JP6191061B2 - コハク酸を生産するための組換え大腸菌、及び組み換え大腸菌の使用 - Google Patents

Description

本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の発酵によってコハク酸を生産する分野に関する。具体的には、本発明は、コハク酸を生産するための操作された組換え大腸菌株を提供する。本発明はまた、コハク酸を生産するための操作された組換え大腸菌株の使用、及びコハク酸を生産するための操作された組換え大腸菌株の使用方法に関する。

ブタン二酸とも呼ばれるコハク酸は、化学産業、材料、医薬、及び食品産業の分野において広く用いられており、且つ米国エネルギー省によって１２の最も貴重なプラットフォーム化学物質の１つであると考えられている、優れたプラットフォーム化学物質である（ＭｃＫｉｎｌａｙら、２００７、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６：７２７〜７４０）。現在、コハク酸は、エステル化溶媒、デアイサー、エンジン冷却水、食品用香料、水処理化学物質などにおいて主に用いられている。コハク酸はまた、多くの下流産物、例えば１，４−ブタンジオール、テトラヒドロフラン、γ−ブチロラクトン、Ｎ−メチルピロリドン、及び２−ピロリドンの生産に用いることができる。さらに、コハク酸及び１，４−ブタンジオールは、優れた特性を有する生分解性プラスチックであるＰＢＳ（ポリブチレンサクシネート）プラスチックを生産するためにポリマー化することができる。コハク酸の将来的な市場可能性は１年当たり２７０万トンを超えると推定される。約２５０の化学製品（ベンゼン材料に基づいて生産される）は全て、原料としてコハク酸を用いることによって生産することができる（ＭｃＫｉｎｌａｙら、２００７、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６：７２７−７４０）。

現在、コハク酸の生産は、主に、無水マレイン酸を原料として用いる石油化学経路に基づく。石油の価格は近年大きく変動しており、このことは、コハク酸の生産の持続可能性及び価格安定性を大きく制限する。他方、化学合成はプロセスが複雑であり、高圧及び高温を通常要し、このことは、生産の間のエネルギー及び材料のコストを大きく増大させ、さらに、化学合成はまた、深刻な環境汚染をもたらす。コハク酸の高性能バイオマニュファクチュアリング技術の開発によって、石油化学経路の欠点を根本的に解決でき、例えば、石油価格の変動に影響されることなくコハク酸の価格を確実に安定させ、ＰＢＳプラスチックの製造コストを下げてＰＢＳプラスチックのさらなる適用を容易にし、グリーンサステイナブルな生産を実現し、生産プロセスを単純化し、エネルギーを節約し、且つ発光を低減させ、且つ環境汚染を減少させる。さらに、コハク酸のバイオマニュファクチュアリングプロセスはまた、二酸化炭素を吸収でき、このことは、低炭素経済を大きく促進する。コハク酸のバイオマニュファクチュアリング技術の核は、バイオマス材料をコハク酸に効果的に変換できる微生物株である。

現在、コハク酸発酵細菌の２つのカテゴリーが主に存在する。第１のものは、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｓ）（Ｇｕｅｔｔｌｅｒら、１９９６、米国特許第５５０４００４号）、アネロビオスピリルム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｇｌａｓｓｎｅｒ及びＤａｔｔａ、１９９２、米国特許第５１４３８３４号）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｌｅｅら、２００２、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５８：６６３〜６６８）、及びバスフィア・サクシニシプロデュセンス（Ｂａｓｆｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、２００９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ３１：１９４７〜１９５１）を含む、コハク酸を天然に生産する細菌である。他方のものは、代謝工学を介して改変されている、操作された細菌であり、これは主に大腸菌である。

天然のコハク酸生産菌はコハク酸を高力価で生産できるが、天然のコハク酸生産菌は欠点を有している。発酵の間、糖からコハク酸への変換率は低く、炭素フラックスの大部分が他の有機酸の合成に流れる。さらに、天然のコハク酸生産菌の発酵は富栄養培地を要し、このことは生産コスト及び下流の単離−精製コストを増大させ、コハク酸の大規模な工業生産を制限する。大腸菌は、少量のコハク酸を糖の発酵の間に蓄積させるにすぎないが、明らかな生理学的及び遺伝的背景を有しており、改変が容易である。多くの研究機関が大腸菌を開始細菌として選択し、大腸菌を、高収量でコハク酸を生産できる操作された細菌として改変している。

ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、コハク酸合成経路における鍵となる前駆体である。ＰＥＰからオキサロ酢酸（ＯＡＡ）へのカルボキシル化は、コハク酸合成経路における鍵となるステップである。Ｍｉｌｌａｒｄらは、大腸菌のＰＥＰカルボキシラーゼ遺伝子ＰＰＣの過剰発現を介して、コハク酸の収量を３．５倍増大させた（Ｍｉｌｌａｒｄら、１９９６、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６２：１８０８〜１８１０）。Ｋｉｍらは、野生型大腸菌におけるＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋの過剰発現はコハク酸の生産に対する影響を示さないが、ｐｐｃ遺伝子が欠失した大腸菌におけるｐｃｋ遺伝子の過剰発現はコハク酸の収量を６．５倍増大できることを発見した（Ｋｉｍら、２００４、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：１２３８〜１２４１）。韓国のＫｗｏｎらは、発酵培養液が重炭酸イオンを高濃度で含有する場合に、野生型大腸菌におけるｐｃｋ遺伝子の過剰発現がコハク酸の収量を２．２倍増大できることをさらに発見した（Ｋｗｏｎら、２００６、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：１４４８〜１４５２）。

Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅらは、大腸菌におけるピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子ｐｆｌＢ及び乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡを不活化することによって、操作された株ＮＺＮ１１１を構築した。この株は、グルコースを炭素源として用いては成長できないが、ラクトース、フルクトース、マンノース、又はフルクトースを炭素源として用いることによってコハク酸、酢酸、及びエタノールを生産できる。このことに基づいて、発酵の間に炭素源としてのグルコースを再利用して成長できる突然変異体株ＡＦＰ１１１を排除した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００１、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６７：１４８〜１５４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９８、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７０−７２：１８７〜１９８）。Ｖｅｍｕｒｉらは、ＡＦＰ１１１においてリゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子ｐｙｃを過剰発現させることによって、コハク酸の収量をさらに増大させた。二相発酵（最初の好気性培養、次いで酸を生産するための嫌気性発酵）の間、コハク酸の最終濃度は９９．２ｇ／Ｌ（８４１ｍＭ）に達し得、糖−酸の変換率は１．１ｇ／ｇ（１．６８ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった（Ｖｅｍｕｒｉら、２００２、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：３２５〜３３２）。

Ｓａｎｃｈｅｚらは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＥ及びｌｄｈＡ、酢酸キナーゼ遺伝子ａｃｋＡ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｔａ、並びにイソクエン酸リアーゼ調節タンパク質遺伝子ｉｃｌＲを不活化することによって、操作された株ＳＢＳ５５０ＭＧを構築した。二相発酵（最初の好気性培養、次いで酸を生産するための嫌気性発酵）の間、この株は、４０ｇ／Ｌ（３３９ｍＭ）のコハク酸を生産でき、収量は１．０６ｇ／ｇ（１．６１ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５、Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ７：２２９〜２３９）。

Ｖｅｍｕｒｉら及びＳａｎｃｈｅｚらによって構築された組換え大腸菌株は、コハク酸を高力価で生産できるが、欠点を依然として有している。ここで使用された発酵プロセスは二相発酵であり、すなわち、細胞培養物を成長させるための好気性プロセスをまず用い、次いで、発酵を行うための嫌気性プロセスを用いる。このようなプロセスの操作は複雑であり、好気性プロセスは装置の構築及び操作のためのコストを大きく増大させる。このような組換え大腸菌株は富栄養培地を要し、このことは発酵のための材料コストを大きく増大させ、計算上のコハク酸収量が高くなる。

Ｊａｎｔａｍａらは、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ギ酸輸送体遺伝子ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ａｃｋＡ、メチルグリオキサル合成酵素遺伝子ｍｇｓＡ、及びピルビン酸酸化酵素遺伝子ｐｏｘＢを不活化することによって、並びに代謝的進化にかけることによって、組換え大腸菌株ＫＪ０７３を構築した。無機塩培地を用いて、この株は、嫌気性条件下で、７９ｇ／Ｌ（６６８ｍＭ）のコハク酸を生産し得、収量は０．７９ｇ／ｇ（１．２ｍｏｌ／ｍｏｌ）である（Ｊａｎｔａｍａら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７４３９；Ｊａｎｔａｍａら、２００８ａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：１１４０〜１１５３）。組換え大腸菌株ＫＪ１２２は、プロピオン酸キナーゼ遺伝子ｔｄｃＤ、２−ケトンメチル酪酸リアーゼ／ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子ｔｄｃＥ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子ａｓｐＣ、及びリンゴ酸酵素遺伝子ｓｆｃＡをさらに不活化することによって、並びに代謝的進化にかけることによって構築された。無機塩培地を用いて、この株は、嫌気性条件下で８０ｇ／Ｌ（６８０ｍＭ）のコハク酸を生産でき、収量は０．８９ｇ／ｇ（１．３６ｍｏｌ／ｍｏｌ）である（Ｊａｎｔａｍａら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７４３９；Ｊａｎｔａｍａら、２００８ｂ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０１：８８１〜８９３）。代謝的進化によって、これらの２つの組換え大腸菌株は、コハク酸を生産する能力を向上させた。Ｚｈａｎｇらは、組換え大腸菌株ＸＺ７２１を、ＰＥＰ−リン糖酸トランスフェラーゼＩ遺伝子ｐｔｓＩ及びｐｆｌＢを欠失させることによって、並びにＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）の活性を増強させることによって構築した。無機塩培地を用いて、この株は、嫌気性条件下で３９ｇ／Ｌ（３２７ｍＭ）のコハク酸を生産でき、収量は０．８２ｇ／ｇ（１．２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）である（Ｚｈａｎｇ、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９７２８；Ｚｈａｎｇら、２００９ｂ、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５：７８０７〜７８１３）。

大腸菌によって生産されるコハク酸の力価及び／又は収量を増大させるために、大腸菌の代謝経路をさらに改変することが望ましい。

１つの態様において、本発明は、コハク酸を生産するための組換え大腸菌を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、（１）ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の阻害、及び／又はホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害と、（２）ｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害と、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（４）ｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子の発現の増強、並びに／又はｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強と、という改変を含む組換え大腸菌であって、前記大腸菌が、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、並びに（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変の１つ又は複数をさらに含む、組換え大腸菌に関する。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）の発現が阻害されており、及び／又はホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性が阻害されており、ここで、前記遺伝子（複数可）は、ＰＴＳ系酵素ＩをコードするｐｔｓＩ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＨｐｒをコードするｐｔｓＨ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃをコードするｃｒｒ遺伝子、及びＰＴＳ系酵素ＩＩＣＢ^ＧｌｃをコードするｐｔｓＧ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である。

別の実施形態において、本発明の大腸菌において、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性が増強されており、ここで、前記遺伝子（複数可）は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡ遺伝子、６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｎｄ遺伝子、リボース−５−リン酸イソメラーゼをコードするｒｐｉ遺伝子、リブロース−５−リン酸エピメラーゼをコードするｒｐｅ遺伝子、及びトランスアルドラーゼをコードするｔａｌＢ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である。

さらなる実施形態において、発現が増強されているか、又はそれによってコードされるタンパク質（複数可）の活性が増強されている、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の前記遺伝子（複数可）は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡ遺伝子、６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｎｄ遺伝子、及びトランスアルドラーゼをコードするｔａｌＢ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である。

１つの実施形態において、本発明は、ｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子の発現、並びに／又はｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増強されている、組換え大腸菌に関する。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する位置での改変を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている。好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、プラスミド内又は染色体内にある。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（ｃ）突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子であって、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する位置での改変を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている、という改変を含む、組換え大腸菌に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌はまた、（５）ａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（６）ａｃｅＢＡ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＢＡ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強と、（７）ｄｃｕＣ遺伝子の発現の増強、及び／又はｄｃｕＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、（８）ｍｇｓＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｍｇｓＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、という改変を含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１０）ａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、及び／又はａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、並びに（１１）ｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターの発現の阻害、及び／又はｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害という改変をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１２）ａｃｅＥＦ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＥＦ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強という改変をさらに含む。

第２の態様において、本発明は、本発明の大腸菌を培養するステップを含む、コハク酸を生産するための方法を提供する。

第３の態様において、本発明は、コハク酸の生産における本発明の大腸菌の使用に関する。

組換え株ＮＺ−０３７．Ｘを得るために大腸菌を改変するための概要図は、ｌｄｈＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、ｐｔｓＩ遺伝子、及びａｃｋＡ−ｐｔａ遺伝子を含む遺伝子の欠失を表す。四角の星形は、ｇａｌＰ遺伝子、ｐｃｋ遺伝子、ａｃｅＢＡ遺伝子、及びｄｃｕＣ遺伝子を含む遺伝子の発現の増強を表す。 株ＨＸ０２１を得るための、１０８０世代にわたる株ＮＺ−０３７の代謝的進化を示す図である。 株ＨＸ０２４を得るための、３６０世代にわたる株ＨＸ０２３の代謝的進化を示す図である。 ５Ｌの発酵容器における、コハク酸を生産するための株ＨＸ０２４の発酵を示す図である。 株ＨＸ０２８を得るための、６５０世代にわたる株ＨＸ０２７の代謝的進化を示す図である。 ５Ｌの発酵容器における、コハク酸を生産するための株ＨＸ０２８の発酵を示す図である。 ＨＸ０２４の比較トランスクリプトーム分析の結果を示す図である。影のついた数字及び四角で囲まれた数字は、ＨＸ０２４と野生型大腸菌ＡＴＣＣ８７３９とにおける遺伝子の発現レベルの比率である。略記：ＧＬＣ：グルコース、Ｇ６Ｐ：グルコース−６−リン酸、Ｆ６Ｐ：フルクトース−６−リン酸、ＦＢＰ：フルクトース−１，６−二リン酸、ＧＡＰ：グリセルアルデヒド−３−リン酸、ＤＨＡＰ：ジヒドロキシアセトンリン酸、ＧＢＰ：１，３−ビスホスホグリセリン酸、Ｇ３Ｐ：３−ホスホグリセリン酸、ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸、ＯＡＡ：オキサロ酢酸、ＭＡＬ：リンゴ酸、ＦＵＭ：フマル酸、ＳＵＣ：コハク酸、６ＰＧＣＬ：グルコノラクトン−６−リン酸、６ＰＧＣ：６−ホスホグルコン酸、ＲＬ５Ｐ：リブロース−５−リン酸、Ｘ５Ｐ：キシロース−５−リン酸、Ｒ５Ｐ：リボース−５−リン酸、Ｓ７Ｐ：セドヘプツロース−７−リン酸、Ｅ４Ｐ：エリトロース−４−リン酸、ＰＹＲ：ピルビン酸、ＡＣＡ：アセチル−ＣｏＡ、ＡＣＰ：アセチルリン酸、ＡＣＥ：酢酸、ＣＩＴ：クエン酸、ＩＣＩＴ：イソクエン酸、ＧＬＯ：グリオキサル酸、ＤＬＡＣ：Ｄ−乳酸、ＦＯＲ：ギ酸、ＥＴＨ：エタノール、ＮＡＤ^＋：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＰＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＰ^＋：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ｇａｌＰ：ガラクトースパーミアーゼ遺伝子、ｇｌｋ：グルコキナーゼキナーゼ遺伝子、ｇａｐＡ：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ｐｆｋＡ：フルクトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子、ｐｃｋ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、ｍｄｈ：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ｆｕｍＡ：フマル酸ヒドラターゼ酵素Ｉ遺伝子、ｆｒｄＡＢＣＤ：フマル酸還元酵素遺伝子、ｚｗｆ：６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ｐｇｌ：６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ｇｎｄ：６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ｒｐｅ：リブロース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子、ｒｐｉＡＢ：リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子、ｔｋｔＡ：トランスケトラーゼ遺伝子、ｔｋｔＢ：トランスケトラーゼ遺伝子、ｔａｌＢ：トランスアルドラーゼ遺伝子、ｐｙｋＦ：ピルビン酸キナーゼ遺伝子、ｐｄｈ：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ｐｔａ：リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ａｃｋＡ：アセトキナーゼ遺伝子、ｇｌｔＡ：クエン酸合成酵素遺伝子、ａｃｎ：アコニターゼ遺伝子、ａｃｅＢ：リンゴ酸合成酵素遺伝子、ａｃｅＡ：イソクエン酸リアーゼ遺伝子、ｓｔｈＡ：ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、ｍａｅＢ：ＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素遺伝子、ｄｃｕＢ：嫌気性Ｃ４ジカルボン酸輸送体遺伝子、ｄｃｕＣ：Ｃ４ジカルボン酸輸送体遺伝子、ｄｃｔＡ：好気性Ｃ４ジカルボン酸輸送体遺伝子。 （Ａ）野生型ｌｐｄＡ遺伝子と突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子（ｌｐｄＡ^＊）との間のヌクレオチド配列のアラインメント、（Ｂ）野生型ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドと突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子（ｌｐｄＡ^＊）によってコードされるポリペプチドとの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 Ｚｗｆ酵素の活性とコハク酸の収量及び力価との間の関連を示す図である。 Ｐｇｌ酵素の活性とコハク酸の収量及び力価との間の関連を示す図である。 Ｇｎｄ酵素の活性とコハク酸の収量及び力価との間の関連を示す図である。 Ｔｋｔ酵素の活性とコハク酸の収量及び力価との間の関連を示す図である。 Ｔａｌ酵素の活性とコハク酸の収量及び力価との間の関連を示す図である。

別段の指示がない限り、全ての技術用語及び科学用語は、当技術分野において知られている一般的な意味を有する。全ての特許、特許出願、刊行物、配列、及び他の出版物は、別段の指示がない限り、参考文献として本明細書に組み込まれる。

１つの態様において、本発明は、コハク酸を生産するための操作された組換え大腸菌を提供する。本発明の大腸菌において、大腸菌のコハク酸の収量及び／又は変換率は、代謝経路に関与するいくつかの酵素の活性を調節することによって向上する。

本明細書において用いられる場合、用語「操作された組換え大腸菌」、「操作された大腸菌」、及び「組換え大腸菌」は、区別せずに用いられ得、改変された大腸菌を指し、ここで、改変は、例えば、遺伝子の発現の増強、遺伝子の発現の阻害、新たな遺伝子（複数可）の導入、突然変異遺伝子（複数可）の導入、又は遺伝子（複数可）の突然変異から選択され得、遺伝子の発現の増強又は発現の阻害は、当技術分野における一般的な技術、例えば遺伝子の欠失、遺伝子コピー数の変化、プラスミドの導入、遺伝子プロモーターの変化（例えば、強力な又は弱いプロモーターを用いることによる）を用いることによって行うことができる。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、並びに（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変の１つ又は複数を含む、組換え大腸菌に関する。

本明細書において用いられる場合、用語「ペントースリン酸経路」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有する。ペントースリン酸経路は、動物、植物、及び微生物に広く存在する１つの糖異化作用経路であり、グルコースが糖分解を受けることなく直接酸化されて脱水素化及び脱カルボキシル化を達成し、デヒドロゲナーゼの補酵素がＮＡＤ^＋ではなくＮＡＤＰ^＋であり、生成したＮＡＤＰＨがＯ_２に送達されるよりもむしろ生合成のための還元性同等物として用いられることを特徴とする。

いくつかの実施形態において、本発明の大腸菌において、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性が増強されており、ここで、前記遺伝子（複数可）は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡ遺伝子、６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｎｄ遺伝子、リボース−５−リン酸イソメラーゼをコードするｒｐｉ遺伝子、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼをコードするｒｐｅ遺伝子、及びトランスアルドラーゼをコードするｔａｌＢ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である。

本発明において、ｔｋｔＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４８．１）によってコードされるタンパク質はトランスケトラーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．２．１．１）であり、ｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７４３０．１）によってコードされるタンパク質は６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．４９）であり、ｐｇｌ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８５２２．１）によってコードされるタンパク質は６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：３．１．１．３１）であり、ｇｎｄ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６６４５．１）によってコードされるタンパク質は６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．４４）であり、ｒｐｉ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４６８．１）によってコードされるタンパク質はリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ Ｎｏ：５．３．１．６）であり、ｒｐｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６００５．１）によってコードされるタンパク質はリブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ＥＣ Ｎｏ：５．１．３．１）であり、ｔａｌＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９２５８．１）によってコードされるタンパク質はトランスアルドラーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．２．１．２）である。

ＳｔｈＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６５３．１）は、可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．６．１．１）をコードする。１つの実施形態において、本発明に従ったｓｔｈＡ遺伝子の配列は、配列番号５で示される。１つの実施形態において、本発明に従ったｓｔｈＡ遺伝子の配列は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。

１つの実施形態において、本発明に従ったｔｋｔＡ遺伝子の配列は、配列番号６で示される。１つの実施形態において、本発明に従ったｔｋｔＡ遺伝子の配列は、配列番号６で示されるヌクレオチド配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。

本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子の発現の増強」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有し、遺伝子転写の結果生じるｍＲＮＡの数を増大させる、遺伝子発現の強度の増強を指す。遺伝子の発現の増強は、例えば、限定はしないが、遺伝子の前方への強力なプロモーターの導入、遺伝子のコピー数の増大、又はｍＲＮＡの安定性の増強などによって行うことができる。本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有し、遺伝子の転写及び翻訳から生じるタンパク質の活性の増大を指す。遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強は、例えば、遺伝子発現の強度の増強、細胞内の酵素量の増大、及びアミノ酸部位での突然変異の導入によって行うことができる。「遺伝子の発現の増強」及び「遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強」に用いられる様々な技術的手段は、当業者に周知である。

本発明において、遺伝子の発現の増強は、例えば、強力なプロモーターの導入によって行うことができる。本発明のいくつかの実施形態において、例えば、強力なプロモーターは、Ｐｐｃｋ^＊（配列番号１０８）（Ｚｈａｎｇら、２００９ｂ、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５：７８０７〜７８１３）、Ｍ１−３７（配列番号１０９）、及びＭ１−９３（配列番号１１０）（Ｌｕら、２０１２、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９３：２４５５〜２４２６）からなる群から選択される。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（ｃ）突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子であって、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する１つ又は複数の位置での改変（複数可）を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている、という改変の１つ又は複数を含む、組換え大腸菌に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

用語「突然変異」、「突然変異体」、及び「突然変異した」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有し、ヌクレオチド配列における１つ若しくは複数のヌクレオチドの挿入、付加、欠失、若しくは置換を指すか、又はポリペプチド配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失、若しくは置換を指す。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、プラスミド内又は染色体内にある。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、染色体内にある。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、プラスミド内にある。

本明細書において用いられる場合、用語「プラスミド」は、当技術分野において周知の定義を有し、これは、エピソーム形態で細胞内に存在する非染色体ＤＮＡであり、自己複製できるＤＮＡ分子である。本発明において有用なプラスミドは、例えば、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ、ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−Ｋａｎ、ｐＫＤ４、及びｐＫＤ４６などを含む。

本明細書において用いられる場合、用語「染色体」は、当技術分野において周知の定義を有する。いくつかの実施形態において、本発明に従った改変された遺伝子は、染色体内にある。改変された遺伝子を染色体内に組み込む技術は当業者に周知であり、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｇｒｅｅｎ及びＪｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第４版）を参照されたい。

ｌｐｄＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９１５７．１）は、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．８．１．４）をコードする遺伝子である。本発明の１つの実施形態において、用いられる開始大腸菌株において、野生型ｌｐｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２で示され、野生型ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１で示される。本発明の大腸菌に導入される突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、突然変異Ｃ２４２Ｔ、Ｃ８２３Ｔ、及びＣ１０７３Ｔの１つ又は複数を含有し、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ８１Ｉ、Ｐ２７５Ｓ、及びＡ３５８Ｖの１つ又は複数を含む（図８を参照されたい）。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する１つ又は複数の位置での改変（複数可）を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列のＣ２４２位、Ｃ８２３位、及びＣ１０７３位に対応する１つ又は複数の位置での改変を含む突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、ここで、対応する位置は、遺伝子の配列と配列番号２とをアラインすることによって決定され、場合によって、全ての突然変異はＣからＴへの置換である。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

当業者には、異なる大腸菌株のｌｐｄＡ遺伝子配列が配列番号２で示されるｌｐｄＡ遺伝子配列に完全に同一でないことがあり、また、異なる大腸菌株から得られるｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチド配列が配列番号１で示されるポリペプチド配列に完全に同一でないことがあることが理解されよう。本発明のいくつかの実施形態において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子における前記突然変異は、配列番号２のＣ２４２位、８２３位、及び／又は１０７３位にある。本発明のいくつかの実施形態において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドにおける置換は、配列番号１の８１位、２７５位、及び／又は３５８位に対応する位置にある。

本発明において、配列番号１又は配列番号２における具体的な位置「に対応する」位置は、例えば、手動のアラインメント又は様々な利用可能なアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）、及び当業者に知られている他の方法を用いる、配列アラインメントによって決定できる。ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列をアラインすることによって、当業者は、本発明の技術的効果を得るために、対応する突然変異（複数可）を適正な位置（複数可）で導入できる。さらに、当業者はまた、本発明の技術的効果を得るために、対応する位置（複数可）のアミノ酸残基（複数可）を保存された若しくは類似のアミノ酸残基（複数可）で置換できるか、又は、同義突然変異（複数可）をｌｐｄＡ遺伝子配列内に導入できる。

１つの実施形態において、本発明は、ｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子の発現が増強されているか、又はｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増強されている、組換え大腸菌に関する。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（ｃ）突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子であって、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する１つ又は複数の位置での改変（複数可）を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている、という遺伝子改変を含む、組換え大腸菌に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

別の実施形態において、本発明の大腸菌は、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子を含み、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する位置での改変を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列のＣ２４２位、Ｃ８２３位、及びＣ１０７３位に対応する位置での改変を含み、ここで、対応する位置は、遺伝子の配列と配列番号２とをアラインすることによって決定され、場合によって、全ての突然変異はＣからＴへの置換である。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の増強、及び／又はペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（ｃ）突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子であって、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する位置での改変を含み、ここで、対応する位置は、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴはＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰはＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡはＶで置換されている、という遺伝子改変を含む、組換え大腸菌に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｔｋｔＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｔｋｔＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、（ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（ｃ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列のＣ２４２位、Ｃ８２３位、及び、Ｃ１０７３位に対応する位置での改変を含む突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子であって、ここで、対応する位置は、遺伝子の配列と配列番号２とをアラインすることによって決定され、場合によって、全ての改変はＣからＴへの置換である、という改変を含む、組換え大腸菌に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明の大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は増強されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の阻害、及び／又はホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害と、（２）ｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（４）ｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子の発現の増強、並びに／又はｇａｌＰ遺伝子及び／又は外因性ｇｌｆ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、という改変の１つ又は複数をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の阻害、及び／又はホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害を含み、ここで、前記遺伝子は、ＰＴＳ系酵素ＩをコードするｐｔｓＩ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＨｐｒをコードするｐｔｓＨ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃをコードするｃｒｒ遺伝子、及びＰＴＳ系酵素ＩＩＣＢ^ＧｌｃをコードするｐｔｓＧ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である。

本発明において、ｐｔｓＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６９２８．１、ＮＣ＿０１０４６８．１）はホスホエノールピルビン酸−リン糖酸トランスフェラーゼＩ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．３．９）をコードし、ｐｔｓＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６９２９．１）はホスホエノールピルビン酸−リン糖酸トランスフェラーゼＨｐｒ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．１．６９）をコードし、ｃｒｒ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６９２７．１）はホスホエノールピルビン酸−リン糖酸トランスフェラーゼＩＩＡ^Ｇｌｃ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．１．６９）をコードし、ｐｔｓＧ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８１３１．１）はホスホエノールピルビン酸−リン糖酸トランスフェラーゼＩＩＣＢ^Ｇｌｃ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．１．６９）をコードする。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ｐｔｓＩ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｔｓＩ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（２）ｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（４）ｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子の発現の増強、並びに／又はｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、という改変の１つ又は複数をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ｐｔｓＩ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｔｓＩ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（２）ｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（４）ｇａｌＰ遺伝子の発現の増強、及び／又はｇａｌＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、という改変の１つ又は複数をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ｐｔｓＩ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｔｓＩ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（２）ｐｆｌＢ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｆｌＢ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（４）ｇａｌＰ遺伝子の発現の増強、及び／又はｇａｌＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変の１つ又は複数をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ｐｔｓＩ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｔｓＩ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（２）ｐｆｌＢ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｆｌＢ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（４）ｇａｌＰ遺伝子の発現の増強、及び／又はｇａｌＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変をさらに含む。

本発明において、ｐｆｌＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８３２２．１）はピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．３．１．５４）をコードし、ａｄｈＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８０２２．１）はエタノール／アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．１、ＥＣ Ｎｏ：１．２．１．１０）をコードし、ｌｄｈＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７１７６．１）は乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．２８）をコードし、ｇａｌＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４３．１）はガラクトースＭＦＳ輸送体をコードし、ｇｌｆ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＡＡ２７６９１．１）はグルコース輸送体Ｇｌｆ（グルコース促進タンパク質）をコードし、ｐｃｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７５９８８．１）はＰＣＫ酵素（ＥＣ Ｎｏ：４．１．１．４９）とも呼ばれるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする。

本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子の発現の阻害」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有し、遺伝子転写から得られるｍＲＮＡの量を低減させる、遺伝子発現の強度の低下を指す。遺伝子の発現の阻害は、例えば、限定はしないが、遺伝子の欠失、遺伝子コピー数の低減、遺伝子プロモーターの変化（例えば、弱いプロモーターを用いる）などによって行うことができる。本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害」は、当技術分野において知られている一般的な意味を有し、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の低下を指す。遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害は、例えば、遺伝子発現の強度の低下、遺伝子におけるヌクレオチドの挿入又は欠失、及びアミノ酸部位の突然変異によって行うことができる。「遺伝子の発現の阻害」及び「遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害」を行うための様々な技術的手段は、当業者に周知である。

別の実施形態において、本発明の大腸菌は、（１）ｐｔｓＩ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｔｓＩ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（２）ｐｆｌＢ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｐｆｌＢ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、（３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、並びに（４）ｇａｌＰ遺伝子の発現の増強、及び／又はｇａｌＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌はまた、（５）ａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、（６）ａｃｅＢＡ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＢＡ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強と、（７）ｄｃｕＣ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はｄｃｕＣ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質の活性の増強と、（８）ｍｇｓＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｍｇｓＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、という改変を含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌はまた、（９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変を含む。別の実施形態において、本発明の大腸菌におけるｐｃｋ遺伝子は欠失している。

Ｐｔａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７０２１．１）アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．３．１．８）をコードし、ａｃｋＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７０２２．１）はアセトキナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．２．１）をコードする。ＡｃｅＢＡ遺伝子クラスターは、リンゴ酸合成酵素（ＥＣ Ｎｏ：２．３．３．９）をコードするａｃｅＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６１５．１）、及びイソクエン酸リアーゼ（ＥＣ Ｎｏ：４．１．３．１）をコードするａｃｅＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６１４．１）を含む。ＤｃｕＣ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８６４７．１）は、Ｃ４ジカルボン酸輸送体ＤｃｕＣをコードする。ＭｇｓＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８２６３．１）は、メチル−グリオキサル合成酵素（ＥＣ Ｎｏ：４．２．３．３）をコードする。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１０）ａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、及び／又はａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、並びに（１１）ｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターの発現の阻害、及び／又はｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害という改変をさらに含む。

ＴｄｃＤＥ遺伝子クラスターは、ｔｄｃＤ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６２５９．１）及びｔｄｃＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６２６０．１）を含み、ここで、ｔｄｃＤ遺伝子はプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．７．２．１５）をコードし、ｔｄｃＥ遺伝子は２−ケトメチル酪酸リアーゼ／メチルプロピオン酸リアーゼ（ＥＣ Ｎｏ：２．３．１．５４）をコードする。ＡｄｈＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８０２２．１）は、エタノール／アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．１／ＥＣ Ｎｏ：１．２．１．１０）をコードする。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、（１２）ａｃｅＥＦ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＥＦ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、（１３）ｄｃｕＢ遺伝子の発現の増強、及び／又はｄｃｕＢ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、（１４）ｍｄｈ遺伝子の発現の増強、及び／又はｍｄｈ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、（１５）ｆｕｍＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｆｕｍＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、（１６）ｆｕｍＢ遺伝子の発現の増強、及び／又はｆｕｍＢ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強、並びに（１７）ｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強という改変の１つ又は複数をさらに含む。

ＡｃｅＥＦ遺伝子クラスターはピルビン酸複合体Ｅ１／Ｅ２（ＥＣ Ｎｏ：１．２．４．１）をコードし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１をコードするａｃｅＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９１５９．１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ２をコードするａｃｅＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９１５８．１）を含む。ＤｃｕＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９５０６．１）は、嫌気性Ｃ４ジカルボン酸輸送体ＤｃｕＢをコードする。Ｍｄｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６１４７．１）は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ Ｎｏ：１．１．１．３７）をコードする。ＦｕｍＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７６６２．１）は、好気性フマラーゼ酵素Ｉ（ＥＣ Ｎｏ：４．２．１．２）をコードする。ＦｕｍＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９５０７．１）は、嫌気性フマラーゼ酵素Ｉ（ＥＣ Ｎｏ：４．２．１．２）をコードする。ＦｒｄＡＢＣＤ遺伝子クラスターはフマル酸還元酵素（ＥＣ Ｎｏ：１．３．５．４）をコードし、フマル酸還元酵素フラボプロテインサブユニットをコードするｆｒｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９４６０．１）、フマル酸還元酵素鉄−硫黄タンパク質サブユニットをコードするｆｒｄＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９４６１．１）、フマル酸還元酵素サブユニットＣをコードするｆｒｄＣ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９４６２．１）、及びフマル酸還元酵素サブユニットＤをコードするｆｒｄＤ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９４６３．１）を含む。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、２０１３年２月２５日に、寄託番号ＣＧＭＣＣ７２６０（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）でＣＧＭＣＣに寄託されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、２０１３年２月２５日に、寄託番号ＣＧＭＣＣ７２５９（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）でＣＧＭＣＣに寄託されている。

１つの実施形態において、本発明の大腸菌は、２０１３年５月３日に、寄託番号ＣＧＭＣＣ７５５０（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）でＣＧＭＣＣに寄託されている。

第２の態様において、本発明は、本発明の大腸菌を培養するステップを含む、コハク酸を生産するための方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明のコハク酸を生産するための方法は、本発明の大腸菌を培養するステップ、及び場合によって、コハク酸を回収又は精製するステップを含む。

１つの実施形態において、本発明の「培養」には、種培養及び発酵培養が含まれる。

本明細書において用いられる場合、用語「種培養」は、固体培地での発酵のために細菌株を活性化した後に、振とうフラスコ及び種タンク内で増加させて、一定の量及び質の純粋種を得るプロセスを指す。

本明細書において用いられる場合、用語「発酵培養」は、適切な条件下で微生物株を用いることによって、特定の代謝経路（複数可）を介して、培地の構成成分をいくつかの特異的産物に変換するプロセスを指す。

１つの実施形態において、本発明の方法は、本発明の大腸菌の嫌気性発酵を行うステップを含む。

本明細書において用いられる場合、用語「嫌気性発酵」は、無酸素条件下で嫌気性発酵細菌株を用いることによって、特定の代謝経路（複数可）を介して、培地の構成成分をいくつかの特異的産物に変換するプロセスを指す。

１つの実施形態において、本発明の方法における培養プロセスは、いかなる通気ステップも伴わない。

１つの実施形態において、大腸菌を培養するための本発明の方法は、
（１）本発明の組換え大腸菌を種培地内に接種し、大腸菌の成長に適した条件下で一定期間培養して、種溶液を得るステップ、
（２）種溶液を発酵培地内に接種し、嫌気性条件下で培養するステップ
を含む。

本発明の方法において、培地、培養温度、培養時間、及び振とう器の使用の有無、並びに振とう速度などの、大腸菌のための様々な従来の培養条件を用いることができる。当業者は、必要に応じて適正な条件を選択できる。本発明の方法において用いられる培養及び発酵の条件は、当業者に周知である（Ｚｈｕｇｅ ｊｉａｎら、１９９４、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈｉｎａ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。

１つの実施形態において、本発明の培養条件には、限定はしないが、３０〜４５℃、例えば、３０〜３１℃、３１〜３２℃、３２〜３３℃、３３〜３４℃、３４〜３５℃、３５〜３６℃、３６〜３７℃、３７〜３８℃、３８〜３９℃、３９〜４０℃、４０〜４１℃、４１〜４２℃、４２〜４３℃、４３〜４４℃、又は４４〜４５℃の温度が含まれる。

１つの実施形態において、本発明の培養条件には、限定はしないが、６〜１６時間、例えば、６〜７時間、７〜８時間、８〜９時間、９〜１０時間、１０〜１１時間、１１〜１２時間、１２〜１３時間、１３〜１４時間、１４〜１５時間、又は１５〜１６時間の種培養時間が含まれる。

１つの実施形態において、本発明の培養条件には、限定はしないが、２〜５日、例えば、２日、３日、４日、又は５日の発酵培養時間が含まれる。

１つの実施形態において、本発明の培養条件には、限定はしないが、０．１〜１０％（Ｖ／Ｖ）、例えば、０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、又は１０％の接種量で本発明の組換え大腸菌を種培地に接種することが含まれる。

１つの実施形態において、本発明の培養条件には、限定はしないが、ＯＤ_５５０が０．０５〜０．５、例えば、０．０５〜０．１、０．１〜０．２、０．２〜０．３、０．３〜０．４、又は０．４〜０．５である最終濃度の接種量で種溶液を発酵培地に接種することが含まれる。

１つの実施形態において、大腸菌に一般的に用いられるあらゆる培地が用いることができる。本発明の大腸菌に用いられる培地は、適正な窒素源、例えば有機窒素化合物、又は無機窒素化合物、又はその混合物を含むことができる。１つの実施形態において、前記有機窒素化合物は、大豆ミール、ピーナッツミール、ウシ抽出物、魚ミール、酵母抽出物、ペプトン、及びトウモロコシ浸出液の１つ又は混合物から例えば選択することができ、前記無機窒素化合物は、硝酸塩（硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウムなど）、アンモニウム塩（リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）の１つ又は混合物から例えば選択することができる。１つの実施形態において、本発明の大腸菌に用いられる培地は、グルコース、デンプン、アミロ加水分解から得られるサッカリン、フルクトース、デキストリン、ラクトース、ガラクトース、キシロース、スクロース、グリセロール、マルトース、脂肪酸、酢酸、ピルビン酸、及びフマル酸の１つ又は混合物から例えば選択される適正な炭素源を含むことができる。

１つの実施形態において、本発明の方法において用いられる種培地及び発酵培地は、
主要成分：グルコース、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、及びベタイン−ＫＣｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２、及びＨ_３ＢＯ_３
からなる（水を溶媒として用いる）。

１つの実施形態において、本発明の培地は、
主要成分：グルコース２０〜１２０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２〜５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ４〜８ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ３〜５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１〜０．３ｇ／Ｌ、及びベタイン−ＫＣｌ ０．１〜１ｇ／Ｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ １〜５μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ_２ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２ ０．１〜１μｇ／Ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０１〜０．５μｇ／Ｌ
からなる（水を溶媒として用いる）。

１つの実施形態において、本発明の方法において用いられる種培地及び発酵培地は、
主要成分：グルコース、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、及びベタイン−ＫＣｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２、及びＨ_３ＢＯ_３
からなる（水を溶媒として用いる）。

１つの実施形態において、本発明の培地は、
主要成分：グルコース２０〜１２０ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ ０．５〜１．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ２〜５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１〜０．３ｇ／Ｌ、及びベタイン−ＫＣｌ ０．１〜１ｇ／Ｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ １〜５μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ_２ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０５〜１μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２ ０．１〜１μｇ／Ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０１〜０．５μｇ／Ｌ
からなる（水を溶媒として用いる）。

１つの実施形態において、大腸菌を培養するための本発明の方法は、
（１）種培養：種培地の１／３〜１／２容積を三角フラスコに取り、オートクレーブにかけて滅菌し、冷却後、本発明の組換え大腸菌を０．１〜１０％（Ｖ／Ｖ）の接種量で種培地に接種し、３７℃で６〜１６時間、振とうしながら培養して、発酵培地を接種するための種溶液を得ること、
（２）発酵培養：発酵培地の１／３〜１／２容積を嫌気性発酵容器に取り、種溶液をＯＤ_５５０が０．０５〜０．５の最終濃度の接種量で発酵培地に接種し、３７℃で２〜５日培養して、発酵培養液を得ること、
を含む、細菌株の嫌気性発酵のステップ
を含む。

１つの実施形態において、コハク酸を生産するための本発明の方法は、発酵培養液からコハク酸を単離及び／又は精製するステップをさらに含む。

第３の態様において、本発明は、コハク酸の生産における本発明の大腸菌の使用に関する。

本発明は、以下の実施例を通してさらに説明されるが、いかなる実施例又は実施例の組み合わせも、本発明の範囲又は実施形態を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、本明細書及び当技術分野における一般的な知識に基づいて、当業者には、特許請求の範囲によって定義される範囲が明らかに理解され得る。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明の技術的解決法に対するあらゆる修正又は変更を行い得、このような修正又は変更もまた、本発明の範囲内である。

以下の実施例において用いられる実験プロセスは、別段の指示がない限り、全て従来のプロセスである。以下の実施例において用いられる材料、試薬などは、別段の指示がない限り、全て市販されている。

本発明は、以下の実施例を具体的に含む。

実施例１：組換え大腸菌ＮＺ−０３７株の構築
組換え大腸菌ＮＺ−０３７（表１）の構築は、以下の８つのステップを含むものであった：

（１）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡの欠失
（１−１）遺伝子の欠失、調節、及び組み込みのために、まずプラスミドｐＸＺ−ＣＳを構築した。

４つのステップを、構築物プラスミドｐＸＺ−ＣＳに適用した：
第１のステップで、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４ ＤＮＡ（Ｍｏｋら、１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：２３２１〜２３２３）を鋳型として用い、プライマーセット１８４−ｃａｔ−ｕｐ（配列番号７）及び１８４−ｃａｔ−ｄｏｗｎ（配列番号８）を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。クロラムフェニコール遺伝子プロモーター配列を含有する９９４ｂｐの得られたＰＣＲ産物を断片Ｉと呼んだ。

ＰＣＲ系：５０μｌの全容積で、１０μｌのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ ５倍緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ）、２０ｎｇのＤＮＡ鋳型、及びプライマーセット（それぞれ１０μＭ）、０．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、３３．５μｌの蒸留水。

ＰＣＲサイクル：９８℃で２分を１サイクル（変性前）、９８℃で１０秒（変性）、５６℃で１０秒（アニーリング）、及び７２℃で３０秒（伸長）を３０サイクル、７２℃で５分（伸長）を１サイクル。

第２のステップで、バチルス・サブティリス・エスピー・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｎａ．ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１．１３９０）から得られた染色体ＤＮＡを鋳型として用い、プライマーセットＢｓ−ｓａｃＢ−ｕｐ（配列番号９）及びＢｓ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ（配列番号１０）を用いて、レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を増幅した。ｓａｃＢ遺伝子プロモーター配列を含有する１６１８ｂｐの得られたＰＣＲ産物を断片ＩＩと呼んだ。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、上記の第１のステップで述べた。

第３のステップで、第１のステップで得られた断片Ｉ及び第２のステップで得られた断片ＩＩを、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ（ＮＥＢ）で、３７℃で３０分消化した。消化産物を、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＢｉｏＭＩＧＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてクリーニングした。それぞれ２０ｎｇの断片Ｉ及び断片ＩＩに、１μｌの１０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）及び１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を添加し、蒸留水を補って１０μｌの全容積にし、２５℃で５分反応させた。１μｌのライゲーション産物を鋳型として取り、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを含有する断片ＩＩＩを、プライマーセット１８４−ｃａｔ−ｕｐ／Ｂｓ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、上記の第１のステップで述べた。

第４のステップで、ＰＣＲから得られた１μｌの断片ＩＩＩを１μｌのｐＥＡＳＹ−ｂｌｕｎｔ ｓｉｍｐｌｅベクター（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｈｉｎａ）に添加し、２５℃で１５分反応させた。ＣａＣｌ_２形質転換：５０μｌのＴｒａｎｓ１０ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｈｉｎａ）の添加及び３０分の氷浴、４２℃で３０秒の熱ショック、並びに氷上へ２分の即座の移動。２５０μｌのＬＢ培地の添加、及び３７℃、２００ｒｐｍで１時間のインキュベーション。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（最終濃度３４μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。５つの陽性コロニーを、プライマーセットＭ１３−Ｆ（配列番号１１）／Ｍ１３−Ｒ（配列番号１２）を用いるコロニーＰＣＲによって検証し、配列決定した。正確なコロニーから得られたプラスミドをｐＸＺ−ＣＳと呼んだ（表３）。

（１−２）：以下の６つのステップを含む、大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１０２を得るための二相相同組換えによる、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（Ｇｕｎｓａｌｕｓら、１９４１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １４１：８５３〜８５８）からのｌｄｈＡ遺伝子の欠失：

第１のステップで、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノムＤＮＡを鋳型として取り、１７５３ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−ｕｐ（配列番号１３）／ＸＺ−ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎ（配列番号１４）を用いて増幅した。１７５３ｂｐのＰＣＲ産物は、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣＡ７７１７６．１）、並びに乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡの約４００ｂｐの上流及び下流の配列を含有していた。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、上記の実施例１の節（１−１）における第１のステップで述べた。

１７５３ｂｐの増幅されたＰＣＲ産物を、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローニングした。クローニング系及び塩化カルシウム形質転換は、プラスミドｐＸＺ−ＣＳの構築についての上記の節（１−１）における第４のステップで述べた。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、カナマイシン（最終濃度１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。５つの陽性コロニーを、プライマーセットＭ１３−Ｆ／Ｍ１３−Ｒを用いるコロニーＰＣＲによって検証し、配列決定し、正確なコロニーから得られたプラスミドをｐＸＺ−００１と呼んだ。

第２のステップ、ＰＣＲ増幅を、プラスミドｐＸＺ００１のＤＮＡを鋳型として用いて、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−１（配列番号１５）及びＸＺ−ｌｄｈＡ−２（配列番号１６）を用いて行い、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクター、並びにｌｄｈＡ遺伝子の約４００ｂｐの上流及び下流の配列のそれぞれを含有する、４７５８ｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、上記の節（１−１）における第１のステップで述べた。

第３のステップで、クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡ断片ｃａｔ−ｓａｃＢを、第２のステップのＰＣＲ増幅産物にライゲーションした。詳細は以下の通りであった：

ｐＸＺ−ＣＳを鋳型として取り、クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有する２６１８ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーセットｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ（配列番号１７）／ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ（配列番号１８）を用いて増幅した。

ライゲーション系：第２のステップで得られた１０ｎｇの４７５８ｂｐのＰＣＲ産物、３０ｎｇのｃａｔ−ｓａｃＢカセットＤＮＡ断片、及び２μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ、４０万付着末端単位／ｍＬ）、並びに蒸留水を添加して、２０μｌの最終全容積にした。ライゲーションは、室温で２時間であった。１０μｌのライゲーション反応物を、プラスミドｐＸＺ−ＣＳの構築についての上記の節（１−１）において記載されている第４のステップを参照して、ＣａＣｌ_２形質転換方法によってＴｒａｎｓ１０に形質転換した。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、クロラムフェニコール（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。５つの陽性の単一コロニーを採取し、液体培地において培養し、プラスミド（ｃａｔ−ｓａｃＢのＤＮＡ断片をプラスミドｐＸＺ００１にクローニングした）を配列決定によって確認した。配列決定の結果は、ｃａｔ−ｓａｃＢのＤＮＡ断片が上記の第２のステップにおけるＰＣＲ産物にライゲーションされたことを示し、このことはプラスミドの正確な構築を実証し、得られた組換えプラスミドをｐＸＺ００２Ｃと呼んだ。

第４のステップで、プラスミドｐＸＺ００２Ｃを鋳型として取り、ＰＣＲ断片Ｉ（３４４７ｂｐ）を、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−ｕｐ／ＸＺ−ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、プラスミドｐＸＺ−ＣＳの構築についての上記の節（１−１）における第１のステップで述べた。ＤＮＡ断片Ｉは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡの４００ｂｐ上流、ｃａｔ−ｓａｃＢカセット、及び乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡの４００ｂｐ下流を含有していた。

ＤＮＡ断片Ｉを第１の相同組換えに用いた。プラスミドｐＫＤ４６（Ｗａｎｎｅｒ及びＤａｔｓｅｎｋｏ ２０００、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳＣＩ ＵＳＡ ９７：６６４０〜６６４５、プラスミドは、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＣＧＳＣ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ Ｃｅｎｔｅｒから購入した）を、ＣａＣｌ_２形質転換によって大腸菌ＡＴＣＣ８７３９にまず形質転換し、次いで、ＤＮＡ断片Ｉを、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９にエレクトロポレーションした。

エレクトロポレーションプログラム：まず、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のエレクトロポレーションコンピテント細胞を、Ｄｏｗｅｒ（Ｄｏｗｅｒら、１９８８．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：６１２７〜６１４５）によって記載されている方法によって調製した。５０μｌのエレクトロポレーションコンピテント細胞を氷上に置き、５０ｎｇのＤＮＡ断片Ｉを添加し、次いで、氷上に２分置いた。ＤＮＡと細胞との混合物を０．２ｃｍのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。電圧はＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）エレクトロポレーション器具によって２．５ＫＶであった。ショック後、１ｍＬのＬＢ培地をエレクトロポレーションキュベットに素早く添加し、５回ピペッティングした後に試験管に移した。培養物を、３０℃で、７５ｒｐｍで振とうしながら２時間インキュベートした。２００μｌの培養物を、クロラムフェニコール（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。５つのコロニーを、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−ｕｐ／ＸＺ−ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを用いるＰＣＲによって検証した。正確なコロニーをＳｕｃ−Ｔ１０１と呼んだ。

第５のステップで、第２のステップで得られた４７５８ｂｐのＰＣＲ産物をリン酸化し、自己ライゲーションしたプラスミドを第２の相同組換えに用いた。具体的には、４７５８ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｇｅｌ／ＰＣＲ精製Ｋｉｔ（Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＢｉｏＭＩＧＡ）でクリーニングした。３０ｎｇの精製されたＰＣＲ産物、２μｌの１０×Ｔ４ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）、及び残りの蒸留水を含む、２０μｌの反応容積を、３７℃で３０分反応させた。１μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ、４０万付着末端単位／ｍｌ）を添加し、室温で２時間反応させて、ライゲーション産物を得た。１０μｌのライゲーション産物を、プラスミドｐＸＺ−ＣＳの構築についての上記の節（１−１）において記載されている第４のステップを参照して、Ｔｒａｎｓ１０に形質転換した。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、カナマイシン（最終濃度１５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに広げ、一晩成長させた。５つの陽性コロニーを採取し、液体培地において培養し、プラスミドを配列決定のために抽出した。配列決定の結果は、第２のステップにおけるＰＣＲ産物が自己ライゲーションしたことを示し、このことは、プラスミドの正確な構築を示す。正確なコロニーをｐＸＺ００３と呼んだ。

第６のステップで、８２９ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを、プラスミドｐＸＺ００３を鋳型として用いて、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−ｕｐ／ＸＺ−ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを用いて、第２の相同組換えのために増幅した。ＤＮＡ断片ＩＩを、株Ｓｕｃ−Ｔ１０１にエレクトロポレーションした。

エレクトロポレーションプログラム：まず、プラスミドｐＫＤ４６を有するＳｕｃ−Ｔ１０１のエレクトロポレーションコンピテント細胞を、Ｄｏｗｅｒ（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）によって記載されている方法によって調製した。５０μｌのコンピテント細胞を氷上に置き、５０ｎｇのＤＮＡ断片ＩＩを添加し、次いで、氷上に２分置いた。ＤＮＡと細胞との混合物を、０．２ｃｍのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。電圧は、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）エレクトロポレーション器具によって２．５ＫＶがかけられた。ショック後、１ｍＬのＬＢ培地をエレクトロポレーションキュベットに素早く添加し、５回ピペッティングした後に試験管に移した。培養物を、３０℃で、７５ｒｐｍで振とうしながら４時間インキュベートして、プラスミドｐＫＤ４６を除去した。培養物を次いで、１０％スクロースを有するが塩化ナトリウムは有さないＬＢ培地（２５０ｍＬのフラスコ内で５０ｍＬの培地）に移し、２４時間培養し、次いで、６％スクロースを有するが塩化ナトリウムは有さないＬＢ固体培地に画線を付け、インキュベートした。正確なコロニーの増幅産物は、プライマーセットＸＺ−ｌｄｈＡ−ｕｐ／ＸＺ−ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを有するＰＣＲを介して、７６３ｂｐの断片であった。正確なコロニーをＳｕｃ−Ｔ１０２と呼んだ（表１）。

ｌｄｈＡ遺伝子を欠失させるために構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。

（２）ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子ｐｆｌＢの欠失
組換え大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１０２のｐｆｌＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８３２２．１）を、上記の節（１）において記載されている方法を用いて欠失させた。得られた株をＳｕｃ−Ｔ１０４と呼んだ。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがｐｆｌＢによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（３）ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子ｐｔｓＩの欠失
組換え大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１０４のｐｔｓＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６９２８．１）を、上記の節（１）において記載されている方法を用いて欠失させた。得られた株はＳｕｃ−Ｔ１０６であった。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがｐｓｔＩによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（４）ガラクトースＭＦＳ輸送体ＧａｌＰの活性化
組換え大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１０６のｇａｌＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４３．１）の非変性プロモーターを、調節部分Ｐｐｃｋ^＊（配列番号１０８）によって置換した。得られた株をＳｕｃ−Ｔ１０８と呼んだ。本発明において、Ｐｐｃｋ^＊は、ＡＴＧ開始コドンと比較して６４位でＧからＡに移行した、大腸菌の突然変異したｐｃｋプロモーターに相当した（Ｚｈａｎｇら、２００９ｂ、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５：７８０７〜７８１３）。

６つのステップをプロセスに適用した。
第１のステップで、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノムＤＮＡを鋳型として取り、ｇａｌＰ遺伝子のプロモーター、並びにｇａｌＰ遺伝子の約４００ｂｐの上流及び下流の配列を含有する８４１ｂｐの増幅産物を、プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｕｐ（配列番号２７）／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｄｏｗｎ（配列番号２８）を用いて増幅した。増幅産物を、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。陽性コロニーのプラスミドを、配列決定のために抽出した。配列決定の結果は、ガラクトース輸送体遺伝子ｇａｌＰのプロモーター、並びにガラクトース輸送体遺伝子ｇａｌＰの約４００ｂｐの上流及び下流の配列が、プラスミドｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔに挿入されたことを示し、このことは、プラスミドの正確な構築を示す。得られた組換えプラスミドをｐＸＺ０１１と呼んだ。

第２のステップで、プラスミドｐＸＺ０１１のＤＮＡを鋳型として取り、４６１４ｂｐの増幅産物を、プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−１（配列番号２９）／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−２（配列番号３０）を用いて増幅した。得られた増幅産物は、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターの配列、ｇａｌＰ遺伝子のプロモーター、並びにｇａｌＰ遺伝子のおよそ４００ｂｐの上流及び下流の配列を含有していた。

第３のステップで、プラスミドｐＸＺ−ＣＳを鋳型として取り、クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有する２６１８ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ／ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。

クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡ断片を、第２のステップで得られた４６１４ｂｐのＰＣＲ産物にライゲーションした。ライゲーション産物を、Ｔｒａｎｓ１−Ｔ１ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに形質転換した。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、クロラムフェニコール（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。５つの陽性コロニーを採取し、液体培地において培養し、プラスミド（このプラスミドにおいて、ｃａｔ−ｓａｃＢのＤＮＡ断片をｐＸＺ０１０にクローニングした）を配列決定のために抽出した。結果は、第２のステップにおけるＰＣＲ産物が、ｃａｔ−ｓａｃＢのＤＮＡ断片とライゲーションされたことを示し、このことは、プラスミドの正確な構築を示す。得られた組換えプラスミドをｐＸＺ０１２Ｃと呼んだ。

第４のステップ、プラスミドｐＸＺ０１２Ｃを鋳型として取り、ｇａｌＰのプロモーターの４００ｂｐ上流、ｃａｔ−ｓａｃＢカセット、ｇａｌＰのプロモーターの４００ｂｐ下流を含有するＤＮＡ断片Ｉ（３３０３ｂｐ）を、プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｕｐ／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。

ＤＮＡ断片Ｉを第１の相同組換えに用いた。プラスミドｐＫＤ４６を、ＣａＣｌ_２形質転換によって株Ｓｕｃ−Ｔ１０６に形質転換し、次いで、ＤＮＡ断片Ｉを、ｐＫＤ４６を有する株Ｓｕｃ−Ｔ１０６にエレクトロポレーションした。

エレクトロポレーションプログラムは、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失についての上記の節（１−２）における第４のステップで述べた。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、クロラムフェニコール（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩成長させた。５つのコロニーを、プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｕｐ／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｄｏｗｎを用いるＰＣＲによって検証した。正確なコロニーをＳｕｃ−Ｔ１０７と呼んだ。

第５のステップで、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノムＤＮＡを鋳型として取り、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のｐｃｋ遺伝子のプロモーターを、プライマーセットＰ−ｐｃｋ^＊−ｕｐ−ＳｐｅＩ（配列番号３１）／Ｐ−ｐｃｋ^＊−ｄｏｗｎ−ＫｐｎＩ（配列番号３２）を用いて増幅させた。プライマーを表２に列挙する。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ（ＮＥＢ）及びＫｐｎＩ（ＮＥＢ）で切断し、同一の酵素で切断された発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎら、１９９８、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜１５）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＸＺ６０２と呼んだ。プラスミドｐＸＺ６０２を鋳型として取り、増幅を、プライマーセットｐｃｋ^＊−Ｆ（配列番号３３）／ｐｃｋ^＊−Ｒ（配列番号３４）を用いて行った。プライマーを表２に列挙する。増幅産物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）によってリン酸化し、次いで、自己ライゲーションさせて、配列決定のための陽性プラスミドを得た。正確なプラスミドをｐＸＺ６０３と呼んだ。

ｐＸＺ６０３を鋳型として取り、３７８ｂｐの突然変異したＰｐｃｋ^＊を、プライマーセットＰ−ｐｃｋ^＊−ｕｐ−ＳｐｅＩ／Ｐ−ｐｃｋ^＊−ｄｏｗｎ−ＫｐｎＩを用いて増幅し、第２のステップにおいて調製された４６１４ｂｐの断片にライゲーションし、プラスミドｐＸＺ０１３を得た。

ＤＮＡ断片ＩＩを、プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｕｐ／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｄｏｗｎを用いて、プラスミドｐＸＺ０１３から増幅した。

第６のステップで、ＤＮＡ断片ＩＩを第２の相同組換において用いた。ＤＮＡ断片ＩＩを、Ｓｕｃ−Ｔ１０７にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションプログラムは、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失についての上記の節（１−２）において記載されている第６のステップで述べた。プライマーセットＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｕｐ／ＸＺ−ｇａｌＰ−Ｐ−ｄｏｗｎを用いるＰＣＲ、及び配列決定を介して、そこから１０５１ｂｐの産物が増幅された正確なコロニーが得られ、このコロニーをＳｕｃ−Ｔ１０８と呼んだ（表１）。

ｇａｌＰのプロモーターをＰｐｃｋ^＊によって置換するために用いたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。

（５）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫの活性化
Ｓｕｃ−Ｔ１０８のｐｃｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７５９８８．１）の非変性プロモーターを、調節部分Ｐｐｃｋ^＊によって置換し、組換え大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１１０を得た（表１）。

特に：
第１の相同組換え：プラスミドｐＸＺ−ＣＳを鋳型として取り、第１の相同組換えのためのＤＮＡ断片Ｉ（２７１７ｂｐ）を、プライマーセットｐｃｋ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ（配列番号３５）／ｐｃｋ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ（配列番号３６）を用いて増幅した。用いたプライマーを表２に列挙する。ＤＮＡ断片Ｉを、ｐＫＤ４６を有するＳｕｃ−Ｔ１０８にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性のコロニーを排除して、中間組換え細菌を得た。

第２の相同組換え：プラスミドｐＸＺ６０３を鋳型として取り、３７８ｂｐの人工調節部分Ｐｐｃｋ^＊を、プライマーセットＰ−ｐｃｋ^＊−ｕｐ−ＳｐｅＩ／Ｐ−ｐｃｋ^＊−ｄｏｗｎ−ＫｐｎＩを用いて増幅し（プライマーを表２に列挙する）、中間組換え株にエレクトロポレーションして、組換え細菌Ｉを得た。プライマーセットｐｃｋ−ＹＺ−ｕｐ（配列番号３７）／ｐｃｋ−ＹＺ−ｄｏｗｎ（配列番号３８）を、組換え細菌ＩのＰＣＲ検証に用いた。そこから６７６ｂｐの断片が正確に増幅及び配列決定された正確なコロニーをＳｕｃ−Ｔ１１０と呼んだ。

（６）リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｔａ及び酢酸キナーゼ遺伝子ａｃｋＡの欠失
ｐｔａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７０２１．１）及びａｃｋＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７０２２．１）を、上記の節（１）において記載されている方法を用いて、組換え大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１１０から欠失させた。得られた株をＮＺ−０３５と呼んだ（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがそれぞれｐｔａ又はａｃｋＡによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（７）リンゴ酸合成酵素ＡｃｅＡ及びイソクエン酸リアーゼＡｃｅＢの活性化
組換え大腸菌ＮＺ−０３５のａｃｅＢＡ遺伝子クラスター（ａｃｅＢ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６１５．１、ａｃｅＡ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６１４．１）の非変性プロモーターを、上記の節（４）において記載されている方法を用いて、プロモーターＰｐｃｋ^＊によって置換した。得られた株をＮＺ−０３６と呼んだ（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｇａｌＰがａｃｅＢによって置換された以外、ｇａｌＰ遺伝子の活性化に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（８）ジカルボン酸Ｄｃｕ輸送体ＤｃｕＣの活性化
組換え大腸菌ＮＺ−０３６のｄｃｕＣ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８６４７．１）の非変性プロモーターを、上記の節（４）において記載されている方法を用いて、Ｐｐｃｋ^＊によって置換した。得られた株をＮＺ−０３７と呼んだ（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｇａｌＰがｄｃｕＣによって置換された以外、ｇａｌＰ遺伝子の活性化に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

実施例２：組換え株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、ＮＺ−０３５、ＮＺ−０３６、及びＮＺ−０３７によるコハク酸の生産
種培地は、以下から構成される（Ｈ_２Ｏが溶媒）：
主要成分：グルコース２０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ３．５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ６．５５ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ３．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ、及びベタイン−ＫＣｌ ０．１５ｇ／Ｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ １．５μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．１μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１μｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ_２ ０．１μｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．１μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．２μｇ／Ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０５μｇ／Ｌ。

発酵培地は、別段の記載がない限り、５０ｇ／Ｌのグルコース及び１００ｍＭのＫＨＣＯ_３を含有することを除いて、種培地と同一であった。

株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、ＮＺ−０３５、ＮＺ−０３６、及びＮＺ−０３７の嫌気性発酵を、以下の条件下で行った：

（１）種培養：２５０ｍｌのフラスコ内の１００ｍｌの種培地を、１１５℃で１５分滅菌した。Ｓｕｃ−Ｔ１１０、ＮＺ−０３５、ＮＺ−０３６、及びＮＺ−０３７を、ｐｒｅ−ｉｎｏｃｕｌａ（１％（ｖ／ｖ）の接種材料）を種培地に移すことによって、３７℃で、１００ｒｐｍで振とうさせながら１２時間成長させて、種培養物を得た。

（２）発酵：種培養物を、２５０ｍｌの発酵培地を含有する５００ｍｌの発酵容器内に希釈して、ＯＤ_５５０が０．１の最終濃度とし、３７℃で、１５０ｒｐｍで４日成長させて、発酵培養液を得た。中和剤は、２．４Ｍの炭酸カリウム及び１．２Ｍの水酸化カリウムであった。発酵培養液は、容器内の全物質を含む。空気は、発酵のプロセス全体で散布されなかった。

分析：発酵培養液内の構成成分を、Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ａｇｉｌｅｎｔ−１２００）を用いて４日目にアッセイした。発酵培養液内のグルコース及び有機酸の濃度を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）のカラムによって測定した。

結果を表４に示す。９６時間の発酵の後、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０は２８０ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．１２ｍｏｌ／ｍｏｌであり、９６時間の発酵の後、株ＮＺ−０３５は２８６ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．１６ｍｏｌ／ｍｏｌであり、９６時間の発酵の後、株ＮＺ−０３６は２９８ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．１９ｍｏｌ／ｍｏｌであり、９６時間の発酵の後、株ＮＺ−０３７は３５７ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例３：ナトリウム塩を用いる組換え大腸菌ＮＺ−０３７の発酵によるコハク酸の生産
種培地の構成成分は、以下から構成される（Ｈ_２Ｏが溶媒）：
主要成分：グルコース２０ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ ０．８７ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ２．６３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ／Ｌ、ベタイン−ＫＣｌ ０．１５ｇ／Ｌ、並びに
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ２．４μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．３μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１５μｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ_２ ０．３μｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．５μｇ／Ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０７２μｇ／Ｌ。

発酵培地は、１００ｇ／Ｌのグルコース及び３５ｍＭの重炭酸ナトリウムを含有することを除いて、種培地と同一である。中和剤は、２．４Ｍの炭酸ナトリウム及び１．２Ｍの水酸化ナトリウムである。

種培養、発酵、及び分析は、実施例２において記載されているものと同一であった。

結果：９６時間の発酵の後、コハク酸の力価は２２６ｍＭであり、収量は１．２７ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例４：組換え大腸菌ＨＸ０２１の構築
細胞の成長及びコハク酸の生産性を向上させるために、ＮＺ−０３７の代謝的進化を行った。

代謝的進化のための発酵培地は、以下から構成される（Ｈ_２Ｏが溶媒）：
主要成分：グルコース１００〜２００ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ ０．８７ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ２．６３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ／Ｌ、ベタイン−ＫＣｌ ０．１５ｇ／Ｌ、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、及び
微量成分：ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ２．４μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．３μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１５μｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ_２ ０．３μｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．５μｇ／Ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０７２μｇ／Ｌ。

代謝的進化を、２５０ｍｌの発酵培地を含有する５００ｍｌの発酵容器内で行った。２．４Ｍの炭酸ナトリウム及び１．２Ｍの水酸化ナトリウムを中和剤として用いた。

１〜８０世代では、発酵培地は１００ｇ／Ｌのグルコース（１０％）を含有した。４８時間ごとに、発酵培養液を新たな発酵容器に移し、最初のＯＤ５５０を０．０５とした。

８１〜７８０世代では、発酵培地は１００ｇ／Ｌのグルコースを含有した。２４時間ごとに、発酵培養液を新たな発酵容器に移し、最初のＯＤ５５０を０．０５とした。

７８１〜１０８０世代では、発酵培地は１２０ｇ／Ｌのグルコース（１２％）を含有した。２４時間ごとに、発酵培養液を新たな発酵容器に移し、最初のＯＤ５５０を０．０５とした。

１０８０世代にわたる代謝的進化で、最終的な株ＨＸ０２１が得られた（図２）。

実施例５：組換え大腸菌ＨＸ０２３の構築
実施例１の節（１）におけるｌｄｈＡの欠失について記載された方法を用いて、組換え大腸菌ＨＸ０２１からｍｇｓＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８２６３．１）を欠失させた。得られた株をＨＸ０２３と呼んだ。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがｍｇｓＡによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

実施例６：組換え大腸菌ＨＸ０２４の構築
細胞の成長及びコハク酸の生産性を向上させるために、ＨＸ０２３代謝的進化を行った。
発酵及び代謝的進化は、実施例４において記載されているものと同一であった。
１〜３６０世代では、発酵培地は１２０ｇ／Ｌのグルコース（１２％）を含有した。２４時間ごとに、発酵培養液を新たな発酵容器に移し、最初のＯＤ５５０を０．０５とした。
３６０世代にわたる代謝的進化で、最終的な株ＨＸ０２４が得られた（図３）。

実施例７：組換え大腸菌ＨＸ０２４の発酵に対する様々な濃度の重炭酸イオン供給の影響
様々な濃度の重炭酸イオンを、組換え大腸菌ＨＸ０２４の発酵において供給した。
種培地は、実施例３において記載されているものと同一であった。

２５０ｍｌの発酵培地を含有する５００ｍｌの発酵容器を用いた。発酵培地は種培地と同一であったが、１２０ｇ／Ｌのグルコース及び３５ｍＭの重炭酸ナトリウムを補った。用いた中和剤は、５つの異なる比率、すなわち、１：４、１：２、１：１、３：２、及び２：１の、６Ｍの水酸化ナトリウム及び３Ｍの炭酸ナトリウムを有していた。

株ＨＸ０２４では、５００ｍｌの発酵容器における嫌気性発酵を、以下のように行った：
（１）種培養：２５０ｍｌのフラスコ内の１００ｍｌの種培地を、１１５℃で１５分滅菌した。ＨＸ０２４を、ｐｒｅ−ｉｎｏｃｕｌａ（１％（ｖ／ｖ）の接種材料）を種培地に移すことによって、３７℃で、１００ｒｐｍで振とうさせながら１２時間成長させて、種培養物を得た。

（２）発酵：５００ｍｌの発酵容器内の２５０ｍｌの発酵培地を、１１５℃で２５分滅菌した。種培養物を、発酵培地に希釈して、ＯＤ_５５０が０．１の最終濃度とし、３７℃で、１５０ｒｐｍで嫌気性条件下で４日成長させて、発酵培養液を得た。発酵培養液は、容器内の全物質を含む。空気は、発酵のプロセス全体で散布されなかった。

発酵の結果を表５に示す。塩基性溶液内のＣＯ_２のモル濃度比率が３３．３％より低い場合、コハク酸の収量は、水酸化ナトリウム及び炭酸ナトリウムの異なる比率の間で有意に減少した。しかし、塩基性溶液内のＣＯ_２のモル濃度比率が３３．３％より高い場合は、有意な差は見られなかった。

実施例８：５００ｍｌの発酵容器内での組換え大腸菌ＨＸ０２１、ＨＸ０２３、及びＨＸ０２４の発酵
種培地は、実施例３において記載されているものと同一であった。

２５０ｍｌの発酵培地を含有する５００ｍｌの発酵容器を用いた。発酵培地は種培地と同一であったが、１２０ｇ／Ｌのグルコース及び３５ｍＭの重炭酸ナトリウムを補った。用いた中和剤は、１．５Ｍの炭酸ナトリウム及び３Ｍの水酸化ナトリウムであった。

結果：９６時間の発酵の後、株ＨＸ０２１によって生産されたコハク酸の力価は６１８ｍＭであり、収量は１．２４ｍｏｌ／ｍｏｌであり、９６時間の発酵の後、株ＨＸ０２３によって生産されたコハク酸の力価は５９４ｍＭであり、収量は１．２５ｍｏｌ／ｍｏｌであり、９６時間の発酵の後、株ＨＸ０２４によって生産されたコハク酸の力価は７９８ｍＭであり、収量は１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌであった（表６）。

実施例９：５Ｌの発酵容器における組換え株ＨＸ０２４の発酵
種培地、発酵培地、及び分析は、実施例８において記載されているものと同一であった。
５Ｌの発酵容器（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢａｏＸｉｎｇ，ＢＩＯＴＥＣＨ−５ＢＧ）におけるＨＸ０２４の嫌気性発酵を以下のように行った：
（１）種培養：５００ｍｌのフラスコ内の１５０ｍｌの種培地を１１５℃で１５分滅菌した。ＨＸ０２４を、ｐｒｅ−ｉｎｏｃｕｌａ（１％（ｖ／ｖ）の接種材料）を種培地に移すことによって、３７℃で、１００ｒｐｍで振とうさせながら１２時間成長させて、種培養物を得た。
（２）発酵：５Ｌの発酵容器内の３Ｌの発酵培地を、１１５℃で２５分滅菌した。種培養物を、発酵培地に希釈して、ＯＤ_５５０が０．２の最終濃度とし、３７℃で、２００ｒｐｍで嫌気性条件下で４日成長させて、発酵培養液を得た。発酵培養液は、容器内の全物質を含む。空気は、発酵のプロセス全体で散布されなかった。
結果：９６時間の発酵の後、コハク酸の力価は９１５ｍＭ（１０８ｇ／Ｌ）であり、収量は１．３７ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．９ｇ／ｇ）であった（図４）。

実施例１０：組換え大腸菌ＨＸ０４１〜ＨＸ０４４の構築及び発酵
（１）組換え大腸菌ＨＸ０４１〜ＨＸ０４４の構築
実施例１の節（１−２）に記載されている方法を用いて、組換え大腸菌ＨＸ０２４から、ｐｃｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７５９８８．１）、ｍａｅＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７８１７．１）、ｍａｅＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６８８０．１）、及びｐｐｃ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６５９．１）を個別に欠失させ、それぞれ株ＨＸ０４１〜ＨＸ０４４を得た（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがｐｃｋ、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ、又はｐｐｃでそれぞれ置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（２）組換え大腸菌ＨＸ０４１〜ＨＸ０４４の発酵
組換え大腸菌ＨＸ０４１〜ＨＸ０４４による発酵によるコハク酸の生産は、実施例８において記載されているものと同一の方法を用いて行った。

発酵の結果を表７に示す。ｐｃｋ遺伝子が欠失した株ＨＸ０４１は大量のコハク酸を依然として生産し、このことは、大腸菌株が、ＰＣＫが関与するＰＥＰカルボキシル化を伴わずにコハク酸を生産できたことを示す。ｍａｅＢ遺伝子をＨＸ−０２４から欠失させた後、株のコハク酸の力価は２９％減少し、このことは、ＭａｅＢが株ＨＸ０２４において役割を有し、炭素代謝フラックスの一部がＭａｅＢを経てコハク酸の生産に寄与したことを示す。ＨＸ０２４においてｍａｅＡ遺伝子を欠失させた後、コハク酸の力価は４９％減少し、このことは、ＭａｅＡが株ＨＸ０２４において役割を有し、炭素代謝フラックスの一部がＭａｅＡを経てコハク酸の生産に寄与したことを示す。

さらに、ＨＸ０２４からｐｐｃ遺伝子を欠失させた後、株の種培養物は無機塩培地において成長できなかった。種培養物をＬＢ培地において成長させ、次いで無機塩培地において発酵させた後、コハク酸の力価は７０％減少し、このことは、ＰＰＣが、その優れた酵素触媒動態特徴を理由に、コハク酸の生産に対して重要な役割を有し得たことを示す。

実施例１１：組換え大腸菌ＨＸ０２７及びＨＸ０２８の構築及び発酵
（１）組換え大腸菌ＨＸ０２７の構築
実施例１の節（１）において記載されている方法を用いて、ａｄｈＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８０２２．１）を株ＨＸ０２４から欠失させて組換え株ＨＸ０２６を得、次いで、ｔｄｃＤＥ遺伝子クラスター（ｔｄｃＤ遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６２５９．１、ｔｄｃＥ遺伝子ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６２６０．１）をさらに欠失させて、組換え株ＨＸ０２７を得た（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがａｄｈＥ又はｔｄｃＤＥでそれぞれ置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（２）組換え株ＨＸ０２８の構築
細胞の成長及びコハク酸の生産性を向上させるために、ＨＸ０２７の代謝的進化を行った。
発酵培地及び代謝的進化は、実施例４において記載されているものと同一であった。
１〜６５０世代では、発酵培地は１２０ｇ／Ｌのグルコース（１２％）を含有した。２４時間ごとに、発酵培養液を新たな発酵容器に移し、最初のＯＤ５５０を０．０５とした（図５）。
６５０世代の進化の後、株ＨＸ０２８（図５）を得た。

（３）組換え株ＨＸ０２８の発酵
実施例９の方法に従って、組換え大腸菌ＨＸ０２８の発酵を５Ｌの発酵容器内で行った。
発酵の結果を図６に示す。９６時間の発酵の後、コハク酸の力価は１０４２ｍＭ（１２３ｇ／Ｌに等しい）であり、収量は１．０２ｇ／ｇ（１．５６ｍｏｌ／ｍｏｌに等しい）であった。

実施例１２：組換え大腸菌ＨＸ０２４のトランスクリプトーム分析
組換え大腸菌ＨＸ０２４のトランスクリプトーム分析を以下のように行った：
（１）発酵
株ＨＸ０２４の種培養及び発酵は、実施例８において記載されているものと同一であった。３つの嫌気性発酵を平行して行った。
野生型ＡＴＣＣ８７３９の種培養及び発酵は、グルコースの濃度が５０ｇ／Ｌであることを除いて、実施例５において記載されているものと同一であった。

（２）ＲＮＡの抽出
ＨＸ０２４細胞の３つの平行した発酵試料を、ＯＤ５５０＝３．９で回収し、混合し、ＲＮＡを抽出した。
野生型ＡＴＣＣ８７３９細胞の３つの平行した発酵試料を、ＯＤ５５０＝２．５で回収し、混合し、ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＤＮａｓｅ処理を、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって行った。

（３）トランスクリプトーム配列決定
トランスクリプトーム配列決定をＢＧＩ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）によって行った。１Ｇｂのクリーンなデータを各試料から生成した。参照配列は、ＡＴＣＣ８７３９のゲノム配列であった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿０１０４６８．１）。
ＨＸ０２４におけるコハク酸の生産に関連する遺伝子の発現レベルを、表８及び図７に示す。

トランスクリプトーム分析によると、コハク酸の生産に関連する遺伝子の発現レベルは有意に増大した。
（１）ペントースリン酸経路からのｔｋｔＡ遺伝子の発現レベルは増大し、糖分解経路（ＥＭＰ）からのｐｆｋＡ遺伝子の発現レベルは低下し、このことは、より多くの炭素フラックスがＰＰＰ経路を経て、ＥＭＰよりもＮＡＤＰＨの形態の、より多くの還元性同等物を生成したことを示す。他方で、ｍａｅＢ遺伝子の発現は増強され、このことは、細胞がＭａｅＢを介してカルボキシル化する能力が増強されたことを示す。細胞はより多くのＮＡＤＰＨを生産し、ＭａｅＢを介するカルボキシル化に有利に働いた。

（２）トランスヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｔｈＡの発現レベルは増大し、このことは、細胞がＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換する能力が増強されたことを示す。細胞はより多くのＮＡＤＰＨを生産し、ＮＡＤＰＨは次いでＮＡＤＨに変換されて、コハク酸の生産のための還元性同等物を提供した。

実施例１３：組換え大腸菌ＨＸ０２４のｌｐｄＡ遺伝子の配列決定分析
組換え大腸菌ＨＸ０２４のゲノムの配列決定を、ＢＧＩ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）によって行った。結果は、３つのヌクレオチド突然変異（Ｃ２４２Ｔ、Ｃ８２３Ｔ、及びＣ１０７３Ｔ）がｌｐｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９１５７．１）のコード領域に見られ、３つのアミノ酸の変化（Ｔ８１Ｉ、Ｐ２７５Ｓ、及びＡ３５８Ｖ）をもたらすことを示した（図８）。

実施例１４：ＴｔｋＡ及びＳｔｈＡの活性化はコハク酸の生産を向上させる
（１）組換え大腸菌ＺＴ−２５１、ＺＴ−２５２、及びＺＴ−２５３の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０から得られるｔｋｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４８．１）の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−３７（配列番号１０９）によって置換して、株ＺＴ−２５１を得た。

組換え株ＺＴ−２５１を以下のように構築した：
第１の相同組換え：プラスミドｐＸＺ−ＣＳを鋳型として取り、第１の相同組換えのための２７１７ｂｐのＤＮＡ断片Ｉを、プライマーセットｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ（配列番号７９）及びｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ（配列番号８０）を用いて増幅した。プライマーセットを表２に列挙する。得られたＤＮＡ断片Ｉを、プラスミドｐＫＤ４６を有する株Ｓｕｃ−Ｔ１１０にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性のコロニーを排除して、中間組換え株を得た。

第２の相同組換え：大腸菌Ｍ１−３７のゲノムＤＮＡ（Ｌｕら、２０１２、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：２４５５〜２４６２、配列番号１０９）を鋳型として取り、ＰＣＲを、プライマーセットｔｋｔＡ−Ｐ−ｕｐ（配列番号８１）及びｔｋｔＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ（配列番号８２）を用いて行って、ｔｋｔＡプロモーターの隣接相同アーム及び人工調節部分Ｍ１−３７を含有するＤＮＡ断片ｔｋｔＡ−Ｍ１−３７（１９３ｂｐ）を得た。用いたプライマーを表２に列挙する。

１９３ｂｐの断片ｔｋｔＡ−Ｍ１−３７を中間組換え株にエレクトロポレーションして、組換え細菌を得た。エレクトロポレーション及びクローンのスクリーニングの方法は、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失についての実施例１の節（１−２）の第６のステップにおいて記載されているものと同一であった。

組換え細菌を、プライマーセットｔｋｔＡ−ＹＺ−ｕｐ（配列番号８３）／ｔｋｔＡ−ＹＺ−ｄｏｗｎ（配列番号８４）を用いてＰＣＲによって検証し、配列決定し、配列決定によって検証された陽性コロニーをＺＴ−２５１と呼んだ。

同一の方法を用いて、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０における遺伝子ｓｔｈＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６５３．１）の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−３７で置換して、株ＺＴ−２５２を得た。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｔｋｔＡがｓｔｈＡによって置換された以外、遺伝子ｔｋｔＡのプロモーターの置換に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

同一の方法を用いて、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−３７（配列番号１０９）で置換して、株ＺＴ−２５３を得た。用いたプライマーを表２に列挙する。

（２）組換え大腸菌ＺＴ−２５１、ＺＴ−２５２、及びＺＴ−２５３の発酵
組換え株ＺＴ−２５１、ＺＴ−２５２、及びＺＴ−２５３の発酵を、実施例２において記載されているように行った。発酵の結果を表９に示す。株Ｓｕｃ−Ｔ１１０においてＰＰＰから生じるｔｋｔＡ遺伝子の発現を向上させると、コハク酸の力価及び収量はそれぞれ４％及び１３％増大した。ｔｋｔＡ遺伝子の発現の増強は、ＰＰＰを介する炭素フラックスを増強させて、コハク酸の生産のための還元同等物を増大させ得た。

ｓｔｈＡ遺伝子の発現を向上させると、コハク酸の力価及び収量はそれぞれ５％及び１３％増大した。ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強は、コハク酸の生産のためにＮＡＤＨに変換される細胞内のＮＡＤＰＨの一部を触媒できた。

ｔｋｔＡ遺伝子及びｓｔｈＡ遺伝子の発現を同時に向上させると、コハク酸の力価及び収量はそれぞれ１０％及び１９％増大した。ＰＰＰによって生成したＮＡＤＰＨは、コハク酸の生産のためにＮＡＤＨに変換された。より高い７％のグルコースを有するＮＢＳ培地において、コハク酸をより多く生産する株ＺＴ−２５３は、５０６ｍＭのコハク酸を生産でき、収量は１．３６ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例１５：コハク酸の生産を向上させるためのＴｋｔＡ、ＳｔｈＡ、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性化
（１）組換え大腸菌ＺＴ−２７３の構築
実施例１４の（１）において記載されているものと同一の方法を用いて、株ＺＴ−２５３におけるａｃｅＥＦ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−９３で置換した。プライマーは、ｔｋｔＡがａｃｅＥＦによって置換された以外、遺伝子ｔｋｔＡのプロモーターの置換に用いたプライマーと同一の様式で名付けた（表２）。得られた中間組換え株ＺＴ２７３Ａを、プライマーセットＡＰ１−ｕｐ（配列番号９５）／ａｃｅＥＦ−１（配列番号９６）を用いて検証した。

ｌｐｄＡ^＊を中間組換え株ＺＴ−２７３ＡのａｃｋＡ部位に組み込んで、中間組換え株ＺＴ−２７３Ｂを得た。詳細なプロセスは以下の通りである。

第１のステップ：組み込みベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−Ｋａｎの構築
具体的には、プラスミドｐＫＤ４（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ ２０００、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：６６４０〜６６４５；ｐＫＤ４は、エール大学のＣＧＳＣ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒから購入した）を鋳型として取り、ＦＲＴ−ｋｍ断片を、プライマーセットＫａｎ−ｕｐ−ＰａｃＩ（配列番号９７）／Ｋａｎ−ｄｏｗｎ−ＥｃｏＲＩ（配列番号９８）を用いて増幅した。ＰＣＲ系及びＰＣＲサイクルは、ｐＸＺ−ＣＳの構築についての実施例１の節（１−１）における第１のステップでに述べた。ＦＲＴ−ｋｍ断片を、制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩ／ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で３０分消化し、ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ（Ｚｈａｏら、２０１３、Ｍｅｔ Ｅｎｇ １７：４２〜５０、本発明者らの研究所によって構築され、配列番号１１１の配列を有する）を、同一の条件下で同一の酵素を用いて消化した。消化産物を、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＢｉｏＭＩＧＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてクリーニングした。５０ｎｇの精製されたＦＲＴ−Ｋｍ断片及び３０ｎｇの精製されたｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍベクター断片に、２μｌの１０×Ｔ４ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を添加し、蒸留水を補って２０μｌの最終容積とし、３７℃で３０分反応させた。１μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ、４０万付着末端単位／ｍｌ）を添加し、室温で２時間反応させて、ライゲーション産物を得た。１０μｌのライゲーション産物を、プラスミドｐＸＺ−ＣＳの構築についての実施例１の節（１−１）における第４のステップにおいて記載されているように、ＣａＣｌ_２形質転換によってＴｒａｎｓ１０に形質転換した。２００μｌの形質転換された細胞を、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。２〜３個のクローンを選択し、プライマーセットＫａｎ−Ｆ（配列番号９９）／ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｒ（配列番号１００）を用いてＰＣＲによって検証した。正確なプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−Ｋａｎと呼んだ。

第２のステップで、ｌｐｄＡ^＊遺伝子を、組み込みベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−Ｋａｎにクローニングして、プラスミドｐＸＺ１７７を得た。
具体的には、プラスミドｐＸＺ１７４を、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で３０分消化し、１４５５ｂｐの断片をゲルから回収した。ｐＴｒｃ９９ＡＭ−Ｋａｎを同一の酵素で消化した。消化産物を、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＢｉｏＭＩＧＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてクリーニングした。５０ｎｇの回収された断片及び２０ｎｇのｐＴｒｃ９９ＡＭ−Ｋａｎベクター断片に、２μｌの１０×Ｔ４ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を添加し、蒸留水を補って２０μｌの最終容積とし、３７℃で３０分反応させた。１μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ、４０万付着末端単位／ｍｌ）を添加し、室温で２時間反応させて、ライゲーション産物を得た。５μｌのライゲーション産物を、Ｔｒａｎｓ１−Ｔ１コンピテント細胞（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に形質転換し、２００μｌの形質転換された細胞を、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、一晩成長させた。５つの陽性コロニーを採取し、プライマーセットＫａｎ−Ｆ／ｌｐｄＡ−Ｒ−１７０（配列番号１０１）を用いてコロニーＰＣＲによって確認した。配列決定の結果はプラスミドの正確な構築を示し、このプラスミドをｐＸＺ１７７と呼んだ。

第３のステップで、ｌｐｄＡ^＊断片を、株ＺＴ−２７３ＡのａｃｋＡ部位に組み込んだ。
一段階組換えのための断片の調製：ｐＸＺ１７７を鋳型として取り、ａｃｋＡの５０ｂｐの左側の相同なアーム、ＦＲＴ−ｋｍ−ｌｐｄＡ^＊配列、及びａｃｋＡの５０ｂｐの右側の相同なアームを含有する、一段階組換えのための断片を、プライマーセットａｃｋＡ−ＦＲＴ−ｕｐ（配列番号１０２）／ｐｔａ−ｒｒｎＢ−ｄｏｗｎ（配列番号１０３）を用いて増幅した。

一段階組換え：プラスミドｐＫＤ４６をＣａＣｌ_２形質転換によって株ＺＴ−２７３Ａに形質転換し、次いで、一段階組換えのための断片を、ｐＫＤ４６を有するＺＴ−２７３株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションプログラムは、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失についての実施例１の節（１−２）の第４のステップにおいて記載されているものと同一であった。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞を、クロラムフェニコール（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩成長させた。５つのコロニーを、プライマーセットＸＺ−ａｃｋＡ−ｕｐ（配列番号３９）／ｌｐｄＡ−Ｒ−１７０（配列番号１０１）を用いてコロニーＰＣＲによって検証した。正確なコロニーをＺＴ−２７３Ｂと呼んだ。

実施例１４の節（１）において記載されている方法を用いて、人工調節部分Ｍ１−９３を、ＺＴ−２７３Ｂ内のｌｐｄＡ^＊遺伝子の前方に挿入した。プライマーは、ｔｋｔＡがａｃｋＡ又はｌｐｄＡによって置換された以外、ｔｋｔＡ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた（表２）。得られた株をＺＴ−２７３と呼んだ。

（２）組換え大腸菌ＺＴ−２７３の発酵
実施例２の方法に従って、株の発酵を行った。

発酵の結果を表１０に示す。ｔｋｔＡ遺伝子とｓｔｈＡ遺伝子との両方の発現が株Ｓｕｃ−Ｔ１１０において増強されると、コハク酸の力価及び収量は、それぞれ１０％及び１９％増大した。このことに基づいて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼのさらなる活性化によって、コハク酸の生産のための追加の還元性同等物が生産された。Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較して、組換え大腸菌ＺＴ−２７３によるコハク酸の力価及び収量は、それぞれ２４％及び３４％増大し、収量は最大１．５ｍｏｌ／ｍｏｌであった。さらに、コハク酸を多く生産する株ＺＴ−２７３は、より高い濃度の糖（７％グルコース）を含有する発酵培地において、力価が５６６ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．４８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

本発明において得られた組換え大腸菌を、他者による組換え大腸菌と比較し（表１１）、以下の結論を得ることができる。

（１）これらの株の間で、本発明の株ＨＸ０２８は、同一の発酵条件下でコハク酸の最高の力価及び収量を有する。カリウム塩と培養された株ＫＪ０７３及びＫＪ１２２と比較して、本発明の株の発酵はナトリウム塩と共に用いられ、したがって、費用がかなり低い。さらに、活性化型ペントースリン酸経路はＣＯ_２を生成できるため、本発明の株ＨＸ０２４及びＨＸ０２８の発酵は、重炭酸イオンをそれほど要しない。中和剤は、２．４ＭのＮａ_２ＣＯ_３＋１．２ＭのＮａＯＨの代わりに１．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３＋３ＭのＮａＯＨからなり、コハク酸の力価及び収量はほぼ同一であるため、炭酸ナトリウムの量及び生産コストが低下する。

２）株ＡＦＰ１１１及びＳＢＳ５５０ＭＧは、収量がそれぞれ１．６８及び１．６１ｍｏｌ／ｍｏｌのコハク酸を生産した。しかし、これらは、発酵のために富栄養培地を要し、生産コストを増大させ、培地内に含有される炭素源を理由に収量が多くなる。例えば、株ＡＦＰ１１１は、収量が１．６８ｍｏｌ／ｍｏｌ（１．１ｇ／ｇ）の９９．２ｇ／Ｌのコハク酸、１０ｇ／Ｌの酢酸、及び５ｇ／Ｌのエタノールを生産した（Ｖｅｍｕｒｉら、２００２、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：３２５〜３３２）。グルコースの消費は９０．２ｇ／Ｌであったと推定することができる。しかし、８８．６ｇ／Ｌのグルコースが９９．２ｇ／Ｌのコハク酸を生産するために（１．１２ｇのコハク酸に変換される１ｇのグルコース）、１５ｇ／Ｌのグルコースが１０ｇ／Ｌの酢酸を生産するために（２ｍｏｌの酢酸に変換される１ｍｏｌのグルコース）、９．２ｇ／Ｌのグルコースが５ｇ／Ｌのエタノールを生産するために（２ｍｏｌのエタノールに変換される１ｍｏｌのグルコース）、それぞれ消費された。理論上の消費された総グルコースは、８８．６＋１５＋９．２＝１１２．８ｇ／Ｌであり、これは、実際に消費されたグルコースよりも、１１２．８−９０．２＝２２．６ｇ／Ｌ多く、その理由は、発酵培地に１０ｇ／Ｌの酵母抽出物及び２０ｇ／Ｌのペプトンが添加されたためである。グルコースが発酵培地内の唯一の炭素源であった場合、コハク酸の収量は大きく減少し得る。最大でわずか８８．６／１１２．８＝７８．５％のグルコースがコハク酸の合成に用いられ、２１．５％のグルコースが酢酸及びエタノールの合成に用いられたと計算することができる。コハク酸の収量は、わずか７８．５％×１．７１＝１．３４ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

さらに、ＡＦＰ１１１株とＳＢＳ５５０ＭＧ株との両方は、好気性−嫌気性の二段階発酵によって発酵された。好気性発酵の間には空気が通気される必要があり、これはエネルギー消費を増大させ、発酵容器の利用率を低減させ、生産コストを増大させる。

３）株ＫＪ０７３は、ＰＣＫカルボキシル化によってコハク酸を主に生産した。コハク酸の力価は、ｐｃｋ遺伝子のみが欠失した場合、８８％低下した。他の３つのカルボキシラーゼはコハク酸の生産にほとんど関与せず、コハク酸の力価は、ｐｐｃ遺伝子、ｍａｅＡ遺伝子、及びｍａｅＢ遺伝子が別々に欠失した場合、それぞれ４％、７％、及び７％低下した（Ｚｈａｎｇら、２００９ａ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳＣＩ ＵＳＡ １０６：２０１８０〜２０１８５）。

本発明のコハク酸を多く生産する株ＨＸ０２４において、４つのカルボキシラーゼがコハク酸の生産にある程度関与し、その中でも、ＰＰＣは最も関与する。ｐｐｃ遺伝子のみけが欠失した場合、種培養物は無機塩培地では成長できない。種培養物を調製するためにＬＢ培地を用い、次いで無機塩培地で発酵させると、コハク酸の力価は７０％低下した。コハク酸の力価は、ｐｃｋ遺伝子、ｍａｅＡ遺伝子、又はｍａｅＢ遺伝子が別々に欠失した場合、それぞれ３８％、４９％、及び２９％低下した。

４）株ＸＺ７２１（Ｚｈａｎｇら、ＡＥＭ、２００９ｂ、７５：７８０７〜７８１３）はＳｕｃ−Ｔ１１０の派生と類似の背景を有し、これらは代謝的進化にかけなかった。

Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較して、ｔｋｔＡ遺伝子とｓｔｈＡ遺伝子との両方を改変することによって得られた株ＺＴ−２５３は、コハク酸の力価及び収量を、それぞれ１０％及び１９％増大させた。Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較して、ｔｋｔＡ、ｓｔｈＡ、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを改変することによって得られた株ＺＴ−２７３は、コハク酸の力価及び収量を、それぞれ２４％及び３４％増大させた。

本発明の組換え株ＺＴ−２７３は、５０ｇ／Ｌのグルコースを用いる発酵によって、４０．８ｇ／Ｌ（３４６ｍＭ）のコハク酸を生産し、収量は０．９８ｇ／ｇ（１．５０ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、ＸＺ７２１よりも良好なコハク酸生産を有する。組換え株ＺＴ−２７３は、７０ｇ／Ｌのグルコースを用いる発酵によって、６６．８ｇ／Ｌ（５６６ｍＭ）のコハク酸を生産し、収量は０．９７ｇ／ｇ（１．４８ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

実施例１６：組換え大腸菌ＮＺ−５１２、ＮＺ−５１３、ＮＺ−５１４、及びＮＺ−５１７の構築
（１）組換え大腸菌ＮＺ−５１２（表１）の構築は、以下の２つのステップを含むものであった：
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＥの欠失：実施例１の節（１）において記載されている方法を用いて、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０から得られたａｄｈＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８０２２．１）を欠失させて、組換え株ＮＺ−５１１を得た（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがａｄｈＥによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

ピルビン酸ギ酸−リアーゼ遺伝子ｐｆｌＢの回収：実施例１の節（１）において記載されている方法を用いて、ＮＺ−５１１（表１）から得られたΔｐｆｌＢ遺伝子を野生型大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のｐｆｌＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８３２２．１）に回収した。第２の相同組換えのための２２６０ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーセットＸＺ−ｐｆｌＢ−ｕｐ／ＸＺ−ｐｆｌＢ−ｄｏｗｎを用いて、野生型大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のＤＮＡから増幅させた。得られた株をＮＺ−５１２と呼んだ（表１）。構築されたプラスミドを表３に列挙し、用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｌｄｈＡがｐｆｌＢによって置換された以外、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

（２）ＴｋｔＡ及びＳｔｈＡの活性化による組換え大腸菌ＮＺ−５１３、ＮＺ−５１７、及びＮＺ−５１４の構築
株ＮＺ−５１２におけるｔｋｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４８．１）の非変性プロモーターを、実施例１４の節（１）において記載されている方法を用いて、人工調節部分Ｍ１−３７（配列番号１０９）で置換して、株ＮＺ−５１３（表１）を得た。同一の様式によって、ＮＺ−５１２及びＮＺ−５１３におけるｓｔｈＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９６５３．１）の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−３７で置換して、それぞれ株ＮＺ−５１７及びＮＺ−５１４を得た（表１）。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｔｋｔＡがｓｔｈＡによって置換された以外、ｔｋｔＡ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。

実施例１７：組換え大腸菌ＮＺ−５１２、ＮＺ−５１３、ＮＺ−５１４、及びＮＺ−５１７の発酵
実施例２において記載されている方法に従って、株の発酵を行った。

発酵の結果を表１２に示す。ｐｆｌＢ遺伝子が回収され、ａｄｈＥ遺伝子が不活化された株ＮＺ５１２は、２８９ｍＭのコハク酸を生産し、収量は１．１８ｍｏｌ／ｍｏｌであり、これは、Ｓｕｃ−Ｔ１１０との有意差を示さなかった。

ＮＺ−５１２におけるｔｋｔＡ遺伝子のみの活性化によって生じた、株ＮＺ−５１３のコハク酸の力価及び収量は、ＮＺ−５１２のコハク酸の力価及び収量よりもそれぞれ４％及び６％高かった。ＮＺ−５１２におけるｓｔｈＡ遺伝子のみの活性化によって生じた、株ＮＺ−５１７のコハク酸の力価及び収量は、ＮＺ−５１２のコハク酸の力価及び収量よりもそれぞれ７％及び５％高かった。ＮＺ−５１２におけるｔｋｔＡ遺伝子とｓｔｈＡ遺伝子との両方の活性化によって生じた、株ＮＺ−５１４のコハク酸の力価及び収量は、ＮＺ−５１２のコハク酸の力価及び収量よりもそれぞれ９％及び１２％高かった。これらの結果は、ｔｋｔＡ遺伝子及びｓｔｈＡ遺伝子が相乗的影響を有すること、並びにペントースリン酸経路において生じるＮＡＤＰＨをコハク酸の生産のためにＮＡＤＨに変換できることを示した。

実施例１８：コハク酸の生産の向上のためのＳｕｃ−Ｔ１１０におけるＺｗｆの活性化
（１）ｚｗｆ遺伝子の調節を用いる組換え大腸菌の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０における６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７７４３０．１）の非変性プロモーターを、以下のプロセスに従って、人工調節ライブラリーで置換した：

第１の相同組換え：プラスミドｐＸＺ−ＣＳを鋳型として取り、第１の相同組換えのためのＤＮＡ断片Ｉを、プライマーセットｚｗｆ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ及びｚｗｆ−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。プライマーを表２に列挙する。得られた２７１７ｂｐのＤＮＡ断片Ｉを、プラスミドｐＫＤ４６を有する大腸菌Ｓｕｃ−Ｔ１０８に電気的形質転換した。アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性のコロニーを排除して、中間組換え細菌を得た。

第２の相同組換え：組換え大腸菌Ｍ１−９３（Ｌｕら、２０１２、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９３：２４５５〜２４６２、配列番号１１０）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ｚｗｆプロモーターの隣接相同アーム及び人工調節性ライブラリーを含む１８９ｂｐのＤＮＡ断片ＲＢＳＬ−ｚｗｆを、プライマーセットｚｗｆ−Ｐ−ｕｐ及びｚｗｆ−ＲＢＳＬ−ｄｏｗｎを用いて増幅した。用いたプライマーを表２に列挙する。

１８９ｂｐのＤＮＡ断片ＲＢＳＬ−ｚｗｆを中間組換え細菌に電気的形質転換し、その中にＤＮＡ断片Ｉを組み込んで組換え細菌を得た。電気的形質転換及びスクリーニングの方法は、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失について第６のステップにおいて記載されている方法と同一であった。

組換え細菌を、プライマーセットｚｗｆ−ＹＺ−ｕｐ／ｚｗｆ−ＹＺ−ｄｏｗｎを用いてＰＣＲによって検証し、配列決定によって検証された１０個の正確な陽性コロニーを、Ｚｗｆ酵素活性のその後のアッセイのためにランダムに選択した。

（２）組換え細菌におけるＺｗｆ活性のアッセイ
中央値及び指数増殖期後の３０ｍｌの発酵培養液を、５０ｍｌの遠心分離管内で、４℃で、１００００ｒｐｍで５分遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを回収し、１５ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液内で２回洗浄し、３ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ内に懸濁し、氷浴内で３〜５分、澄明化するまで超音波処理し（電力：２５Ｗ、Ｏｎ：１秒、Ｏｆｆ：３秒）、４℃、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離した。上清を酵素活性アッセイのために回収した。

Ｚｗｆ酵素活性アッセイ系：９９０μｌの反応緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＮＡＤＰ^＋、２ｍＭのグルコース−６−リン酸、ｐＨ７．５）を１０μｌの上記の超音波処理した上清に添加し、混合し、キュベットに移してＡ３４０で読み取った（Ｌａｍｅｄら、１９８０、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １４１：１２５１〜１２５７；Ｋａｂｉｒ及びＳｈｉｍｉｚｕ、２００３、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０５：１１〜３１）。ブランク対照は、１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを有する反応緩衝液であった。３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの係数は６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１である。１単位の酵素活性を、１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの生産として定義した。

（３）コハク酸を生産するための組換え大腸菌の発酵
異なるＺｗｆ活性を有する組換え株ＺＴ−３１１、ＺＴ−３１２、ＺＴ−３１３、及びＺＴ−３１４を、上記のステップ（２）のＺｗｆ活性アッセイを介して排除した。株ＺＴ−３１１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｚｗｆ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ１−ｚｗｆ（配列番号１４２）で置換し、株ＺＴ−３１２において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｚｗｆ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ２−ｚｗｆ（配列番号１４３）で置換し、株ＺＴ−３１３において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｚｗｆ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ３−ｚｗｆ（配列番号１４４）で置換し、株ＺＴ−３１４において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｚｗｆ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ４−ｚｗｆ（配列番号１４５）で置換した。

実施例２の方法に従って、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、並びにＺＴ−３１１、ＺＴ−３１２、ＺＴ−３１３、及びＺＴ−３１４の嫌気性発酵を行った。結果を表１３に示す。結果は、ある特定の範囲内で、Ｚｗｆ活性が増大したため、コハク酸の力価及び収量が有意に増大したことを示し（図９）、ここで、最適な結果はＺｗｆ活性が中程度の値（１．５０Ｕ／ｍｇ）である場合に生じ、株ＺＴ−３１２のコハク酸の力価及び収量は、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較してそれぞれ２９％及び２９％増大して、それぞれ３３８ｍＭ及び１．４４ｍｏｌ／ｍｏｌであった。このことは、Ｚｗｆ活性の増大がＰＰＰの活性化に有利に働き、コハク酸の生産のための、より多くの還元性同等物を提供することを示した。

しかし、このことに基づいて、Ｚｗｆ活性をさらに増大させると、コハク酸の力価及び収量は、ある程度低下した（図９）。Ｚｗｆ活性がより高い（Ｚｗｆ：２．１６Ｕ／ｍｇ）株ＺＴ−３１３のコハク酸の力価及び収量は、ＺＴ−３１２と比較して５％及び５％低減して、それぞれ３２２ｍＭ及び１．３７ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例１９：コハク酸の生産に対する株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるＰｇｌ活性の増強の影響
（１）ｐｇｌ遺伝子の調節を用いる組換え大腸菌の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０における６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子ｐｇｌ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７８５２２．１）の非変性プロモーターを、人工調節性ライブラリーで置換した。組換え株の構築方法は、実施例１８において記載されているものと同一であった。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｚｗｆがｐｇｌによって置換された以外、ｚｗｆ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。配列決定によって検証された１０個の正確な陽性コロニーを、Ｐｇｌ活性のその後のアッセイのためにランダムに選択した。

（２）組換え細菌におけるＰｇｌ活性のアッセイ
組換え細菌の粗酵素溶液の調製は、実施例１８において記載されているものと同一であった。

Ｐｇｌ酵素活性アッセイ系：９９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＮＡＤＰ^＋、０．５ｍＭのグルコース−６−リン酸、１Ｕの６−グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ７．１）を室温で８分置き、次いで、１．５Ｕの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ及び１０μｌの超音波処理された上清を添加し、混合し、キュベットに移してＡ３４０で読み取った（Ｓｔａｎｆｏｒｄら、２００４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８：１１７〜１２７）。ブランク対照は、１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを有する反応緩衝液であった。３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの係数は６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１である。１単位の酵素活性を、１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの生産として定義した。

（３）コハク酸を生産するための組換え大腸菌の発酵
異なるＰｇｌ活性を有する組換え株ＺＴ−３２１、ＺＴ−３２２、ＺＴ−３２３、及びＺＴ−３２４を、上記のステップ（２）のＰｇｌ活性アッセイを介して排除し、株ＺＴ−３２１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｐｇｌ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ１−ｐｇｌ（配列番号１４６）で置換し、株ＺＴ−３２２において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｐｇｌ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ２−ｐｇｌ（配列番号１４７）で置換し、株ＺＴ−３２３において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｐｇｌ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ３−ｐｇｌ（配列番号１４８）で置換し、株ＺＴ−３２４において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｐｇｌ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ４−ｐｇｌ（配列番号１４９）で置換した。

実施例２の方法に従って、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、並びにＺＴ−３２１、ＺＴ−３２２、ＺＴ−３２３、及びＺＴ−３２４の嫌気性発酵を行った。結果を表１４に示す。結果は、ある特定の範囲内で、Ｐｇｌ活性が増大したため、コハク酸の力価及び収量が有意に増大したことを示し（図１０）、ここで、最適な結果はＰｇｌ活性が中程度の値（Ｐｇｌ：２．４４Ｕ／ｍｇ）を有する場合に生じ、株ＺＴ−３２１のコハク酸の力価及び収量は、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較してそれぞれ１９％及び１９％増大して、それぞれ３２１ｍＭ及び１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌであった。このことは、Ｐｇｌ活性の増大がＰＰＰの活性化に有利に働き、コハク酸の生産のための、より多くの還元性同等物を提供することを示した。

しかし、このことに基づいて、Ｐｇｌ活性をさらに増大させると、コハク酸の力価及び収量は、ある程度低下した（図１０）。Ｐｇｌ活性がより高い（Ｐｇｌ：５．３４Ｕ／ｍｇ）株ＺＴ−３２３のコハク酸の力価及び収量は、ＺＴ−３２１と比較して４％及び４％低減して、それぞれ３０８ｍＭ及び１．２８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例２０：コハク酸の生産に対する株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるＧｎｄ活性の増強の影響
（１）ｇｎｄ遺伝子の調節を用いる組換え大腸菌の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０における６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｎｄ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６６４５．１）の非変性プロモーターを、人工調節性ライブラリーで置換した。組換え株の構築方法は、実施例１８において記載されているものと同一であった。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｚｗｆがｇｎｄによって置換された以外、ｚｗｆ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。配列決定によって検証された１０個の正確な陽性コロニーを、Ｇｎｄ活性のその後のアッセイのためにランダムに選択した。

（２）組換え細菌におけるＧｎｄ活性のアッセイ
組換え細菌の粗酵素溶液の調製は、実施例１８において記載されているものと同一であった。
Ｇｎｄ酵素活性アッセイ系：９９０μｌの反応緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＮＡＤＰ^＋、２ｍＭの６−ホスホグルコン酸、ｐＨ７．５）を、１０μｌの超音波処理された上清に添加し、混合し、キュベットに移してＡ３４０で読み取った（Ｐａｄｉｌｌａら、２００４、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：３７０〜３７６）。ブランク対照は、１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを有する反応緩衝液であった。３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの係数は６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１である。１単位の酵素活性を、１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの生産として定義した。

（３）コハク酸を生産するための組換え大腸菌の発酵
異なるＧｎｄ活性を有する組換え株ＺＴ−３３１、ＺＴ−３３２、ＺＴ−３３３、及びＺＴ−３３４を、上記のステップ（２）のＧｎｄ活性アッセイを介して排除し、株ＺＴ−３３１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｇｎｄ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ１−ｇｎｄ（配列番号１５０）で置換し、株ＺＴ−３３２において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｇｎｄ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ２−ｇｎｄ（配列番号１５１）で置換し、株ＺＴ−３３３において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｇｎｄ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ３−ｇｎｄ（配列番号１５２）で置換し、株ＺＴ−３３４において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｇｎｄ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ４−ｇｎｄ（配列番号１５３）で置換した。

実施例２の方法に従って、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、並びにＺＴ−３３１、ＺＴ−３３２、ＺＴ−３３３、及びＺＴ−３３４の嫌気性発酵を行った。結果を表１５に示す。結果は、ある特定の範囲内で、Ｇｎｄ活性が増大したため、コハク酸の力価及び収量が有意に増大したことを示し（図１１）、ここで、最適な結果はＧｎｄ活性が中程度の値（Ｇｎｄ：５．７１Ｕ／ｍｇ）を有する場合に生じ、株ＺＴ−３３３のコハク酸の力価及び収量は、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較してそれぞれ１７％及び１７％増大して、それぞれ３２０ｍＭ及び１．３１ｍｏｌ／ｍｏｌであった。このことは、Ｇｎｄ活性の増大がＰＰＰの活性化に有利に働き、コハク酸の生産のための、より多くの還元性同等物を提供することを示した。

しかし、このことに基づいて、Ｇｎｄ活性をさらに増大させると、コハク酸の力価及び収量は、ある程度低下した（図１１）。Ｇｎｄ活性がより高い（Ｇｎｄ：１１．３Ｕ／ｍｇ）株ＺＴ−３３４のコハク酸の力価及び収量は、ＺＴ−３３３と比較してそれぞれ１３％及び５％低減して、それぞれ２７８ｍＭ及び１．２４ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例２１：コハク酸の生産に対する株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるＴｋｔ活性の増強の影響
（１）ｔｋｔＡ遺伝子の調節を用いる組換え大腸菌の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるトランスケトラーゼ遺伝子ｔｋｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７６４４８．１）の非変性プロモーターを、人工調節性ライブラリーで置換した。組換え株の構築方法は、実施例１８において記載されているものと同一であった。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｚｗｆがｔｋｔＡによって置換された以外、ｚｗｆ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。配列決定によって検証された１０個の正確な陽性コロニーを、Ｔｋｔ活性のその後のアッセイのためにランダムに選択した。

（２）組換え細菌におけるＴｋｔ活性のアッセイ
組換え細菌の粗酵素溶液の調製は、実施例１８において記載されているものと同一であった。
Ｔｋｔ酵素活性アッセイ系：１０μｌの粗酵素を、９９０μｌの反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１ｍＭのＴＰＰ、０．２５ｍＭのＮＡＤＨ、３Ｕのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、１０Ｕのアセトンリン酸イソメラーゼ、０．５ｍＭのＤ−キシルロース５−リン酸、０．５ｍＭのリボース５−リン酸、ｐＨ７．５）に添加し、混合し、キュベットに移してＡ３４０で読み取った。ブランク対照は、１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを有する反応緩衝液であった。３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの係数は６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１である。１単位の酵素活性を、１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの生産として定義した。

（３）コハク酸を生産するための組換え大腸菌の発酵
異なるＴｋｔ活性を有する組換え株ＺＴ−３６１、ＺＴ−３６２、及びＺＴ−３６３を、上記のステップ（２）のＴｋｔ活性アッセイを介して排除し、株ＺＴ−３６１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔｋｔＡ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ１−ｔｋｔＡ（配列番号１５４）で置換し、株ＺＴ−３６２において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔｋｔＡ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ２−ｔｋｔＡ（配列番号１５５）で置換し、株ＺＴ−３６３において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔｋｔＡ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ３−ｔｋｔＡ（配列番号１５６）で置換し、株ＺＴ−２５１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔｋｔＡ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分Ｍ１−３７−ｔｋｔＡ（配列番号１５７）で置換した。

実施例２の方法に従って、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、並びにＺＴ−３６１、ＺＴ−３６２、ＺＴ−３６３、及びＺＴ−２５１の嫌気性発酵を行った。結果を表１６に示す。結果は、ある特定の範囲内で、Ｔｋｔ活性が増大したため、コハク酸の力価及び収量が有意に増大したことを示し（図１２）、ここで、最適な結果はＴｋｔ活性が中程度の値（Ｔｋｔ：０．６１Ｕ／ｍｇ）を有する場合に生じ、株ＺＴ−３６１のコハク酸の力価及び収量は、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較してそれぞれ２２％及び２２％増大して、それぞれ３２６ｍＭ及び１．３７ｍｏｌ／ｍｏｌであった。このことは、Ｔｋｔ活性の増大がＰＰＰの活性化に有利に働き、コハク酸の生産のための、より多くの還元性同等物を提供することを示した。

しかし、このことに基づいて、Ｔｋｔ活性をさらに増大させると、コハク酸の力価及び収量は、ある程度低下した（図１２）。Ｔｋｔ活性がより高い（Ｔｋｔ：１．２０Ｕ／ｍｇ）株ＺＴ−２５１のコハク酸の力価及び収量は、ＺＴ−３６１と比較してそれぞれ８％及び８％低減して、それぞれ３００ｍＭ及び１．２６ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

実施例２２：コハク酸の生産に対する株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるＴａｌＢ活性の増強の影響
（１）ｔａｌＢの調節を用いる組換え大腸菌の構築
株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＡＣＡ７９２５８．１）の非変性プロモーターを、人工調節性ライブラリーで置換した。組換え株の構築方法は、実施例１８において記載されているものと同一であった。用いたプライマーを表２に列挙する。プライマーは、ｚｗｆがｔａｌＢによって置換された以外、ｚｗｆ遺伝子の調節に用いたプライマーと同一の様式で名付けた。配列決定によって検証された１０個の正確な陽性コロニーを、Ｔａｌ活性のその後のアッセイのためにランダムに選択した。

（２）組換え細菌におけるＴａｌ活性のアッセイ
組換え細菌の粗酵素溶液の調製は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたことを除いて、実施例１８において記載されているものと同一であった。
Ｔａｌ活性アッセイ：１０μｌの粗酵素を、９９０μｌの反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＮＡＤＰ^＋、１０Ｕのグルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３Ｕのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、０．５ｍＭのＤ−７−セドヘプツロース、０．５ｍＭの３−ホスホグリセルアルデヒド、ｐＨ８．５）に添加し、混合し、キュベットに移してＡ３４０で読み取った（Ｓｐｒｅｎｇｅｒら、１９９５、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７：５９３０〜５９３６）。ブランク対照は、１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを有する反応緩衝液であった。３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの係数は６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１であった。１単位の酵素活性を、１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの生産として定義した。

（３）コハク酸を生産するための組換え大腸菌の発酵
異なるＴａｌ活性を有する組換え株ＺＴ−３７１、ＺＴ−３７２、ＺＴ−３７３、及びＺＴ−３７４を、上記のステップ（２）のＴａｌ活性アッセイを介して排除し、株ＺＴ−３７１において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔａｌＢ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ１−ｔａｌＢ（配列番号１５８）で置換し、株ＺＴ−３７２において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔａｌＢ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ２−ｔａｌＢ（配列番号１５９）で置換し、株ＺＴ−３７３において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔａｌＢ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ３−ｔａｌＢ（配列番号１６０）で置換し、株ＺＴ−３７４において、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０におけるｔａｌＢ遺伝子の非変性プロモーターを人工調節部分ＲＢＳＬ４−ｔａｌＢ（配列番号１６１）で置換した。

実施例２の方法に従って、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０、並びにＺＴ−３７１、ＺＴ−３７２、ＺＴ−３７３、及びＺＴ−３７４の嫌気性発酵を行った。結果を表１７に示す。結果は、ある特定の範囲内で、Ｔａｌ活性が増大したため、コハク酸の力価及び収量が有意に増大したことを示し（図１３）、ここで、最適な結果はＴａｌ活性が中程度の値（Ｔａｌ：０．２０Ｕ／ｍｇ）を有する場合に生じ、株ＺＴ−３７２のコハク酸の力価及び収量は、株Ｓｕｃ−Ｔ１１０と比較してそれぞれ２７％及び２７％増大して、それぞれ３３８ｍＭ及び１．４２ｍｏｌ／ｍｏｌであった。このことは、Ｔａｌ活性の増大がＰＰＰの活性化に有利に働き、コハク酸の生産のための、より多くの還元性同等物を提供することを示した。

しかし、このことに基づいて、Ｔａｌ活性をさらに増大させると、コハク酸の力価及び収量は、ある程度低下した（図１３）。Ｔａｌ活性がより高い（Ｔａｌ：０．２６Ｕ／ｍｇ）株ＺＴ−３７４のコハク酸の力価及び収量は、ＺＴ−３７２と比較してそれぞれ８％及び８％低減して、それぞれ３０９ｍＭ及び１．３０ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

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Claims (11)

1. （１）ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）の発現の阻害、及び／又はホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害と、
   （２）ｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はｐｆｌＢ遺伝子及び／若しくはａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、
   （３）ｌｄｈＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、
   （４）ｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子の発現の増強、並びに／又はｇａｌＰ遺伝子及び／若しくは外因性ｇｌｆ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、
   という改変を含む組換え大腸菌であって、
   （ａ）ｔｋｔＡ遺伝子、ｔａｌＢ遺伝子、及びｐｇｌ遺伝子の１以上の遺伝子の発現の増強、及び／又はｔｋｔＡ遺伝子、ｔａｌＢ遺伝子、及びｐｇｌ遺伝子の１以上の遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強、並びに
   （ｂ）ｓｔｈＡ遺伝子の発現の増強、及び／又はｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強
   という改変の１つ又は複数をさらに含む、組換え大腸菌。
2. ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に関与する前記遺伝子が、ＰＴＳ系酵素ＩをコードするｐｔｓＩ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＨｐｒをコードするｐｔｓＨ遺伝子、ＰＴＳ系酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃをコードするｃｒｒ遺伝子、及びＰＴＳ系酵素ＩＩＣＢ^ＧｌｃをコードするｐｔｓＧ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である、請求項１に記載の組換え大腸菌。
3. ｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子の発現、並びに／又はｓｔｈＡ遺伝子及びｔｋｔＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増強されている、請求項１に記載の組換え大腸菌。
4. （５）ａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子の発現の阻害、並びに／又はａｃｋＡ遺伝子及びｐｔａ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、
   （６）ａｃｅＢＡ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＢＡ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強と、
   （７）ｄｃｕＣ遺伝子の発現の増強、及び／又はｄｃｕＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強と、
   （８）ｍｇｓＡ遺伝子の発現の阻害、及び／又はｍｇｓＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害と、
   という改変をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え大腸菌。
5. 突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え大腸菌であって、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＴ８１位、Ｐ２７５位、及びＡ３５８位に対応する位置での改変を含み、対応する位置が、ポリペプチドの配列と配列番号１とをアラインすることによって決定され、場合によって、Ｔ８１に対応する位置でＴがＩで置換され、Ｐ２７５に対応する位置でＰがＳで置換され、Ａ３５８に対応する位置でＡがＶで置換されており、場合によって、前記大腸菌において、突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子の発現、及び／又は前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増強されている、組換え大腸菌。
6. 前記突然変異体ｌｐｄＡ遺伝子が、プラスミド内又は染色体内にある、請求項５に記載の組換え大腸菌。
7. （９）ｐｃｋ遺伝子の発現の増強、及び／又はｐｃｋ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強という改変をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え大腸菌。
8. （１０）ａｄｈＥ遺伝子の発現の阻害、及び／又はａｄｈＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害、並びに
   （１１）ｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターの発現の阻害、及び／又はｔｄｃＤＥ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の阻害
   という改変をさらに含む、請求項７に記載の組換え大腸菌。
9. ａｃｅＥＦ遺伝子クラスターの発現の増強、及び／又はａｃｅＥＦ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質（複数可）の活性の増強という遺伝子改変（複数可）も含有する、請求項７に記載の組換え大腸菌。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え大腸菌を培養するステップを含む、コハク酸を生産するための方法。
11. コハク酸の生産における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え大腸菌の使用。

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