JP4672671B2 - 新規ルーメンバクテリア変異菌株及びそれを用いたコハク酸の製造方法 - Google Patents
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Description
ldhAを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Mannheimia succiniciproducens 55E(KCTC 0769BP)のゲノムDNAを鋳型とし、下記配列番号1及び2のプライマーを用いてPCRを行った後、得られたPCR断片をSacI及びPstIで切断し、これをpUC18(New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.)に導入してpUC18−L1を作製した。
配列番号1:5’−CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG(LS1)
配列番号2:5’−CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA(LP1)
配列番号3:5’−GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC(LP2)
配列番号4:5’−GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG(LH2)
配列番号5:5’−TCTAGAAGCT
配列番号6:5’−GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG(SXF)
配列番号7:5’−GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC(SXR)
pflを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。sacB遺伝子(Genbank 02730)を含有したpKmobsacBを鋳型とし、下記配列番号8及び9のプライマーを用いてPCRを行った後、得られたsacB産物をPstI及びBamHIで切断し、これをpUC19(Stratagene Cloning Systems.LaJolla,Calif.)に導入してpUC19−sacBを作製した。
配列番号8:5’−AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG(SBG)
配列番号9:5’−GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC(SPR)
配列番号10:5’−CATGGCGGATCCAGGTACGCTGATTTCGAT(PB1)
配列番号11:5’−CAAGGATCCAACGGATAAAGCTTTTATTAT(PB2)
配列番号12:5’−CTCGAGCCCGGGGTTTAAGGGCACCAATAA(CTR)
配列番号13:5’−CTCGAGCCCCGGGCTTTGCGCCGAATAAAT(CTF)
図3は、Mannheimia succiniciproducens 55Eにおいて、ldhA及びpflを欠失させて変異株(LPK)を作製する過程を示す図である。Mannheimia succiniciproducens 55Eを10g/lのグルコースを含有するLB(Luria−Bertani)−グルコース培地に塗抹して、37℃で36時間培養した後、コロニーをLB−グルコース液体培地10mLに接種して12時間培養した。充分に成長した培養液をLB−グルコース液体培地100mLに1%接種して、200rpm、37℃の振盪培養器で培養した。
配列番号14:5’−GACGTTTCCCGTTGAATATGGC(KM1)
配列番号15:5’−CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC(LU1)
配列番号16:5’−GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)
配列番号17:5’−CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LD2)
配列番号18:5’−GGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT(CM1)
配列番号19:5’−CTTTGCAACATTATGGTATGTATTGCCG(PU1)
配列番号20:5’−TACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAA(CM2)
配列番号21:5’−CCCCAGCATGTGCAAATCTTCGTCAC(PD2)
前記実施例3で作製されたMannheimia sp.LPKの発酵特性を調べるために、CO2で飽和された嫌気的な条件で培養し、これから生産される反応産物を分析した。まず、20g/Lのブドウ糖、5g/Lのポリペプトン、5g/Lの酵母抽出物、3g/LのK2HPO4、1g/LのNaCl、1g/Lの(NH4)2SO4、0.2g/LのCaCl2・2H2O、0.2g/LのMgCl2・6H2O及び10g/LのMgCO3からなる前培養培地100mLに炭酸ガスを注入した後、Mannheimia sp.LPKを接種し、39℃で14時間前培養を行った。次いで、20g/Lのブドウ糖、5g/Lのポリペプトン、5g/Lの酵母抽出物、3g/LのK2HPO4、1g/LのNaCl、5g/Lの(NH4)2SO4、0.2g/LのCaCl2・2H2O、0.2g/LのMgCl2・6H2O及び5g/LのNa2CO3からなる本培養培地0.9Lを2.5Lの培養槽に入れ、100mLの前培養された微生物を接種した後、39℃でpH6.5の条件下で、炭酸ガスを0.25vvmの流速で供給しつつ回分培養を行った。
pta及びackAを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)のゲノムDNAを鋳型とし、下記配列番号22及び23のプライマーを用いてPCRを行った後、得られたPCR断片をXbaI及びBamHIで切断し、これをpUC19に導入してpUC19−PTA1を作製した。
配列番号22:5’−GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
配列番号23:5’−TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
配列番号24:5’−GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTTCC
配列番号25:5’−GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
配列番号26:5’−GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
配列番号27:5’−CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC
ppcを相同組換え方法で破壊するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Mannheimia sp.LPKのゲノムDNAを鋳型とし、下記配列番号28及び29のプライマーを用いてPCRを行った後、得られたPCR断片をXbaI及びBamHIで切断し、これをpUC19に導入してpUC19−PPC1を作製した。
配列番号28:5’−TACGGATCCCCAGAAAATCGCCCCCATGCCGA
配列番号29:5’−GCTCTAGATATCGTTTGATATTGTTCCGCCACATTTG
配列番号30:5’−GCTCTAGATATCCGTCAGGAAAGCACCCGCCATAGC
配列番号31:5’−GGGGAGCTCGTGTGGCGCTGCGGAAGTAAGGCAAAAATC
図8及び図9は、Mannheimia sp.LPKでpta−ackA及びppcをそれぞれ欠失させて変異株、LPK7及びLPK4を作製する過程を示す図である。Mannheimia sp.LPKを、10g/lのグルコースを含有したLB−グルコース培地に塗抹して、37℃で36時間培養した後、コロニーをLB−グルコース液体培地10mLに接種して12時間培養した。充分に成長した培養液をLB−グルコース液体培地100mLに1%接種して、37℃の振盪培養器で培養した。
配列番号32:5’−CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC
配列番号33:5’−GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC
配列番号34:5’−GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG
配列番号35:5’−GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG
配列番号36:5’−GATCCAGGGAATGGCACGCAGGCTTTCAACGCCGCC
配列番号37:5’−GCAAAGCCAGAGGAATGGATGCCATTAACCAATAGCG
前記実施例7で作製されたMannheimia sp.LPK7及びLPK4の発酵特性を調べるために、CO2で飽和された嫌気的な条件で培養し、これから生産される反応産物を分析した。まず、実施例4に記載の前培養培地200mLに炭酸ガスを注入した後、Mannheimia sp.LPK7及びLPK4をそれぞれ接種し、39℃で24時間前培養を行った。次いで、本培養培地(ブドウ糖濃度が18g/L(最終100mM)であることを除いては、実施例4と同じである)1.8Lを6.6Lの培養槽に入れ、100mLの前培養された微生物を接種した後、39℃でpH6.5の条件下で、炭酸ガスを0.25vvmの流速で供給しつつ回分式培養を行った。
Claims (26)
- 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子(以下、「ldhA」という)及びピルビン酸−蟻酸の分解酵素をコードする遺伝子(以下、「pfl」という)が欠失されており、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するマンヘミア属のルーメンバクテリア変異菌株。
- ldhA、pfl、ホスホトランスアセチル化酵素遺伝子(以下、「pta」という)及び酢酸キナーゼ遺伝子(以下、「ackA」という)が欠失されており、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するマンヘミア属のルーメンバクテリア変異菌株。
- ldhA、pfl及びホスホピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(以下、「ppc」という)が欠失されており、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するマンヘミア属のルーメンバクテリア変異菌株。
- 前記ルーメンバクテリアが同型発酵菌株であることを特徴とする請求項1〜請求項3の何れか一項に記載のルーメンバクテリア変異菌株。
- 前記ルーメンバクテリア変異菌株が、Mannheimia sp.LPK(受託番号KCTC10558BP)であることを特徴とする請求項1記載の変異菌株。
- 前記ルーメンバクテリア変異菌株が、Mannheimia sp.LPK7(受託番号KCTC 10626BP)であることを特徴とする請求項2記載の変異菌株。
- マンヘミア属のルーメンバクテリアからldhA及びpflを欠失させることを含む、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
- ldhA及びpflが欠失されているマンヘミア属のルーメンバクテリアからpta及びackAを更に欠失させることを含む、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
- ldhA及びpflが欠失されているマンヘミア属のルーメンバクテリアからppcを追加で欠失させることを特徴とする、CO2を含む嫌気的な条件で、コハク酸を生成する特性を有するルーメンバクテリア変異菌株の製造方法。
- 前記ldhA及びpflが欠失されているルーメンバクテリアが、Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)であることを特徴とする請求項8または請求項9記載の方法。
- 前記ldhA及びpflの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 前記相同組換えは、欠失されたldhAを含む遺伝子交換ベクター及び欠失されたpflを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 前記欠失されたldhAを含む遺伝子交換ベクターが、配列番号1及び2のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物;配列番号3及び4のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物;及びsacBをこの順序で含むpUC18ベクターであって、カナマイシン抵抗遺伝子が、配列番号1及び2のプライマーを用いたPCR産物及び配列番号3及び4のプライマーを用いたPCR産物の両方の融合核酸にPstIの制限酵素サイトで挿入されており、前記欠失されたpflを含む遺伝子交換ベクターは、sacB;及び配列番号10及び11のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物をこの順序で含むpUC19ベクターであって、クロラムフェニコール耐性遺伝子が配列番号10及び11のプライマーを用いたPCR産物にBst1107Iの制限酵素サイトで挿入されていることを特徴とする請求項12記載の方法。
- 前記pta及びackAの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項8記載の方法。
- 前記相同組換えは、欠失されたpta及びackAを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項14記載の方法。
- 前記欠失されたpta及びackAを含む遺伝子交換ベクターは、配列番号22及び23のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;配列番号24及び25のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;及びsacBをこの順序で含むpUC19ベクターであって、スペクチノマイシン遺伝子が、配列番号22及び23のプライマーを用いたPCR産物及び配列番号24及び25のプライマーを用いたPCR産物の両方の融合核酸にEcoRVの制限酵素サイトで挿入されていることを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記ppcの欠失は、相同組換えにより行われることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 前記相同組換えは、欠失されたppcを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項17記載の方法。
- 前記欠失されたppcを含む遺伝子交換ベクターは、配列番号28及び29のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;スペクチノマイシン耐性遺伝子;及び配列番号30及び31のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物をこの順序で含むpUC19ベクターであることを特徴とする請求項18記載の方法。
- 配列番号1及び2のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物;配列番号3及び4のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物;及びsacBをこの順序で含むpUC18ベクターであって、カナマイシン抵抗遺伝子が、配列番号1及び2のプライマーを用いたPCR産物及び配列番号3及び4のプライマーを用いたPCR産物の両方の融合核酸にPstIの制限酵素サイトで挿入されている遺伝子交換ベクター。
- sacB;及び配列番号10及び11のプライマーを用いたMannheimia succiniciproducens 55E(受託番号KCTC 0769BP)由来のPCR産物をこの順序で含むpUC19ベクターであって、クロラムフェニコール耐性遺伝子が配列番号10及び11のプライマーを用いたPCR産物にBst1107Iの制限酵素サイトで挿入されている欠失されたpflを含む遺伝子交換ベクター。
- 配列番号22及び23のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;配列番号24及び25のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;及びsacBをこの順序で含むpUC19ベクターであって、スペクチノマイシン遺伝子が、配列番号22及び23のプライマーを用いたPCR産物及び配列番号24及び25のプライマーを用いたPCR産物の両方の融合核酸にEcoRVの制限酵素サイトで挿入されている遺伝子交換ベクター。
- 配列番号28及び29のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物;スペクチノマイシン耐性遺伝子;及び配列番号30及び31のプライマーを用いたMannheimia sp.LPK(受託番号KCTC 10558BP)由来のPCR産物をこの順序で含むpUC19ベクターである、遺伝子交換ベクター。
- 請求項1〜3の何れか一項のルーメンバクテリア変異菌株をCO2を含む嫌気的な条件で培養する段階;及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法。
- 前記培養は、コハク酸のみを生成する同型発酵であることを特徴とする請求項24に記載のコハク酸の製造方法。
- 前記ルーメンバクテリア変異菌株は Mannheimia sp.LPK(受託番号KCTC10558BP)、又はLPK7(受託番号KCTC 10626BP)であることを特徴とする請求項24記載のコハク酸の製造方法。
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