CN115637233A - 一种高产十碳二元酸的菌株及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种维斯假丝酵母菌株，及利用该菌株发酵生产十碳二元酸的方法。所述菌株为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)，保藏编号为CCTCC M 2021824。本产品涉及一种利用维斯假丝酵母生物法生产十碳二元酸的方法，使发酵过程中发酵底物的含量维持在稳定的水平，提高发酵产物的含量。本发明所公开的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)，提高了十碳二元酸的产能，降低了生产成本，发酵生产过程易于大规模工业化生产。

Description

一种高产十碳二元酸的菌株及发酵方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菌株，特别涉及一种生产十碳二元酸的维斯假丝酵母菌株，及利用该菌株发酵生产十碳二元酸的方法。

背景技术

长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂、医药和农药等的重要原料，其结构式为HOOC(CH₂)_nCOOH，其中n为大于7的整数。其中，十碳二元酸或称为十碳长链二元酸、癸二酸，其化学式为HOOC(CH₂)₈COOH。十碳二元酸作为一种重要的单体原料，广泛用于生产聚酰胺工程塑料，如尼龙510、尼龙1010、尼龙610。十碳二元酸也可用于制造耐高温润滑油、环氧树脂固化剂、合成润滑脂及人造香料、耐寒增塑剂等，是应用广泛的化工原料之一。

生物法制备十碳二元酸具有生产工艺简单、绿色环保的特点。中国科学院微生物所的余志华(见《微生物学报》1989年06期：0253-2654)通过诱变筛选获得一株高产菌株，在16升发酵罐上获得十碳二元酸的产量达到71g/L以上，通过水相结晶得到了十碳二元酸产品，产品纯度99.6％以上；中科院林业土壤研究所(见《微生物学报》1979年01期)筛选得到的解脂假丝酵母发酵生产十碳二元酸的产量为30～40g/L。

在生物法制备十碳二元酸(DC10)的过程中，癸烷或其类似物常作为发酵底物，这类发酵底物在发酵过程中可能存在的转化途径包括：被菌体多步氧化成为目的产物十碳二元酸、被菌体生长维持所消耗或者挥发后进入外部环境等。癸烷等发酵底物的易挥发性质大大制约了十碳二元酸的转化率，同时烷烃成本也是发酵过程中成本占比最高的部分。因此，通过改良菌株产酸性能，降低生产成本是一个重要的研究方向。

发明内容

本发明的第一方面目的在于提供一种维斯假丝酵母菌株，以提高目前维斯假丝酵母菌株产十碳二元酸产酸浓度和转化效率，进而降低生产成本的技术问题。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。

本发明提供了一种高产十碳二元酸的菌株：新型维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAes2121，其保藏编号为CCTCC M 2021824，保藏日期是2021年7月7日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)。所述维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121除了具有亲本菌CAES2113在生产中的优质特性外，可以在pH值7.0以上以及7.0以下的发酵体系中均具有很高酶活性，还能提高十碳二元酸的产酸速率，有效降低能耗，提高效率。

本发明所提供的菌种为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)，是以一株维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113为出发菌株，通过使用LiCl诱变剂和ARTP复合诱变，筛选培育出来的。所述亲本菌CAES2113已于2020年2月24日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号：CCTCC M 2020048，分类命名为Candida viswanathii。它具备的生物学和遗传学特点参见中国发明专利CN111748480A。

本发明所提供的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121形态特征：奶油白色，菌落为表面光滑湿润呈乳白色有光泽、圆形、边缘整齐，如图1和图2所示。

本发明的第二个方面提供了所述维斯假丝酵母CAES2113的应用，即所述维斯假丝酵母CAes2121在发酵生产十碳二元酸中的应用。

在一些具体的实施方案中，所述发酵生产使用的底物包括癸烷、十碳脂肪酸、十碳脂肪酸衍生物或它们的混合物。

本发明的第三方面目的在于提出一种生物法生产长链十碳二元酸的方法所述方法包括以下步骤：

a)维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121的种子培养和发酵培养；

b)从步骤a)获得的发酵产物中提取十碳二元酸。

在一些具体的实施方案中，所述种子培养前还包括菌种活化，具体可在YPD培养基中摇床培养菌株1～2天。所述YPD培养基包括葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％(w/v)。

在一些具体的实施方案中，所述种子培养和发酵培养时的温度为28℃～33℃，优选为29～30℃。

在一些具体的实施方案中，所述种子培养和发酵培养时，使用的种子培养基和发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和/或营养因子。其中，所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种，所述碳源的添加量可以为1％～10％(w/v)；和/或，所述氮源包括酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种，所述氮源的添加量可以为0.1％～3％(w/v)；和/或，所述无机盐包括钾盐和钠盐中的一种或多种；优选地，所述钾盐包括氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述无机盐的添加量可以为0.1％～1.5％(w/v)；和/或，所述营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素、氨基酸中的一种或多种，所述营养因子的添加量可以为0～1％(w/v)。

在一些具体的实施方案中，所述种子培养时，种子培养基包括：蔗糖或葡萄糖1.0％～4.0％、玉米浆0.3～1.5％、酵母膏0.5～2.5％、尿素0.01％～0.3％及磷酸二氢钾0.4％～0.8％。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，发酵培养基包括：蔗糖或葡萄糖1.0％～4.0％、玉米浆0～1.5％、酵母膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.4％～0.8％、硝酸钾0.1～0.4％，氯化钠0.15～0.4％、硫酸铵0.5～0.8％、尿素0.05％～0.5％、维生素B2 0～0.05％。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵体系pH值为7.0以下或者7.0以上。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵体系pH值为4.0～6.8；具体的pH值示例可以为：4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵体系pH值为7.0～8.5；具体的pH值示例可以为：6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，发酵培养基中加入的底物包括正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物中的一种或多种，优选地，所述底物包括C10的正烷烃、C10的直链饱和脂肪酸、C10的直链饱和脂肪酸酯和C10的直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制底物浓度为0.5％～3％。优选将发酵底物浓度的范围控制在0.5％～1％、1％～1.5％、1.5％～2％或2％～3％中的任意一个范围内，或这些范围的端点值任意组合构成的其他浓度范围内，如0.5％和1.5％端点值构成的0.5％～1.5％的浓度范围，或，1％和2％端点值构成的1％～2％的浓度范围。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵过程的压力为0.05～0.15MPa，空气流量为0.1～0.7vvm。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵过程的压力为0.08～0.12MPa，空气流量为0.3～0.5vvm。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制溶氧在5％以上，优选为10～50％，例如20％以上、40％以上。

在一些具体的实施方案中，所述发酵培养时，控制发酵液中活细胞的浓度为8*10⁷cfu/mL～1.5*10⁹cfu/mL，更优选为2*10⁸cfu/mL～9*10⁸cfu/mL。具体可以通过控制底物的流加速度或通气量来控制活细胞的浓度。发明人发现细胞浓度较低时，发酵周期延长，会导致产酸速率低；细胞浓度较高时，DC10产量偏低。

在一些具体的实施方案中，所述提取十碳二元酸的步骤可以参考公开号为CN101985416B或CN103965035B的中国发明专利。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：筛选得到了新的维斯假丝酵母菌株CAes2121，其在pH值低于或高于7.0的环境下均可长时间保持高活力，在发酵生产十碳二元酸时控制活细胞数量、使发酵过程中发酵底物的含量维持在稳定的水平，能获得更高的DC10产量，产酸速率更快，提高了效率并节约了能耗，可用于工业化放大生产。

保藏信息

菌株：维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121

保藏日期：2021年7月7日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)

保藏编号：CCTCC M 2021824

附图说明

图1为本发明实施例2的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121的第一代的菌落形态图片。

图2为本发明实施例2的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121的第六代的菌落形态图片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，以使本发明的特征和优点更清楚，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

本发明中，所述发酵液中十碳二元酸、发酵底物含量可以采用气相色谱、液相色谱、液相色谱-质谱联用技术或气相色谱-质谱联用技术检测。细胞浓度使用哈密尔顿活细胞浓度分析仪监测。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例发酵液中DC10含量检测：用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末，将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。

如下实施例中使用的YPD培养基配方为：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％；种子培养基配方为：蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.8％，尿素0.3％；发酵培养基1配方为：蔗糖4％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.8％，硝酸钾0.4％，氯化钠0.15％，尿素0.05％；发酵培养基2配方为：蔗糖4％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.8％，硝酸钾0.4％，氯化钠0.15％，硫酸铵0.5％，尿素0.05％；发酵培养基3配方为：蔗糖4％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.8％，硝酸钾0.4％，氯化钠0.15％，硫酸铵0.5％，尿素0.05％，维生素B2 0.01％。上述培养基在使用前均在121℃灭菌20分钟。

实施例1维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121菌株的获得

以维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113菌株(于2020年2月24日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020048)为出发菌株，将出发菌株甘油管接入装有YPD培养基的摇瓶中，并在培养基中加入1mL无菌的0.5％LiCl溶液，在30℃、200rpm震荡培养20h。取生长好的培养液离心收集菌体并用生理盐水洗涤3～5次，用10％的甘油水溶液悬浮细胞，利用ARTP进行诱变，处理条件为：功率120W，气量10SLM，距离2mm，处理时间为100s，经过诱变的菌株在YPD培养基摇瓶中培养24h，培养温度29℃，处理后的菌液经过稀释后涂布平板，涂布后再YPD培养基的平板上培养72h，培养温度29℃，可培养出单克隆，经过多轮摇瓶发酵筛选获得稳定高产菌株，并命名为CAes2121，保存于甘油管中。

实施例2维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121菌株的稳定性验证

所述维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121经传代实验验证，经五次传代后菌落形态及生产十碳二元酸的能力均未出现明显变化。菌落形态：菌落表面光滑湿润呈乳白色有光泽、圆形、边缘整齐。从图1和图2可见本发明的维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAes2121的传代稳定性良好。

使用维斯假丝酵母CAes2121发酵生产十碳二元酸，具体方法如下：将前述获得的第一代和第六代菌株进行摇瓶发酵生产DC10的性能验证。取1支维斯假丝酵母CAes2121的甘油管种子(第一代和第六代各一支)接入YPD培养基中，培养24h后接种于种子培养基，在30℃条件下培养28h，测得种子液的OD₆₂₀达到了0.8(稀释30倍测定)。将种子液接种到装有发酵培养基1的摇瓶中，发酵培养基1中添加3.5mL底物正癸烷。在30℃条件下发酵，发酵结束后，测定第一代和第六代菌株的DC10产量分别为117.88g/L和117.25g/L。

实施例3～5维斯假丝酵母CAes2121在摇瓶中添加不同量十碳烷烃的发酵产酸

取1支实施例1获得的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121甘油管种子接入YPD培养基中，培养24h后接入种子培养基，在29℃条件下培养28h，测得种子液的OD₆₂₀达到了0.82(水稀释30倍)，将3.8mL种子液接种到装有15mL发酵培养基1的摇瓶中。

实施例3～5发酵培养基1中所加的正癸烷分别为3.5mL，3.0mL，2.0mL。在29℃条件下发酵，发酵液内的正烷烃检测为0时结束发酵，获得的发酵液测试结果如下表1。

对比例1

取1支出发菌株出发菌株维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113甘油管，与实施例4采用相同的工艺进行摇瓶发酵，测得接发酵前种子液的OD₆₂₀达到了0.8(水稀释30倍)，在29℃条件下发酵，发酵液内的发酵底物检测为0时结束发酵，获得的发酵液测试结果如下表1。

表1

	正癸烷加入量(mL)	发酵液中DC10含量(g/L)	平均产酸速率(g/h·L)
				实施例3	3.5	116.8	0.77
实施例4	3.0	96.0	0.68
				对比例1	3.0	89.0	0.62
实施例5	2.0	69.0	0.51

从表1中可以看出，在进行摇瓶发酵时，本发明菌株与出发菌株相比，在相同条件下获得的DC10产量更高，产酸速率更快，更节约能耗。

实施例6维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

将维斯假丝酵母菌体CAes2121接种于种子培养基，培养温度30℃，当种子液菌体光密度(OD₆₂₀)达到0.5(稀释30倍)时，将种子液接入发酵培养基2中进行发酵转化，接种量为10％(v/v)。控制发酵温度30℃，控制发酵过程中pH值为6.2，控制空气流量为0.3vvm，控制发酵罐压为0.08MPa，保持一定的搅拌速度，发酵过程中溶氧维持在20％以上。种子液接入发酵罐后，菌体开始生长繁殖，当发酵液中菌体光密度(OD₆₂₀)达到0.5(稀释30倍)时，加入发酵底物正癸烷。控制发酵液内的癸烷浓度范围为0.5％～1％(v/v)，在发酵过程中通过控制正癸烷的流加速度使得发酵液中活细胞的浓度维持在2*10⁸cfu/mL～9*10⁸cfu/mL，发酵底物正癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

对比例2维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例6相同，区别在于菌种不同：将出发菌株维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAES2113甘油管接种于种子培养基，发酵底物正癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

实施例7维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

将维斯假丝酵母菌体CAes2121接种于种子培养基，培养温度29℃，当种子液菌体光密度(OD₆₂₀)达到0.6(稀释30倍)时，将种子液接入发酵培养基2中进行发酵转化，接种量为10％(v/v)。控制发酵温度30℃，控制发酵过程中pH值为7.2，控制空气流量为0.3vvm，控制发酵罐压为0.08MPa，保持一定的搅拌速度，发酵过程中溶氧维持在20％以上。种子液接入发酵罐后，菌体开始生长繁殖，当发酵液中菌体光密度(OD₆₂₀)达到0.6(稀释30倍)时，加入发酵底物正癸烷。控制发酵液内的癸烷浓度范围为0.5％～1％(v/v)，在发酵过程中通过控制烷烃的流加速度使得发酵液中活细胞的浓度在2*10⁸cfu/mL～9*10⁸cfu/mL，发酵底物癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

对比例3维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例7相同，区别在于菌种不同：将维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAES2113甘油管接种于种子培养基，发酵底物正癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

实施例8维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例6相同，区别在于：发酵过程中控制罐压为0.11MPa，溶氧维持在40％以上，在发酵过程中通过控制正癸烷的流加速度，使得发酵液中活细胞的浓度维持在8*10⁷cfu/mL～2*10⁸cfu/mL，发酵底物正癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

实施例9维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例7相同，区别在于：发酵过程中溶氧低于10％。在发酵过程中通过控制烷烃的流加速度，使得发酵液中活细胞的浓度维持在9*10⁸cfu/mL～1.1*10⁹cfu/mL，发酵底物正癸烷总添加量为1300g。发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液测试结果如下表2。

实施例10维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例6相同，区别在于：将种子液接入发酵培养基3中进行发酵，在发酵过程中控制溶氧在10％以上，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液检测结果如下表2。

对比例4维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例6相同，区别在于：在发酵过程中控制溶氧在40％以上，在发酵过程中通过控制烷烃的流加速度，使得发酵液中活细胞的浓度维持在2*10⁷cfu/mL～8*10⁷cfu/mL，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液检测结果如下表2。

对比例5维斯假丝酵母CAes2121在10L发酵罐中发酵生产DC10

发酵方法与实施例6相同，区别在于：在发酵过程中控制溶氧在10％以上，在发酵过程中通过控制烷烃的流加速度，使得发酵液中活细胞的浓度维持在2*10⁹cfu/mL～5*10⁹cfu/mL，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵，获得的发酵液检测结果如下表2。

表2

从表2可以看出，使用发酵罐发酵时，本发明菌株与出发菌株相比，在相同条件下获得的DC10产量更高，产酸速率更快，更节约能耗。

实施例11十碳二元酸产品的制备

将实施例6制得的发酵液用硫酸调节pH值至3.2，进行酸化，过滤得固形物，再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在85℃条件下脱色70min，过滤分离得清液，将清液降温至65℃保温1h，再降温至35℃，结晶，离心分离得高纯度十碳二元酸产品。

由上述实施例对比例可知，本发明所采用的维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAes2121，较亲本维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121具有更好的产十碳二元酸能力，在实施例6中产十碳二元酸的含量达185g/L，其产酸速率达到1.23g/h·L。本发明方法通过控制发酵液中菌体的浓度、发酵底物的浓度、压力、空气流量等发酵工艺参数，在保证发酵效率、产酸量方面效果获得更佳效果。本发明的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121可用于生物法工业化生产十碳二元酸。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高产十碳二元酸的菌株，其特征在于，所述菌株为维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)CAes2121，保藏编号为CCTCC M 2021824。

2.包括如权利要求1所述的维斯假丝酵母菌株CAes2121的菌剂。

3.一种如权利要求1所述的维斯假丝酵母在发酵生产十碳二元酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵生产使用的底物包括癸烷、十碳脂肪酸、十碳脂肪酸衍生物或它们的混合物。

5.一种生物法生产长链十碳二元酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAes2121的种子培养和发酵培养；

b)从步骤a)获得的发酵产物中提取十碳二元酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养和发酵培养时的温度为28℃～33℃，优选为29～30℃。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养和发酵培养时，使用的种子培养基和发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和/或营养因子；和/或，

所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种，所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)；和/或，

所述氮源包括酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种，所述氮源的添加量为0.1％～3％(w/v)；和/或，

所述无机盐包括钾盐和钠盐中的一种或多种；优选地，所述钾盐包括氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述无机盐的添加量为0.1％～1.5％(w/v)；和/或，

所述营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素和氨基酸中的一种或多种，所述营养因子的添加量为0～1％(w/v)。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养时，控制发酵体系pH值为7.0以下或者7.0以上。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养时，控制底物浓度为0.5％～3％。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养时，控制发酵液中活细胞的浓度为8*10⁷cfu/mL～1.5*10⁹cfu/mL，更优选为2*10⁸cfu/mL～9*10⁸cfu/mL。

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