CN109161570B - 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 - Google Patents
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Abstract
一种提高发酵产N‑乙酰神经氨酸的方法及发酵液,涉及发酵工程技术领域。本发明实施例的提高发酵产N‑乙酰神经氨酸的方法在液体发酵培养基中接种产N‑乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵,液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25‑35:1,发酵过程维持pH 6.5‑7,并在液体发酵培养基中的碳源耗完后,以5‑6g/(L·h)的速率补充碳源;每隔36‑60h排出85%‑95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基,该方法工序简单,生产效率高。本发明实施例的发酵液采用上述的提高发酵产N‑乙酰神经氨酸的方法得到,生产效率更高。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域,且特别涉及一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法及发酵液。
背景技术
2017年5月31日,国家卫计委审核并批准了包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)在内的10种新食品原料的使用。Neu5Ac是细胞信息传递的第一接触位点,且其分子结构具有多样性,因此Neu5Ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程。此外,Neu5Ac能调节IgG的抗炎活性,增强婴儿免疫力,影响神经细胞的完整性、渗透性及活性,促进婴儿大脑发育的功能,所以N-乙酰神经氨酸及其生产引起了较多的关注和研究。
目前N-乙酰神经氨酸的生产方法包括:天然产物提取、化学合成、生物酶催转化、基因工程菌直接发酵及聚唾液酸发酵水解法。绝大多数天然产物中的Neu5Ac含量低,而且组分非常复杂,从中提取Neu5Ac伴随着复杂的过程,回收率低,因此天然产物提取很难满足大规模生产的要求。化学合成法由于繁琐的基团保护、去保护等操作,以及手性异构副产物的存在,该方法亦无法应用于工业生产。生物酶催转化因为转化前体N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸成本高,导致合成成本高。聚唾液酸水解法由于发酵产量低及后处理复杂,成本也居高不下。基因工程菌直接发酵通过对大肠杆菌模式菌株基因改造,使之能够利用普通碳源进行高密度发酵,并达到较高的Neu5Ac产量,近年来该方法受到广泛重视。
目前基因工程菌直接发酵具体包括连续发酵、分批发酵和补料分批发酵。分批发酵又称为分批培养,是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后,接入少量的微生物菌种进行培养,使微生物生长繁殖,在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法;分批发酵的人力、物力消耗较大,每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作,工序繁琐,发酵周期较长,生产效率较低。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程;连续发酵可以大幅提高生产强度,但是容易染菌、菌株退化、设备投资大和产物浓度低等确定。补料分批发酵(又称“半连续发酵”或者“流加发酵”)是指在微生物分批发酵过程中,以某种方式向发酵系统中补加一定物料,但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术;补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足,但是由于有害代谢产物的不断积累,最终产物合成难免受到阻遏。
鉴于此,需要一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,工序简单,生产效率高。
本发明的另一目的在于提供一种发酵液,生产效率更高。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其包括以下步骤:
在液体发酵培养基中接种产N-乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵,液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1,发酵过程维持pH 6.5-7,并在液体发酵培养基中的碳源耗完后,以5-6g/(L·h)的速率补充碳源;每隔36-60h排出85%-95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基。
进一步地,在本发明较佳实施例中,产N-乙酰神经氨酸菌种选自产N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌基因工程菌中的至少一种。
进一步地,在本发明较佳实施例中,种子培养液的制备方法包括以下过程:
取冻存的产N-乙酰神经氨酸菌种接种至固体LB培养基上,于35-40℃培养;
待长出单菌落后,挑取单菌落,接种到液体LB培养基中,于150-250rpm、35-40℃培养过夜,得到一级种子液;
将一级种子液按0.8%-1.2%的接种量接到液体LB培养基中,于150-250rpm、35-40℃培养5-7h,得到二级种子液。
进一步地,在本发明较佳实施例中,液体LB培养基含有:蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L,pH7.0±0.2。
进一步地,在本发明较佳实施例中,固体LB培养基含有:蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L、琼脂15-25g/L,pH7.0±0.2。
进一步地,在本发明较佳实施例中,液体发酵培养基的成分包括:甘油15-25g/L、玉米浆干粉10-13g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁1-1.5g/L、氯化钙0.005-0.015g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3mM。
进一步地,在本发明较佳实施例中,液体发酵培养基中还包括0.8-1.2mL/L的泡敌消泡剂。
进一步地,在本发明较佳实施例中,新鲜液体培养基的成分包括玉米浆干粉10-13g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁1-1.5g/L、氯化钙0.005-0.015g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3mM。
进一步地,在本发明较佳实施例中,发酵条件为:接种前,控制初始通气量为0.8-1.2vvm,初始转速为150-250rpm;接种后,通过调整转速及通气量维持溶解氧浓度高于3.0mg/L、发酵温度为35-40℃。
本发明提出一种发酵液,其采用上述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法得到。
本发明实施例的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法及发酵液的有益效果是:本发明实施例的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法在液体发酵培养基中接种产N-乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵,液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1,发酵过程维持pH 6.5-7,并在液体发酵培养基中的碳源耗完后,以5-6g/(L·h)的速率补充碳源;每隔36-60h排出85%-95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基,该方法工序简单,生产效率高。本发明实施例的发酵液采用上述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法得到,生产效率更高。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法及发酵液进行具体说明。
本发明实施例提供一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其包括以下步骤:
在液体发酵培养基中接种产N-乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵,液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1,发酵过程维持pH 6.5-7,一般是用质量浓度15%-20%的氨水调节pH,并在液体发酵培养基中的碳源耗完后,以5-6g/(L·h)的速率补充碳源;每隔36-60h排出85%-95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基,可选的,每隔48h排出90%体积的发酵液,同时补入90%体积的新鲜液体培养基。
本实施例采用反复分批补料发酵,是指在补料分批发酵的基础上,周期性地放出部分含有目标产物的发酵液,然后再补加相同体积的新鲜液体培养基的发酵方法。反复分批发酵可以省去批次间种子培养、接种、清洗、灭菌和发酵初始的延迟期等时间,较分批发酵和补料分批发酵相比生产强度大大提高,发酵过程中通过放掉部分发酵液再补入新鲜液体培养基,不仅可以补充养分和前体,而且代谢有害物会被稀释,从而有利于产物的继续合成。反复分批发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用,改善了菌体的培养环境,有助于保持菌体活力的稳定。
本实施例中,液体发酵培养基和新鲜液体培养基的成分大致相同,区别在于新鲜液体培养基不含碳源,而是另外以一定的速率持续补充碳源;碳源可选为甘油。
本实施例中,发酵条件为:接种前,控制初始通气量为0.8-1.2vvm,初始转速为150-250rpm;接种后,通过调整转速及通气量维持溶解氧DO浓度高于3.0mg/L、发酵温度为35-40℃。
本实施例中,产N-乙酰神经氨酸菌种选自产N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌基因工程菌中的至少一种,比如为中国发明专利ZL 201310600843.0中构建的产N-乙酰神经氨大肠杆菌工程菌。
本实施例中,种子培养液的制备方法包括以下过程:
(1)菌种活化:取冻存的产N-乙酰神经氨酸菌种接种至固体LB培养基上,于35-40℃培养。其中,固体LB培养基含有:蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L、琼脂15-25g/L,pH7.0±0.2。
(2)一级种子的培养:待长出单菌落后,挑取单菌落,接种到液体LB培养基中,于150-250rpm、35-40℃培养过夜,得到一级种子液。其中,液体LB培养基含有:蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L,pH7.0±0.2。
(3)二级种子的培养:将一级种子液按0.8%-1.2%的接种量接到液体LB培养基中,于150-250rpm、35-40℃培养5-7h,得到二级种子液,即为种子培养液。
本实施例中,液体发酵培养基的成分包括:甘油15-25g/L、玉米浆干粉10-13g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁1-1.5g/L、氯化钙0.005-0.015g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3mM;液体发酵培养基中还包括0.8-1.2mL/L的泡敌消泡剂以抑制泡沫产生。
新鲜液体培养基的成分新鲜液体培养基的成分包括玉米浆干粉10-13g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁1-1.5g/L、氯化钙0.005-0.015g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3mM;新鲜液体培养基中还包括0.8-1.2mL/L的泡敌消泡剂。
本发明实施例还提供一种发酵液,其采用上述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种发酵液,其按照以下的制备方法制得:
1、菌种活化:取冻存的、中国发明专利ZL 201310600843.0中构建的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌的菌种划线接种至固体LB培养基上,37℃培养。其中,固体LB培养基含有:蛋白胨10g/L、酵母浸膏粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L,pH7.0。
2、一级种子的培养:待长出单菌落后,挑取单菌落,接种到含50mL液体LB培养基的三角瓶中,200rpm、37℃培养过夜,得到一级种子液。其中,液体LB培养基含有:蛋白胨10g/L、酵母浸膏粉5g/L、氯化钠10g/L,pH7.0。
3、二级种子的培养:将一级种子液按1%的接种量接到含50mL液体LB培养基的三角瓶中,200rpm、37℃培养6h,得到二级种子液。
4、发酵罐发酵:在5L规格的发酵罐中装入液体发酵培养基3L,将二级种子液100mL接种至发酵罐中培养。其中,液体发酵培养基的成分包括:甘油(碳源)20g/L、玉米浆干粉11g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁1.2g/L、氯化钙0.01g/L、IPTG 0.2mM、泡敌1mL/L。
发酵条件:接种前,控制初始通气量1vvm,初始转速200rpm;接种后,根据调整转速及通气量维持溶解氧浓度高于3.0mg/L、发酵温度37℃。发酵过程用17%的氨水维持pH6.8,当液体发酵培养基中甘油耗完后,以5.5g/(L·h)的速率补充甘油。
5、反复分批补料发酵:发酵开始后,每隔36h,排出90%体积的发酵液,并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基,即将90%发酵液替换为新鲜液体培养基。其中,新鲜液体培养基的成分包括:玉米浆干粉11g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁1.2g/L、氯化钙0.01g/L、IPTG 0.2mM、泡敌1mL/L。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸Neu5Ac含量,N-乙酰神经氨酸的检测方法如下:
将发酵液离心去除菌体得到清液,将清液稀释一定倍数,采用高效液相色谱(HPLC)检测法检测:岛津Lc-15c;检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic AnalysisColumn(300×7.8mm);柱温60℃;流动相5mmol硫酸,流速是0.6ml/min;检测波长210nm。
实施例2
本实施例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
每隔48h,排出90%体积的发酵液,并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸含量。
实施例3
本实施例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
每隔60h,排出90%体积的发酵液,并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸含量。
实施例4
本实施例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
每隔60h,排出95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸含量。
实施例5
本实施例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
每隔60h,排出85%体积的发酵液,并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸含量。
统计实施例1-5的检测结果:
实施例1-3分别是在每次发酵36h、48h、60h后,将90%发酵液替换为新鲜液体培养基(不含甘油),然后继续分批补料发酵,每个实施例得到2批发酵液;实施例3-5分别是在每次发酵60h后,将90%、95%和85%发酵液替换为新鲜液体培养基(不含甘油),然后继续分批补料发酵,每个实施例得到2批发酵液。实施例1-5排出的发酵液检测结果如下:
表1实施例1-5的发酵液的检测结果
由上表可知,每隔36-60h排出85%-95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基可以显著提高Neu5Ac的合成效率,尤其是每隔48h排出90%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基,Neu5Ac净增长和合成速率最高,即Neu5Ac合成效率最高。
实施例6
本实施例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
分别在在发酵48h、96h、144h(每隔48h)后,将发酵液的90%替换为新鲜液体培养基(不含甘油),然后继续分批补料发酵。
取每批排出的发酵液,检测其OD600和N-乙酰神经氨酸含量,发酵192h(共4批发酵液),Neu5Ac累计产量261.2g/L,合成速率16.32g/L*12h。
对比例1
本对比例提供一种发酵液,该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同,不同之处在于:
发酵过程中,未进行反复分批补料发酵,持续发酵培养72h放罐。培养期间,于不同时间点(发酵第12h、24h、36h、48h、60h、72h),取发酵产物,检测其OD600和Neu5Ac含量。发酵72h,Neu5Ac产量74.3g/L,合成速率12.38g/L*12h。
综上所述,本发明实施例的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法的工序简单,生产效率高;本发明实施例的发酵液中N-乙酰神经氨酸含量高。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,其包括以下步骤:
在液体发酵培养基中接种产N-乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵,所述液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1,发酵过程维持pH 6.5-7,并在所述液体发酵培养基中的碳源耗完后,以5-6 g/(L·h)的速率补充碳源;每隔36-60 h排出85%-95%体积的发酵液,并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基;碳源为甘油,所述液体发酵培养基的成分包括:甘油15-25 g/L、玉米浆干粉10-13 g/L、磷酸氢二钾4-6 g/L、硫酸镁1-1.5 g/L、氯化钙0.005-0.015 g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3 mM;所述新鲜液体培养基的成分包括:玉米浆干粉10-13 g/L、磷酸氢二钾4-6 g/L、硫酸镁1-1.5 g/L、氯化钙0.005-0.015g/L、异丙基硫代半乳糖苷0.1-0.3 mM;
所述产N-乙酰神经氨酸菌种选自产N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌基因工程菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,所述种子培养液的制备方法包括以下过程:
取冻存的产N-乙酰神经氨酸菌种接种至固体LB培养基上,于35-40 ℃培养;
待长出单菌落后,挑取单菌落,接种到液体LB培养基中,于150-250 rpm、35-40 ℃培养过夜,得到一级种子液;
将一级种子液按0.8%-1.2%的接种量接到液体LB培养基中,于150-250 rpm、35-40 ℃培养5-7 h,得到二级种子液。
3.根据权利要求2所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,所述液体LB培养基含有:蛋白胨8-12 g/L、酵母浸膏粉4-6 g/L、氯化钠8-12 g/L,pH7.0±0.2。
4.根据权利要求2所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,所述固体LB培养基含有:蛋白胨8-12 g/L、酵母浸膏粉4-6 g/L、氯化钠8-12 g/L、琼脂15-25 g/L,pH7.0±0.2。
5.根据权利要求1所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,所述液体发酵培养基中还包括0.8-1.2 mL/L的泡敌消泡剂。
6.根据权利要求1所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,发酵条件为:接种前,控制初始通气量为0.8-1.2 vvm,初始转速为150-250 rpm;接种后,通过调整转速及通气量维持溶解氧浓度高于3.0 mg/L、发酵温度为35-40 ℃。
7.一种发酵液,其特征在于,其采用如权利要求1至6中任一项所述的提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法得到。
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