CN104988108A

CN104988108A - 一种高产n-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用

Info

Publication number: CN104988108A
Application number: CN201510278527.5A
Authority: CN
Inventors: 柳鹏福; 孙立洁; 袁丽霞; 陈祥松; 王纪; 吴金勇; 朱薇薇; 王刚; 史吉平; 姚建铭
Original assignee: Wuhan Zhongke Guanggu Green Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Zhongke Guanggu Green Biological Technology Co ltd
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2015-10-21

Abstract

本发明公开了一种高产N-乙酰神经氨酸工程菌的构建方法和应用，该工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶基因通过T7强启动子在大肠杆菌中表达以增强两个酶的活性，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌；构建的工程菌株利用葡萄糖或甘油为底物进行发酵培养生成N-乙酰神经氨酸。本发明的工程菌利用葡萄糖或甘油合成N-乙酰神经氨酸发酵水平高，副产物的积累较少，具有工业化潜力。

Description

一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用，属生物工程技术领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是唾液酸的主要成分，其含量占整个唾液酸家族的99％以上，通常以α-糖苷的形式位于非还原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。N-乙酰神经氨酸广泛存在于各种生物体内，发挥着多种生理作用。在人体中主要能提高肠道对维生素及矿物质的吸收、抗病毒和提高婴幼儿神经系统的发育。

N-乙酰神经氨酸以其所具有的的生理功能和特殊的结构，应用于食品、保健品和医药中间体领域。食品和保健品领域主要应用于婴幼儿奶粉的添加，以使婴幼儿奶粉更接近母乳的成分，促进婴儿神经系统的发育。医药中间体领域主要用于抗流感药物扎那米韦合成的前体。

N-乙酰神经氨酸的生产目前主要是通过以N-乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸钠为底物，以高表达神经氨酸醛缩酶和N-乙酰氨基葡糖差向异构酶的基因工程菌催化，通过全细胞或酶催化法而合成。该方法所需的底物N-乙酰氨基葡萄糖成本较高，而且涉及到双酶高表达的大肠杆菌发酵，步骤繁琐，成本较高。发酵法生产唾液酸以其工艺简单，绿色环保而吸引了很多研究者的关注，也开发了不同的菌株用于N-乙酰神经氨酸的合成。发酵法存在的主要问题是目前的菌株N-乙酰神经氨酸产量过低，导致其成本仍然过高，限制了其大规模的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用。本发明通过用T7启动子强表达N-乙酰神经氨酸合成所需的neuBC基因，构建新的高产N-乙酰神经氨酸的基因工程大肠杆菌，提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

为解决上述技术问题，本发明的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，首先是选择在大肠杆菌中表达编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶编码基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶编码基因neuB，实现利用葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的目的。为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，选择了目前所知表达最强的T7启动子作为上述两个基因表达所需的启动子，详见图1，并敲除了N-乙酰神经氨酸分解代谢基因簇nanATEK，阻断N-乙酰神经氨酸的降解，达到在胞外积累终产物N-乙酰神经氨酸的目的。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇为大肠杆菌自身基因组中所有，包含了四个基因，分别为：N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因nanT、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因nanK，四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK。

上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇，将neuBC基因克隆到表达载体pET24a上，转入敲除了nanATEK基因簇大肠杆菌BL21(DE3)中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中，该构建方法，更加具体的步骤包括：

1)敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK失活的菌株BL21(DE3)/ΔnanATEK；

2)克隆编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuBC至表达载体pET24a，以实现该基因的超高表达；

3)将2)中获得的表达载体转化入1)所得的菌株中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

所述高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2015261，CCTCCNO:M2015261的分类号为：大肠杆菌CASOV－5Escherichia coli CASOV－CASOV-5。

本发明还公开了一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的应用，即利用上述工程菌进行N-乙酰神经氨酸的生产，该生产方法包括步骤：

1)在三角摇瓶的培养基中活化培养高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子；

2)将培养好的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子逐级放大，并在相应含有发酵培养基的发酵罐中进行好气培养；

3)培养至菌体浓度OD₆₀₀为20～25时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导相关蛋白的表达；

4)至产物浓度不再增加，结束发酵工作。

所述步骤1)和2)中的种子培养基和发酵培养基的配方如下：

氮源，0.1-10g/L，磷源0.1-25g/L，葡萄糖或甘油1-100g/L，微量元素0.01-50mg/L。氮源包括酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、铵盐、硝酸盐或其组合的混合物。磷源包括磷酸及其盐类。微量元素包括：锰、锌、钼、硼、钴、铜、镍。

5)使用该方法发酵该高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌可得发酵液中N-乙酰神经氨酸产量在70g/L以上。

本发明通过在大肠杆菌中超强表达N-乙酰神经氨酸合成所需的酶，以提高N-乙酰神经氨酸的合成效率，同时，失活导致N-乙酰神经氨酸消耗和回流的基因，阻止N-乙酰神经氨酸的回流和消耗，使得工程菌株能积累高浓度的N-乙酰神经氨酸。通过本发明的方法，得到一株基因工程大肠杆菌，该菌株可以利用葡萄糖或甘油合成高水平N-乙酰神经氨酸，同时，副产物的积累少，具有工业化生产的潜力。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是大肠杆菌中构建高水平N-乙酰神经氨酸生产工程菌株代谢相关途径。

具体实施方式

以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。

实施例1：高产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的构建

一、采用Red重组方法，敲除菌株中的nanATEK基因簇，其具体步骤如下：

1、nanATEK基因簇的敲除

1)根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组(Genbank No.CP001509)序列，设计引物：上游引物F-nanA：

GCAACGAATTTACGTGGCGTAATGGCTGCACTCCTGACTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.1所示)和下游引物R-nanK：

TTTTTCTCCCTGGGCCAACAGCGCAGCCCCAAGTAAACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.2所示)，利用引物F-nanA和R-nanK，以质粒pKD13为模板，利用商业化的PCR试剂，经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

2)LB培养基37度过夜培养大肠杆菌BL21(DE3)，用氯化钙法制备感受态细胞，转化pKD46，涂布氨苄青霉素抗性LB平板，30度过夜培养，得到BL21(DE3)/pKD46。

3)LB培养基中加入1％(m/V，质量体积百分比)的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养菌株BL21(DE3)/pKD46至OD600达到0.8，然后制备感受态细胞。将上述制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布卡那霉素抗性(50μg/mL)LB平板，37度过夜培养得到转化子，以便同时消除质粒pKD46。

4)挑取转化子，用菌落PCR鉴定

菌落PCR引物为F-nanA2：GACAAGCATCACTTCAGAGG(SEQ ID NO.3所示)和R-nanK。

挑取的转化子菌落经PCR扩增，能扩增出大小为1.5kb左右条带的菌落，即为敲除成功的突变株。

5)转化重组质粒pCP20至上述突变株中，挑取转化子划线，于42度过夜培养，热启动重组酶的表达，以消除染色体上引入的卡那霉素抗性基因，同时消除重组质粒pCP20。

6)挑取划线平板上的单菌落，分别在LB平板和LB卡那霉素平板上培养，选择没有卡那霉素抗性的菌落即为nanATEK失活且卡那霉素抗性被消除的菌株BL21(DE3)/ΔnanATEK。

二、neuBC基因表达载体pET-neuBC的构建

1)根据neuBC的基因序列(GenBank No.AF400048)全基因合成neuBC基因，两端加NdeI和BamHI位点，具体序列如下所示(SEQ ID NO.4)。

CATATGAAAGAAATAAAAATACAAAATATAATCATAAGTGAAGAAAAAGCACCCTTAGTCGTACCTGAAATAGGCATTAATCATAATGGCAGTTTAGAACTAGCTAAAATTATGGTAGATGCAGCCTTTAGCGCAGGTGCTAAGATTATAAAGCATCAAACTCATATTGTTGAAGATGAGATGAGTAAGGCCGCTAAAAAAGTAATTCCTGGTAATGCAAAAATAAGCATTTATGAGATTATGCAAAAATGTGCTTTGGATTATAAAGATGAGCTAGCACTTAAAGAATACACAGAAAAATTAGGTCTTGTTTATCTTAGCACACCTTTTTCTCGTGCAGGTGCGAACCGCTTAGAAGATATGGGAGTTAGTGCTTTTAAGATTGGTTCAGGTGAGTGTAATAATTATCCGCTTATTAAACACATAGCAGCCTTTAAAAAGCCTATGATAGTTAGCACAGGAATGAATAGTATTGAAAGTATAAAACCAACTGTAAAAATCTTATTAGACAATGAAATTCCTTTTGTTTTAATGCACACGACCAATCTTTACCCAACCCCGCATAATCTTGTAAGATTAAACGCTATGCTTGAGTTAAAAAAAGAATTTTCTTGTATGGTAGGCTTAAGCGACCACACAACAGATAATCTTGCGTGTTTAGGTGCAGTTGTACTTGGAGCTTGTGTGCTTGAAAGACATTTTACTGATAGTATGCATAGAAGTGGCCCTGATATAGTTTGTTCTATGGATACAAAGGCTTTAAAAGAGCTAATTATACAAAGTGAGCAAATGGCTATAATAAGAGGAAATAATGAAAGTAAAAAAGCGGCTAAACAAGAACAAGTTACAATTGATTTTGCCTTTGCAAGTGTAGTTAGCATTAAAGATATTAAAAAAGGCGAAGTTTTATCTATGGATAATATTTGGGTTAAAAGACCTGGACTTGGTGGAATTAGTGCGGCTGAATTTGAAAATATTTTAGGCAAAAAAGCATTAAGAGATATAGAAAATGATGCTCAGTTAAGCTATGAGGATTTTGCGTGAAAAAAATCCTTTTTATAACAGGCTCTAGGGCTGATTATTCTAAGATTAAATCTTTAATGTACAGGGTGCAAAACTCAAGCGAATTTGAACTTTACATCTTTGCAACAGGAATGCACTTAAGTAAAAATTTTGGCTATACAGTTAAAGAACTTTATAAAAATGGCTTTAAAAATATTTATGAATTTATAAATTATGATAAATATTATCAAACTGATAAGGCTTTAGCTACTACAATTGATGGATTTTCAAGGTATGCAAATGAGCTAAAACCTGATTTAATCGTAGTACATGGAGATAGAATTGAGCCTTTAGCAGCAGCTATTGTTGGAGCATTAAATAATATCTTAGTAGCGCATATTGAAGGCGGAGAGATTTCAGGAACTATTGACGATAGCTTACGCCACGCTATATCAAAACTAGCTCATATTCATTTAGTAAATGATGAGTTTGCAAAAAGGCGTTTAATGCAGCTTGGAGAAGATGAAAAATCTATTTTTATCATAGGTTCGCCTGATTTAGAACTTTTAAACGATAATAAAATTTCACTTAGCGAAGCAAAAAAATATTATGATATAAATTATGAAAACTACGCTTTGCTTATGTTTCATCCTGTTACAACTGAAATTACTAGCATTAAAAATCAAGCAGACAATTTAGTAAAAGCACTGATACAAAGTAATAAAAATTATATTGTTATTTATCCAAATAATGATTTAGGTTTTGAATTAATCTTGCAAAGCTATGAAGAGTTTAAAAATAACCCTAGATTTAAGCTTTTTCCATCGCTTAGATTTGAGTATTTTATAACTTTGTTAAAAAATGCTGATTTTATAATAGGTAATTCAAGTTGTATTTTAAAAGAGGCCTTATACTTAAAAACAGCAGGGATTTTAGTTGGCTCAAGACAAAATGGAAGACTTGGCAATGAAAATACACTAAAAGTTAATGCAAATAGTGATGAAATACTAAAAGCTATTAACACTATTCATAAAAAACAAGATTTATTTAGCGCTAAGTTAGAGATTTTAGATAGCTCAAAATTATTTTTTGAATATTTACAAAGCGGAGATTTTTTTAAACTCAGCACACAAAAAGTTTTTAAGGATATAAAATGAGGATCC

2)将合成的基因片段用NdeI和BamHI酶切，回收备用。

3)抽提表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，回收备用。

4)连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α(购自TAKARA公司)感受态细胞，得到表达载体pET-neuBC。

四、N-乙酰神经氨酸工程菌的构建

1)用液体LB培养基过夜培养含有载体pET-neuBC的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒pET-neuBC。

2)培养大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ΔnanATEK，制备感受态细胞，并电击转化质粒载体pET-neuBC进入该菌株，获得基因工程菌株BL21(DE3)/ΔnanATEK/pET-neuBC，即为能高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，命名为CASOV-2。

实施例2葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰神经氨酸

1、种子和发酵培养基(1L)：

(NH4)₂SO₄4g/L；KH₂PO₄6g；K₂HPO₄·3H₂O 8g；酵母提取物(购自OXOID公司)5g；蛋白胨10g/L；葡萄糖5g。

补料液：500g/L葡萄糖。

2、发酵过程：

1)挑取CASOV-2单菌落于装液量4ml LB试管中，37℃培养8-12小时。

2)2ml一级种子接种于200ml种子培养基中，37℃培养8～10小时。

3)二级种子接种于装液量3.5L的发酵罐中，37℃，搅拌速度300～800转/分钟，溶氧保持在30％以上，用氨水控制pH在6.9。

4)葡萄糖耗完后，开始以5g/L.h的速度补加葡萄糖。

5)发酵液菌体OD₆₀₀＝25～30时加入IPTG(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养，培养基中葡萄糖浓度保持在2～5g/L，70小时后可减慢补料速度，至结束发酵。

经检测，发酵结束时，产物N-乙酰神经氨酸的浓度可达30g/L。

实施例3甘油为碳源发酵生产N-乙酰神经氨酸

以20g/L的甘油代替葡萄糖，发酵培养基其他成分同实施例2，补料培养基为600g/L甘油；

发酵工艺同实施例2。

最终经过80小时左右发酵后，产物N-乙酰神经氨酸浓度可达70g/L以上。

以上培养结果表明，经代谢工程技术构建的基因工程菌具有高产N-乙酰氨基葡萄糖的能力，具备了工业化的潜力。

Claims

1.一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶基因通过T7启动子在大肠杆菌中表达以增强两个酶的活性，同时敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的nanATEK基因簇构建而成的重组大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因导入大肠杆菌高表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。

3.如权利要求2所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述表达载体为pET24a载体或含有T7启动子的载体。

4.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株或含有来源于λ噬菌体中DE3片段的菌株。

5.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用类似手段从其他生物体获得。

6.如权利要求5所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的编码基因在空肠弯曲菌中串联在一起，一起克隆表达或分开克隆表达。

7.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运蛋白nanT、编码N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和编码N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因nanK，四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK。

8.高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤包括：敲除大肠杆菌BL21（DE3）中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇，将neuBC基因克隆到表达载体pET24a上，转入敲除了nanATEK基因簇大肠杆菌BL21（DE3）中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

9.根据权利要求8所述的高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于：1）敲除大肠杆菌BL21（DE3）中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK失活的菌株BL21（DE3）/ΔnanATEK；

2）克隆编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuBC至表达载体pET24a，以实现该基因的超高表达；

3）将2）中获得的表达载体转化入1）所得的菌株中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

10.一种如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的应用，其特征在于：利用高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌进行N-乙酰神经氨酸的生产，其步骤包括：

1）在三角摇瓶的培养基中活化培养高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子；

2）将培养好的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子逐级放大，并在相应含有发酵培养基的发酵罐中进行好气培养；

3）培养至菌体浓度OD₆₀₀为20~25时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导相关蛋白的表达；

4）至产物浓度不再增加，结束发酵工作;

5) 使用该方法发酵该高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌可得发酵液中N-乙酰神经氨酸产量在70g/L以上。