JP5805768B2 - スクロースとグリセロールとを同時に利用する新規コハク酸生成変異微生物及びこれを利用したコハク酸製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、炭素源として、スクロースとグリセロールとを同時に利用可能なコハク酸産生変異微生物に関し、より詳細にはコハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構（mechanism of sucrose-mediated catabolite repression of glycerol）を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物に関するものである。
コハク酸は、４個の炭素からなるジカルボン酸であり、多様な産業的応用の可能性を有している。コハク酸は、アジピン酸（adipic acid）、１，４−ブタンジオール（1,4-butanediol）、エチレンジアミンジスクシネート（ethylene diamine disuccinate）、イタコン酸（itaconic acid）、ガンマブチロラクトン（γ-butyrolactone）、ガンマアミノ酪酸（γ-aminobutyric acid）、及びテトラヒドロフラン（tetrahydrofuran）等産業的に重要な化学物質の前駆体として活用され、コハク酸の市場規模は前駆体を含むと、約１５０億ドルに達すると知られている（McKinlay et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:727, 2007）。最近の環境変化に伴う持続可能な開発に対する関心と、減り続ける原油埋蔵量と、それに伴った価格変動等の理由から去る十数年間バイオ基盤コハク酸産生に対する全世界的な研究が進められた（McKinlay et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:727, 2007; Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006; Jantama et al., Biotechnol. Bioeng., 99:1140, 2008）。しかし、現在まで開発されたいずれの種類の菌株も副産物生産を最小化しながら、生産性と収率を同時に極大化することはできなかった。生産性が高い場合にはその効率が低く、逆に効率が高い場合には生産性が低く、また、生産性が高い場合には多くの副産物を共に産生する等、現状はコハク酸だけを単独で産生しながら生産性と収率を同時に高めることができる理想的な菌株の開発は現在までなされていない（Jantama et al., Biotechnol. Bioeng., 99:1140, 2008）。
スクロースは、通常微生物発酵を介してコハク酸産生に用いられる葡萄糖価格の１／４であり、グリセロールは、世界的なバイオディーゼル産業の急成長と共に、副産物として発生して供給過剰による価格下落と適切な処理方法の開発が求められ、従ってその価格が非常に安く、持続的に減少傾向にある（Miller-Klein Associates, Oct. 2006）。
一方、多くの微生物は、種々の炭素源の混合物から、好ましい炭素源を優先的に活用する。これを可能にするために、多くの微生物は好ましい炭素源がある時、好ましくない炭素源の利用を阻害する異化代謝産物抑制機構（catabolite repression mechanism）を持っている（Gorke et al., Nature Reviews, 6:613, 2008）。代表的な異化代謝産物抑制機構による炭素源の選択的利用現象としては、１９４２年Ｍｏｎｏｄ等が発見した大腸菌でグルコースとラクトースが同時に存在する時、２段階（diauxie）成長を見せる現象が最も良く知られている。この時、好ましい炭素源は、グルコースであり、従って好ましくない炭素源であるラクトースの場合は、グルコースが全部消費してから若干の遅延期後に消費し始める成長曲線を見せており、これを２段階（diauxie）成長と呼ぶ。一般的なマンヘミア菌株にも、スクロースとグリセロールとを同時に活用することは、このような異化代謝産物抑制機構のために多くの難しさを伴う。それにもかかわらず、グリセロールを炭素源として活用することは多くのメリットがある。グリセロールは高度に還元されており、グリセロールを炭素源として活用する場合、該当過程の中間体であるホスホエノールピルビン酸（phosphoenolpyruvate、ＰＥＰ）を産生するに当たり、グルコース、キシロース、及びスクロースのような糖類に比べて二倍多い還元等価物（reducing equivalents、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２等）を生成することで、特に還元化学物質の産生において脚光を浴びている炭素源である（Yazdani et al., Curr. Opin. Biotechnol., 18:213, 2007）。しかし、嫌気条件の多くの場合において、グリセロールを利用した成長速度は、他の糖類を利用するより遅いため、グリセロールだけを単独炭素源として活用する場合には、還元力の提供においては優れているが、成長自体が遅く、目的バイオ産生品の生産性を高めるのに限界がある。
このような限界を克服するために、グリセロールより利用速度が高く、細胞の成長をさらに高いレベル及び速度で可能にするスクロースのような糖類を活用しながら、グリセロールの活用速度も増加させることができるならば、グリセロールの優れた還元力提供の長所を活用しながら速い速度で細胞を成長させて、結果的に還元化学物質の産生において、特にコハク酸産生において、効果的な産生戦略として活用できる。
そこで、本発明者等は、安価なスクロースとグリセロールとを同時に利用しながら高効率で、高い純度のコハク酸を生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、コハク酸生成微生物において、プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させるか、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入させた微生物を培養する場合、異化代謝産物抑制機構が弱化されて、スクロースとグリセロールとを同時に用いてコハク酸を産生でき、副産物を最小化して純粋にコハク酸だけを高効率で産生しながら、生産性も世界最高水準に接近することを確認して、本発明を完成するようになった。
本発明の目的は、スクロースとグリセロールとを同時に利用可能な菌株を開発して、コハク酸産生収率が理論水準に近接するように最大化しながら、同時に他の副産物の産生を極力最小化して、純粋にコハク酸だけを産生する異化代謝産物抑制機構が弱化された変異微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記変異微生物を嫌気条件下で、スクロース及びグリセロールを炭素源として用いて、コハク酸以外の他の副産物を生成することなく純粋にコハク酸を製造する方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を提供する。
さらに本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることを含む、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法を提供する。
さらに本発明は、前記コハク酸生成変異微生物を嫌気的条件で培養する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法を提供する。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
一観点において、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物に関する。
本発明で「異化代謝産物抑制機構（catabolite repression mechanism）」とは、種々の炭素源が存在する培地で微生物が培養される際に、好ましい炭素源を選択的に活用する。これを可能にするために多くの微生物は好ましい炭素源がある時、好ましくない炭素源の利用を阻害する機序を持っており、これを異化代謝産物抑制機構という（Gorke et al., Nature Reviews, 6:613, 2008）。
コハク酸産生菌株のマンヘミア菌株においても、異化代謝産物抑制機構によって、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に活用できなかった。
一般に、スクロースとグリセロールとが同時に存在する場合には、好ましい炭素源であるスクロースを先に消費し、グリセロールを後で消費する。マンヘミアでも同様にスクロースを好み、スクロースとグリセロールとが同時に存在する場合には、スクロースをより速く代謝するようになる。
本発明では、このような異化代謝産物抑制機構を人為的に弱化させようにした。
異化代謝産物抑制機構のメカニズムを詳しく調べると、大きく転写レベルの阻害とアロステリック阻害の二つに分けられる（Deutscher et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70:939, 2006; Gorke et al., Nature reviews, 6:613, 2008; Pettigrew et al., J. Bacteriol., 178:2846, 1996; Zwaig et al., J. Bacteriol., 102:753, 1970）。先に転写レベルでは、ＧｌｐＲレギュレーターの作用でグリセロールを細胞内に輸送し、利用するのに用いられる遺伝子の転写（transcription）が阻害される。アロステリック阻害とは、グリセロール代謝で核心的な機能を担うグリセロールキナーゼにフルクトース１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）やＥＩＩＡ等が結合して、その活性を落とすことをいう。スクロースとグリセロールとが同時にある環境では、ＧｌｐＲレギュレーターによる転写レベルの阻害と、ＦＢＰとＥＩＩＡによるアロステリック阻害が、同時に起きて、グリセロール代謝が全般的に阻害される。従って、このような異化代謝産物抑制機構を弱化できる戦略は、ＧｌｐＲによる転写レベルの阻害を弱化し、ＦＢＰやＥＩＩＡによるアロステリック阻害を受けないようにすることである。
異化代謝産物抑制機構のメカニズムを詳しく調べると、大きく転写レベルの阻害とアロステリック阻害の二つに分けられる（Deutscher et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70:939, 2006; Gorke et al., Nature reviews, 6:613, 2008; Pettigrew et al., J. Bacteriol., 178:2846, 1996; Zwaig et al., J. Bacteriol., 102:753, 1970）。先に転写レベルでは、ＧｌｐＲレギュレーターの作用でグリセロールを細胞内に輸送し、利用するのに用いられる遺伝子の転写（transcription）が阻害される。アロステリック阻害とは、グリセロール代謝で核心的な機能を担うグリセロールキナーゼにフルクトース１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）やＥＩＩＡ等が結合して、その活性を落とすことをいう。スクロースとグリセロールとが同時にある環境では、ＧｌｐＲレギュレーターによる転写レベルの阻害と、ＦＢＰとＥＩＩＡによるアロステリック阻害が、同時に起きて、グリセロール代謝が全般的に阻害される。従って、このような異化代謝産物抑制機構を弱化できる戦略は、ＧｌｐＲによる転写レベルの阻害を弱化し、ＦＢＰやＥＩＩＡによるアロステリック阻害を受けないようにすることである。
図１は、マンヘミア菌株でスクロース及びグリセロール代謝経路と異化代謝産物抑制機構を図式化したものである。図１のＡは、一般のスクロース及びグリセロールの代謝経路とこれらの間の異化代謝産物抑制機構を示したもので、図１のＢは、Ａのどの部分を代謝工学的に改良した際に、異化代謝産物抑制機構を弱化させることができるのか示したものである。実線矢印は、スクロースやグリセロールの代謝経路を示し、その太さは相対的な代謝速度を示す。細い点の矢印は、ＰＥＰからＰＴＳ ＩＩＢＣユニットまでのリン酸化基（phosphoryl group）の連続的伝達過程を示し、太い点線の矢印は、ｇｌｐオペロンの発現を誘導できる多様な経路を模式化したもので、リン酸化された（phosphorylated）ＩＩＡから始まる経路、アデニレートサイクラーゼ（ＡＣ）から始まる経路、ＣＲＰ−ｃＡＭＰから始まる経路、Ｇ３Ｐ−ＧｌｐＲから誘導される経路等多様な経路が存在する。太い点線からなる端がＴ字状に詰まった線は、ｇｌｐオペロンで核心的な役割を果たすグリセロールキナーゼ（ＧｌｐＫ）に加えられるリン酸化されなかった（non-phosphorylated）ＩＩＡ及び／またはフルクトース１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）によるアロステリック阻害とその程度を相対的に示す。
図１のＡに示されたに、スクロースとグリセロールとの間の異化代謝産物抑制機構は、大きくＧｌｐＲ等による転写阻害、及びＦＢＰ及びＥＩＩＡによるアロステリック阻害からなる。これを克服するためには、図１のＢに示したように種々のアクチベータ（activator）の生成を誘導して、転写阻害を克服し、ＦＢＰやＩＩＡの濃度を低くすることでＧｌｐＫ対するアロステリック阻害を緩和する等の方法がある。
例えば、図１のＢの（１）でＩＩＢＣＦを除去することでリン酸化されたＩＩＡの濃度を相対的に高めてＡＣの発現を誘導し、これによってｃＡＭＰがより多く生成することで、ＣＲＰ−ｃＡＭＰの生成が増加するようになり、結果的にｇｌｐオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したＧｌｐＫによって生成されたＧ３Ｐは、追加的に転写抑制要素であるＧｌｐＲをｇｌｐレギュロン（ｇｌｐＡＢＣ、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ等）ＤＮＡの結合部位（binding site）から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにする。この時、相対的にリン酸化されなかったＩＩＡの濃度は低く維持され、ＩＩＢＣＦの除去による全体的なスクロースの代謝能低下により、ＦＢＰ濃度が相対的に低下し、アロステリック阻害を緩和させることも可能になり、このような２要素の同時効果により、グリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。
他の例として、図１のＢの（２）でリン酸化されたＩＩＡ濃度を高めてＡＣの発現を誘導し、これをよりｃＡＭＰがより多く生成されて、ＣＲＰ−ｃＡＭＰの生成が増加することになり、結果的にｇｌｐオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したＧｌｐＫによって生成されたＧ３Ｐは、追加的に転写抑制要素であるＧｌｐＲをｇｌｐレギュロンＤＮＡの結合部位（binding site）から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子らの転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。
さらに他の例として、図１のＢの（３）でＡＣの過発現を誘導して、ｃＡＭＰをより多く合成するようにして、ＣＲＰ−ｃＡＭＰの生成を増加させ、結果的にｇｌｐオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したＧｌｐＫによって生成されたＧ３Ｐは、追加的に転写抑制要素であるＧｌｐＲをｇｌｐレギュロンＤＮＡの結合部位から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。
さらに他の例として、図１のＢの（４）でＣＲＰの過発現と（３）でのＡＣの過発現を同時に誘導することで、ＣＲＰ−ｃＡＭＰの生成を増加させ、結果的にｇｌｐオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したＧｌｐＫによって生成されたＧ３Ｐは、追加的に転写抑制要素であるＧｌｐＲをｇｌｐレギュロンＤＮＡの結合部位（binding site）から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。
さらに他の例として、図１のＢの（４）でＣＲＰの過発現を誘導して、ＣＲＰ−ｃＡＭＰの生成を増加させ、結果的にｇｌｐオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したＧｌｐＫによって生成されたＧ３Ｐは、追加的に転写抑制要素であるＧｌｐＲをｇｌｐレギュロンＤＮＡの結合部位から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。
さらに他の例として、図１のＢの（５）でＧｌｐＫの過発現を誘導して、Ｇ３Ｐの生成を増加させ、転写抑制要素のＧｌｐＲをｇｌｐレギュロンＤＮＡの結合部位（binding site）から離してｇｌｐレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法がある。
さらに他の例として、ｇｌｐレギュロンに含まれる遺伝子全体を過発現させるか、各々を組み合わせて過発現させてグリセロール代謝の増大を持たせる方法がある。
さらに他の例として、（５）で染色体上のｇｌｐレギュロン各転写単位の発現のためのプロモーター部位にＧｌｐＲが結合できる部位を持っていない過発現プロモーターを導入することで、ＧｌｐＲによる阻害を元から遮断する方法によって、ｇｌｐレギュロンを過発現させる方法によって、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法が挙げられる。
また、ＧｌｐＲを除去することで、ｇｌｐレギュロンの発現阻害を弱化させて、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法があって、さらに他の例として、図１のＢの（６）及び（７）でＩＩＡ及び／またはＦＢＰの濃度を低くすることで、ＧｌｐＫにアロステリック阻害程度を低くする方法によるグリセロール代謝を増加させる方法によって、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法が挙げられる。
また、上述した方法以外にも、前記方法を組み合わせ可能な方法と、これらから自明に類推できる方法、例えば、アロステリック阻害を相対的に少なく受けるように設計されるか、或いは少なく受ける異種菌株由来のグリセロールキナーゼを過発現することでグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法があり、上述した方法以外の異化代謝産物抑制機構を弱化させ、グリセロール代謝を活発にできる方法等が可能である。
一方、コハク酸は、このような還元化学物質の代表的な例として、ＰＥＰ（phosphoenolpyruvate）を中間前駆体として持つカルボキシル基が二つあるＣ４化学物質である。また、コハク酸生成微生物は、他の代謝産物に比べてコハク酸を過量に産生する微生物であり、発酵によるコハク酸産生に産業的に用いられる微生物を意味する。代表的なコハク酸生成微生物としては、ルーメンバクテリアが挙げられ、ルーメンバクテリアにはアクチノバチラス（Actinobacillus）属、アネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属、及びマンヘミア（Mannheimia）属（Ｂａｓｆｉａ属も含んで通称する。Ｂａｓｆｉａ属は最初に分離された時マンヘミア属と命名されたが、後にＢａｓｆｉａ属に分類され、１６ＳｒＲＮＡ配列も９９.８％一致する等の非常に類似する菌株であるため、ここではこれを全部併せてマンヘミア属と通称する。Scholten et al., WO2009/024294A1; Kuhnert et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60:44）等が知られている。最近まで知らされたコハク酸を産生する種々のルーメンバクテリアの部分的な遺伝情報（１６ｓ ｒＲＮＡ）、酵素分析、及び発酵結果を調べると、これらルーメンバクテリアのコハク酸産生のための炭素源の主要生合成経路が、ルーメンバクテリアの一種であるマンヘミア属のコハク酸産生生合成経路と略同じであることが分かる。特に、コハク酸生成に係るいずれのルーメンバクテリアも、コハク酸生成時二酸化炭素固定化酵素を利用して、Ｃ３化学物質であるホスホエノールピルビン酸（phosphoenolpyruvate）とピルビン酸（pyruvate）をＣ４化学物質であるオキサロ酢酸（oxaloacetate）とリンゴ酸（malate）に転化後、最終的にフマル酸（fumarate）を経てコハク酸を産生する（Zeikus et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:1939, 2006）。即ち、マンヘミア属を含む全てのルーメンバクテリアが同じコハク酸生合成経路を持つため、当業者において本発明の遺伝的変異を本実施例で示されたＭ．サクシニシプロデュセンス以外のルーメンバクテリア由来のコハク酸産生菌株に適用可能であることを予測できることは自明である。
本発明において、前記コハク酸生成微生物は、ルーメンバクテリアであることを特徴とし、前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア属（Mannheimia sp.）、アクチノバチルス属（Actinobacillus sp.）及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum sp.）からなる群から選択されることを特徴とする。
本発明において、前記マンヘミア属菌株は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens）ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）であってもよい。
本発明において、異化代謝産物抑制機構の弱化は、プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて行ってもよく、前記変異微生物は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）であってもよい。
本発明において、異化代謝産物抑制機構の弱化は、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入して行ってもよく、前記コハク酸生成変異微生物マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）であってもよい。
本発明では、コハク酸産生微生物であるルーメンバクテリアの遺伝子操作を介して、コハク酸産生収率を最大化しながら、他の有機酸を全く産生しないコハク酸産生変異微生物を作製した。
本発明の一実施例において、マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のゲノムＤＮＡでプルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｆｒｕＡ）を欠失させることで、スクロースを代謝すると同時にグリセロールを代謝する能力を持った菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）を作製することで、副産物を全く産生することなく、コハク酸の生産性と収率を共に高水準に維持する菌株を作製した。
本発明で前記各遺伝子の欠失は、相同組換え方法を利用して、該当遺伝子の不活性化させる方法を用いたが、該当遺伝子によってコードされる酵素が生成されないように、該当遺伝子を変形または除去させることができる遺伝子操作方法であるならば、制限なしに使用可能である。
本発明に係るコハク酸生成変異微生物の培養及びコハク酸の取得過程は、従来発酵工程で通常知られた培養方法及びコハク酸の分離精製方法を用いて行われる。
本発明で、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）のコハク酸収率と副産物生成程度及び炭素源代謝能を既存の変異菌株と比較した。これのために使った変異菌株は、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）である。Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）は、マンヘミア属菌株のゲノムで乳酸脱水素化酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチル化酵素をコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失されている変異微生物であり、本発明に係る変異微生物であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）でプルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｆｒｕＡ）が欠失されなかった菌株である。
本発明に係るコハク酸生成変異微生物Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）は、コハク酸産生に用いられる変異菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）と比較して、乳酸、ピルビン酸、酢酸、ギ酸等の副産物産生を最小化し、コハク酸産生収率を略理論収率水準（１．７１〜１．８６ｍｏｌ／ｍｏｌ）に高めて、コハク酸産生菌株として優れた特徴を示す。
他の観点において、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることを含む、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法に関する。
本発明の一実施例で、マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のゲノムＤＮＡに大腸菌のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入させることで、スクロースを代謝すると同時にグリセロールを代謝する能力を持った菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）を作製することで、副産物を全く産生することなく、コハク酸の生産性と収率が共に高い水準に維持する菌株を作製した。
本発明に係るコハク酸生成変異微生物Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）も前記のような方法で比較した。
また他の観点において、本発明は、前記コハク酸生成変異微生物を嫌気的条件で培養する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法に関する。
本発明において、前記培養は、スクロースとグリセロールとが同時に含まれた培地で行われることを特徴とし、前記副産物として、他の有機酸の生成量は、コハク酸生成重量の１％以下であることを特徴とする。
また他の観点において、本発明は、（ａ）高い収率を持って副産物生成が低いコハク酸産生変異微生物、または前記スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を嫌気的条件で培養する段階；（ｂ）前記培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる段階；（ｃ）前記高濃度の細胞を培養する段階；及び（ｄ）前記培養液からコハク酸を回収する段階、を含むコハク酸生成能が向上したコハク酸の製造方法に関するものである。
本発明において、培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる前記段階（ｂ）は、播種時高濃度の生産菌株を注入するイノキュラム法（以下、「イノキュラム法」）またはメンブラン細胞リサイクリングバイオリアクター（membrane cell recycling bioreactor；ＭＣＲＢ）方法（以下、「ＭＣＲＢ法」）で行う方法を含むことを特徴とする。
本発明に係るコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を利用したコハク酸の産生方法によると、副産物が全くなく、高純度でコハク酸を産生可能であり、この時、コハク酸産生収率は、理論収率に近い超高収率で産生可能である。また、スクロースは、通常微生物発酵を介してコハク酸産生に用いられる葡萄糖価格の１／４であり、グリセロールは世界的なバイオディーゼル生産産業の急成長と共に、副産物として発生して供給過剰による価格下落と、適切な処理方法の開発が求められ、従ってその価格が非常に安く、持続的に減少傾向にある（Miller-Klein A ssociates, Oct. 2006）。これは、原料物質として莫大な原料費用の節減を介して現在化学合成法によって生産されているコハク酸を微生物発酵を介して安く生産できるようにする側面、そしてコハク酸産生収率を理論収率に近い超高効率で生産する側面、また、分離精製にかかる費用を最小化できるように超高純度で生産可能であるという側面から、その価値が非常に高いと言える。
本発明に係るＰＡＬＦＫ菌株を利用すると、副産物を略完璧に除去させながら、単独のコハク酸だけ産生することができ、この時、コハク酸産生収率（yield）は、略理論収率（１．７１〜１．８６ｍｏｌ／ｍｏｌ）に近い非常に高収率が得られる。生産性（productivity）、収率（yield）、副産物の程度（byproducts/succinic acid比）の三つの要素は、コハク酸産生工程の産業化に当たり、最も核心的な要素であり、生産性工場の規模と連携され、初期工場設立費用（capital cost）及びエネルギー費用（energy cost）と関わる。収率は原料物質を如何に効果的に用いるかに関する尺度であり、バイオ工程で相当部分を占める原料費用（raw material cost）と関わる。副産物の程度は、バイオ工程全費用の半分以上を占める分離精製費用（separation and purification cost）と関わる。
従って、本発明の一実施例では、ＰＡＬＦＫ菌株を利用して収率を最大化し、副産物の産生程度を最小化することで、上述した三つの核心要素中の二つ（収率及び副産物程度）を達成可能な極端な水準に向上させた。更に、生産性を向上させるための方法を探すために鋭意努力し、その結果、イノキュラム法及びＭＣＲＢ法を活用する等の培養液内の細胞濃度を増加させることによって母菌株に比べて各々２倍及び１０倍以上生産性が向上することを確認した。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
特に、下記実施例では、本発明に係る遺伝子を除去するために、特定ベクターと宿主細胞として、コハク酸生成微生物であるマンヘミア属微生物のみを例示したが、他種のコハク酸生成微生物を用いても、高い純度のコハク酸を生成する変異微生物を取得できることは当業界で通常の知識を有する者には自明であろう。
実施例１：ｆｒｕＡ欠失ベクター（ｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡ）の作製
コハク酸生成微生物のゲノムからｆｒｕＡ遺伝子（プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子）を相同組換え方法で除去するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。先にＭ．サクシニシプロデュセンスＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６のプライマーを用いてｆｒｕＡ左側相同性部位（ＨＬ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）を抵抗性遺伝子として含むＰＣＲ切片、及びｆｒｕＡ右側相同性部位（ＨＲ）各々のＰＣＲ切片を取得した。その後、配列番号１と６のプライマーを用いて前記三つのＰＣＲ切片を鋳型として、オーバーラッピングＰＣＲを行って、このように得られたＤＮＡの切片をＳａｃＩとＰｓｔＩで切断し、これをｐＳａｃＨＲ０６ベクターに導入して、ｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡベクターを完成した。
配列番号１：５'-ＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＧＧＴＴＴＡＴＴ
配列番号２：５'-ＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡ
配列番号３：５'-ＣＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧ
配列番号４：５'-ＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣ
配列番号５：５'-ＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＴＴＧＧＣＧＧＡＧ
配列番号６：５'-ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧ
コハク酸生成微生物のゲノムからｆｒｕＡ遺伝子（プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子）を相同組換え方法で除去するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。先にＭ．サクシニシプロデュセンスＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６のプライマーを用いてｆｒｕＡ左側相同性部位（ＨＬ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）を抵抗性遺伝子として含むＰＣＲ切片、及びｆｒｕＡ右側相同性部位（ＨＲ）各々のＰＣＲ切片を取得した。その後、配列番号１と６のプライマーを用いて前記三つのＰＣＲ切片を鋳型として、オーバーラッピングＰＣＲを行って、このように得られたＤＮＡの切片をＳａｃＩとＰｓｔＩで切断し、これをｐＳａｃＨＲ０６ベクターに導入して、ｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡベクターを完成した。
配列番号１：５'-ＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＧＧＴＴＴＡＴＴ
配列番号２：５'-ＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡ
配列番号３：５'-ＣＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧ
配列番号４：５'-ＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣ
配列番号５：５'-ＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＴＴＧＧＣＧＧＡＧ
配列番号６：５'-ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧ
実施例２：Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ菌株の作製
実施例１で作製されたｆｒｕＡ遺伝子除去用ベクターｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡを利用して、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のゲノムにおいてｆｒｕＡを欠失させて変異菌株を作製した。
実施例１で作製されたｆｒｕＡ遺伝子除去用ベクターｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡを利用して、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のゲノムにおいてｆｒｕＡを欠失させて変異菌株を作製した。
即ち、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＢＨＩ（Brain-Heart Infusion）固体培地に塗抹して、３６時間３９℃で培養した後、コロニーをＢＨＩ液体培地１０ｍＬに播種して、１２時間培養した。十分に育った細胞培養液を再度ＢＨＩ液体培地１００ｍＬ １％に播種して、３９℃の静置培養器で培養した。
約４〜５時間後、細胞成長が、ＯＤ６００基準で０．３〜０．５程度になった時、前記細菌培養液を０〜４℃に２０分間置いて細胞成長がそれ以上進行されないように防ぎ、これを４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を取得した。その後、４℃の１０％グリセロール溶液２００ｍＬでセルを再懸濁した後、また前記条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を、１０％グリセロール溶液を半分に減らしながら合わせて３回行った。最終的に得られたセルは、同じ体積の１０％グリセロール溶液で再懸濁し分株して、−８０℃に保管した。
前記取得された細胞濃縮懸濁液と実施例１で作製した遺伝子除去ベクターｐＳａｃＨＲ０６ｆｒｕＡを混合して、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００ｏｈｍｓの条件でエレクトロポレーション（electroporation）を行って、前記ベクターでＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）の形質転換を試みた。このようにエレクトロポレーション（electroporation）された細胞は、ＢＨＩ液体培地を加えて、３９℃静置培養器で１時間回復培養した後、培養液を全部抗生剤クロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩ固体培地に塗抹して、３９℃静置培養器で４８時間以上培養した。二重交叉（double crossover）が起きたコロニーを選別するために、形成されたコロニーをクロラムフェニコール（６．８μｇ／ｍＬ）と１００ｇ／Ｌのスクロースを含有したＢＨＩ固体培地に塗抹してから、２４時間培養した後、形成されたコロニーを同じ固体培地に再塗抹した。
前記培地で形成された変異株を抗生剤が含まれたＢＨＩ液体培地で培養して、Ｒｏｃｈｅｌｌｅ等の方法（Rochelle et al., FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992）を応用して、培養菌株のゲノムＤＮＡを分離した。前記分離された変異株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、取得されたＰＣＲ産物を電気泳動することで、ゲノムＤＮＡのｆｒｕＡ遺伝子欠失の有無を確認した。ｆｒｕＡ遺伝子の欠失の有無は、下記のように２回のＰＣＲを行って確認した。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７と８、そして配列番号９と１０のプライマーを利用してＰＣＲを各々行った。前記２回のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ断片を電気泳動してＰＣＲ断片の大きさを確認して最終ｆｒｕＡの欠失の有無を確認し、最終的にはＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）を作製し、前記菌株を韓国生命工学研究院に受託した（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）。
配列番号７：５'-ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＣＧＴＴＴ
配列番号８：５'-ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡ
配列番号９：５'-ＴＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴ
配列番号１０：５''ＴＴＧＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣ
配列番号７：５'-ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＣＧＴＴＴ
配列番号８：５'-ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡ
配列番号９：５'-ＴＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴ
配列番号１０：５''ＴＴＧＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣ
実施例３：ｐＭＥ１８ｇｌｐＫ２２ベクターの作製及びこれを導入したＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ菌株の作製
大腸菌由来グリセロールキナーゼをコードする遺伝子（ｇｌｐＫ２２）を含むＤＮＡを取得するために大腸菌Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（ATCC 47076; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６のプライマーを用いて各々ＰＣＲを行った。このように得られた三つのＰＣＲ産物を鋳型として再度ＰＣＲを行うことで、一つのＰＣＲ産物を取得し、このＰＣＲ産物にはコード配列の９１３番目の塩基対が本来大腸菌Ｋ−１２ ＭＧ１６５５のｇｌｐＫ遺伝子が持っていたグアニンがアデノシンに転化されているｇｌｐＫ２２遺伝子が含まれているが、本遺伝子から発現するグリセロールキナーゼ（glycerol kinase）は変異前のｇｌｐＫに比べてＦＢＰとＩＩＡによるアロステリック阻害を相対的に少なく受けることが知られている（Pettigrew et al., J. Bacteriol., 178:2846, 1996）。
配列番号１１：５'-ＡＣＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＣＴＴ
配列番号１２：５'-ＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＡ
配列番号１３：５'-ＴＴＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧ
配列番号１４：５'-ＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＣＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＣ
配列番号１５：５'-ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧ
配列番号１６：５'-ＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＴ
大腸菌由来グリセロールキナーゼをコードする遺伝子（ｇｌｐＫ２２）を含むＤＮＡを取得するために大腸菌Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（ATCC 47076; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６のプライマーを用いて各々ＰＣＲを行った。このように得られた三つのＰＣＲ産物を鋳型として再度ＰＣＲを行うことで、一つのＰＣＲ産物を取得し、このＰＣＲ産物にはコード配列の９１３番目の塩基対が本来大腸菌Ｋ−１２ ＭＧ１６５５のｇｌｐＫ遺伝子が持っていたグアニンがアデノシンに転化されているｇｌｐＫ２２遺伝子が含まれているが、本遺伝子から発現するグリセロールキナーゼ（glycerol kinase）は変異前のｇｌｐＫに比べてＦＢＰとＩＩＡによるアロステリック阻害を相対的に少なく受けることが知られている（Pettigrew et al., J. Bacteriol., 178:2846, 1996）。
配列番号１１：５'-ＡＣＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＣＴＴ
配列番号１２：５'-ＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＡ
配列番号１３：５'-ＴＴＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧ
配列番号１４：５'-ＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＣＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＣ
配列番号１５：５'-ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧ
配列番号１６：５'-ＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＴ
このように得られたＰＣＲ産物をｐＭＥ１８（Jang et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:5411, 2007）にＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位にクローニングして、ｐＭＥ１８ｇｌｐＫ２２ベクターを完成した。また、下記配列番号１７〜２１のプライマーを利用して、ソルゼンント（Solgent, Korea）にシーケンシングを依頼して塩基配列の一致の有無を確認した。
配列番号１７：５'-ＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴ
配列番号１８：５'-ＡＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ
配列番号１９：５'-ＣＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＴ
配列番号２０：５'-ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＣＣ
配列番号２１：５'-ＴＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＴＡＧＴＣＣＣ
配列番号１７：５'-ＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴ
配列番号１８：５'-ＡＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ
配列番号１９：５'-ＣＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＴ
配列番号２０：５'-ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＣＣ
配列番号２１：５'-ＴＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＴＡＧＴＣＣＣ
前記のように作製されたｐＭＥ１８ｇｌｐＫ２２をＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に導入することで、最終的にＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）菌株を完成した。本発現ベクター導入のためには、実施例２に記載の細胞濃縮懸濁液製造方法と、エレクトロポレーション（electroporation）方法と同様に行い、抗生剤クロラムフェニコールの代わりにアンピシリン２５μｇ／ｍＬを含有するＢＨＩ固体培地に塗抹して、３９℃静置培養器で４８時間以上培養した。純粋コロニーからＢＨＩ液体培地で８時間培養した後、最終濃度が１５％（ｗ／ｖ）となるようにグリセロール溶液を混合した後、−８０℃に使用時まで保管した。
実施例４：Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ菌株及びＰＡＬＫＧ菌株を利用した単一コハク酸産生
前記実施例２及び３で作製されたＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）、またはＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）菌株を１０ｇ／Ｌスクロースを含んだ１０ｍＬのＭＨ５培地（リットル当り、２．５ｇ酵母エキス（yeast extract）、２．５ｇポリペプトン（polypeptone）、１ｇのＮａＣｌ、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、８．７ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０．０ｇのＮａＨＣＯ３）に播種して嫌気条件下３９℃で８時間培養した後、これをまた同じ培地３００ｍＬに移して培養した。発酵は、前記培養液を２．５Ｌの合成培地（リットル当り、１ｇのＮａＣｌ、２ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、８．７０９ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇシステイン（cysteine）、０．５ｇメチオニン（methionine）、０．５ｇアラニン（alanine）、０．５ｇアスパラギン（asparagine）、０．５ｇアスパラギン酸（aspartic acid）、２．４６ｇプロリン（proline）、０．５ｇセリン（serine）、０．００５ｇニコチン酸（nicotinic acid）、０．００５ｇＣａ−パントセネート（Ca-pantothenate）、０．００５ｇピリドキシンＨＣｌ（pyridoxine・HCl）、０．００５ｇチアミン（thiamine）、０．００５ｇアスコルビン酸（ascorbic acid）及び０．００５ｇビオチン（biotin））を含有した微バイオリアクター（Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA）に播種して行い、発酵条件は、２２．２５ｇ／Ｌ（６５ｍＭ）初期スクロース濃度、４．６ｇ／Ｌ（５０ｍＭ）初期グリセロール濃度で、温度３９℃ ２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍ（二酸化炭素体積／培養器内稼動体積（working volume）／分）速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中ｐＨはアンモニア水を用いて６.５に調整し、抗生剤は、ＰＡＬＫの場合、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ、ＰＡＬＦＫの場合、クロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬ、ＰＡＬＫＧの場合、アンピシリン２５μｇ／ｍＬを各々添加した。高濃度のコハク酸産生のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時７００ｇ／Ｌのスクロース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。前記と同様の方法でコハク酸産生用変異菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＰＡＬＦＫ菌株の性能と比較のために培養した。培養液内の細胞濃度は、分光光度計を利用して測定し、予め測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検証線を利用して細胞濃度を計算した。発酵過程中バイオリアクターから周期的にサンプルを採取し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、スクロース及びグリセロール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
前記実施例２及び３で作製されたＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）、またはＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）菌株を１０ｇ／Ｌスクロースを含んだ１０ｍＬのＭＨ５培地（リットル当り、２．５ｇ酵母エキス（yeast extract）、２．５ｇポリペプトン（polypeptone）、１ｇのＮａＣｌ、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、８．７ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０．０ｇのＮａＨＣＯ３）に播種して嫌気条件下３９℃で８時間培養した後、これをまた同じ培地３００ｍＬに移して培養した。発酵は、前記培養液を２．５Ｌの合成培地（リットル当り、１ｇのＮａＣｌ、２ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、８．７０９ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇシステイン（cysteine）、０．５ｇメチオニン（methionine）、０．５ｇアラニン（alanine）、０．５ｇアスパラギン（asparagine）、０．５ｇアスパラギン酸（aspartic acid）、２．４６ｇプロリン（proline）、０．５ｇセリン（serine）、０．００５ｇニコチン酸（nicotinic acid）、０．００５ｇＣａ−パントセネート（Ca-pantothenate）、０．００５ｇピリドキシンＨＣｌ（pyridoxine・HCl）、０．００５ｇチアミン（thiamine）、０．００５ｇアスコルビン酸（ascorbic acid）及び０．００５ｇビオチン（biotin））を含有した微バイオリアクター（Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA）に播種して行い、発酵条件は、２２．２５ｇ／Ｌ（６５ｍＭ）初期スクロース濃度、４．６ｇ／Ｌ（５０ｍＭ）初期グリセロール濃度で、温度３９℃ ２００ｒｐｍ条件で０．２ｖｖｍ（二酸化炭素体積／培養器内稼動体積（working volume）／分）速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中ｐＨはアンモニア水を用いて６.５に調整し、抗生剤は、ＰＡＬＫの場合、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ、ＰＡＬＦＫの場合、クロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬ、ＰＡＬＫＧの場合、アンピシリン２５μｇ／ｍＬを各々添加した。高濃度のコハク酸産生のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時７００ｇ／Ｌのスクロース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。前記と同様の方法でコハク酸産生用変異菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）をＰＡＬＦＫ菌株の性能と比較のために培養した。培養液内の細胞濃度は、分光光度計を利用して測定し、予め測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検証線を利用して細胞濃度を計算した。発酵過程中バイオリアクターから周期的にサンプルを採取し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、スクロース及びグリセロール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
その結果、図２及び表１に示した通り、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）は、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）菌株と比較すると、より優れたコハク酸産生収率を示し、副産物を全く産生することなく、純粋にコハク酸だけを産生することが分かる。また、コハク酸と還元された程度が同じグリセロールの使用量が７倍程増え、これはグリセロールの摂取時に、スクロースを用いた時とは異なり、副産物産生と直接関わるピルビン酸産生が媒介されないことで、相対的に少ない副産物の産生となる。また、増えたグリセロール摂取量は、相対的に少ない量のスクロースを使用させることで、少ない量の炭素源で単一コハク酸だけを産生することで、より高いコハク酸産生収率（yield）を示す。
また、Ｍ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫＧ（ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ）の場合には、ＰＡＬＦＫ菌株とは若干異なるパターンを示すが、それはスクロース利用能と細胞成長を阻害しない範囲内でグリセロール利用を増加させることで、ピルビン酸蓄積がＰＡＬＫ水準に維持される点である。それにもかかわらずＰＡＬＫ菌株と比較して２倍以上高いグリセロール利用能を示し、結果的に１．３９ｍｏｌ／ｍｏｌの収率でコハク酸を産生して、ＰＡＬＫの１．２４ｍｏｌ／ｍｏｌより高いコハク酸産生収率（yield）を示す。
実施例５：高収率単一コハク酸産生菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ菌株を利用した生産性向上
本実施例では高収率単一コハク酸産生菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫの生産性向上方法を確認した。
本実施例では高収率単一コハク酸産生菌株であるＭ．サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫの生産性向上方法を確認した。
図２のＢから分かるように、ＰＡＬＦＫ菌株は播種してから１３〜１５時間後、最大生産性に到達しており、この時の細胞濃度が最も高いことが分かる。従って、生産性を最大化させるために、現在水準より細胞濃度をより高めた時、生産性の変化を先に調べた。
実施例４と同様の培養条件で、ＰＡＬＦＫ初期細胞濃度をＯＤ６００＝９．０３水準に高めた時、コハク酸生産性の変化を調べようと、実施例４と同様にＭＨ５培地に２２．２５ｇ／Ｌスクロースと１０ｇ／Ｌグリセロールを含んだ５Ｌ培地条件で、微生物培養器（Ｂｉｏｆｌｏ ３０００）で温度３９℃、２００ｒｐｍの条件で、０．２ｖｖｍ（二酸化炭素体積／培養器内稼動体積（working volume）／分）の速度で純粋な二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中ｐＨは、アンモニア水を用いて６．５に調整し、抗生剤はクロラムフェニコール６．８μｇ／ｍＬを添加した。ＰＡＬＦＫを発酵させて、細胞濃度がＯＤ６００値が４．６近くなった時、培養を終了し、培養液を常温で６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することで、細胞ペレットを取得した。取得した細胞ペレットを再びＭＨ５培地３００ｍＬに再懸濁させて、高濃度の接種材料が得られた。これを播種し、実施例４の条件で合成培地で培養した結果、図３及び表２に示したように、コハク酸生産性が６．０３ｇ／Ｌ／ｈ（最大区間生産性１０．６９ｇ／Ｌ／ｈ）となり、本来発酵条件に比べて２倍以上増加したことが分かり、副産物生成程度と収率が略類似することが分かった。
従って、このような結果を基に、細胞濃度を人為的により増加させるために、メンブラン細胞リサイクリングバイオリアクター（ＭＣＲＢ）システムを用いた（図４のＡ）。
ＭＣＲＢシステムは、細胞循環のために中空繊維膜ユニット（hollow fiber membrane unit）（CellFlo Plus Module; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA）をＢｉｏｆｌｏ １１０リアクター（New Brunswick Scientific Co.）に連結して用いて、この時ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ（稼動体積）は、０．４Ｌに維持させた。培養器内の撹拌速度は、１００ｒｐｍに維持させ、細胞再循環のための隔膜（diaphragm）ポンプの速度は、１５０ｍＬ／ｍｉｎに維持させた。
合成培地組成は、プロリンのみが０．５ｇ／Ｌ添加されたことを除いて実施例４と同様であった。培養器内の初期スクロース濃度は、２２．２５ｇ／Ｌ、及び初期グリセロール濃度は、４．６ｇ／Ｌであり、供給タンク（feed tank）内では、３０ｇ／Ｌスクロースと２１ｇ／Ｌグリセロールが用いられた。ＭＣＲＢ操業のための希釈速度（dilution rate、Ｄ）は、１．０２７ｈ−１に維持され、正常状態での成長を決めるｃｅｌｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ速度は、０．０１５ｈ−１に維持された。ＭＣＲＢ操業で正常状態は最小ターンオーバ（turnover）時間（希釈速度に応じて培養が進められた時、操業体積を１回満たすのにかかる時間を意味、Ｄ＝１、または２なら操業体積を満たすには１ｈ及び０．２ｈかかる）以上の間隔で５回以上試料を分析して、細胞濃度、代謝産物の生成程度、炭素源の消費量等を測定し、これらが一定に維持された時と決めた。
これにより、ＭＣＲＢ培養を進めた結果、図４のＢ及び表２に示したように、生産性が母菌株の１０倍以上（２９．７３ｇ／Ｌ／ｈ）に増加した。また、コハク酸産生収率は、そのまま維持され、副産物の程度も実施例４の場合よりは若干高いが、低い水準を維持することが分かった。結論的に本実施例で示したように、産生収率及び副産物減少程度を最大化した後に、生産性を高める戦略で理論収率に近い高効率（１．５４ｍｏｌ／ｍｏｌ）でコハク酸を超高生産性で２９．７３ｇ／Ｌ／ｈの産生に成功した。本実施例で提示したコハク酸生産性は、以前にあらゆる方法でも達成されたことのない超高生産性であり、さらに１．５４ｍｏｌ／ｍｏｌの理論値に近い収率を達成すると共になされた点からその意義がより大きい。
受託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ
受託日時：２０１００５１０
受託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ
受託日時：２０１００５１０
受託番号：ＫＣＴＣ１１６９３ＢＰ
受託日時：２０１００５１０
受託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ
受託日時：２０１００５１０
以上、説明しように、本発明に係るコハク酸生成変異微生物を培養すると、スクロースとグリセロールとを同時に利用して、コハク酸産生において従来の発酵収率を理論収率に近く最大化して、副産物を最小化しながら高い生産性でコハク酸を産生することができる。また、本発明によると、従来に産生収率が低かった種々の還元化学物質（reduced chemical）をより効果的に産生することができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
Claims (7)
- コハク酸生成微生物から、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を嫌気的条件で培養し、グリセロールとスクロースとを同時に摂取してコハク酸を生産する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法。
- 副産物として、他の有機酸の生成量は、コハク酸生成重量の１％以下であることを特徴とする請求項１に記載のコハク酸の製造方法。
- 前記コハク酸生成微生物は、ルーメンバクテリアであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア属（Mannheimia sp.）、アクチノバチルス属（Actinobacillus sp.）及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum sp.）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 前記マンヘミア属菌株は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 前記変異微生物は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンスＰＡＬＦＫ（ＫＣＴＣ１１６９４ＢＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 下記段階を含むコハク酸の製造方法:
（ａ）コハク酸生成微生物から、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を嫌気的条件で培養し、グリセロールとスクロースとを同時に摂取してコハク酸を生産する段階；
（ｂ）前記培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる段階；
（ｃ）前記高濃度の細胞を培養する段階；及び
（ｄ）前記培養液からコハク酸を回収する段階。
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