RU2631922C1 - Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) - Google Patents
Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2631922C1 RU2631922C1 RU2016147378A RU2016147378A RU2631922C1 RU 2631922 C1 RU2631922 C1 RU 2631922C1 RU 2016147378 A RU2016147378 A RU 2016147378A RU 2016147378 A RU2016147378 A RU 2016147378A RU 2631922 C1 RU2631922 C1 RU 2631922C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yarrowia lipolytica
- strain
- vkpm
- cultivation
- succinic acid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к микробиологической промышленности. Заявлены штамм дрожжей Yarrowia lipolytica Y-3753ch и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica Y4215Leu+, обладающие способностью продуцировать янтарную кислоту. Штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационными номерами ВКПМ Y-4215 и ВКПМ Y-4297 соответственно. Заявленные штаммы могут быть использованы для получения чистой янтарной кислоты. Изобретение позволяет получить чистую янтарную кислоту. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новых штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica, используемых для получения чистой янтарной кислоты (ЯК).
Традиционно для получения ЯК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов янтарной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH, что приводит к необходимости добавления щелочи в процессе культивирования. В результате образуются соли янтарной кислоты. Для дальнейшего выделения и очистки янтарной кислоты необходимо использовать сильную минеральную кислоту, что негативно сказывается на экологичности процесса, ведет к образованию дополнительных отходов и, как следствие, к повышению стоимости производства янтарной кислоты.
В связи с этим особый интерес для создания продуцентов янтарной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH.
Перспективным объектом для производства янтарной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности.
Среди дрожжей известны различные продуценты янтарной кислоты, отличающиеся как по уровню накопления продукта, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.
Штамм дрожжей Issatchenkia orientalis 257 [WO 2014018757] выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода глюкозы (12,0 об. %). Культивирование осуществляют в колбах в течение 96 часов с добавлением мела. При этом янтарная кислота накапливалась до 89 г/л при средней скорости биосинтеза 0,93 г/л*ч и конверсии около 78% (г/г). Недостатком данного процесса является необходимость культивирования на среде с мелом.
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae SUC-297 [WO 2011064151] при культивировании в ферментере объемом 1,0 м3 с минеральной средой и глюкозой в качестве источника углерода накапливает за 95 часов 43 г/л янтарной кислоты, при этом образуются вторичные продукты: 16,4 г/л этанола и 14,9 г/л глицерина. Недостатком данного процесса является низкая конверсия за счет образования вторичных продуктов.
Известен штамм дрожжей Yarrowia lipolytica PGC01003 [Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 179], который при культивировании в ферментере на минеральной среде в периодическом режиме с подпиткой и при поддержании pH на уровне 6,0, используя в качестве источника углерода глицерин, производит 160,2 г/л янтарной кислоты, при конверсии 40% (г/г). Недостатком данного штамма является необходимость поддерживать значение рН=6,0 на протяжении всего процесса ферментации.
В работе (RU 2487931) для получения янтарной кислоты предложено использовать штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753. При культивировании штамма в лабораторном ферментере в периодическом режиме с подпиткой на минеральной среде без использования титрующих агентов он за 54 часа накапливает 42 г/л янтарной кислоты с конверсией 39%, конечное pH равно 2,9 [Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113 (11), 2425-2432]. Штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3753 является ауксотрофом по лейцину.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала микроорганизмов, продуцирующих янтарную кислоту без использования веществ, стабилизирующих pH.
Задача решена путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 продуцента янтарной кислоты.
Заявляемый штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 получен из коллекционного штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 путем автоселекции. Штамм ВКПМ У-3753 культивировали в ферментере в хемостатном режиме в течение 840 часов, несколько раз дискретно увеличивая скорость протока и снижая pH. Отбор нового штамма производился в конце ферментации по размеру колоний после высева образца культуральной жидкости на агаризованную среду.
Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4215.
Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 также как штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 является ауксотрофом по лейцину, но имеет более высокие показатели по продукции и конверсии.
Задача решена также путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 продуцента янтарной кислоты.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 получен из штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 путем восстановления прототрофности по лейцину.
Для этого штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 трансформировали линейным фрагментом ДНК с геном LEU2, комплементирующим делению размером 681 п.о. в мутантной аллели leu2-270.
Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти и продуцировать янтарную кислоту на минеральной среде с глюкозой без добавления лейцина и применения титрующих агентов.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.
В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.
На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%), фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) и лейцина (0,002%) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину, лейцину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C.
Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.
В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.
На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%) и фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C. Оптимальное pH 5,5, способен к росту в кислой среде (до pH 3).
Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.
Изобретение подтверждено следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215.
Посевной материал получают, высевая культуру, хранящуюся в 10% глицерине при -70°C, на среду, содержащую (мас. %): глицерин - 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0; пептон - 1,0; карбонат кальция - 1,0; агар - 2,0; вода - остальное. Выращивают в течение 2 суток и для засева одной пробирки используют полную петлю посевного материала.
Культивируют штамм в пробирках при температуре 30°C при 250 об/мин в 10 мл минеральной питательной среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 2,5; Na2HPO4⋅12H2O - 0,6; KH2РО4 - 0,071; NH4Cl - 1,177; (NH4)2SO4 - 0,065; MgSO4⋅7H2O - 0,065; CaCl2 -0,0011; Лимонная кислота - 0,18; Биотин (витамин B7) - 0,00002; Тиамин (витамин B1) - 0,0001; L-Лейцин - 0,5; раствор микроэлементов - 0,46 (состав в мас. %: CuSO4⋅5H2O - 0,6; KJ - 0,0088; MnSO4⋅5H2O - 0,3; H3ВO4 - 0,02; CoCl3⋅6H2O - 0,0955; ZnSO4⋅7H2O - 4,2; FeSO4⋅7H2O - 6,5; H2SO4конц. - 0,5), вода - остальное. Значение pH среды доводят до уровня 7,1 путем внесения 25%-ного раствора NH4OH. Время выращивания - 48 часов, для засева одной колбы используют 10 мл культуральной жидкости.
Культивирование в колбах осуществляют в среде и условиях, описанных выше. Рабочий объем 100 мл. Время выращивания - 24 часа. Для засева в посевной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.
В посевном ферментере штамм культивируют в периодическом режиме с рабочим объемом 1000 мл, в среде такого же состава, но с концентрацией глюкозы 100 г/л при температуре 30°C и скорости вращения мешалки 700 об/мин. Аэрацию осуществляют воздухом с расходом 1 л/мин. Значение pH поддерживают в течение всего процесса культивирования на уровне 5,5 добавлением 25%-го раствора NH4OH. Время выращивания - 56 часов. Для засева в основной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.
В основном ферментере культивирование штамма осуществляют как в посевном ферментере, но в периодическом режиме с подпиткой. Начальная концентрация глюкозы в среде - 50 г/л. Подпитка осуществляется на 12, 18, 24, 30 и 36-й час культивирования по 40 мл раствора глюкозы, концентрацией 700 г/л. Процесс культивирования проходит без использования титрующих агентов. Время культивирования - 60 часов.
Концентрацию янтарной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ с использованием системы Waters HPLC (Waters, США), колонки с обратной фазой ReproSil-Pur C18-AQ (4 mm×250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Германия) по методу, описанному в (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. 107 (4): 673-682). Остаточную концентрацию глюкозы определяют спектрофотометрически глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Диаком Глюкоза» (Диаком-ВНЦМДЛ, Россия) согласно инструкции производителя.
По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 50 г/л, конверсия по глюкозе 40%, конечное значение pH 2,8.
Пример 2. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297.
Культивирование штамма Y-4297 осуществляют по примеру 1, но в среду не добавляют лейцин, культивирование в посевном ферментере первые 16 часов проходит без аэрации, далее аэрацию осуществляют воздухом с расходом 0,25 л/мин.
Время культивирования в основном ферментере - 53 часа.
По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 49 г/л, конверсия по глюкозе 43%, конечное значение pH 2,4.
Полученный штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти на среде без L-лейцина, что имеет преимущество с экономической точки зрения.
Таким образом, получены перспективные для использования в промышленности, высокопродуктивные штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющие производить янтарную кислоту без добавления титрующих агентов.
Claims (2)
1. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 - продуцент янтарной кислоты.
2. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4297 - продуцент янтарной кислоты.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147378A RU2631922C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147378A RU2631922C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2631922C1 true RU2631922C1 (ru) | 2017-09-28 |
Family
ID=60040539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147378A RU2631922C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2631922C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757603C1 (ru) * | 2021-02-26 | 2021-10-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий изолимонную кислоту |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376369C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2009-12-20 | Корея Эдванст Инститьют Оф Сайенс Энд Текнолоджи | МУТАНТ БАКТЕРИИ РУБЦА РОДА Mannheimia (ВАРИАНТЫ) - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ |
| RU2422526C2 (ru) * | 2009-01-30 | 2011-06-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Yarrowia |
| RU2487931C1 (ru) * | 2012-07-05 | 2013-07-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753 - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ |
| RU2528056C2 (ru) * | 2012-10-19 | 2014-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА |
-
2016
- 2016-12-02 RU RU2016147378A patent/RU2631922C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376369C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2009-12-20 | Корея Эдванст Инститьют Оф Сайенс Энд Текнолоджи | МУТАНТ БАКТЕРИИ РУБЦА РОДА Mannheimia (ВАРИАНТЫ) - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ |
| RU2422526C2 (ru) * | 2009-01-30 | 2011-06-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Yarrowia |
| RU2487931C1 (ru) * | 2012-07-05 | 2013-07-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753 - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ |
| RU2528056C2 (ru) * | 2012-10-19 | 2014-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757603C1 (ru) * | 2021-02-26 | 2021-10-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий изолимонную кислоту |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100086979A1 (en) | Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media | |
| DK165124B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af en 5-hydroxy-s541-macrolidforbindelse | |
| RU2631922C1 (ru) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) | |
| CN1067725C (zh) | 一种利用微生物发酵生产α、ω－长链二元酸的方法 | |
| Wojtanowicz et al. | Effect of inoculum onkinetics and yield of citric acid production on glucose by Yarrowia lipolytica A-101 | |
| CZ285721B6 (cs) | Kmen mikroorganismu Penicillium oxalicum var. Armeniaca a jeho použití | |
| JP6524114B2 (ja) | アウレオバシジウム プルランス（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株からラクトンを生成する方法 | |
| CN105385608A (zh) | 一种香菇液体菌种深层发酵工艺 | |
| RU2487931C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753 - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ | |
| CN105189769A (zh) | 从腐霉属物种生产ω-3脂肪酸 | |
| RU2560584C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИИ Bacillus stratosphericus, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ ЭТАНОЛ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ | |
| US20180265903A1 (en) | Process for the production of malate | |
| RU2096461C1 (ru) | Штамм дрожжей yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты | |
| RU2140980C1 (ru) | Штамм гриба mortierella alpina peyronel бс-2 для производства полиненасыщенных высших жирных кислот и их производных | |
| RU2747583C1 (ru) | Способ получения (2r, 3s)-изолимонной кислоты из подсолнечного масла с помощью дрожжей yarrowia lipolytica | |
| CN109504646A (zh) | 一种获得高dha含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐 | |
| CN1108377C (zh) | 由深红酵母菌培养产生l－苯丙氨酸解氨酶的培养方法 | |
| CN110982716B (zh) | 用于生产天然酪醇的菌株及天然酪醇的制备方法 | |
| CN116286513B (zh) | 一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| RU2676144C1 (ru) | Способ получения инвертазы и лимонной кислоты | |
| CN115948258B (zh) | 产pefa的沼泽红酵母xy11菌株及其应用 | |
| JP2009148212A (ja) | マンニトールの発酵製造方法及びその実施に用いる微生物 | |
| RU2103346C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты | |
| CN115637233A (zh) | 一种高产十碳二元酸的菌株及发酵方法 | |
| CN1854306A (zh) | 发酵生产重组人血清白蛋白hsa的方法 |