KR20230108789A - L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 L-히스티딘의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 에스케리치아 속 변이주는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 강화함으로써 당 이용능을 증가시켜 L-히스티딘의 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

Description

L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 L-히스티딘의 생산 방법{Mutant in Escherichia with enhanced L-histidine productivity and method for preparing L-histidine using the same}

본 발명은 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 L-히스티딘의 생산 방법에 관한 것이다.

L-히스티딘(Histidine)은 사람이나 동물 체내에서 합성되지 않는 필수아미노산으로서 외부에서 공급되어야 하며, 일반적으로 세균이나 효모와 같은 미생물을 이용한 발효에 의해 생산된다. L-히스티딘 생산은 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 L-히스티딘 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다. 최근에는 L-히스티딘의 생산 효율을 개선시키기 위해 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-히스티딘 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법이 개발되고 있다.

한국등록특허 제10-1904666호 및 제10-2004917호에는 히스티딘 생합성 경로에 관여하는 효소나 수송 단백질을 대상으로 유전자 변이를 유도함으로써 해당 단백질의 활성을 강화시키거나 약화시켜 히스티딘 생산량을 증대시키는 방법이 개시되어 있다. 이외에도, 히스티딘 생산에 작용하는 물질의 발현량을 조절하거나 대사흐름을 최적화하는 방법 또한 이용되고 있다.

이와 같이 L-히스티딘 생산성을 증가시키는 다양한 방법이 개발되고 있으나, L-히스티딘 생산에 직간접적으로 연관된 효소, 전사인자, 수송 단백질 등 단백질의 종류가 수십여 종에 이르기 때문에 이러한 단백질의 활성 변화에 따른 L-히스티딘 생산능 증가 여부에 관해 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1904666호 한국등록특허 제10-2004917호

본 발명은 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아(Escherichia) 속 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주를 이용한 L-히스티딘의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 에스케리치아 속 균주를 이용하여 L-히스티딘 생산능이 향상된 새로운 변이주를 개발하기 위해 연구한 결과, L-히스티딘 생합성 과정에서 원활한 탄소원 공급을 위해 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자 galP를 과발현한 경우 L-히스티딘 생산량이 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양상은 갈락토스:H+ 동반수송체의 활성이 강화되어 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “갈락토스:H+ 동반수송체(galactose:H+ symporter)”는 갈락토스, 글루코스 등의 당을 세포 내로 수송하는 막 단백질의 일종으로, 갈락토스 투과효소(galactose permease)라고도 한다.

본 발명에서 사용된 “활성이 강화”는 목적하는 효소, 전사 인자, 수송 단백질 등의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 새로 도입되거나 증대되어 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 발현량이 증가되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 강화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 증가한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 증가 또는 번역 증가 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 높은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 갈락토스:H+ 동반수송체의 활성 강화는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자가 도입되거나, 또는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자의 프로모터에 위치 특이적 변이를 유발하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “프로모터”는 목적하는 유전자의 mRNA 전사를 개시하는 RNA 중합효소(polymerase)에 대한 결합부위를 포함하여 유전자의 전사를 조절하는 DNA의 특정 부위를 의미하며, 일반적으로 전사 개시점을 기준으로 상위(upstream)에 위치한다. 원핵생물에서의 프로모터는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시점 주변의 부위로 정의되며, 일반적으로 전사 개시점으로부터 앞쪽으로 -10 영역과 -35 영역의 염기쌍이 떨어져 있는 두 개의 짧은 염기서열로 구성된다. 본 발명에서의 프로모터 변이는 야생형 프로모터에 비해 높은 활성을 가지도록 개량하는 것으로, 전사 개시점의 상위에 위치한 프로모터 영역 안에서 변이, 보다 구체적으로 일부 또는 전부가 삽입, 치환, 결실 또는 이들의 조합으로 변이를 유발함으로써 하위(downstream)에 위치한 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 갈락토스:H+ 동반수송체는 에스케리치아 속 균주에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 에스케리치아 속 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르만니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 갈락토스:H+ 동반수송체는 에스케리치아 속 균주에서 유래된 유전자의 일부 또는 전부가 삽입, 치환, 결실 또는 이들이 조합으로 변이된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “일부”는 아미노산 서열, 염기서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부가 아닌 것을 의미하며, 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 갈락토스:H+ 동반수송체제를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “생산능이 향상된”은 모균주에 비해 L-히스티딘의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 에스케리치아 속 균주 또는 야생형으로부터 변이된 에스케리치아 속 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 모균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르만니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 모균주로 E. coli DS9H 균주 (KCTC18430P)를 사용하였다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변이주는 에스케리치아 콜라이, 즉 대장균인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장균에 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 galP 유전자를 도입하여 galP 도입 변이주를 획득하였다. 이러한 변이주는 galP가 도입됨으로써 글루코스 흡수능이 향상되어 모균주에 비해 증가된 L-히스티딘 생산능을 나타내며, 특히 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 5% 이상, 구체적으로는 5 내지 40% (바람직하게는 10 내지 30%) 증가되어 균주 배양액 1 ℓ 당 8 ~ 20 g의 L-히스티딘을 생산할 수 있으며, 바람직하게는 8.5 ~ 15 g의 L-히스티딘을 생산할 수 있다.

이러한 galP 도입 변이주는 히스티딘 생합성 경로에서 부산물인 아세트산의 생산을 억제하기 위해 피루브산 탈수소효소(pyruvate dehydrogenase)의 poxB 유전자가 결손되더라도 향상된 글루코스 흡수능으로 인해 모균주에 비해 당 소모 속도가 증가하고 높은 수준의 히스티딘 생산량을 유지할 수 있다.

poxB 유전자는 에스케리치아 속 균주에서 유래된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 galP 유전자는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르만니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어지는 군에서 선택된 1종의 균주에서 유래된 것일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 poxB 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되거나, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 에스케리치아 속 변이주는 모균주에 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 galP 유전자 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 통해 구현될 수 있다.

본 발명에서 사용된 “변이체”는 L-히스티딘의 생합성에 관여하는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 galP 유전자의 일부 또는 전부가 삽입, 치환, 결실 또는 이들이 조합으로 된 변이체를 의미한다.

본 발명에서 사용된 “벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된(operably linked) 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 의미한다. 여기서, “작동 가능하게 연결된”은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결된 것을 의미하고, “조절요소”는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 “재조합 벡터”는 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이때, 상기 "적합한 숙주세포"는 벡터가 복제 가능한 것으로서 복제가 개시되는 특정 염기서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.

상기 형질전환은 숙주세포에 따라 적합한 벡터 도입 기술이 선택되어 목적하는 유전자를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 도입은 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat-shock), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.

상기 숙주세포는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물이다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환 된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 형질전환용 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자들은 상동 재조합 교차로 인하여 에스케리치아 속 미생물과 같은 숙주세포 내로 치환될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 숙주세포는 에스케리치아 속 균주일 수 있으며, 예를 들면 대장균일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 a) 상기 에스케리치아 속 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이주 및 변이주가 배양된 배지에서 L-히스티딘을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-히스티딘을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 히스티딘을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-히스티딘을 회수하는 단계는 L-히스티딘을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 에스케리치아 속 변이주는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 강화함으로써 당 이용능을 증가시켜 L-히스티딘의 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. galP 유전자가 도입된 플라스미드 제작

E. coli DS9H (KCTC18430P) genomic DNA로부터 galP-F 및 galP-R 프라이머 쌍과 pfu premix (bioneer)를 사용하여 galP 유전자를 PCR 증폭하였다. PCR 수행 조건으로는 반응물의 총 부피를 50 ㎕로 하여 95℃에서 5분간 반응한 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분/kb으로 총 30회 실시하였고, 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분간 유지하였다. 이후 PCR 증폭에서도 동일한 조건으로 실시하였다. 그리고 증폭한 PCR 단편과 pTRC99A 플라스미드 (GE Healthcare)에 NcoI 및 HindIII (NEB) 제한효소를 처리하고 T4 ligase (Takara)를 사용하여 pTRC99A-galP 플라스미드를 제작하였다. 최종적으로 pTRC99A-CF 및 pTRC99A-CR 프라이머를 사용하여 서열을 확인하였다.

여기서 사용된 프라이서 서열은 하기 표 1과 같다.

프라이머 명칭	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
galP-F	ATATCCATGGATGCCTGACGCTAAAAAACAG	5
galP-R	ATATAAGCTTTTAATCGTGAGCGCCTATTTCG	6
pTRC99A-CF	ATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAA	7
pTRC99A-CR	TACTGCCGCCAGGCAAATTC	8

실시예 2. galP 유전자가 도입된 히스티딘 생산능 향상 변이주의 제조

세포내 글루코스 흡수능을 강화하기 위해 갈락토스:H+ 동반수송체(Galactose:H+ symporter)를 암호화하는 galP 유전자가 도입된 변이주를 제작하였다.

여기서 galP 유전자가 도입된 E. coli DS9H 균주는 증류수 1 L에 트립톤 10.0 g, NaCl 10.0 g, 효모 추출물 5.0 g 및 암피실린 100 mg/L 조성의 LB 배지 상에서 37℃의 온도로 배양하였다.

항생제 카나마이신(kanamycin)과 암피실린(ampicillin)은 시그마(Sigma)사의 제품을 사용하였다.

DNA 시퀀싱 분석은 마크로젠(주)에 의뢰하여 분석하였다.

E. coli DS9H 균주 (KCTC18430P)의 염색체에 galP 도입을 위해 원스텝 불화성화 방법 (Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 이용하였다. 먼저 상동 재조합(homologous recombination)을 위한 해당 유전자의 염색체내의 도입 위치로 pgi 유전자의 down-stream을 선정하였다. pgi 유전자의 down-stream의 앞쪽과 뒤쪽 단편을 얻기 위해, E. coli DS9H genomic DNA를 주형으로 하여 Dpgi_HF-F 및 Dpgi_HF-R 프라이머 쌍, Dpgi_HR-F 및 Dpgi_HR-R 프라이머 쌍을 각각 사용하여 PCR 증폭을 통해 각각 Dpgi_HF와 Dpgi_HR 단편을 증폭하였다. 그리고 카나마이신 항생제 마커 및 FRT가 포함된 카세트를 얻기 위해, pKD13 플라스미드로부터 FRT(Dpgi_HF)-F 및 FRT(galP)-R 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 카세트 단편을 얻었다. 마지막으로 Trc-galP를 얻기 위해서, 실시예 1의 pTRC99A-galP 플라스미드로부터 galP+FRT-F 및 galP+Dpgi_HR-R 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 Trc-galP 단편을 얻었다. PCR 수행 조건으로는 반응물의 총 부피를 50 ㎕로 하여 95℃에서 5분간 반응한 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분/kb으로 총 30회 실시하였고, 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분간 유지하였다. 이후 PCR 증폭에서도 동일한 조건으로 실시하였다. 이러한 4개의 PCR 단편들을 주형으로 하여 Dpgi_HF-F 및 Dpgi_HR-R 프라이머 쌍을 사용하여 overlapping PCR을 이용하여 하나의 단편으로 연결시켰다. 하나로 연결된 DNA 단편을 pKD46 플라스미드를 가지고 있는 E. coli DS9H 균주에 전기천공법 (Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347)으로 도입하였다.

이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주들을 대상으로 Dpgi-CF 및 Dpgi-CR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하여 카나마이신 카세트가 도입된 균주들을 확인하였다. 도입이 확인된 균주들을 대상으로 항생제 (카나마이신) 내성 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다. 카나마이신 카세트 도입이 확인된 균주에 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도한 후, 항생제 (카나마이신) 첨가 및 미첨가된 LB 평판배지들에서 각각 생장 여부를 통해 항생제 제거 여부를 확인하였다. 항생제 유전자가 제거된 균주들은 LB 평판배지에서 생장하는 반면, 항생제 (카나마이신, 50 mg/L)가 첨가된 LB 평판배지에서는 생장하지 못함을 이용하여 확인하였다. 그리고 최종적으로 Dpgi-CF 및 Dpgi-CR 프라이머 쌍을 사용하여 서열을 확인하였고, galP가 도입된 변이주 (DS9H-1)를 획득하였다.

여기서 사용된 프라이서 서열은 하기 표 2와 같다.

프라이머 명칭	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
Dpgi_HF-F	GCAGGAATATCGTGATCAGGG	9
Dpgi_HF-R	GCCAGCTGTTTACCCAGTTC	10
FRT(Dpgi_HF)-F	GAACTGGGTAAACAGCTGGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	11
FRT(galP)-R	ATCAATTCGCGCTAACTCACACATGAGAATTAATTCCGGGG	12
galP+FRT-F	CCCGGAATTAATTCTCATGTGTGAGTTAGCGCGAATTGATCTG	13
galP+Dgpi_HR-R	ACCTGTAGGCCTGATAAGACTTAATCGTGAGCGCCTATTTCG	14
Dpgi_HR-F	GTCTTATCAGGCCTACAGGTCG	15
Dpgi_HR-R	CAAAAGCAATTAATCTGCGTAT	16
Dpgi-CF	ATACCGGCAAAGCAATCACTG	17
Dpgi-CR	AGTATACACAACTAAAGCATGCG	18

실시예 3. galP 유전자가 도입되고 poxB 유전자가 결손된 히스티딘 생산능 향상 변이주의 제조

실시예 2에서 제조된 변이주의 히스티딘 생산능을 더욱 향상시키기 위해, galP 유전자 도입과 함께 부산물인 아세트산 생산에 관여하는 피루브산 탈수소효소(pyruvate dehydrogenase)를 암호화하는 poxB 유전자가 결손된 변이주를 제작하였다.

E. coli DS9H 균주 (KCTC18430P)의 염색체에 galP 도입 및 poxB 파쇄를 위해 원스텝 불화성화 방법 (Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 이용하였다. 먼저 상동 재조합(homologous recombination)을 위한 poxB 유전자 앞쪽과 뒤쪽 단편을 얻기 위해, E. coli DS9H genomic DNA를 주형으로 하여 poxB_HF-F 및 poxB_HF-R 프라이머 쌍, poxB_HR-F 및 poxB_HR-R 프라이머 쌍을 각각 사용하여 PCR 증폭을 통해 각각 poxB_HF와 poxB_HR 단편을 증폭하였다. 그리고 카나마이신 항생제 마커 및 FRT가 포함된 카세트를 얻기 위해, pKD13 플라스미드로부터 FRT(poxB_HF)-F 및 FRT(galP)-R 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 카세트 단편을 얻었다. 마지막으로 Trc-galP를 얻기 위해서, 실시예 1의 pTRC99A-galP 플라스미드로부터 galP+FRT-F 및 galP+poxB_HR-R 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 Trc-galP 단편을 얻었다. 이러한 4개의 PCR 단편들을 주형으로 하여 poxB_HF-F 및 poxB_HR-R 프라이머 쌍을 사용하여 overlapping PCR을 이용하여 하나의 단편으로 연결시켰다. 하나로 연결된 DNA 단편을 pKD46 플라스미드를 가지고 있는 E. coli DS9H 균주에 전기천공법 (Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347)으로 도입하였다.

이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주들을 대상으로 poxB-CF 및 poxB-CR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하여 galP가 도입된 균주들을 확인하였다. 이어서 실시예 2와 동일하게 수행하여, galP가 도입되고 poxB가 결손된 변이주 (DS9H-2)를 획득하였다.

여기서 사용된 프라이서 서열은 하기 표 3과 같다.

프라이머 명칭	프라이머 서열 (5’-3’)	서열번호
poxB_HF-F	AGCAATAACGTTCCGGTTGTC	19
poxB_HF-R	GGTTCTCCATCTCCTGAATGTG	20
FRT(poxB_HF)-F	CATTCAGGAGATGGAGAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	21
FRT(galP)-R	ATCAATTCGCGCTAACTCACACATGAGAATTAATTCCGGGG	22
galP+FRT-F	CCCGGAATTAATTCTCATGTGTGAGTTAGCGCGAATTGATCTG	13
galP+poxB_HR-R	GACGGGAAATGCCACCCTTTTTAATCGTGAGCGCCTATTTCG	23
poxB_HR-F	AAAGGGTGGCATTTCCCGTCA	24
poxB_HR-R	TTCAAACAGATAGTTATGCGCGG	25
poxB-CF	AAGAGAAATTCTTCACCCCAG	26
poxB-CR	GGTTTGATTTTCATCGCCACT	27

실험예 1. 모균주와 변이주의 L-히스티딘 생산성 비교

모균주 E. coli DS9H 균주와 실시예 2 및 3에서 제조된 DS9H-1 균주 및 DS9H-2 균주의 L-히스티딘 생산성을 비교하였다.

하기 표 4와 같은 조성의 배지 10 ml를 함유한 100 ml 플라스크에 각각의 균주를 1%씩 접종하고, 34℃, 200 rpm의 조건으로 72시간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 히스티딘 생산량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

성분	농도
포도당	8%
황산마그네슘	0.1%
황산암모늄	2.0%
MSG	0.1%
일인산칼륨	0.1%
효모추출물	0.1%
황산칼륨	0.02%
티아민-HCl	20 ppm
니코틴산	10 ppm
황산철	5 ppm
황산아연	5 ppm
황산망간	5 ppm
탄산칼슘 (별도 멸균)	0.5%

균주	L-히스티딘 (g/L)	당 소모 속도(g/L/hr)
모균주 (DS9H)	7.8	0.931
변이주 (DS9H-1)	8.6	0.984
변이주 (DS9H-2)	9.5	0.967

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 변이주 DS9H-1은 galP 유전자가 도입됨으로써 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 약 10% 증가하고 당 소모 속도가 약 5.6% 향상된 것으로 확인되었고, 변이주 DS9H-2는 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 약 21% 증가하고 당 소모 속도가 약 3.8% 향상된 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 galP 유전자 도입에 따른 글루코스 흡수능의 향상으로 인해 당 소모 속도가 증가되어 결과적으로 균주의 L-히스티딘 생산성이 향상되며, 동시에 poxB 유전자 파쇄에 의한 부산물의 생산을 감소시킬 경우 대사흐름이 강화되어 L-히스티딘 생산성이 더욱 향상된다는 것을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant in Escherichia with enhanced L-histidine productivity and method for preparing L-histidine using the same <130> BPN211086 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galP <400> 1 atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc 60 cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg 120 ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc 180 atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg 240 cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg 300 gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt 360 gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc 420 agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct 480 gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg 540 gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc 600 aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa 660 gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg 720 ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta 780 atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg 840 gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac 900 gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta 960 acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc 1020 ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc 1080 ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg 1140 aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc 1200 gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg 1260 tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa 1320 cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata 1380 ggcgctcacg attaa 1395 <210> 2 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> galP <400> 2 Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe 1 5 10 15 Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp 20 25 30 Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln 35 40 45 Ile Thr Ser His Thr Gln Glu Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly 50 55 60 Ala Ala Val Gly Ala Val Gly Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly 65 70 75 80 Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser 85 90 95 Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg 100 105 110 Val Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu 115 120 125 Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser 130 135 140 Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val 165 170 175 Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro 180 185 190 Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu 195 200 205 Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu 210 215 220 Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala 225 230 235 240 Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val 245 250 255 Leu Leu Gln Val Met Gln Gln Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr 260 265 270 Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu 275 280 285 Gln Met Trp Gly Thr Val Ile Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr 290 295 300 Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu 305 310 315 320 Thr Leu Gly Phe Leu Val Met Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr 325 330 335 Met Met His Ile Gly Ile His Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile 340 345 350 Ala Met Leu Leu Met Phe Ile Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro 355 360 365 Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp 370 375 380 Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile 385 390 395 400 Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn 405 410 415 Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr 420 425 430 Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu 435 440 445 Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp 450 455 460 <210> 3 <211> 1719 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poxB <400> 3 atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60 atctggggag tcacaggcga ctctctgaac ggtcttagtg acagtcttaa tcgcatgggc 120 accatcgagt ggatgtccac ccgccacgaa gaagtggcgg cctttgccgc tggcgctgaa 180 gcacaactta gcggagaact ggcggtctgc gccggatcgt gcggccccgg caacctgcac 240 ttaatcaacg gcctgttcga ttgccaccgc aatcacgttc cggtactggc gattgccgct 300 catattccct ccagcgaaat tggcagcggc tatttccagg aaacccaccc acaagagcta 360 ttccgcgaat gtagtcacta ttgcgagctg gtttccagcc cggagcagat cccacaagta 420 ctggcgattg ccatgcgcaa agcggtgctt aaccgtggcg tttcggttgt cgtgttacca 480 ggcgacgtgg cgttaaaacc tgcgccagaa ggggcaacca tgcactggta tcatgcgcca 540 caaccagtcg tgacgccgga agaagaagag ttacgcaaac tggcgcaact gctgcgttat 600 tccagcaata 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Ser Pro Glu Gln Ile Pro Gln Val Leu Ala Ile Ala 130 135 140 Met Arg Lys Ala Val Leu Asn Arg Gly Val Ser Val Val Val Leu Pro 145 150 155 160 Gly Asp Val Ala Leu Lys Pro Ala Pro Glu Gly Ala Thr Met His Trp 165 170 175 Tyr His Ala Pro Gln Pro Val Val Thr Pro Glu Glu Glu Glu Leu Arg 180 185 190 Lys Leu Ala Gln Leu Leu Arg Tyr Ser Ser Asn Ile Ala Leu Met Cys 195 200 205 Gly Ser Gly Cys Ala Gly Ala His Lys Glu Leu Val Glu Phe Ala Gly 210 215 220 Lys Ile Lys Ala Pro Ile Val His Ala Leu Arg Gly Lys Glu His Val 225 230 235 240 Glu Tyr Asp Asn Pro Tyr Asp Val Gly Met Thr Gly Leu Ile Gly Phe 245 250 255 Ser Ser Gly Phe His Thr Met Met Asn Ala Asp Thr Leu Val Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Gln Phe Pro Tyr Arg Ala Phe Tyr Pro Thr Asp Ala Lys Ile 275 280 285 Ile Gln Ile Asp Ile Asn Pro Ala Ser Ile Gly Ala His Ser Lys Val 290 295 300 Asp Met Ala Leu Val Gly Asp Ile Lys Ser Thr Leu Arg Ala Leu Leu 305 310 315 320 Pro Leu Val Glu Glu Lys Ala Asp Arg Lys Phe Leu Asp Lys Ala Leu 325 330 335 Glu Asp Tyr Arg Asp Ala Arg Lys Gly Leu Asp Asp Leu Ala Lys Pro 340 345 350 Ser Glu Lys Ala Ile His Pro Gln Tyr Leu Ala Gln Gln Ile Ser His 355 360 365 Phe Ala Ala Asp Asp Ala Ile Phe Thr Cys Asp Val Gly Thr Pro Thr 370 375 380 Val Trp Ala Ala Arg Tyr Leu Lys Met Asn Gly Lys Arg Arg Leu Leu 385 390 395 400 Gly Ser Phe Asn His Gly Ser Met Ala Asn Ala Met Pro Gln Ala Leu 405 410 415 Gly Ala Gln Ala Thr Glu Pro Glu Arg Gln Val Val Ala Met Cys Gly 420 425 430 Asp Gly Gly Phe Ser Met Leu Met Gly Asp Phe Leu Ser Val Val Gln 435 440 445 Met Lys Leu Pro Val Lys Ile Val Val Phe Asn Asn Ser Val Leu Gly 450 455 460 Phe Val Ala Met Glu Met Lys Ala Gly Gly Tyr Leu Thr Asp Gly Thr 465 470 475 480 Glu Leu His Asp Thr Asn Phe Ala Arg Ile Ala Glu Ala Cys Gly Ile 485 490 495 Thr Gly Ile Arg Val Glu Lys Ala Ser Glu Val Asp Glu Ala Leu Gln 500 505 510 Arg Ala Phe Ser Ile Asp Gly Pro Val Leu Val Asp Val Val Val Ala 515 520 525 Lys Glu Glu Leu Ala Ile Pro Pro Gln Ile Lys Leu Glu Gln Ala Lys 530 535 540 Gly Phe Ser Leu Tyr Met Leu Arg Ala Ile Ile Ser Gly Arg Gly Asp 545 550 555 560 Glu Val Ile Glu Leu Ala Lys Thr Asn Trp Leu Arg 565 570 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galP-F <400> 5 atatccatgg atgcctgacg ctaaaaaaca g 31 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galP-R <400> 6 atataagctt ttaatcgtga gcgcctattt cg 32 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTRC99A-CF <400> 7 atattctgaa atgagctgtt gacaa 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTRC99A-CR <400> 8 tactgccgcc aggcaaattc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpgi_HF-F <400> 9 gcaggaatat cgtgatcagg g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpgi_HF-R <400> 10 gccagctgtt tacccagttc 20 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRT(Dpgi_HF)-F <400> 11 gaactgggta aacagctggc gtgtaggctg gagctgcttc 40 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (5)

1. 갈락토스:H+ 동반수송체(Galactose:H+ symporter)의 활성이 강화되어 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아(Escherichia) 속 변이주.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 갈락토스:H+ 동반수송체의 활성 강화는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자가 도입되거나, 또는 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자의 프로모터에 위치 특이적 변이를 유발하는 것인 에스케리치아 속 변이주.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 갈락토스:H+ 동반수송체를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인 에스케리치아 속 변이주.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 변이주는 대장균인 것인 에스케리치아 속 변이주.
5. a) 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및
   b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법.