CN104498517A - 一种高产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法 - Google Patents

Abstract

一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法，属于遗传工程技术领域。本发明是通过对大肠杆菌中已有的代谢途径进行修饰和改造，阻断 N -乙酰氨基葡萄糖及其副产物分解和向胞内转运途径，同时引入外源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因，在宿主内形成从葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的完整合成途径，构建的工程菌株能利用葡萄糖或甘油为底物，通过好气发酵培养合成 N -乙酰氨基葡萄糖，以实现工业化生产。

Description

一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法

技术领域

一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖是一种葡萄糖的衍生物，在人体内具有多种生理功能，主要作为软骨、关节处的润滑液的主要成分而对骨关节的健康起着十分重要的作用。通过补充外源的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖对于治疗中老年关节疾病，缓解关节疼痛在欧美国家已作为常用的方法而得到广泛的应用。此外，N-乙酰氨基葡萄糖还广泛应用于婴儿食品添加、化妆品和饲料添加等方面，用途十分广泛。

目前N-乙酰氨基葡萄糖的生产是通过氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应而成，其主要原料氨基葡萄糖主要是通过用盐酸或硫酸水解虾蟹外壳而生产得到。在氨基葡萄糖的生产过程中，会产生大量的含盐酸（或硫酸）乙酸的工业废水，给环境带来很大的压力。因此利用微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖成为国内外近几年研究的热点。

大肠杆菌以其培养简单，遗传操作成熟，而被用作多种发酵产品的首选宿主。微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌种改造通常根据大肠杆菌现有的氨基葡萄糖相关代谢途径，利用代谢工程进行修饰改造，以实现能利用简单的葡萄糖或甘油等碳源，经在大肠杆菌体内多步酶促反应，最终合成N-乙酰氨基葡萄糖。目前国内外构建N-乙酰氨基葡萄糖生产菌株一般都通过引入6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶到大肠杆菌中表达，从而将体内代谢生成的6-磷酸氨基葡萄糖合成为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖，进而脱去磷酸根，最终形成N-乙酰氨基葡萄糖。本发明尝试通过引入不同于现有公开的技术手段的酶在大肠杆菌中表达，架构不同的代谢途径，并实现在大肠杆菌中同样高产N-乙酰氨基葡萄糖的目的。另外，现有N-乙酰氨基葡萄糖生产的大肠杆菌菌株中，为了阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物在体内的回流和降解，通过敲除大肠杆菌中nagDCABE基因簇来实现，本发明中只敲除nagABE三个基因，保留了其中的nagDC两个基因，以达到尽量避免对大肠杆菌体内基因的过多改动和敲除且能同样实现阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物在体内的回流和降解的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法，该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌可通过RED重组实现基因的敲除进而达到代谢途径的阻断，通过外源基因表达架构起新的代谢途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌，所述大肠杆菌是通过将编码氨基葡萄糖乙酰化酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌过量表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶构建而成。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶是能催化氨基葡萄糖和乙酰辅酶A生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶来源于丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）或能表达相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙酰化酶的基因获得是根据GenBank No. AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶来源于大肠杆菌或具有相同功能酶的微生物；6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。

所述大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶包括N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白和甘露糖转运系统。

所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶由nagA基因编码，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶由nagB基因编码，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白由nagE基因编码，甘露糖转运系统由manXYZ基因簇编码。

所述敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶的基因，是通过RED重组系统实现。

优选的，所述丙酮丁醇梭菌为菌株ATCC 824。

该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体操作如下：在大肠杆菌BL21（DE3）中，敲除nagABE基因簇和manXYZ基因簇，将glmS和glmA基因分别克隆到同一表达载体上，转入敲除了nagABE和manXYZ基因簇的大肠杆菌中，即得。

该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的应用方法，其特征在于：利用所述高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，以葡萄糖或甘油为碳源，酵母粉或酵母膏为有机氮源，氨水为无机氮源，通气好氧发酵而实现。

本发明技术方案说明如下：

所述高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌中，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代谢途径为：葡萄糖经ptsG基因编码的磷酸转运系统运进胞内，生成6-磷酸葡萄糖，经pgi基因编码的磷酸葡萄糖异构酶催化生产6-磷酸果糖，再经glmS基因编码的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶催化生产6-磷酸氨基葡萄糖，再经磷酸化酶催化脱磷酸生成氨基葡萄糖，再经glmA基因编码的氨基葡萄糖乙酰化酶催化生成N-乙酰氨基葡萄糖，并分泌到细胞外。具体可见图1所示。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，可将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。

所述基因nagA、nagB和nagE在大肠杆菌BL21（DE3）中以基因簇nagABE连锁存在，可一次性全部敲除。

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21（DE3）。大肠杆菌BL21（DE3）用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。大肠杆菌BL21（DE3）基因型：F-, ompT, hsdS（rBB-mB－）, gal, dcm（DE3）。

Red/ET重组是新近出现的一种基于λ噬菌体Red操纵子（Redα/Redβ/Redγ）和Rac噬菌体RecE/RecT重组系统的DNA工程技术。

GenBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇集并注释了所有公开的核酸序列。

甘露糖转运系统，属于大肠杆菌特异性的PTS 系统。大肠杆菌至少有15 种特异性的PTS 系统, 分别负责葡萄糖、甘露糖、甘露醇、果糖、纤维二糖、海藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、β-葡萄糖苷等PTS 糖类的转运和活化。对于麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘油、蜜二糖等无PTS转运系统的糖类, 大肠杆菌只能通过糖特异性的透性酶运输。其他细菌也都存在这两种运输机制转运不同糖类。

PCR扩增为聚合酶链式反应的简称，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸的反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

与现有技术相比，本发明的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法所具有的有益效果是：与现有技术相比，本发明的高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌可以利用葡萄糖或甘油合成高水平N-乙酰氨基葡萄糖。 本发明通过在大肠杆菌中架构一条新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路（如图1所示），加强N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达，同时，阻断N-乙酰氨基葡萄糖消耗和转运的途径，使得工程菌株能积累高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖。

附图说明

图1是本发明所构建的高水平N-乙酰氨基葡萄糖生产工程菌株的代谢相关途径。

具体实施方式

下面结合图1与具体实施例对本发明做进一步详述，但本发明的实施不仅仅限于此。

以下实施例中未注明具体条件的基因操作方法均按照常规条件，具体可参照《分子克隆实验指南（第三版）》（萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.著，黄培堂,译.）所述条件进行。

实施例中所用RED重组操作过程及质粒pKD3，pKD4和pCP20详情可参照文献Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5.

实施例1

本实施例为作为宿主的大肠杆菌nagABE基因簇的敲除，具体操作如下：

1）根据大肠杆菌BL21（DE3）基因组（Genbank No.CP001509）序列中的nagABE基因簇及其上下游序列，设计引物：上游引物nag-S1：

CTATCTGAGCTTGTCCGCCTGGTGTCATACTTTCTCTTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC（SEQ ID NO.1所示）和下游引物nag-A1：

TGCGACGCTCAAGCGTCGCATCAGGCATAAAGCAGATTATGGGAATTAGCCATGGTCC（SEQ ID NO.2所示）。

利用引物nag-S1和nag-A1，以质粒pKD3(GenBank: AY048742.1)为模板，经常规PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

2）将上述片段电转化含有重组质粒pKD46且加阿拉伯糖诱导过的的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，利用Red同源重组技术敲除BL21（DE3）中的nagABE基因簇，筛选获得氯霉素抗性的nagABE失活的菌株BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm。

实施例2

本实施例为大肠杆菌宿主的manXYZ基因簇的敲除，具体操作如下：

1）根据大肠杆菌BL21（DE3）基因组（Genbank No.CP001509）序列中的manXYZ基因簇及其上下游序列，设计引物：上游引物man-S1：

ACGTTGAGGTGTTAACGATAATAAAGGAGGTAGCAAGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC（SEQ ID NO.3所示）和下游引物man-A1：

AACGGGGCCAAAAGGCCCCGGTAGTGTACAACAGTCTTAATGGGAATTAGCCATGGTCC（SEQ ID NO.4所示）；利用引物man-S1和man-A1，以质粒pKD4(GenBank: AY048743.1)为模板，经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

2）将上述片段电转化含有重组质粒pKD46且加阿拉伯糖诱导过的的大肠杆菌BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm感受态细胞中，利用Red同源重组技术敲除BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm中的manXYZ基因簇，利用卡那霉素筛选得到nagABE和manXYZ都失活的菌株BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm/ΔmanXYZ::Kan。

实施例3

本实施例为将实施例2所获得的菌株BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm/ΔmanXYZ::Kan中抗性基因消除，具体操作如下：

1）制备BL21（DE3）/ΔnagABE::Cm/ΔmanXYZ::Kan感受态细胞，转化pCP20质粒，在30度氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素三抗平板上筛选正确的转化子。

2）将上述转化子在无抗LB平板上划线，42℃培养至出现单菌落。

3）挑取单菌落分别点接到无抗LB平板，和卡那霉素、氯霉素双抗平板，选择在双抗平板上不能生长的单菌落即为消除了卡那霉素和氯霉素抗性的菌BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ。

实施例4

本实施例为对实施例3所获得的消除了卡那霉素和氯霉素抗性的菌BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ进行glmS和glmA基因双表达载体pETDuet-glmS-glmA的构建，具体操作如下：

1）根据大肠杆菌W3110基因组序列（GenBank No.NC_007779）设计引物，正向引物glmS-S1：ctggatccgatgtgtggaattgttggcgcg（SEQ ID NO.5所示）和反向引物glmS-A1：catgagctcttactcaaccgtaaccgattttgc （SEQ ID NO.6所示），该引物中的两端增加了BamHI和SacI位点；

2）以大肠杆菌W3110（美国大肠杆菌遗传保藏中心，The E.coli genetic stock center，CGSC）基因组为模板，扩增获得glmS基因，利用BamHI和SacI两个限制酶克隆到表达载体pETDuet-1（Novagen公司）上，得到表达载体pETDuet-glmS；

3）根据基因序列（GenBank No. AE001437.1中的CA_C0184）全基因合成glmA基因，两端加BglII和XhoI位点，起始密码子前加A碱基，以保证正确的读码框，具体序列如下所示（SEQ ID NO.7）：

AGATCTAatggaaattaaagagacatatgattttagtagcattgtagatttgtggaataaaaacataggtacagtgtatccgatgaatttagaactttttaagcaaaactatattaatgataggcaaagaaaaaaaataatgggtgcttttaatggtgaaatactaataggctttgttatatataaacagtggacatataaaagtggatctttaaagcccaaccataagataggatatataaattcaatcatagtggatataaactttaggcatcaagggataggaactaagttattagatgctgctgaagaggaattaatcaattcgggagttaaaatacttcgttgtggtagtgacacctatcacttttttcctggaatacctttagaatgtttaccttcggaagagttttttttagttagaggttataaaatgcaagactatttttatgatttaataggagatgtatctaaagtggattttaaaaaaccttctataaaagatggttttaaggttaatgtaatgaagccagaagataggaaggggctctttgaatttttagaaaaaagctttagtggaagatggcttgaagaatttattgaattttttcaggtaggaatgaaggaaagagatattgtacttataaagtataagacctctgttattgggttctcacatatatatgataacaaaagtagttttataggtccgcctatatattggaaagcattacttgggcataactacggtggtttaggacctatagggatagacaagacatatagaaaacaagggcttgggaggcttttgctatacgaatcactacagattttgaaaaaaagagaagttaagaaaatggttatagattggactgaaaaagatattataaatttttatggaaggtttaattttatgccttggaaagcatatagaaaagcaaccaaagaggtaaaagatggcaagggttaaCTCGAG；

4）利用BglII和XhoI两个限制酶克隆到表达载体pETDuet-glmS上，得到双表达载体pETDuet-glmS-glmA。

实施例5

本实施例为glmS和glmA基因双表达载体pACYCDuet-glmS-glmA的构建，具体操作如下：

采用低拷贝的pACYCDuet-1（Novagen公司）质粒作为克隆glmS和glmA基因的载体，其他方法及过程同实施例4，用氯霉素平板筛选，最终得到双表达载体pACYCDuet-glmS-glmA。

实施例6

本实施例为高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建，具体操作如下：

1）将上述构建完成的质粒pETDuet-glmS-glmA提取后，转化入BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ宿主内，用氨苄青霉素平板筛选，得到最终的基因工程菌BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA，命名为：

BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01；

   2）将上述构建完成的质粒pACYCDuet-glmS-glmA提取后，转化入BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ宿主内，用氯霉素平板筛选，得到最终的基因工程菌BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA，命名为：

BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA-02。

实施例7

本实施例为高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的应用方法的具体实施方式，对实施例6中所获得的BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01和BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA-02分别进行发酵培养，具体操作如下：

1）种子和发酵培养基：

培养基容量为1L ，含有K₂HPO₄·3H₂O 21g，酵母提取物（购自OXOID公司）5g，硫酸铵 7.5g，柠檬酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，葡萄糖10g，微量元素10ml；补料液为500g/L葡萄糖；

其中，微量元素组成和浓度为：硫酸锰100 mg/L，氯化锌70 mg/L，钼酸钠35 mg/L，硼酸60 mg/L，氯化钴200 mg/L，硫酸铜29.28 mg/L，氯化镍25 mg/L，浓盐酸（37%）0.9 ml/L；

2）发酵过程：

过夜培养种子液，转接至5L发酵罐中，37 ℃，搅拌速度300~800转/分钟，溶氧保持在30 %以上，用氨水控制pH在6.9；葡萄糖耗完后，开始以6g/L.h的速度补加葡萄糖；发酵液菌体OD₆₀₀=20~25时加入终浓度为0.2 mM的IPTG，至结束发酵。

实施例8

本实施例为对实施例7所获得的发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度的测定，具体操作如下：

将发酵液稀释至合适倍数后，采用HPLC检测，检测条件如下：

色谱柱：Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column (300×7.8 mm) ；

柱温：60 ℃；

流动相是 6mM 硫酸，流速是0.6 ml/min；

检测波长：210 nm；

经检测，80小时发酵后，BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01的发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达61g/L以上, BL21（DE3）/ΔnagABE/ΔmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA-02的发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达83g/L以上。

以上培养结果表明，经代谢工程技术构建的两株大肠杆菌具有高产N-乙酰氨基葡萄糖的能力，具备了工业化的潜力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  滨州市金朗生物科技有限公司

 

<120>  一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ctatctgagc ttgtccgcct ggtgtcatac tttctcttag tgtaggctgg agctgcttc      59

 

 

<210>  2

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgcgacgctc aagcgtcgca tcaggcataa agcagattat gggaattagc catggtcc       58

 

 

<210>  3

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acgttgaggt gttaacgata ataaaggagg tagcaagtgg tgtaggctgg agctgcttc      59

 

 

<210>  4

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

aacggggcca aaaggccccg gtagtgtaca acagtcttaa tgggaattag ccatggtcc      59

 

 

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ctggatccga tgtgtggaat tgttggcgcg                                      30

 

 

<210>  6

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

catgagctct tactcaaccg taaccgattt tgc                                  33

 

 

<210>  7

<211>  976

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

agatctaatg gaaattaaag agacatatga ttttagtagc attgtagatt tgtggaataa     60

 

aaacataggt acagtgtatc cgatgaattt agaacttttt aagcaaaact atattaatga    120

 

taggcaaaga aaaaaaataa tgggtgcttt taatggtgaa atactaatag gctttgttat    180

 

atataaacag tggacatata aaagtggatc tttaaagccc aaccataaga taggatatat    240

 

aaattcaatc atagtggata taaactttag gcatcaaggg ataggaacta agttattaga    300

 

tgctgctgaa gaggaattaa tcaattcggg agttaaaata cttcgttgtg gtagtgacac    360

 

ctatcacttt tttcctggaa tacctttaga atgtttacct tcggaagagt tttttttagt    420

 

tagaggttat aaaatgcaag actattttta tgatttaata ggagatgtat ctaaagtgga    480

 

ttttaaaaaa ccttctataa aagatggttt taaggttaat gtaatgaagc cagaagatag    540

 

gaaggggctc tttgaatttt tagaaaaaag ctttagtgga agatggcttg aagaatttat    600

 

tgaatttttt caggtaggaa tgaaggaaag agatattgta cttataaagt ataagacctc    660

 

tgttattggg ttctcacata tatatgataa caaaagtagt tttataggtc cgcctatata    720

 

ttggaaagca ttacttgggc ataactacgg tggtttagga cctataggga tagacaagac    780

 

atatagaaaa caagggcttg ggaggctttt gctatacgaa tcactacaga ttttgaaaaa    840

 

aagagaagtt aagaaaatgg ttatagattg gactgaaaaa gatattataa atttttatgg    900

 

aaggtttaat tttatgcctt ggaaagcata tagaaaagca accaaagagg taaaagatgg    960

 

caagggttaa ctcgag                                                    976

 

Claims (10)

1.一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌是通过将编码氨基葡萄糖乙酰化酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌过量表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶构建而成。

2.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述氨基葡萄糖乙酰化酶是能催化氨基葡萄糖和乙酰辅酶A生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。

3.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述氨基葡萄糖乙酰化酶来源于丙酮丁醇梭菌或能表达相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙酰化酶的基因获得是根据GenBank No. AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

4.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。

5.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶来源于大肠杆菌或具有相同功能酶的微生物；6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。

6.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶包括N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白和甘露糖转运系统。

7.根据权利要求6所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶由nagA基因编码，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶由nagB基因编码，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白由nagE基因编码，甘露糖转运系统由manXYZ基因簇编码。

8.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶的基因，是通过RED重组系统实现。

9.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体操作如下：在大肠杆菌BL21（DE3）中，敲除nagABE基因簇和manXYZ基因簇，将glmS和glmA基因分别克隆到同一表达载体上，转入敲除了nagABE和manXYZ基因簇的大肠杆菌中，即得。

10.一种权利要求1所述的高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的应用方法，其特征在于：利用所述高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，以葡萄糖或甘油为碳源，酵母粉或酵母膏为有机氮源，氨水为无机氮源，通气好氧发酵而实现。