＨとｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑを作製した。ｐＩＮｃｇＭＤＨ作製のために、ｓａｃＢ遺伝子を含むｐＳａｃＨＲ０６をＸｈｏＩとＳａｃＩで切断した。その後、ゲノム上に存在するＭＤＨ暗号化遺伝子の前、後の配列を、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株のゲノムを鋳型とし、配列番号３１と３２、配列番号３８と３９のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ｌｏｘ６６－ｃａｔ－ｌｏｘ７７カセットはクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むベクターを鋳型とし、配列番号３６と３７のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。ＣｇＭＤＨ遺伝子は、実施例５で作製したｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈベクターを鋳型とし、配列番号３３と３５番のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。このように得た線形ｐＳａｃＨＲ０６、ＭＤＨ暗号化遺伝子の前、後配列の各１ｋｂ、ｌｏｘ６６－ｃａｔ－ｌｏｘ７７カセット、ＣｇＭＤＨ遺伝子断片をギブソンアセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，６（５）：３４３．，２００９）を用いて合わせ、ｐＩＮｃｇＭＤＨが得られた。ｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑに必要なＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ遺伝子断片は、ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑを鋳型とし、配列番号３３と３４のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。このように得た線形ｐＳａｃＨＲ０６、ＭＤＨ暗号化遺伝子の前、後配列の各１ｋｂ、ｌｏｘ６６－ｃａｔ－ｌｏｘ７７カセット、ＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑ遺伝子断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて合わせ、ｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑを得た。上記のように作製されたｐＩＮｃｇＭＤＨ、ｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１ＱをＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に導入することによって、最終的にそれぞれＰＡＬＫｃｇｍｄｈ、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株を作製した。

配列番号３１：５’－ＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡ
配列番号３２：５’－ＧＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧＧＡ
配列番号３３：５’－ＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＴＧＣＣ
配列番号３４：５’－ＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＡＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＣＣＧＣＡＴ
配列番号３５：５’－ＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＡＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧ
配列番号３６：５’－ＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡ
配列番号３７：５’－ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣ
配列番号３８：５’－ＧＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＣＴＣＣＣＴＡＴＴＴＡＡＧＡＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＧＧＡ
配列番号３９：５’－ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＧＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴＴＡＡＴ

すなわち、実施例５と類似にＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＢＨＩ固体培地に塗抹し、３時間３９℃で培養した後、コロニーをＢＨＩ液体培地１０ｍＬに接種して１時間培養した。十分に育った細胞培養液を再びＢＨＩ液体培地１００ｍＬに１ｍＬ接種し、３９℃静置培養器で培養した。４～５時間後、細胞成長がＯＤ_６００基準に０．３～０．５程度になった時、前記細菌培養液を０～４℃に２分間置いて細胞成長がそれ以上進まないように防ぎ、これを４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を得た。その後、４℃の１０％グリセロール溶液２００ｍＬでセルを再懸濁した後、再び上記と同じ条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を１０％グリセロール溶液を半分に減らしながら総３回行った。最終に得られたセルは、同一体積の１０％グリセロール溶液で再懸濁し分注して－８０℃に保管した。

前記得られた細胞濃縮懸濁液と本実施例で作製した遺伝子除去ベクターｐＩＮｃｇＭＤＨ、ｐＩＮｍｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑをそれぞれ混合し、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で電気穿孔を行って前記ベクターでＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）の形質転換を試みた。このように電気穿孔されたセルはＢＨＩ液体培地を加え、３９℃静置培養器で１時間回復培養した後、培養液を全て、抗生剤クロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩ固体培地に塗抹し、３９℃静置培養器で４８時間以上培養した。二重交差（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が起きたコロニーを選別するために、形成されたコロニーをクロラムフェニコール（６．８μｇ／ｍＬ）と１００ｇ／Ｌのスクロースを含有しているＢＨＩ固体培地に塗抹し、２４時間培養した後、形成されたコロニーを同一の固体培地に再び塗抹した。

前記培地で形成された変異菌株を、抗生剤が含まれているＢＨＩ液体培地で培養し、培養菌株のゲノムＤＮＡを分析した。前記分離された変異菌株のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによって、ゲノムＤＮＡのＭＤＨ遺伝子欠失、及びＣｇＭＤＨ或いはＭｓＭＤＨ^Ｇ１１Ｑの導入有無を確認した。

［実施例９］
Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）、及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株を用いたコハク酸生産
前記実施例５で作製されたＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株は、２０ｍＬ ＭＨ５培地（リッター当たり、２．５ｇ酵母抽出物、２．５ｇポリペプトン、１ｇ ＮａＣｌ、０．０２ｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、及び８．７０９ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４）に炭素源として別に滅菌処理されたグルコース又はグリセロールを１０ｇ／Ｌの濃度で接種し、嫌気条件で３９℃で８時間培養した後、これを再び同一の培地２７０ｍＬに移して培養した。発酵は、前記の培養液を２．５Ｌの合成培地（リッター当たり、１ｇ ＮａＣｌ、２ｇ（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．０２ｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、８．７０９ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５ｇシステイン、０．５ｇメチオニン、０．５ｇアラニン、０．５ｇアスパラギン、０．５ｇアスパラギン酸、０．５ｇプロリン、０．５ｇセリン、０．００５ｇニコチン酸、０．００５ｇパントテン酸カルシウム、０．００５ｇピリドキシン・ＨＣｌ、０．００５ｇチアミン、０．００５ｇアスコルビン酸及び０．００５ｇビオチン）を含有している微生物反応器（Ｂｉｏｆｌｏ ３０００，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，ＮＪ，ＵＳＡ）に接種して行い、発酵条件は１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）初期グルコース濃度、グリセロール使用時には４．６ｇ／Ｌ（５０ｍＭ）初期グリセロール濃度で、温度３９℃、２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍ（二酸化炭素体積／培養器内操業体積（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）／分）の速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にｐＨは、１．５７Ｍアンモニア水及び６．８４Ｍ水酸化マグネシウム溶液を用いて６．５に調整し、抗生剤はカナマイシン２５μｇ／ｍＬとアンピシリン２５μｇ／ｍＬを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に９００ｇ／Ｌのグルコース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。

その結果、図１１及び表１に示すように、炭素源としてグルコースだけを使用した場合、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ）菌株は７９．０７ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．２６ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株は、８７．２３ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２９ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．６ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産し、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ^Ｑ２０Ｇ）菌株は、７９．３９ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．００ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．２７ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。最後に、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株の流加式発酵の結果、８４．１９ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．０８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．４８ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。結果的に、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株が最も優れたコハク酸生産能を示し、また、タンパク質構造分析を用いた改良タンパク質過発現菌株であるＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ）菌株も、既存のＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株に比べて向上したコハク酸生産能を示す。

［実施例１０］
Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）、及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株を用いたコハク酸生産
前記実施例６で作製されたＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）及びＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株は、実施例９と同様に、２０ｍＬ ＭＨ５培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコースを１０ｇ／Ｌの濃度で接種し、嫌気条件で３９℃で８時間培養した後、これを再び同一の培地２７０ｍＬに移して培養した。発酵は、上記の培養液を実施例９におけると同じ２．５Ｌの合成培地を含有している微生物反応器に接種して行い、発酵条件は１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）初期グルコース濃度で、温度３９℃、２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍの速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にｐＨは、１．５７Ｍアンモニア水及び６．８４Ｍ水酸化マグネシウム溶液を用いて６．５に調整し、抗生剤は、カナマイシン２５μｇ／ｍＬとアンピシリン２５μｇ／ｍＬを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に９００ｇ／Ｌのグルコース溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。

その結果、図１２及び表１に示すように、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｅｃｍｄｈ）菌株は、７９．０５ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２９ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．２７ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｚｒｍｄｈ）菌株は、７６．１１ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２５ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．１５ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産し、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ２）菌株は、７７．３４ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．１６ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．１９ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。最後に、ＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｓｃｍｄｈ３）菌株の流加式発酵の結果、７５．１５ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．１ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。このような結果は、実施例９で示したように、ＭＤＨが過発現していない既存のＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株に比べては向上したコハク酸生産能を示すが、ＣｇＭＤＨが過発現したＰＡＬＫ（ｐＭＳ３－ｃｇｍｄｈ）菌株に比べては低い数値であり、即ち、文献に報告されたＭＤＨに比べてＣｇＭＤＨがコハク酸生産に最も主要な役割を担うということを傍証する。

［実施例１１］
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びそれぞれの菌株にＣｇＭＤＨが過発現したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株を用いたコハク酸生産
上記の記実施例７で作製されたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）菌株とＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株は、１０ｍＬ ＬＢ培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコースを３ｇ／Ｌの濃度で接種し、３７℃で１６時間培養した後、これを再び同一の培地１００ｍＬに移して培養した。初期細胞濃度は、ＯＤ_６００基準０．２～０．２５で接種し、フラスコの上の部分に二酸化炭素を十分に充填して嫌気条件３７℃で１６時間培養した。抗生剤は、アンピシリン２５μｇ／ｍＬを添加した。その結果、表２のように、ＣｇＭＤＨが過発現したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐ１００ｐｒｏ９９Ａ－ｃｇｍｄｈ）菌株は、既存Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株が０．１４ｇ／Ｌのコハク酸生産を示したのに比べて格段に向上した０．４３１ｇ／Ｌのコハク酸生産を示した。

前記作製されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株と野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株は、１０ｍＬ ＢＨＩＳ液体培地に接種して３０℃で１８時間培養した後、これを再び同一の培地１００ｍＬに移して培養した。初期細胞濃度はＯＤ_６００基準０．２～０．２５で接種し、細胞成長のために、初期６時間の間に好気環境で培養した後、フラスコの上の部分に二酸化炭素を十分に充填して嫌気条件３０℃で１０時間培養した。抗生剤は、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを添加した。嫌気環境に転換すると同時に、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度が０．５ｍＭになるように添加してインダクションした。その結果、表２のように、ＣｇＭＤＨが過発現したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｐＥＫＥｘ１－ｃｇｍｄｈ）菌株は、既存Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株が０．０８ｇ／Ｌのコハク酸生産を示したのに比べて格段に向上した０．６９ｇ／Ｌのコハク酸生産を示した。このような結果から、ＣｇＭＤＨが一般のコハク酸生産菌株に過発現した時にもコハク酸生産能向上に肯定的な効果を与えることができたということが分かる。

［実施例１２］
Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株を用いたコハク酸生産
上記の実施例８で作製されたＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑを、２０ｍＬ ＭＨ５培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコース又はグリセロールを１０ｇ／Ｌの濃度で接種し、嫌気条件で３９℃で８時間培養した後、これを再び同一の培地２７０ｍＬに移して培養した。発酵は、上記の培養液を実施例９と同様に、２．５Ｌの合成培地を含有している微生物反応器に接種して行い、発酵条件は１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）初期グルコース濃度、グリセロール使用時には４．６ｇ／Ｌ（５０ｍＭ）初期グリセロール濃度で、温度３９℃、２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍの速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にｐＨは、１．５７Ｍアンモニア水及び６．８４Ｍ水酸化マグネシウム溶液を用いて６．５に調整し、抗生剤は、カナマイシン２５μｇ／ｍＬとクロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に９００ｇ／Ｌのグルコース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。

その結果、図１３及び表１に示すように、炭素源としてグルコースだけを使用した場合、ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株は、８９．６ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．７１ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産し、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株は、８２．７６ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．４２ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。

炭素源としてグルコースとグリセロールを同時に使用した場合、ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株は、１０１．１８ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．３７ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと４．１８ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産し、ＰＡＬＫｍｓｍｄｈ^Ｇ１１Ｑ菌株は、９２．５ｇ／Ｌのコハク酸をそれぞれ１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースと３．８２ｇ／Ｌ／ｈの収率及び生産性で生産した。

［実施例１３］
Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株とＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株を用いたコハク酸生産性向上
本実施例ではＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株を用いたコハク酸生産性向上方法を確認した。

図１３の（Ｃ）から分かるように、ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株は接種して１１～１３時間が経過した後に最大生産性に到達しており、この時の細胞濃度が最大に増加したことが分かる。したがって、生産性を最大化させるために、現在レベルよりも細胞濃度をさらに高めたとき、生産性の変化がどのようになるかを調べてみた。

実施例９と同じ培養条件でＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株の初期細胞濃度をＯＤ_６００＝１９．３（８．７ｇＤＣＷ／Ｌ）レベルに上げたとき、コハク酸生産性はどのように変化するかを調べるために、実施例９におけると同様に、２．５Ｌの合成培地を含有している微生物反応器に接種して行い、接種時発酵条件は、１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）初期グルコース濃度、グリセロール使用時には４．６ｇ／Ｌ（５０ｍＭ）初期グリセロール濃度で、温度３９℃、２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍの速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にｐＨは、１．５７Ｍアンモニア水及び６．８４Ｍ水酸化マグネシウム溶液を用いて６．５に調整し、抗生剤は、カナマイシン２５μｇ／ｍＬとクロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に９００ｇ／Ｌのグルコース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。ＰＡＬＫｃｇｍｄｈを１１時間発酵させて細胞濃度が最高点にほとんど達すると培養を終了し、培養液を４℃で６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞ペレットを得た。細胞ペレットを同一の合成培地２００ｍＬに再懸濁し、高濃度の接種源（ｉｎｏｃｌｕｌｕｍ）が得られた。これを接種し、初期グルコース及びグリセロールの濃度を２倍にする以外は、実施例９の条件と同一にして培養した結果、図１４及び表１に示すように、コハク酸生産性が１０．３２ｇ／Ｌ／ｈ、及び最高生産性は１５．７２ｇ／Ｌ／ｈと、本来の発酵条件に比べて２倍以上増加したことが分かった。

このような生産性向上が菌株改良の効果であることを再確認するために、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株も同一の方法で初期細胞濃度をＯＤ_６００＝２１．１（９．５２ｇ ＤＣＷ／Ｌ）レベルに上げたとき、コハク酸生産性が８．９３ｇ／Ｌ／ｈ、及び最高生産性は１２．４ｇ／Ｌ／ｈと確認された。このことから、高濃度の細胞を接種した発酵方法が生産性を飛躍的に増加させるが、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫｃｇｍｄｈ菌株がより優れたコハク酸生産性及び生産量を示すことが分かった。

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者とって、このような具体的記述は単に好ましい実施例であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

本発明に係るコハク酸生成変異微生物は、主鎖のアミド官能基を通じてＮＡＤＨのピロリン酸部分と相互作用するアミノ酸残基がグルタミン（Ｇｌｎ）であるリンゴ酸脱水素酵素が発現してオキサロ酢酸からリンゴ酸への転換活性が顕著に増加するため、制限培地下で微生物を培養時に、現在まで報告された最も高いコハク酸生産性で高濃度のコハク酸を生産することができる。なお、深化した発酵技術を用いてより優れた生産性及び生産濃度でコハク酸を生産することができる。

Claims (5)

1. Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）にリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている変異微生物であって、
   前記リンゴ酸脱水素酵素は、配列番号４０のアミノ酸配列又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、変異微生物。
2. Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のゲノム中に存在するリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、さらに欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
3. 次の段階を含むコハク酸の製造方法：
   （ａ）請求項１又は２に記載の変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階；及び
   （ｂ）前記生成されたコハク酸を回収する段階。
4. 前記培養は、ｉ）グルコース；ｉｉ）スクロース；ｉｉｉ）グリセロール；ｉｖ）グルコース及びグリセロール；又はｖ）スクロース及びグリセロールを炭素源として用いることを特徴とする、請求項３に記載のコハク酸の製造方法。
5. 前記培養は嫌気的条件で行われることを特徴とする、請求項３に記載のコハク酸の製造方法。

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