JP2022510499A - 高活性のリンゴ酸脱水素酵素が導入されたコハク酸生成用変異微生物及びこれを用いたコハク酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)前記変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階;及び
(b)前記生成されたコハク酸を回収する段階。
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ELLDSAFPLLRNITITADANEAFDGANAAFLVGAKPRGKGEERADLLANNGKIFGPQGKA
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(a)前記変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階;及び
(b)前記生成されたコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法に関する。
本発明において、前記変異微生物は、pH 6.0~7.0の培地で培養することを特徴とし得るが、これに限定されない。
MsMDH、CgMDH、EcMDH、ScMDHc、ScMDHm、ScMDHp、YlMDH過発現ベクター(pET30a:MsMDH、pET30a:CgMDH、pET30a:EcMDH、pET30a:ScMDHc、pET30a:ScMDHm、pET30a:ScMDHp、pET30a:YlMDH)の作製及び変異酵素過発現ベクター(pET30a:MsMDHG11Q、pET30a:CgMDHQ20G、pET30a:MsMDHL101Q、pET30a:CgMDHQ117L、pET30a:MsMDHA224S、pET30a:CgMDHS242A)作製
各コハク酸生産微生物のMDHをE.coliで過発現させてタンパク質を確保するためにそれぞれの過発現ベクターを作製した。配列番号1と2、3と4、5と6、7と8のプライマーを用いてそれぞれ、M.succiniciproducens,C.glutamicum,E.coli K12、Y.lipolyticaのゲノムDNA(genomic DNA)を鋳型にしてPCRを行った。このように得られたPCR産物をNdeIとXhoI制限酵素で切った後、pET30a(Merck Millipore)のNdeIとXhoI部位にクローニングして過発現ベクターpET30a:MsMDH、pET30a:CgMDH、pET30a:EcMDH、pET30a:YlMDHを完成した。
配列番号2:5’-GCGCCTCGAG GAGCAAGTCGCGCACTGCCTCGCGC
配列番号3:5’-GCGCCATATGAAAGTTGCAGTTCTAGGTGCCGCA
配列番号4:5’-GCGCCTCGAG ACCGTTAATAAAATCTTCACCTGAC
配列番号5:5’-GCGCCATATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCT
配列番号6:5’-GCGCCTCGAGCTTATTAACGAACTCTTCGCCCAG
配列番号7:5’-GCGCCATATGGTTAAAGCTGTCGTTGCCGGAGCC
配列番号8:5’-GCGCCTCGAGGTTGGCAGGAGGAGGGTTAACAAT
配列番号10:5’-GCGCCTCGAGAGATGATGCAGATCTCGATGCAAC
配列番号11:5’-GCGCCATATGTTGTCAAGAGTAGCTAAACGTGCG
配列番号12:5’-GCGCCTCGAGTTTACTAGCAACAAAGTTGACACC
配列番号13:5’-GCGCCATATGGTCAAAGTCGCAATTCTTGGCGCT
配列番号14:5’-GCGCCTCGAGTAGCTTGGAAGAGTCTAGGATGAA
配列番号16:5’-CAACGCTTGACCAATCTGGCCTGCGGCACCTAG
配列番号17:5’-GGTATTATTCGTAGTCAGACCGAAAAAGTGGCG
配列番号18:5’-CGCCACTTTTTCGGTCTGACTACGAATAATACC
配列番号19:5’-GCGGGCGGCGGTTCTTCAACCTTATCTATGGCG
配列番号20:5’-CGCCATAGATAAGGTTGAAGAACCGCCGCCCGC
配列番号21:5’-ACCGGCGCAGCTGGTGGCATCTCTTATTCACTG
配列番号22:5’-CAGTGAATAAGAGATGCCACCAGCTGCGCCGGT
配列番号23:5’-AAGATTTTCGGACCTCTGGGTAAAGCTATCAATG
配列番号24:5’-CATTGATAGCTTTACCCAGAGGTCCGAAAATCTT
配列番号25:5’-GTCCGTGGAAAGTCTGCGGCAGCTTCTGCAGCA
配列番号26:5’-TGCTGCAGAAGCTGCCGCAGACTTTCCACGGAC
MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH及びそれらの変異酵素タンパク質(MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、CgMDHS242A)の発現及び精製
実施例1で作製した過発現ベクター(pET30a:MsMDH、pET30a:CgMDH、pET30a:EcMDH、pET30a:YlMDH)をE.coli BL21(DE3)-T1Rに形質転換させ、100μg/mLのカナマイシンを含有しているLB培地において37℃で培養した後、OD600が0.6になったとき、IPTGで発現を誘導した。発現誘導後に、さらに該当の酵素タンパク質が発現するように18℃で20時間培養した。このような培養液を4℃で5,000gで15分間遠心分離して細胞を収穫した後、氷中で冷たく維持されたバッファーA(40mM Tris-HCl、pH 8.0)にさらに入れて音波破砕で細胞を壊した。このように確保された細胞破砕物から、1時間の11,000g遠心分離によって細胞残骸を除去した。最終的に確保された上澄液をNi-NTAアガロ-スビーズに結合させ、親和性クロマトグラフィーを用いてヒスチジンタグ付きMDHタンパク質を選択的に精製した。低い20mMの濃度のイミダゾールが含まれているバッファーAで残りの非特異性結合をしたタンパク質を洗い落とした後、300mMイミダゾールが含まれているバッファーAを用いて目的のタンパク質を溶出した。高純度のタンパク質を確保するための追加の精製のために、HiTrap Qを用いたイオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーを用いて95%以上の高純度MDHタンパク質を確保することができた。以上に精製されたMDHタンパク質を実施例3で記述された3nM濃度に希釈して活性測定において使用し、CgMDHとMsMDHタンパク質は、最終的にそれぞれ54mg/mL、42mg/mLに濃縮して結晶化を行った。
MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH、MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、CgMDHS242Aのオキサロ酢酸還元活性測定
MDHのオキサロ酢酸還元活性では補助因子としてNADHという還元力が消耗され、その結果、NAD+が生成される。NADHの340nmにおける独特の吸光性質を用いて分光光度計法でMDHの活性を時間別に測定することができる。比較活性測定のための最終反応溶液の組成は、次のように構成した:0.1M Tris-Hcl(pH 8.0)、100μM NADH、100μM オキサロ酢酸、最後に3nMの精製されたMDH(MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH)。変異酵素(MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、CgMDHS242A)の活性測定のための最終反応溶液の組成は、比較活性測定のための組成と同一であった。反応速度論的活性比較のための最終反応溶液では、前記の条件においてオキサロ酢酸の濃度とNADHの濃度に変化を与えて測定し、オキサロ酢酸に対する反応速度論的活性測定時にはNADHの濃度を200μMに、NADHに対する反応速度論的活性測定時にはオキサロ酢酸の濃度を100μMに固定して測定した。グラフ製図時には、酵素を投入してから初期の反応時間において減少するNADHの量を吸光係数として計算し、分当たり転換されるオキサロ酢酸の濃度(μM)を初期速度として示した。pHによる活性比較時には、前記最終反応溶液の組成(0.1Mバッファー、200μM NADH、100μMオキサロ酢酸、3nMのMDH)を使用し、pH 5.0~6.0ではBIS-trisバッファー、pH 7.0~9.0ではTris-HClバッファー、pH 10.0ではグリシンバッファーをそれぞれ使用した。
CgMDHとMsMDHの結晶化及び構造分析
精製されたタンパク質の初期結晶化は、シッティングドロップ(sitting-drop)蒸気拡散方法を用いてスクリーニングキット(Hampton Research,CA,USA)で20℃で行った。各実験は、1.0μLのCgMDH又はMsMDHタンパク質と1.0μLのreservoir溶液を混ぜて0.5mLのreservoir溶液に対して平衡化させて行われた。CgMDH結晶がいくつかの結晶化スクリーニング条件で発見され、ハンギングドロップ(hanging-drop)蒸気拡散方法を用いて数回の最適化過程を経た後、18% PEG3350、0.2M MgCl2六水和物(hexahydrate)、0.1M HEPES条件で最良の質の結晶が現れた。基質結合構造を決定するために、基質であるNAD+、リンゴ酸と共に結晶化を行って、同じ条件で結晶を確保した。MsMDHの場合、16% PEG3350と8%タクシメート(Tacsimate)pH 6.0で0.3×0.3×0.1mmサイズの良質の結晶を得、X線回折実験を行うことができた。基質結合構造を決定するために、基質であるNAD+と共に結晶化を行い、同じ条件でMsMDH基質結合結晶を確保した。結晶の低温保護のために、reservoir溶液に含まれた30%グリセロールが使用され、0.97934Å波長のX線回折イメージがQUANTUM270CCD検出器によってポハン加速器研究所7Åビームラインで収集された。CgMDHとNAD+、リンゴ酸結合CgMDH結晶、MsMDHとNAD+結合MsMDH結晶はそれぞれ、1.95Å、2.00Å、2.30Å、1.98Åの解像度まで回折することを確認した。このようなデータはHKL2000プログラムによってインデクシング、インテグレーション、スケーリングされ、CgMDHとMsMDHデータのそれぞれは、分子置換(molecular replacement)手法を用いて、探索モデルであるMycobacterium tuberculosis MDH(PDB code 4TVO)とHaemophilus influenzae MDH(PDB code 6AOO)の構造によってフェイジング(phasing)された。モデル構築はWinCootを用いて行い、精製(refinement)はREFMAC5を用いて行った。
MsMDH、CgMDH、CgMDHQ20G、MsMDHG11Q過発現ベクター(pMS3-msmdh、pMS3-cgmdh、pMS3-cgmdhQ20G、pMS3-msmdhG11Q)の作製及びPALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)、PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株の作製
各コハク酸生成微生物のMDHを過発現させてその効果を調べ、構造分析に基づいて改良したMDHを過発現させてその効果を調べるために、それぞれの過発現ベクターを作製した。まず、MsMDH過発現ベクターpMS3-msmdhを得るために、M.succiniciproducensのゲノムを鋳型とし、配列番号27と28のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3(Jang et al.,Appl.Environ.Microb.73(17):5411-5420.,2007)にEcoRIとKpnI部位にクローニングしてpMS3-msmdhベクターを完成した。CgMDH過発現ベクターpMS3-cgmdhを得るために、C.glutamicumのゲノムを鋳型とし、配列番号29と30のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングしてpMS3-cgmdhベクターを完成した。CgMDHQ20G過発現ベクターpMS3-cgmdhQ20Gを得るために、CgMDHQ20G遺伝子断片を鋳型とし、配列番号29と30のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングしてpMS3-cgmdhQ20Gベクターを完成した。MsMDHG11Q過発現ベクターpMS3-msmdhG11Qを得るために、MsMDHG11Q遺伝子断片を鋳型とし、配列番号27と28のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングしてpMS3-msmdhG11Qベクターを完成した。
配列番号28:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTAACCGTTAATAAAATCTTCAC
配列番号29:5’-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAATTCCCCGCAGAAC
配列番号30:5’-GGATCCCCGGGTACCGAGCTTTAGAGCAAGTCGCGCAC
EcMDH、ZrMDH、ScMDH2、ScMDH3過発現ベクター(pMS3-ecmdh、pMS3-zrmdh、pMS3-scmdh2、pMS3-scmdh3)の作製及びPALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)、PALK(pMS3-scmdh3)菌株の作製
先行文献で報告されたMDHを過発現させその効果を調べるためにそれぞれの過発現ベクターを作製した。まず、EcMDH過発現ベクターpMS3-ecmdhを得るために、E.coliのゲノムを鋳型とし、配列番号46と47のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-msmdhベクターを完成した。ZrMDH過発現ベクターpMS3-zrmdhを得るために、Zrmdh遺伝子断片を鋳型とし、配列番号48と49のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-cgmdhベクターを完成した。ScMDH2過発現ベクターpMS3-scmdh2を得るために、ScMDH2遺伝子断片を鋳型とし、配列番号50と51のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-scmdh2ベクターを完成した。ScMDH3過発現ベクターpMS3-scmdh3を得るために、ScMDH3遺伝子断片を鋳型とし、配列番号52と53のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-scmdh3ベクターを完成した。
配列番号47:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTACTTATTAACGAACTCTTCGC
配列番号48:5’-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTTGCAATAGTCG
配列番号49:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTACAATTTAGCACCGAG
配列番号50:5’-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGCCTCACTCAGTTACAC
配列番号51:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTAAGATGATGCAGATCTCG
配列番号52:5’-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGGTCAAAGTCGCAATTC
配列番号53:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTCATAGCTTGGAAGAGTC
E.coli及びC.glutamicum用CgMDH過発現ベクター(p100pro99A-cgmdh、pEKEx1-cgmdh)の作製及びE.coli W3110(p100pro99A-cgmdh)、C.glutamicum(pEKEx1-cgmdh)菌株の作製
CgMDHの過発現効果を代表的なコハク酸生産菌株であるE.coliとC.glutamicumで調べるために、各菌株用CgMDH過発現ベクターを作製した。まず、E.coli用過発現ベクターp100pro99A-cgmdhを得るために、C.glutamicumのゲノムを鋳型とし、配列番号54と55のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をp100pro99A(Bang et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.115(40):E9271-E9279.,2018)のEcoRIとPstI部位にクローニングしてp100pro99A-cgmdhベクターを完成した。C.glutamicum用過発現ベクターpEKEx1-cgmdhを得るために、C.glutamicumのゲノムを鋳型とし、配列番号56と57のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpEKEx1(Cho et al.,Metab.Eng.42:157-167.,2017)のEcoRIとPstI部位にクローニングしてpEKEx1-cgmdhベクターを完成した。
配列番号55:5’-GCCAAGCTTGCATGCCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
配列番号56:5’-CAATTTCACACAGGAAACAGATGAATTCCCCGCAGAAC
配列番号57:5’-AACAGCCAAGCTTGGCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
CgMDH、MsMDHG11Q置換ベクター(pINcgMDH、pINmsMDHG11Q)の作製及びPALKcgmdh、PALKmsmdhG11Q菌株の作製
コハク酸生産菌株に自然的に存在するMDHがPALK(pMS3-cgmdh)菌株とPALK(pMS3-msmdh)菌株のコハク酸生産向上にいかなる影響を与えたかを確認するために、M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)菌株ゲノム上に存在するMDHを暗号化する遺伝子を欠失させ、その座にCgMDHとMsMDHG11Qを暗号化する遺伝子を入れるCgMDH、MsMDHG11Q置換ベクターpINcgMDHとpINmsMDHG11Qを作製した。pINcgMDH作製のために、sacB遺伝子を含むpSacHR06をXhoIとSacIで切断した。その後、ゲノム上に存在するMDH暗号化遺伝子の前、後の配列を、M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)菌株のゲノムを鋳型とし、配列番号31と32、配列番号38と39のプライマーを用いてそれぞれPCRを行った。lox66-cat-lox77カセットはクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むベクターを鋳型とし、配列番号36と37のプライマーを用いてPCRを行って得た。CgMDH遺伝子は、実施例5で作製したpMS3-cgmdhベクターを鋳型とし、配列番号33と35番のプライマーを用いてPCRを行って得た。このように得た線形pSacHR06、MDH暗号化遺伝子の前、後配列の各1kb、lox66-cat-lox77カセット、CgMDH遺伝子断片をギブソンアセンブリー(Gibson assembly)(Gibson et al.,Nat.Methods.,6(5):343.,2009)を用いて合わせ、pINcgMDHが得られた。pINmsMDHG11Qに必要なMsMDHG11Q遺伝子断片は、pMS3-msmdhG11Qを鋳型とし、配列番号33と34のプライマーを用いてPCRを行って得た。このように得た線形pSacHR06、MDH暗号化遺伝子の前、後配列の各1kb、lox66-cat-lox77カセット、MsMDHG11Q遺伝子断片をGibson assemblyを用いて合わせ、pINmsMDHG11Qを得た。上記のように作製されたpINcgMDH、pINmsMDHG11QをM.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)に導入することによって、最終的にそれぞれPALKcgmdh、PALKmsmdhG11Q菌株を作製した。
配列番号32:5’-GGCATTAGCCAACAGAATAGCTGACCGAAAAAGTGGCGGA
配列番号33:5’-CTATTCTGTTGGCTAATGCC
配列番号34:5’-TGTAGCCGCGTTCTAACGACTACGAATAATACCCGCAT
配列番号35:5’-TGTAGCCGCGTTCTAACGTCGACTCTAGAGGATCCCCG
配列番号36:5’-CGTTAGAACGCGGCTACA
配列番号37:5’-ATAGGGAGACCGGCAGATC
配列番号38:5’-GATCTGCCGGTCTCCCTATTTAAGACTCCTTAATGTGGA
配列番号39:5’-GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCGCGTTAGTTGTTGAGTTAAT
M.succiniciproducens PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)、及びPALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株を用いたコハク酸生産
前記実施例5で作製されたM.succiniciproducens PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)及びPALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株は、20mL MH5培地(リッター当たり、2.5g酵母抽出物、2.5gポリペプトン、1g NaCl、0.02g CaCl2・2H2O、0.2g MgCl2・6H2O、及び8.709g K2HPO4)に炭素源として別に滅菌処理されたグルコース又はグリセロールを10g/Lの濃度で接種し、嫌気条件で39℃で8時間培養した後、これを再び同一の培地270mLに移して培養した。発酵は、前記の培養液を2.5Lの合成培地(リッター当たり、1g NaCl、2g(NH4)2HPO4、0.02g CaCl2・2H2O、0.2g MgCl2・6H2O、8.709g K2HPO4、0.5gシステイン、0.5gメチオニン、0.5gアラニン、0.5gアスパラギン、0.5gアスパラギン酸、0.5gプロリン、0.5gセリン、0.005gニコチン酸、0.005gパントテン酸カルシウム、0.005gピリドキシン・HCl、0.005gチアミン、0.005gアスコルビン酸及び0.005gビオチン)を含有している微生物反応器(Bioflo 3000,New Brunswick Scientific Co.,NJ,USA)に接種して行い、発酵条件は18.2g/L(100mM)初期グルコース濃度、グリセロール使用時には4.6g/L(50mM)初期グリセロール濃度で、温度39℃、200rpm条件で0.2vvm(二酸化炭素体積/培養器内操業体積(working volume)/分)の速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にpHは、1.57Mアンモニア水及び6.84M水酸化マグネシウム溶液を用いて6.5に調整し、抗生剤はカナマイシン25μg/mLとアンピシリン25μg/mLを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に900g/Lのグルコース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。
M.succiniciproducens PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)、及びPALK(pMS3-scmdh3)菌株を用いたコハク酸生産
前記実施例6で作製されたM.succiniciproducens PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)及びPALK(pMS3-scmdh3)菌株は、実施例9と同様に、20mL MH5培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコースを10g/Lの濃度で接種し、嫌気条件で39℃で8時間培養した後、これを再び同一の培地270mLに移して培養した。発酵は、上記の培養液を実施例9におけると同じ2.5Lの合成培地を含有している微生物反応器に接種して行い、発酵条件は18.2g/L(100mM)初期グルコース濃度で、温度39℃、200rpm条件で0.2vvmの速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にpHは、1.57Mアンモニア水及び6.84M水酸化マグネシウム溶液を用いて6.5に調整し、抗生剤は、カナマイシン25μg/mLとアンピシリン25μg/mLを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に900g/Lのグルコース溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。
E.coli W3110、C.glutamicum及びそれぞれの菌株にCgMDHが過発現したE.coli W3110(p100pro99A-cgmdh)、C.glutamicum(pEKEx1-cgmdh)菌株を用いたコハク酸生産
上記の記実施例7で作製されたE.coli W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株とE.coli W3110菌株は、10mL LB培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコースを3g/Lの濃度で接種し、37℃で16時間培養した後、これを再び同一の培地100mLに移して培養した。初期細胞濃度は、OD600基準0.2~0.25で接種し、フラスコの上の部分に二酸化炭素を十分に充填して嫌気条件37℃で16時間培養した。抗生剤は、アンピシリン25μg/mLを添加した。その結果、表2のように、CgMDHが過発現したE.coli W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株は、既存E.coli W3110菌株が0.14g/Lのコハク酸生産を示したのに比べて格段に向上した0.431g/Lのコハク酸生産を示した。
M.succiniciproducens PALKcgmdh、PALKmsmdhG11Q菌株を用いたコハク酸生産
上記の実施例8で作製されたM.succiniciproducens PALKcgmdh、PALKmsmdhG11Qを、20mL MH5培地に炭素源として別に滅菌処理されたグルコース又はグリセロールを10g/Lの濃度で接種し、嫌気条件で39℃で8時間培養した後、これを再び同一の培地270mLに移して培養した。発酵は、上記の培養液を実施例9と同様に、2.5Lの合成培地を含有している微生物反応器に接種して行い、発酵条件は18.2g/L(100mM)初期グルコース濃度、グリセロール使用時には4.6g/L(50mM)初期グリセロール濃度で、温度39℃、200rpm条件で0.2vvmの速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中にpHは、1.57Mアンモニア水及び6.84M水酸化マグネシウム溶液を用いて6.5に調整し、抗生剤は、カナマイシン25μg/mLとクロラムフェニコール6.8μg/mLを添加した。高濃度のコハク酸生産のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時に900g/Lのグルコース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。培養液中の細胞濃度は分光光度計を用いて測定し、あらかじめ測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検定線を用いて細胞濃度を計算した。発酵過程中に生物反応器から周期的にサンプルを採取し、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、グルコースとグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。
M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)菌株とPALKcgmdh菌株を用いたコハク酸生産性向上
本実施例ではM.succiniciproducens PALKcgmdh菌株を用いたコハク酸生産性向上方法を確認した。
EcMDH、ZrMDH、ScMDH2、ScMDH3過発現ベクター(pMS3-ecmdh、pMS3-zrmdh、pMS3-scmdh2、pMS3-scmdh3)の作製及びPALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)、PALK(pMS3-scmdh3)菌株の作製
先行文献で報告されたMDHを過発現させその効果を調べるためにそれぞれの過発現ベクターを作製した。まず、EcMDH過発現ベクターpMS3-ecmdhを得るために、E.coliのゲノムを鋳型とし、配列番号46と47のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-ecmdhベクターを完成した。ZrMDH過発現ベクターpMS3-zrmdhを得るために、Zrmdh遺伝子断片を鋳型とし、配列番号48と49のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-zrmdhベクターを完成した。ScMDH2過発現ベクターpMS3-scmdh2を得るために、ScMDH2遺伝子断片を鋳型とし、配列番号50と51のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-scmdh2ベクターを完成した。ScMDH3過発現ベクターpMS3-scmdh3を得るために、ScMDH3遺伝子断片を鋳型とし、配列番号52と53のプライマーを用いてPCRを行った。このように得られたPCR産物をpMS3にEcoRIとKpnI部位にクローニングし、pMS3-scmdh3ベクターを完成した。
Claims (8)
- コハク酸生成能を有する微生物にリンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている変異微生物であって、前記リンゴ酸脱水素酵素は、主鎖のアミド官能基を通じてNADHのピロリン酸部分と相互作用するアミノ酸残基がグルタミン(Gln)であることを特徴とする、変異微生物。
- 前記リンゴ酸脱水素酵素は、i)配列番号40のアミノ酸配列で表されるコリネバクテリウム・グルタミカム由来リンゴ酸脱水素酵素;又はii)配列番号42のアミノ酸配列で表されるマンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来リンゴ酸脱水素酵素において11番目アミノ酸がグルタミンに置換されたリンゴ酸脱水素酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の変異微生物。
- i)前記コリネバクテリウム・グルタミカム由来リンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、配列番号41の塩基配列で表され、ii)前記マンヘミア・サクシニシプロデュセンス由来リンゴ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、配列番号43の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項1に記載の変異微生物。
- 前記コハク酸生成能を有する微生物は、マンヘミア属(Mannheimia sp.)、アクチノバチルス属(Actinobacillus sp.)、アネロビオスピリルム属(Anaerobiospirillum sp.)、大腸菌(E.coli)、及びコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の変異微生物。
- 前記コハク酸生成能を有する微生物は、Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)であることを特徴とする、請求項4に記載の変異微生物。
- 次の段階を含むコハク酸の製造方法:
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の変異微生物を培養してコハク酸を生成させる段階;及び
(b)前記生成されたコハク酸を回収する段階。 - 前記培養は、i)グルコース;ii)スクロース;iii)グリセロール;iv)グルコース及びグリセロール;又はv)スクロース及びグリセロールを炭素源として用いることを特徴とする、請求項6に記載のコハク酸の製造方法。
- 前記培養は嫌気的条件で行われることを特徴とする、請求項6に記載のコハク酸の製造方法。
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