CN104059872A - 高产n-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌及其构建方法和应用，该工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌；构建的工程菌株利用葡萄糖为底物进行发酵培养合成N-乙酰氨基葡萄糖。本发明的工程菌利用葡萄糖合成N-乙酰氨基葡萄糖发酵水平高，同时副产物的积累较少，具有工业化生产的潜力。

Description

高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，广泛存在于各种生物体内。通常以beta-1,4-糖苷键聚合成几丁质。几丁质是自然界中数量仅次于纤维素的第二大类碳水化合物，存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳，高等植物的细胞壁等。除了作为几丁质的组分，N-乙酰氨基葡萄糖还与N-乙酰胞壁酸通过多肽相互交联，构成细菌细胞壁的主要结构-肽聚糖，也与D-葡萄糖醛酸形成重复的二糖单位而构成透明质酸。

N-乙酰氨基葡萄糖医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎症和治疗胃溃疡疾病，若与抗生素一起使用，可促进抗生素在血液中的吸收，降低副反应同时也可抑制癌细胞的生长，是合成新型抗癌药物氯脲霉素的主要原料。食品方面，N-乙酰氨基葡萄糖是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，也是合成VB₆和核黄素中间体的起始原料。此外，还可应用于化妆品和饲料添加剂中，用途十分广泛。

N-乙酰氨基葡萄糖的生产目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应而成，存在成本过高、收率低、纯度不足等缺陷。因此，国内外开展了利用微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的工作。

美国阿基昂生命科学公司(Arkion Life Sciences LLC)利用代谢工程构建了一系列代谢工程菌，通过优化发酵参数，获得了高产N-乙酰氨基葡萄糖的生产工艺(WO2004003175，US7332304和CN101365785A等)，该专利中，通过向大肠杆菌引入并过表达6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶，敲除N-乙酰氨基葡萄糖消耗基因，打通葡萄糖到氨基葡萄糖的代谢途径，构建了高产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌。中国专利申请号201110174246.7(CN102286420A)和201110174249.0(CN102268399A)通过上述类似的方式，构建了两株N-乙酰氨基葡萄糖的生产菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，本发明的另一目的在于提供该工程菌的构建方法，以及在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

本发明通过构建新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程大肠杆菌，提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

为解决上述技术问题，本发明的产(高产)N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，是通过将高表达编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因(如neuC1基因)和高表达编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因(如glmS基因)导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因(如基因簇nagDCABE)构建而成的重组大肠杆菌。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因来源于空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物，6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达，或将两个基因整合到大肠杆菌染色体上表达。

上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠杆菌中的nagDCABE基因簇，将neuC1和glmS基因分别克隆到表达载体上，转入敲除了nagDCABE基因簇的大肠杆菌中，获得高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。其中，该构建方法，更加具体的步骤包括：

A、敲除大肠杆菌中的基因簇nagDCABE，获得基因簇nagDCABE失活的菌株；

B、全基因合成编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuC1基因(SEQ IDNO.5)，并克隆表达载体；

C、以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因(SEQ ID NO.8)，克隆至步骤B获得的表达载体上，获得双基因表达载体；

D、将步骤C获得的双基因表达载体转化入步骤A所得的菌株中，获得第一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌；或

将步骤C获得的双基因表达载体整合至步骤C所得菌株的染色体上，获得第二种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。

所述步骤B中，表达载体包括：质粒pETDuet-1。

所述步骤D中，整合是通过RED重组系统，利用pKD46质粒表达RED重组酶来实现。

本发明还公开了一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的应用，即利用上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌进行N-乙酰氨基葡萄糖的生产，该生产方法包括步骤：

1)挑取高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的单菌落于种子培养基中，在30～40℃好气培养5～10小时；其中，优选在35～38℃培养7～8小时；且种子能多级放大培养；

2)将培养好的种子(高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程种子)接种于含有发酵培养基的发酵罐中，在30～40℃(优选33～38℃，尤其优选37℃)发酵培养，搅拌速度300～800转/分钟，通风培养，用氨水控制pH6～8，优选pH6.8～7.1；

4)当菌体浓度OD₆₀₀为25～30时，加入终浓度为0.05～1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，30～40℃继续培养(优选37℃)，至结束发酵。其中，IPTG的终浓度优选0.1～0.5mM，最优选0.2mM。

所述步骤1)和2)中的种子培养基和发酵培养基的配方如下：

氮源，0.1-10g/L，磷源0.1-25g/L，葡萄糖1-100g/L，微量元素0.01-50mg/L。氮源包括酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、铵盐、硝酸盐或其组合的混合物。磷源包括磷酸及其盐类。微量元素包括：锰、锌、钼、硼、钴、铜、镍。

本发明通过在大肠杆菌中构建一条新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路(如图1所示)，增强N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达，同时，失活导致N-乙酰氨基葡萄糖消耗和回流的基因，阻止N-乙酰氨基葡萄糖的回流和消耗，使得工程菌株能积累高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖。通过本发明的方法，得到一株基因工程大肠杆菌，该菌株可以利用葡萄糖合成高水平N-乙酰氨基葡萄糖，同时，副产物的积累较少，具有工业化生产的潜力。

附图说明

图1是大肠杆菌中构建高水平N-乙酰氨基葡萄糖生产工程菌株代谢相关途径。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施不仅限于此。

以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实验指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件进行。

pKD46和pIJ773质粒参见[Gust,B.,et al.,PCR-targeted Streptomyces genereplacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soilodor geosmin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2003.100(4):p.1541]。

实施例1

一、采用RED重组方法，失活菌株中的nagDCABE基因簇，其具体步骤如下：

1、根据大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)基因组(Genbank No.CP001509)序列，设计引物：

上游引物F-KO-nag：

ATCAGAGCCAACCACGTCCGCAGACGTGGTTGCTATTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.1所示)

下游引物R-KO-nag：

TGCGACGCTCAAGCGTCGCATCAGGCATAAAGCAGATTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.2所示)

利用引物F-KO-nag和R-KO-nag，以质粒pIJ773为模板，利用商业化的PCR试剂，经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

PCR反应体系：Tag酶0.5μl，10×buffer5μl，模板1μl，dNTP(2.5mmol/L)4μl，引物(10μ mol/L)各1.5μl，ddH2O36.5μl；

PCR反应过程：94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min。

将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1.5kb左右存在明显条带。

2、将RED重组酶表达质粒载体pKD46利用电击转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3)/pKD46；

3、LB培养基中加入1％(m/V，质量体积百分比)的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养菌株BL21(DE3)/pKD46至OD600达到0.5，然后制备感受态细胞。将步骤1制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布安普霉素抗性(50μg/mL)LB平板，得到转化子。

4、挑取转化子，用菌落PCR鉴定

菌落PCR引物为F-nag：AGCACTGTGCGCAAGCGATTTGG(SEQ ID NO.3所示)和R-nag：CCTGGGCGATCCCGAAGTTCAG(SEQ ID NO.4所示)。

挑取的转化子菌落经PCR扩增，能扩增出大小为2kb左右条带的菌落，即为nagDCABE失活的菌株BL21(DE3)/Δnag。

二、glmS和neuC1基因双表达载体pETDuet-glmS-neuC1的构建

1、根据基因序列(GenBank No.AF400048)全基因合成neuC1基因，两端加NdeI和XhoI位点，具体序列如下所示(SEQ ID NO.5)。

2、利用常规分子生物学技术将neuC1基因连接至pETDuet-1(Novogen公司)的NdeI和XhoI位点上，得到载体pETDuet-neuC1。

3、根据大肠杆菌W3110基因组序列(GenBank No.NC_007779)设计引物，正向引物F-glmS-BsaI：TACGGTCTCCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC(SEQ ID NO.6所示)和反向引物R-glmS-BamHI：GCGGGATCCTTACTCAACCGTAACCGATTTTG(SEQ ID NO.7所示)，该引物中的两端增加了BsaI和BamHI位点；

4、以大肠杆菌W3110菌株(美国大肠杆菌遗传保藏中心，The E.coli genetic stockcenter，cgsc)的总DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO.6和7所示)PCR扩增得到glmS基因片段(SEQ ID NO.8所示)，并用BsaI和BamHI酶切，回收备用。

5、用试剂盒抽提纯化表达载体pETDeut-neuC1，用NcoI和BamHI双酶切，回收备用。可选用市售的质粒抽提试剂盒，如Axygen plasmid extraction kit等。

6、连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α(购自TAKARA公司)感受态细胞，得到双表达载体pETDuet-glmS-neuC1。

三、glmS和neuC1基因以质粒方式在BL21(DE3)/Δnag中表达

1、用液体LB培养基过夜培养含有载体pETDuet-glmS-neuC1的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒pETDuet-glmS-neuC1。

2、培养大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Δnag，制备感受态细胞，并电击转化质粒载体pETDuet-glmS-neuC1进入该菌株，获得基因工程菌株BL21(DE3)/Δnag/pETDuet-glmS-neuC1，即为能高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。

四、工程菌株发酵实验

1、种子和发酵培养基(1L)：

KH₂PO₄14g；K₂HPO₄·3H₂O21g；酵母提取物(购自OXOID公司)5g；柠檬酸钠·2H₂O1g；硫酸铵7.5g；MgSO₄·7H₂O0.25g；CaCl₂0.02g；葡萄糖5g，微量元素10ml。

其中，微量元素为：硫酸锰100mg/L；氯化锌70mg/L；钼酸钠35mg/L；硼酸60mg/L；氯化钴200mg/L；硫酸铜29.28mg/L；氯化镍25mg/L；浓盐酸(37％)0.9ml/L。

补料液：650g/L葡萄糖。

2、发酵过程：

1)挑取BL21(DE3)/Δnag/pETDuet-glmS-neuC1单菌落于装液量4ml LB试管中，37℃培养8小时。

2)2ml一级种子接种于200ml种子培养基中，35℃培养16～18小时。

3)二级种子接种于装液量3.5L的发酵罐中，37℃，搅拌速度300～800转/分钟，溶氧保持在30％以上，用氨水控制pH在6.9。

4)葡萄糖耗完后，开始以6.5g/L.h的速度补加葡萄糖。

5)发酵液菌体OD₆₀₀＝25～30时加入IPTG(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养，培养基中葡萄糖浓度保持在5～10g/L，50小时后可减慢补料速度，至结束发酵。

五、发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度的测定

将发酵液稀释至合适倍数后，采用HPLC检测，检测条件如下：

检测柱：Bio-Rad AMINEX HPX87H Organic Analysis Column(300×7.8mm)；

柱温：60℃；

流动相是6mM硫酸，流速是0.6ml/min；

检测波长：210nm

经检测，60小时发酵后，发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达30g/L。

实施例2

一、glmS和neuC1基因整合至菌株BL21(DE3)/Δnag染色体上表达

1、根据质粒pIJ778序列，设计引物F-IJ778-KpnI：

CTAGGTACCATTCCGGGGATCCGTCGAC(SEQ ID NO.9所示)R-IJ778-XhoI:

GATCTCGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.10所示)，以质粒pIJ778为模板，PCR扩增获得链霉素抗性DNA片段；

2、纯化上述DNA片段，并用KpnI和XhoI双酶切，回收备用。

3、用KpnI和XhoI双酶切质粒载体pETDuet-glmS-neuC1，纯化后与步骤2中纯化好的链霉素抗性DNA片段连接，转化大肠杆菌DH5α，获得整合载体pETDuet-glmS-neuC-Str。

4、设计上游引物F-ETDu-fucI：

ATGAAAAAAATCAGCTTACCGAAAATTGGTATCCGCCCGTGCGTCCGGCGTAGAGGATC(SEQ ID NO.11所示)和下游引物R-ETDu-fucI:

TTAACGCTTGTACAACGGACCGTAGTTCTGGCAAGCGCGGCCAATCCGGATATAGTTCC(SEQ ID NO.12所示)，引物前端为大肠杆菌fucI基因内的片段，末端为与整合载体pETDuet-glmS-neuC-Str匹配的片段，以整合载体pETDuet-glmS-neuC-Str为模板，PCR扩增获得含有待表达基因glmS和neuC1以及链霉素筛选标记的DNA片段，纯化备用。

5、将RED重组酶表达载体pKD46利用电击转化法转入实施例1中获得的nagDCABE失活的菌株BL21(DE3)/Δnag，得到菌株BL21(DE3)/Δnag/pKD46。

6、LB培养基中加入1％的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养菌株BL21(DE3)/Δnag/pKD462～3小时，然后制备感受态细胞。将上述制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布链霉素(50μg/mL)抗性LB平板，得到转化子。

7、用菌落PCR鉴定转化子，根据插入位点及整合基因的序列设计引物F-fucI：GTTCTCAAACGGCAACTAACTG(SEQ ID NO.13所示)和原来用于扩增glmS基因的引物R-glmS-BamHI：GCGGGATCCTTACTCAACCGTAACCGATTTTG(SEQ ID NO.7所示)，PCR扩增得到2kb左右条带的转化子，即为将glmS和neuC1基因整合至染色体的菌株BL21(DE3)/Δnag/ΔfucI：glmS-neuC1——高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。

二、工程菌株发酵检验

种子和发酵培养基及发酵过程同实施例1，菌株BL21(DE3)/Δnag/ΔfucI：glmS-neuC1经60小时发酵后，经如实施例1的HPLC检测，N-乙酰氨基葡萄糖浓度达到70g/L。

以上培养结果表明，经代谢工程技术构建的基因工程菌具有高产N-乙酰氨基葡萄糖的能力，具备了工业化的潜力。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述的工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因来源于空肠弯曲菌Campylobacter jejun或能表达相同功能酶的微生物。

3.根据权利要求2所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因是根据GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。

4.根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌，或具有相同功能酶的微生物。

5.根据权利要求4所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的获得是根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。

6.根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：是将如SEQ ID NO.5所示的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuC1基因和如SEQ IDNO.8所示的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因克隆直接整合到敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因nagDCABE的大肠杆菌染色体上表达；或两个基因通过表达载体转化入敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因nagDCABE的大肠杆菌中表达。

7.一种如权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括步骤：

A、敲除大肠杆菌中的基因簇nagDCABE，获得基因簇nagDCABE失活的菌株；

B、全基因合成编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuC1基因如SEQ IDNO.5所示，并克隆表达载体；

C、以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因如SEQ ID NO.8所示，克隆至步骤B获得的表达载体上，获得双基因表达载体；

D、将步骤C获得的双基因表达载体转化入步骤A所得的菌株中，获得第一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌；或

将步骤C获得的双基因表达载体整合至步骤C所得菌株的染色体上，获得第二种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。

8.根据权利要求7所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤B中，表达载体为质粒pETDuet-1。

9.根据权利要求7所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤D中，整合是通过RED重组系统，利用pKD46质粒表达RED重组酶来实现。

10.一种如权利要求1至6任一所述的产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用，其特征在于，生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法包括：

1)挑取产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的单菌落于种子培养基中，在30～40℃好气培养12～20小时；其中，种子能多级放大培养；

2)将培养好的种子接种于含有发酵培养基的发酵罐中，在30～40℃发酵培养，搅拌速度300～800转/分钟，通风培养，用氨水控制发酵过程pH6～8；

3)培养至菌体浓度OD₆₀₀为25～30时，加入终浓度为0.05～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，30～40℃继续培养，至结束发酵；

所述的种子培养基和发酵培养基的配方如下：

氮源，0.1-10g/L，磷源0.1-25g/L，葡萄糖1-100g/L，微量元素0.01-50mg/L。