CN112175893B

CN112175893B - 一种产唾液酸的重组微生物及其应用

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Publication number: CN112175893B
Application number: CN202010924133.3A
Authority: CN
Inventors: 陈振; 刘德华
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN112175893A

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种产唾液酸的重组微生物及其应用。本发明提供一种重组微生物，其与能够合成唾液酸的出发菌株相比，具有提高的6‑磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达，以及提高的果糖‑1,6‑双磷酸酯酶和/或谷氨酰胺合成酶的表达。本发明通过对微生物进行改造获得了能够以葡萄糖、甘油等廉价碳源为原料发酵生产唾液酸的重组微生物，该重组微生物的唾液酸产量得到了显著提高，实现了从葡萄糖、甘油等廉价碳源到唾液酸的高效转化，显著降低了唾液酸的生产成本，具有重要的工业应用价值。

Description

一种产唾液酸的重组微生物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种产唾液酸的重组微生物及其应用。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)，又名N-乙酰神经氨酸，是人体中一种重要的生理活性物质，是大脑神经节苷脂和糖蛋白的主要组成部分。唾液酸是中国传统珍稀食品燕窝当中最重要的功能成分，也是母初乳中对婴儿早期大脑发育及免疫体系的完善具有重要作用的组份之一。研究发现唾液酸是大脑发育不可缺少的营养物，唾液酸和婴儿脑部正常发育密切相关，补充唾液酸有利于人类学习和记忆的形成。目前唾液酸已经广泛应用于婴儿配方食品，保健食品，化妆品等领域。

目前唾液酸的生产方法主要是以乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为原料，以过表达神经氨酸醛缩酶和乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的重组微生物进行全细胞催化。该方法的原料氨基葡萄糖和丙酮酸价格昂贵，且由于神经氨酸醛缩酶同时催化唾液酸的可逆分解，使得原料的转化率低，生产成本高。

利用葡萄糖、甘油等廉价原料直接发酵生产唾液酸具有原料来源广泛、过程简单、环境友好等特点，对降低唾液酸的生产成本以及拓展下游产品的应用范围具有重要意义。但现有的发酵法生产唾液酸的产量仍然很低，难以满足工业生产的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组微生物，该重组微生物在发酵过程中能够产生大量的唾液酸。本发明的另一目的是提供该重组微生物的应用以及发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物的方法。

为实现上述目的，本发明在对微生物的唾液酸代谢相关途径及其代谢流量进行大量预测和分析以及实践验证的基础上，发现果糖-6-磷酸这一代谢节点是限制唾液酸大量积累的关键瓶颈节点，由于糖酵解等优势代谢途径的竞争作用，想要将代谢流量大量地导入唾液酸的合成途径存在较大难度。本发明进一步发现，通过提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶(glmS)的表达将代谢流量导向唾液酸合成途径的效果十分有限，而将6-磷酸葡萄糖胺合成酶(glmS)与果糖-1,6-双磷酸酯酶(glpX)或谷氨酰胺合成酶(glnA)(尤其是同时提高这三种酶的表达)时，6-磷酸葡萄糖胺合成酶可促进果糖6-磷酸导向唾液酸的代谢流量，果糖-1,6-双磷酸酯酶可提高代谢前体果糖6-磷酸的供给，谷氨酰胺合成酶可提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶的另一底物谷氨酰胺的合成，两者可进一步推动代谢流量更多地进入唾液酸合成途径，与高表达的6-磷酸葡萄糖胺合成酶协同配合作用，极大地促进唾液酸合成途径的代谢流量提高，进而显著提高唾液酸的产量。

基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有提高的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达和/或酶活性，以及提高的果糖-1,6-双磷酸酯酶和/或谷氨酰胺合成酶的表达和/或酶活性。

具体地，本发明提供以下任一种重组微生物：

(1)与出发菌株相比，具有提高的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达和/或酶活性，以及提高的果糖-1,6-双磷酸酯酶的表达和/或酶活性；

(2)与出发菌株相比，具有提高的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达和/或酶活性，以及提高的谷氨酰胺合成酶的表达和/或酶活性；

(3)与出发菌株相比，具有提高的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达和/或酶活性，以及提高的果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶的表达和/或酶活性。

本发明所述的出发菌株为能够合成唾液酸的微生物。能够合成唾液酸的微生物可为能够合成唾液酸的野生型菌株(或其衍生菌株)，或者对本身不能合成唾液酸的野生型菌株(或其衍生菌株)进行诱变或基因工程改造获得的菌株。

本发明的出发菌株对于其唾液酸的产量高低没有特别限制，为获得高产唾液酸的生产菌株，优选以具有相对较高唾液酸产量的菌株作为出发菌。

以下对于6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体、果糖-1,6-双磷酸酯酶、谷氨酰胺合成酶简称为目标酶。

以上所述的表达的提高具体可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：

(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；

(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件。

其中，(1)中所述的增加目标酶的编码基因的拷贝数可通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现。

(2)中所述的转录或翻译调控元件可为选自启动子、核糖体结合位点、增强子中的一种或多种。

对于导入携带目标酶的编码基因的质粒的方式，这些目标酶可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。

对于质粒，本发明没有特别的限制，只要能够在出发菌株中克隆、表达目标酶的质粒均可使用。对于质粒的拷贝数，本发明没有特别的限制，可为高拷贝质粒、中拷贝质粒或低拷贝质粒。为获得高产唾液酸的生产菌株，优选的质粒为拷贝数为5～100的质粒。

以出发菌株为大肠杆菌为例，所述质粒可为pXMJ19、pTrc99a、pET28a、pUC18等中的任一种。

作为本发明的一种优选方案，将6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体以及果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶置于一个质粒上进行过表达，质粒的拷贝数为5～100。

具体地，将6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体以及果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶合成酶置于pXMJ19上，从距离pXMJ19多克隆位点区启动子由近至远的方向，依次为6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体编码基因、果糖-1,6-双磷酸酯酶编码基因和谷氨酰胺合成酶编码基因。

对于在基因组上整合目标酶的编码基因的方式，整合编码基因的拷贝数至少为1个，对于整合拷贝数的具体数量，本发明没有特别的限制，为获得高产唾液酸的生产菌株，优选的整合拷贝数为1～10个。

对于将转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件的方式，可采用将目标酶的编码基因的启动子替换为活性更强的启动子，例如：trc、tac、J23110、T7、T5等。

本发明所述的酶活性的提高可利用目前已报道的以上目标酶的突变体，或者利用本领域常规技术手段对以上目标酶进行突变，获得酶活性提高的突变体。

本发明所述的重组微生物为选自棒杆菌属细菌、肠杆菌科细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母中的一种。

优选地，所述棒杆菌属细菌为选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)中的一种；

所述肠杆菌科细菌为选自大肠杆菌(Escherichia coli)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中的一种；

所述芽孢杆菌属细菌为选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中的一种；

所述酵母为选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)中的一种。

以上所述的用于增加目标酶的编码基因的拷贝数的编码基因来源于棒杆菌属细菌、肠杆菌科细菌、芽孢杆菌属细菌或酵母。

优选地，所述用于增加目标酶的编码基因的拷贝数的编码基因来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。

来源于上述各种微生物的目标酶的氨基酸序列以及编码基因序列均可通过NCBI等数据库获得。其中，来源于大肠杆菌的glmS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。来源于大肠杆菌的glpX的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。来源于谷氨酸棒杆菌的glpX的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。来源于大肠杆菌的glnA的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示。来源于谷氨酸棒杆菌的glnA的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明中，所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶的突变体为使得6-磷酸葡萄糖胺合成酶的活性提高和/或解除产物反馈抑制的突变体。

优选地，所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶的突变体相比于野生型6-磷酸葡萄糖胺合成酶具有E15K，D387V，S450P和E525G的突变。具有上述突变的突变体的酶活性更高且不受乙酰氨基葡萄糖的反馈抑制。本发明发现相比于其它突变体，该突变体能够与果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶更好地协同配合作用，更显著地提高唾液酸的产量。

作为本发明的一种优选方案，所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示。

对于出发菌株，本发明进一步提供了优选方案。具体地，所述的出发菌株与其野生型菌株相比，具有提高的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶(neuC)和N-乙酰神经氨酸合成酶(neuB)的表达和/或酶活性。

其中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶可来源于选自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)中的一种。

优选地，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶来源于空肠弯曲菌。过表达该UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶能够更好地与以上所述的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体以及果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶过表达配合作用，更有利于提高唾液酸的产量。

来源于空肠弯曲菌的neuB的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，neuC的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，neuBC基因簇的序列如SEQ ID NO.15所示。

(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；

作为本发明的一种优选方案，将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的编码基因与6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体以及果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶的编码基因共同置于一个质粒上进行过表达。具体地，从距离pXMJ19多克隆位点区启动子由近至远的方向，依次为N-乙酰神经氨酸合成酶的编码基因、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶编码基因、6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体编码基因、果糖-1,6-双磷酸酯酶编码基因和谷氨酰胺合成酶编码基因。

进一步地，所述出发菌株与野生型菌株相比，具有降低的N-乙酰神经氨酸醛缩酶(nanA)、N-乙酰神经氨酸转运蛋白(nanT)、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶(nanE)和N-乙酰甘露糖胺激酶(nanK)的表达和/或酶活性。

具体地，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：

(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；

(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件。

大肠杆菌中，nanA、nanT、nanE和nanK以基因簇形式存在，其序列如SEQ ID NO.16所示。

作为本发明的优选实施方式，所述出发菌株中N-乙酰神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸转运蛋白、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶和N-乙酰甘露糖胺激酶的编码基因同时失活。

本发明发现，在失活nanA、nanT、nanE和nanK、过表达neuBC的出发菌株基础上，仅需简单地过表达glmS、glpX、glnA而无需过多的、复杂的靶点改造，即可获得高产唾液酸的重组微生物。

作为本发明的一种具体实施方式，本发明提供一种重组微生物，其为含有过表达质粒pXMJ19-neuBC-glmS-glpX-glnA、且敲除了nanA、nanT、nanE和nanK的大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ19-neuBC-glmS-glpX-glnA。

作为本发明的另一种具体实施方式，本发明提供一种重组微生物，其为含有过表达质粒pXMJ19-neuBC-glmS(E15K，D387V，S450P，E525G)-glpX-glnA、且敲除了nanA、nanT、nanE和nanK的大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ19-neuBC-glmS*-glpX-glnA。

本发明还提供所述重组微生物的构建方法，其包括将用于提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶、果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶表达的质粒导入出发菌株的步骤。

具体地，针对大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ19-neuBC-glmS-glpX-glnA，其构建方法包括如下步骤：

(1)敲除大肠杆菌BL21的nanA、nanT、nanE和nanK；

(2)在pXMJ19的多克隆位点区依次连入neuBC、glmS(或其突变体glmS*)、glpX和glnA，得到过表达质粒pXMJ19-neuBC-glmS-glpX-glnA或pXMJ19-neuBC-glmS*-glpX-glnA；

(3)将步骤(2)得到的过表达质粒导入步骤(1)的敲除菌株中。

本发明还提供所述的重组微生物的如下任一种应用：

(1)在发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物中的应用；

(2)在用于生产唾液酸或唾液酸化化合物的微生物遗传育种中的应用。

本发明所述的唾液酸化化合物包括但不限于唾液酸化寡糖(唾液酸化乳糖等)、唾液酸化酯、唾液酸化糖酯、唾液酸化蛋白质或唾液酸化苷元。

本发明还提供一种发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物的方法，其包括培养所述重组微生物的步骤。

具体地，所述发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物的方法包括如下步骤：

(1)在包含至少一种可同化的碳源的培养基中培养所述重组微生物，获得包含唾液酸的发酵液；

(2)从方法步骤(1)中获得的发酵液中回收唾液酸。

其中，可同化的碳源可选自葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种。

本发明的有益效果在于：本发明通过对微生物进行改造获得了能够以葡萄糖、甘油等廉价碳源为原料发酵生产唾液酸的重组微生物，该重组微生物的唾液酸产量可达90g/L以上，远高于目前唾液酸的发酵生产水平，实现了从葡萄糖、甘油等廉价碳源到唾液酸的高效转化，显著降低唾液酸的生产成本，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1出发菌株的构建

本实施例以大肠杆菌BL21为例，构建能够合成唾液酸的出发菌株，具体为：在大肠杆菌BL21(购自中国工业微生物菌种保藏中心)中敲除nanATEK基因簇，同时导入过表达质粒pXMJ-neuBC，获得能够产唾液酸的出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC。

1、nanATEK的敲除

利用Red重组方法敲除nanATEK(基因簇序列如SEQ ID NO.16所示)，具体方法如下：以nan-F(ggtataacaggtataaaggtatatcgtttatcagacaagcatcacttcagaggtatttgtgtaggctggagctgcttc)和nan-R(tcataatttttctccctgggccaacagcgcagccccaagtaaacctgcatcatggcggtaatgcgccgccctgtcaaacatgagaattaa)为引物，以质粒pKD13(购自Addgene)为模板扩增获得1.3Kb的PCR片段，将该片段通过电转转入到包含质粒pSIJ8(购自Addgene)的大肠杆菌BL21中，在含有50mg/L的卡那霉素的LB平板上筛选获得抗性的菌株。挑取单克隆菌株在含有1％鼠李糖的LB培养基中过夜培养(42℃)，获得抗性消失的菌株，经鉴定nanATEK已被敲除，将敲除菌株命名为BL21△nanATEK。

2、过表达质粒pXMJ-neuBC的构建

人工合成neuBC基因，其基因序列如SEQ ID NO.15所示。利用Gibson组装的方法将neuBC基因插入到质粒pXMJ19(购自Addgene)的EcoRI/XbaI酶切位点处，获得过表达质粒pXMJ-neuBC。

3、出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC的构建

将过表达质粒pXMJ-neuBC电转入大肠杆菌BL21△nanATEK，在含有25mg/L氯霉素的LB平板上获得抗性菌株，经鉴定pXMJ-neuBC成功转入BL21△nanATEK中，将转入pXMJ-neuBC的菌株命名为BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC。

实施例2过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的重组菌的构建

在实施例1构建的出发菌株的基础上，进一步过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示)或其突变体E15K+D387V+S450P+E525G(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示)，具体方法如下：

1、过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶glmS或其突变体glmS*的质粒的构建

人工合成glmS*突变基因，序列如SEQ ID NO.12所示，该序列与来源于大肠杆菌W3110的glmS(野生型glmS，序列如SEQ ID NO.2所示)相比包含有以下突变E15K，D387V，S450P，E525G，与野生型glmS相比，该酶活性更高且不受乙酰氨基葡萄糖的抑制。将neuBC(SEQ ID NO.15)以及glmS或glmS*插入到质粒pXMJ19(购自addgene)的EcoRI/XbaI酶切位点处，获得质粒pXMJ-neuBC-glmS及pXMJ-neuBC-glmS*。

2、过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的菌株的构建

将质粒pXMJ-neuBC-glmS*电转入大肠杆菌BL21△nanATEK，获得的重组菌株命名为BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*。同时将包含来源于大肠杆菌W3110的glmS的质粒pXMJ-neuBC-glmS电转入大肠杆菌BL21△nanATEK，获得的重组菌株命名为BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS。

实施例3同时过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶和果糖-1,6-双磷酸酯酶的重组菌的构建

果糖-1,6-双磷酸酯酶能够催化果糖-1,6-双磷酸脱磷酸化产生果糖6-磷酸，本发明发现在过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶或者其突变体的基础上进一步过表达果糖-1,6-双磷酸酯酶glpX可以进一步提高唾液酸的产量。

同时过表达大肠杆菌6-磷酸葡萄糖胺合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示)或其突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示)以及果糖-1,6-双磷酸酯酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示)的重组菌的构建方法如下：

以大肠杆菌BL21的基因组为模板，以glpX-F(atatcctgcaggctgcttagagtttgctatgagacgagaacttgccatc)和glpX-R(atatcctgcaggtcagaggatg tgcacctgcatttccgg)为引物克隆获得约1.1kb的glpX片段。利用Gibson组装的方法将glpX片段插入到质粒pXMJ-neuBC-glmS或者pXMJ-neuBC-glmS*的酶切位点SbfI处，获得质粒pXMJ-neuBC-glmS-glpX及pXMJ-neuBC-glmS*-glpX。将质粒pXMJ-neuBC-glmS-glpX或pXMJ-neuBC-glmS*-glpX电转入大肠杆菌BL21△nanATEK，获得的菌株命名为BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX或BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX。

实施例4同时过表达6-磷酸葡萄糖胺合成酶、果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶的重组菌的构建

谷氨酰胺是合成唾液酸中氮的直接来源，本发明发现进一步过表达谷氨酰胺合成酶可以进一步提高唾液酸的产量。

同时过表达大肠杆菌6-磷酸葡萄糖胺合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示)或其突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示)、果糖-1,6-双磷酸酯酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示)和谷氨酰胺合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示)的重组菌的构建方法如下：

以大肠杆菌BL21的基因组为模板，以glnA-F(atatcctgcaggctg caatccaggagagttaaagtatgtccgctgaacacgtact)和glnA-R(atatcctgcaggagtttgagctgtactacagcgt ctaa)为引物克隆获得约1.4kb的glpX片段。利用Gibson组装的方法将glnA片段插入到质粒BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX的酶切位点BseRI处，获得质粒pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA。将质粒pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA电转入大肠杆菌BL21△nanATEK，获得的菌株命名为BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA。

实施例5重组菌的发酵验证

对实施例1构建的出发菌株以及实施例2-4构建的重组菌进行摇瓶发酵实验，以验证其产生唾液酸的能力。

发酵使用的培养基配方如下：

M9Y-葡萄糖培养基：葡萄糖30g/L,K₂HPO₄ 16g/L，KH₂PO₄ 14g/L，二水合柠檬酸钠1g/L，硫酸铵7.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L,CaCl₂ 15mg/L,酵母粉5g/L,氯霉素25mg/L；

M9Y-甘油培养基：甘油30g/L,K₂HPO₄ 16g/L，KH₂PO₄ 14g/L，二水合柠檬酸钠1g/L，硫酸铵7.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L,CaCl₂ 15mg/L,酵母粉5g/L,氯霉素25mg/L。

1、摇瓶发酵

将大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX和BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA以及出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC，在500mL的摇瓶进行培养，培养基为M9Y-葡萄糖或M9Y-甘油，培养温度为37℃，转速200rpm，在菌体长到OD₆₀₀达到0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。发酵72h时取样，利用高效液相色谱检测三株菌生产唾液酸的情况。

结果显示，在M9Y-甘油培养基中，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS和BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*唾液酸的产量分别达到4.59和5.49g/L，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX的唾液酸产量分别达到6.19和7.76g/L，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA唾液酸的产量达到9.24g/L，而出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC的唾液酸产量为3.04g/L。

在M9Y-葡萄糖培养基中，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS和BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*唾液酸的产量分别达到2.21和2.78g/L，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX唾液酸的产量分别达到3.16和3.79g/L，大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA唾液酸的产量达到4.77g/L，而出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC唾液酸的产量分别为1.29g/L。

以上结果表明：

(1)过表达glmS或其突变基因均可显著提高唾液酸的产量，特别是过表达突变基因glmS*可以更显著地提高唾液酸的产量。

(2)与单独过表达glmS相比，同时过表达glmS和glpX可以进一步显著提高唾液酸的产量。

(3)与单独过表达glmS以及同时过表达glmS和glpX相比，同时过表达glmS、glpX和glnA可以进一步显著提高唾液酸的产量。

此外，本发明发现过表达其他来源的果糖-1,6-双磷酸酯酶也可以显著提高唾液酸的产量，如过表达来源于谷氨酸棒杆菌的glpX_cg基因(蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示)，获得的重组菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX_cg,在相同的发酵条件下，唾液酸的产量与BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*相比提高了22％。

此外，本发明发现过表达其他来源的谷氨酰胺合成酶也可以显著提高唾液酸的产量，如表达来源于谷氨酸棒杆菌的glnA_cg基因(蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示)，获得的重组菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA_cg,在相同的发酵条件下，唾液酸的产量与BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX相比提高了24％。

2、发酵罐发酵

进一步在发酵罐中测试BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA、BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS，BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX和出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC生产唾液酸的能力。

发酵培养基为M9Y-甘油培养基，发酵温度为37℃，通过控制发酵罐的转速和通气量使得发酵过程的溶氧保持在10％以上，用25％的氨水控制pH在7.0。当发酵过程的OD₆₀₀达到20～30时加入1mM的IPTG进行诱导。当发酵液中的甘油浓度低于5g/L，流加600g/L的甘油以维持甘油浓度在5～10g/L。

结果显示，发酵72h，BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA的唾液酸产量达到92g/L，BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS-glpX的唾液酸产量为74g/L，而BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC-glmS*的唾液酸产量仅为52g/L，出发菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC的唾液酸产量仅为45g/L。

实施例6基因组整合glmS*-glpX-glnA的重组菌的构建

以实施例4构建的质粒pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA为模板，以引物ggg-F(tgcatgcctgcaggtcgactagaaaggtgtgttgatgaaggaaatcaaaat)和ggg-R(atatcctgcaggagtttgagctgtactacagcgtctaa gagatccccgcgctggagga)克隆获得约5.4kb的glmS*-glpX-glnA片段。以大肠杆菌BL21的基因组为模板，以引物pyk-F(tcctccagcgcggggatctcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatc)和(ttacaggacgtgaacagatg)为引物克隆获得约1.4kb的pyk片段。利用Gibson组装的方法将pyk片段和glmS*片段插入到自杀性质粒pKD13的BamHI/SalI位点处，获得质粒pKD-pyk-glmS*-glpX-glnA。将质粒pKD-pyk-glmS*电转入大肠杆菌BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC，在包含50mg/L的卡那霉素和25mg/L氯霉素的LB平板上筛选获得抗性的菌株，命名为BL21△nanATEK-ggg/pXMJ-neuBC。由于质粒pKD-pyk-glmS*-glpX-glnA不能在大肠杆菌BL21中复制，进一步通过菌落PCR验证glmS*-glpX-glnA整合到大肠杆菌的pyk基因位置。

将大肠杆菌BL21△nanATEK-ggg/pXMJ-neuBC和对照菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC在500mL的摇瓶进行培养，培养基为M9Y-甘油或者M9Y-葡萄糖，培养条件如实施例5的1中所示。在M9Y-甘油培养基中，大肠杆菌BL21△nanATEK-ggg/pXMJ-neuBC唾液酸的产量达到7.22g/L，而对照菌株BL21△nanATEK/pXMJ-neuBC，产量为2.94g/L。

实施例7产唾液酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建

将以上实施例构建的质粒pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA、pXMJ-neuBC-glmS*-glpX、pXMJ-neuBC-glmS*和pXMJ-neuBC分别电转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032(购自中国工业微生物菌种保藏中心)，获得的重组菌株分别命名为Cg/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA、Cg/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX、Cg/XMJ-neuBC-glmS*和Cg/pXMJ-neuBC。

将这四株菌在500mL的摇瓶进行培养，培养基为:葡萄糖40g/L,KH₂PO₄ 5g/L，NaCl1g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，MgSO₄ 1.5g/L,CaCl₂ 15mg/L,酵母粉5g/L,卡氯霉素5mg/L，培养温度为30度，转速200rpm，在菌体长到OD600达到0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导，发酵72h时取样，利用高效液相色谱检测唾液酸积累情况。谷氨酸棒杆菌Cg/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX-glnA、Cg/pXMJ-neuBC-glmS*-glpX、Cg/pXMJ-neuBC-glmS*和Cg/pXMJ-neuBC唾液酸的产量分别为4.2、3.1、2.0和1.1g/L。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种产唾液酸的重组微生物及其应用

<130> KHP201114835.5

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

35 40 45

Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu

50 55 60

His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu

65 70 75 80

Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val

85 90 95

Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu

100 105 110

Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu

130 135 140

Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val

145 150 155 160

Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly

165 170 175

Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu

195 200 205

Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp

210 215 220

Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln

225 230 235 240

Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu

245 250 255

Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile

260 265 270

Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu

275 280 285

Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser

290 295 300

Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly

305 310 315 320

Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

325 330 335

Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu

340 345 350

Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr

355 360 365

Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg

370 375 380

Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val

385 390 395 400

Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu

405 410 415

Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His

420 425 430

Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met

435 440 445

Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp

450 455 460

Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala

465 470 475 480

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu

485 490 495

Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp

500 505 510

Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu

515 520 525

Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu

530 535 540

Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met

545 550 555 560

His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe

565 570 575

Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys

580 585 590

Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val

595 600 605

Glu

<210> 2

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcggaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggctca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg caccggtatt gctcatactc gctgggcgac acacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca ttgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ttgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc tctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagct gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgca 1500

ggtgaactga aacacggtcc gctggcgctg attgatgccg atatgccggt tatcgtcgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaacta aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac caatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctac tggcttatca cgtcgcgctg atcaaaggta ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 3

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Arg Glu Leu Ala Ile Glu Phe Ser Arg Val Thr Glu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ala Gly Tyr Lys Trp Leu Gly Arg Gly Asp Lys Asn Thr Ala

20 25 30

Asp Gly Ala Ala Val Asn Ala Met Arg Ile Met Leu Asn Gln Val Asn

35 40 45

Ile Asp Gly Thr Ile Val Ile Gly Glu Gly Glu Ile Asp Glu Ala Pro

50 55 60

Met Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Val Gly Thr Gly Arg Gly Asp Ala Val

65 70 75 80

Asp Ile Ala Val Asp Pro Ile Glu Gly Thr Arg Met Thr Ala Met Gly

85 90 95

Gln Ala Asn Ala Leu Ala Val Leu Ala Val Gly Asp Lys Gly Cys Phe

100 105 110

Leu Asn Ala Pro Asp Met Tyr Met Glu Lys Leu Ile Val Gly Pro Gly

115 120 125

Ala Lys Gly Thr Ile Asp Leu Asn Leu Pro Leu Ala Asp Asn Leu Arg

130 135 140

Asn Val Ala Ala Ala Leu Gly Lys Pro Leu Ser Glu Leu Thr Val Thr

145 150 155 160

Ile Leu Ala Lys Pro Arg His Asp Ala Val Ile Ala Glu Met Gln Gln

165 170 175

Leu Gly Val Arg Val Phe Ala Ile Pro Asp Gly Asp Val Ala Ala Ser

180 185 190

Ile Leu Thr Cys Met Pro Asp Ser Glu Val Asp Val Leu Tyr Gly Ile

195 200 205

Gly Gly Ala Pro Glu Gly Val Val Ser Ala Ala Val Ile Arg Ala Leu

210 215 220

Asp Gly Asp Met Asn Gly Arg Leu Leu Ala Arg His Asp Val Lys Gly

225 230 235 240

Asp Asn Glu Asp Asn Arg Arg Ile Gly Glu Gln Glu Leu Ala Arg Cys

245 250 255

Lys Ala Met Gly Ile Glu Ala Gly Lys Val Leu Arg Leu Asp Asp Met

260 265 270

Ala Arg Ser Asp Asn Val Ile Phe Ser Ala Thr Gly Ile Thr Lys Gly

275 280 285

Asp Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Lys Gly Asn Ile Ala Thr Thr Glu

290 295 300

Thr Leu Leu Ile Arg Gly Lys Ser Arg Thr Ile Arg Arg Ile Gln Ser

305 310 315 320

Ile His Tyr Leu Asp Arg Lys Asp Pro Glu Met Gln Val His Ile Leu

325 330 335

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagacgag aacttgccat cgaattttcc cgcgtcaccg aatcagcggc gctggctggc 60

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gagaagctga tcgtcggacc gggagccaaa ggcaccattg atctgaacct gccgctggcg 420

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<210> 5

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu

1 5 10 15

Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val

20 25 30

Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met

35 40 45

Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly

50 55 60

Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val

65 70 75 80

Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp

85 90 95

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100 105 110

Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr

115 120 125

Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile

130 135 140

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145 150 155 160

Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His

165 170 175

Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu

180 185 190

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser

195 200 205

Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile

210 215 220

Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile

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Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly

245 250 255

Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp

260 265 270

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275 280 285

Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met

290 295 300

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys

1 5 10 15

Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val

20 25 30

Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Glu Phe Phe Glu Glu Gly Lys

35 40 45

Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser

50 55 60

Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Ile Arg Phe Gly Ser Ser

130 135 140

Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn

145 150 155 160

Ser Ser Thr Gln Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val

165 170 175

Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Ile

180 185 190

Arg Ser Glu Met Cys Leu Val Met Glu Gln Met Gly Leu Val Val Glu

195 200 205

Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr

210 215 220

Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys

225 230 235 240

Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe

245 250 255

Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His

260 265 270

Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ala Gly Asp Lys Tyr

275 280 285

Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys

290 295 300

His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ala Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr

305 310 315 320

Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser

325 330 335

Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ser Ser Pro

340 345 350

Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro

355 360 365

Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys

370 375 380

Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu

385 390 395 400

Pro Pro Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu

405 410 415

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465

<210> 8

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtccgctg aacacgtact gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgttgatttg 60

cgcttcaccg atactaaagg taaagaacag cacgtcacta tccctgctca tcaggtgaat 120

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tatgttgtgc acaacgtagc gcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccaaaaccg 780

atgttcggtg ataacggctc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtctaa aaacggcgtt 840

aacctgttcg caggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacattggc 900

ggcgtaatca aacacgctaa agcgattaac gccctggcaa acccgaccac caactcttat 960

aagcgtctgg tcccgggcta tgaagcaccg gtaatgctgg cttactctgc gcgtaaccgt 1020

tctgcgtcta tccgtattcc ggtggtttct tctccgaaag cacgtcgtat cgaagtacgt 1080

ttcccggatc cggcagctaa cccgtacctg tgctttgctg ccctgctgat ggccggtctt 1140

gatggtatca agaacaagat ccatccgggc gaagccatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200

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gtagagtttg agctgtacta cagcgtctaa 1410

<210> 9

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu

1 5 10 15

Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu

20 25 30

Gln His Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Glu

35 40 45

Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile

50 55 60

Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His

85 90 95

Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala

100 105 110

Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys

115 120 125

Asn Phe Gly Ala Glu Ala Glu Phe Tyr Leu Phe Asp Ser Val Arg Tyr

130 135 140

Ser Thr Glu Met Asn Ser Gly Phe Tyr Glu Val Asp Thr Glu Glu Gly

145 150 155 160

Trp Trp Asn Arg Gly Lys Glu Thr Asn Leu Asp Gly Thr Pro Asn Leu

165 170 175

Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr

180 185 190

Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala

195 200 205

Ser Gly Phe Ala Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln

210 215 220

Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp

225 230 235 240

Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly

245 250 255

Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser

260 265 270

Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe

275 280 285

His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr

290 295 300

Ile Gly Gly Ile Leu His His Ala Gly Ala Val Leu Ala Phe Thr Asn

305 310 315 320

Ala Thr Leu Asn Ser Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Phe Glu Ala Pro

325 330 335

Ile Asn Leu Val Tyr Ser Gln Arg Asn Arg Ser Ala Ala Val Arg Ile

340 345 350

Pro Ile Thr Gly Ser Asn Pro Lys Ala Lys Arg Ile Glu Phe Arg Ala

355 360 365

Pro Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Ala Ala Met Met Met

370 375 380

Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn Arg Ile Glu Pro His Ala Pro Val

385 390 395 400

Asp Lys Asp Leu Tyr Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ile Pro

405 410 415

Gln Ala Pro Thr Ser Leu Glu Ala Ser Leu Lys Ala Leu Gln Glu Asp

420 425 430

Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ser Asp Val Phe Thr Glu Asp Leu Ile Glu

435 440 445

Ala Tyr Ile Gln Tyr Lys Tyr Asp Asn Glu Ile Ser Pro Val Arg Leu

450 455 460

Arg Pro Thr Pro Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Phe Asp Cys

465 470 475

<210> 10

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60

gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120

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atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780

ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840

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gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020

tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccgaag 1080

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<210> 11

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Lys Ile

1 5 10 15

Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

35 40 45

Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu

50 55 60

His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu

65 70 75 80

Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val

85 90 95

Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu

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Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

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130 135 140

Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val

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Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly

165 170 175

Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu

195 200 205

Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp

210 215 220

Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln

225 230 235 240

Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu

245 250 255

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Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu

275 280 285

Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser

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Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly

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Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

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Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg

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Glu Ser Val Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val

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Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu

405 410 415

Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His

420 425 430

Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met

435 440 445

Leu Pro Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp

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Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala

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Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu

485 490 495

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Glu

<210> 12

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Lys Glu Ile Lys Ile Gln Asn Ile Ile Ile Ser Glu Glu Lys Ala

1 5 10 15

Pro Leu Val Val Pro Glu Ile Gly Ile Asn His Asn Gly Ser Leu Glu

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Gln Lys Cys Ala Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Leu Ala Leu Lys Glu Tyr

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Gly Ala Asn Arg Leu Glu Asp Met Gly Val Ser Ala Phe Lys Ile Gly

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Lys Lys Pro Met Ile Val Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile Glu Ser Ile

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Lys Pro Thr Val Lys Ile Leu Leu Asp Asn Glu Ile Pro Phe Val Leu

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180 185 190

Asn Ala Met Leu Glu Leu Lys Lys Glu Phe Ser Cys Met Val Gly Leu

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Ser Asp His Thr Thr Asp Asn Leu Ala Cys Leu Gly Ala Val Val Leu

210 215 220

Gly Ala Cys Val Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Ser Met His Arg Ser

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Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asp Thr Lys Ala Leu Lys Glu Leu

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Ile Ile Gln Ser Glu Gln Met Ala Ile Ile Arg Gly Asn Asn Glu Ser

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Lys Lys Ala Ala Lys Gln Glu Gln Val Thr Ile Asp Phe Ala Phe Ala

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Ser Val Val Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Val Leu Ser Met

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Glu Phe Glu Asn Ile Leu Gly Lys Lys Ala Leu Arg Asp Ile Glu Asn

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Asp Ala Gln Leu Ser Tyr Glu Asp Phe Ala

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<210> 14

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Lys Lys Ile Leu Phe Ile Thr Gly Ser Arg Ala Asp Tyr Ser Lys

1 5 10 15

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Val Lys Glu Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Lys Asn Ile Tyr Glu Phe Ile

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Asp Gly Phe Ser Arg Tyr Ala Asn Glu Leu Lys Pro Asp Leu Ile Val

85 90 95

Val His Gly Asp Arg Ile Glu Pro Leu Ala Ala Ala Ile Val Gly Ala

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Leu Asn Asn Ile Leu Val Ala His Ile Glu Gly Gly Glu Ile Ser Gly

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Glu Asp Glu Lys Ser Ile Phe Ile Ile Gly Ser Pro Asp Leu Glu Leu

165 170 175

Leu Asn Asp Asn Lys Ile Ser Leu Ser Glu Ala Lys Lys Tyr Tyr Asp

180 185 190

Ile Asn Tyr Glu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Phe His Pro Val Thr Thr

195 200 205

Glu Ile Thr Ser Ile Lys Asn Gln Ala Asp Asn Leu Val Lys Ala Leu

210 215 220

Ile Gln Ser Asn Lys Asn Tyr Ile Val Ile Tyr Pro Asn Asn Asp Leu

225 230 235 240

Gly Phe Glu Leu Ile Leu Gln Ser Tyr Glu Glu Phe Lys Asn Asn Pro

245 250 255

Arg Phe Lys Leu Phe Pro Ser Leu Arg Phe Glu Tyr Phe Ile Thr Leu

260 265 270

Leu Lys Asn Ala Asp Phe Ile Ile Gly Asn Ser Ser Cys Ile Leu Lys

275 280 285

Glu Ala Leu Tyr Leu Lys Thr Ala Gly Ile Leu Val Gly Ser Arg Gln

290 295 300

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Asp Glu Ile Leu Lys Ala Ile Asn Thr Ile His Lys Lys Gln Asp Leu

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Phe Ser Ala Lys Leu Glu Ile Leu Asp Ser Ser Lys Leu Phe Phe Glu

340 345 350

Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Phe Phe Lys Leu Ser Thr Gln Lys Val Phe

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Lys Asp Ile Lys

370

<210> 15

<211> 2174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaaggaaa tcaaaatcca aaacattatt attagcgagg agaaagcccc gctggtagtg 60

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atcgccgcgt ttaaaaagcc tatgatcgta agcaccggta tgaactcgat cgagagcatt 480

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gttacgattg attttgcctt cgcttctgtc gtgtcaatta aagacattaa gaaaggcgag 900

gttctttcca tggataacat ctgggtgaaa cgtcctggtc ttggaggtat ttccgcagca 960

gagtttgaga acattcttgg caaaaaggct ctgcgcgata ttgaaaatga cgcacaactt 1020

tcatacgaag actttgccta aagaaaggtg tgttgatgaa gaagattctt tttatcacgg 1080

gatcacgggc agattattcg aaaatcaaat cacttatgta tcgggttcag aatagctcag 1140

aattcgaact ctacatcttc gcaactggca tgcaccttag caaaaatttc ggctatactg 1200

ttaaagaact ctacaagaac ggattcaaga atatttacga gtttatcaac tatgacaaat 1260

actatcagac cgacaaagca ctcgcaacca ctatcgacgg ctttagccgg tacgcaaatg 1320

aactcaaacc agaccttatt gtagtacacg gtgaccgcat cgaaccgctt gcagctgcca 1380

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ttggctctcc tgatcttgaa ctgcttaacg ataataagat ttcactctcg gaggccaaga 1620

aatattacga tattaattac gagaattacg cacttctgat gttccaccca gtaactactg 1680

aaattacttc tatcaaaaac caagctgata atcttgtcaa ggcattgatt cagagcaata 1740

agaattacat tgtaatttat cccaacaacg atttgggctt cgaactgatc ctgcaatcct 1800

acgaagaatt caaaaacaac ccgcgcttca agttgttccc gtccctccgt tttgaatatt 1860

tcattacgtt gctgaaaaac gcagatttta ttattggtaa cagctcgtgt atcttgaagg 1920

aagcgcttta tctgaagact gccggcattc ttgtcggttc ccggcaaaat ggccgcctgg 1980

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<210> 16

<211> 4102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggcaacga atttacgtgg cgtaatggct gcactcctga ctccttttga tcaacaacaa 60

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tatctgccag aactgaaggc gctggcccag cagttgatgc aagagcgcgg gtgagttgtt 900

tcccctcgct cgcccctacc gggtgagggg aaataaacgc atctgtaccc tacaattttc 960

ataccaaagc gtgtgggcat cgcccaccgc gggagactca caatgagtac tacaacccag 1020

aatatcccgt ggtatcgcca tctcaaccgt gcacaatggc gcgcattttc cgctgcctgg 1080

ttgggatatc tgcttgacgg ttttgatttc gttttaatcg ccctggtact caccgaagta 1140

cagggtgaat tcgggctgac gacggtgcag gcggcaagtc tgatctctgc agcctttatc 1200

tctcgctggt tcggcggcct gatgctcggc gctatgggtg accgctacgg gcgtcgtctg 1260

gcaatggtca ccagcatcgt tctcttctcg gccgggacgc tggcctgcgg ctttgcgcca 1320

ggctacatca ccatgtttat cgctcgtctg gtcatcggca tggggatggc gggtgaatac 1380

ggttccagcg ccacctatgt cattgaaagc tggccaaaac atctgcgtaa caaagccagt 1440

ggttttttga tttcaggctt ctctgtgggg gccgtcgttg ccgctcaggt ctatagcctg 1500

gtggttccgg tctggggctg gcgtgcgctg ttctttatcg gcattttgcc aatcatcttt 1560

gctctctggc tgcgtaaaaa catcccggaa gcggaagact ggaaagagaa acacgcaggt 1620

aaagcaccag tacgcacaat ggtggatatt ctctaccgtg gtgaacatcg cattgccaat 1680

atcgtaatga cactggcggc ggctactgcg ctgtggttct gcttcgccgg taacctgcaa 1740

aatgccgcga tcgtcgctgt tcttgggctg ttatgcgccg caatctttat cagctttatg 1800

gtgcagagta caggcaaacg ctggccaacg ggcgtaatgc tgatggtggt cgtgttgttt 1860

gctttcctct actcatggcc gattcaggcg ctgctgccaa cgtatctgaa aaccgatctg 1920

gcttataacc cgcatactgt agccaatgtg ctgttcttta gtggctttgg cgcggcggtg 1980

ggatgctgcg taggtggctt cctcggtgac tggctgggaa cccgcaaagc gtacgtttgt 2040

agcctgctgg cctcgcagct gctgattatt ccggtatttg cgattggcgg cgcaaacgtc 2100

tgggtgctcg gtctgttact gttcttccag caaatgcttg gacaagggat cgccgggatc 2160

ttaccaaaac tgattggcgg ttatttcgat accgaccagc gtgcagcggg cctgggcttt 2220

acctacaacg ttggcgcatt gggcggtgca ctggccccaa tcatcggcgc gttgatcgct 2280

caacgtctgg atctgggtac tgcgctggca tcgctctcgt tcagtctgac gttcgtggtg 2340

atcctgctga ttgggctgga tatgccttct cgcgttcagc gttggttgcg cccggaagcg 2400

ttgcgtactc atgacgctat cgacggtaaa ccattcagcg gtgccgtgcc gtttggcagc 2460

gccaaaaacg atttagtcaa aaccaaaagt taatcctgtt gcccggtcta tgtaccgggc 2520

ctttcgctaa gggaagatgt atgtcgttac ttgcacaact ggatcaaaaa atcgctgcta 2580

acggtggcct gattgtctcc tgccagccgg ttccggacag cccgctcgat aaacccgaaa 2640

tcgtcgccgc catggcatta gcggcagaac aggcgggcgc ggttgccatt cgcattgaag 2700

gtgtggcaaa tctgcaagcc acgcgtgcgg tggtgagcgt gccaattatc gggattgtga 2760

aacgcgatct ggaggattct ccggtacgca tcacggccta tattgaagat gttgatgcgc 2820

tggcgcaggc gggcgcggac attatcgcca ttgacggcac cgaccgcccg cgtccggtgc 2880

ctgttgaaac gctgctggca cgtattcacc atcacggttt actggcgatg accgactgct 2940

caacgccgga agacggcctg gcatgccaaa agctgggagc cgaaattatt ggcactacgc 3000

tttctggcta taccacgcct gaaacgccag aagagccgga tctggcgctg gtgaaaacgt 3060

tgagcgaagc cggatgtcgg gtgattgccg aagggcgtta caacacgcct gctcaggcgg 3120

cagatgcgat gcgccacggc gcgtgggcgg tgacggtcgg ttctgccatt acgcgtcttg 3180

aacacatttg tcagtggtac aacacagcga tgaaaaaggc ggtgctatga ccacactggc 3240

gattgatatc ggcggtacta aacttgccgc cgcgctgatt ggcgctgacg ggcagatccg 3300

cgatcgtcgt gaacttccta cgccagccag ccagacacca gaagccttgc gtgatgcctt 3360

atccgcatta gtctctccgt tgcaagctca tgcgcagcgg gttgccatcg cttcaaccgg 3420

aattattcgc gacggcagtt tgctggcgct gaatccgcat aatctcggtg gattgctaca 3480

ctttccgtta gtcaaaacgc tggaacaact taccaatttg ccgaccattg ccattaacga 3540

cgcgcaggcc gcagcatggg cagagtatca ggcgctggaa ggcgatataa ccgatatggt 3600

ctttatcacc gtttccactg gcgtcggcgg cggtgtagtg agcggcggca aactgcttac 3660

cggccctggc ggtctggcgg ggcacatcgg gcatacgctt gccgatccac acggcccagt 3720

ctgcggctgt ggacgcacag gttgcgtgga agcaattgct tctggtcgcg gcattgcggc 3780

ggcagcgcag ggcgagctgg ctggcgcgga tgcgagaact attttcacac gcgccgggca 3840

gggcgatgag caggcgcagc aactgattca tcgctccgca cgtacgcttg caaggctgat 3900

cgctgatatt aaagccacaa ctgattgcca gtgcgtggtg gttggtggca gcgttggtct 3960

ggcagaaggg tatctggcgt tggtggaaat gtatctggcg caggagccag cggcatttca 4020

tgttgattta ctggcggcgc attaccgcca tgatgcaggt ttacttgggg ctgcgctgtt 4080

ggcccaggga gaaaaattat ga 4102

<210> 17

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtataacag gtataaaggt atatcgttta tcagacaagc atcacttcag aggtatttgt 60

gtaggctgga gctgcttc 78

<210> 18

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcataatttt tctccctggg ccaacagcgc agccccaagt aaacctgcat catggcggta 60

atgcgccgcc ctgtcaaaca tgagaattaa 90

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atatcctgca ggctgcttag agtttgctat gagacgagaa cttgccatc 49

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atatcctgca ggtcagagga tgtgcacctg catttccgg 39

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atatcctgca ggctgcaatc caggagagtt aaagtatgtc cgctgaacac gtact 55

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atatcctgca ggagtttgag ctgtactaca gcgtctaa 38

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgcatgcctg caggtcgact agaaaggtgt gttgatgaag gaaatcaaaa t 51

<210> 24

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atatcctgca ggagtttgag ctgtactaca gcgtctaaga gatccccgcg ctggagga 58

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcctccagcg cggggatctc atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc 50

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttacaggacg tgaacagatg 20

Claims

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比，具有提高的6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的表达和/或酶活性，以及提高的果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶的表达和/或酶活性；

所述出发菌株为能够合成唾液酸的微生物；

所述出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；且在出发菌株中降低nanATEK基因簇的表达或酶活性，同时过表达UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的编码基因；

所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.11所示；所述果糖-1,6-双磷酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述表达或酶活性的提高通过增加目标酶的编码基因的拷贝数实现。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述增加目标酶的编码基因的拷贝数通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现。

3.根据权利要求1～2任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶的突变体为使得6-磷酸葡萄糖胺合成酶的活性提高和/或解除产物反馈抑制的突变体。

4.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶的突变体相比于野生型6-磷酸葡萄糖胺合成酶具有E15K，D387V，S450P和E525G的突变。

5.根据权利要求1～2、4任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述出发菌株与其野生型菌株相比，具有提高的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的表达和/或酶活性。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)中的一种。

7.根据权利要求1～2、4、6任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述出发菌株与野生型菌株相比，具有降低的选自N-乙酰神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸转运蛋白、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶和N-乙酰甘露糖胺激酶中的一种或多种的表达和/或酶活性。

8.根据权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：

9.权利要求1～8任一项所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，包括将用于提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶、果糖-1,6-双磷酸酯酶和谷氨酰胺合成酶表达的质粒导入出发菌株的步骤。

10.权利要求1～8任一项所述的重组微生物的如下任一种应用：

(1)在发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物中的应用；

11.一种发酵生产唾液酸或唾液酸化化合物的方法，其特征在于，包括培养权利要求1～8任一项所述的重组微生物的步骤。