CN113174397B

CN113174397B - 一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法

Info

Publication number: CN113174397B
Application number: CN202110417521.7A
Authority: CN
Inventors: 徐娴; 刘洁; 兰海全; 顾万怡; 杜邦绵; 张志东
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN113174397A

Abstract

本发明公开了一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，首先构建番茄红素合成途径关键酶GGPPS、PSY、PDS的重组质粒，基于CFPS体系表达GGPPS、PSY、PDS，或基于富含GGPPS、PSY、PDS的大肠杆菌细胞裂解液，人工外源添加合成反应所需的底物、能量和辅因子等，在体外高效合成番茄红素。本发明首次将无细胞体系应用于体外合成番茄红素中，该方法缩短了底物传递距离，提高了反应速率和催化效率；操作简单、稳定性强，反应条件精确易控；副反应少、生产速率较高，底物得率接近理论值，而且能够方便快捷地检测番茄红素，适合检测与验证。

Description

一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法。

背景技术

番茄红素是一种天然类胡萝卜素，属于类异戊二烯类烯萜类化合物，由于其高抗氧化性以及在冠状病、前列腺癌等疾病中有良好的抑制作用，被广泛应用于药剂、食品、医疗以及保健品等行业中。

类似于番茄红素这样的复杂萜类化合物，都是由一系列的酶参与、多酶协同催化反应合成。现阶段随着基因工程技术的迅速发展，以及代谢工程和合成生物学方法的引入，人们越来越关注利用微生物发酵法生产番茄红素。微生物发酵法安全无毒，并能解决番茄红素产量和产率低、提取成本高等一系列问题。但是在微生物细胞中人工设计生物合成途径进行异源多酶级联反应往往会受到多种因素限制：首先在细胞中需要进行代谢通路的平衡和多基因调控，耗费时间长且繁琐；其次细胞宿主本身代谢具有复杂性，高浓度中间代谢物或具有毒性的终产物都会对细胞产生抑制作用；最后，人工合成的生物元件与宿主的兼容适配性低，支路途径的副产物会导致目标产品的低产量和低产率等。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，针对番茄红素的多酶合成体系，将无细胞合成体系引入到其中，可建立起解决生物大分子代谢途径构建和调控问题的一种新的研究策略，摒弃了传统复杂的体内基因改造以及细胞内各种环境干扰的负面因素，使得在体外就可以对反应微环境进行优化，具有很强的应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，包括以下步骤：

步骤1)番茄红素关键酶重组质粒的构建：

以含有GGPPS、PSY、PDS基因的重组质粒pET-EBI为模板对下列引物分别进行PCR，分别得到片段crtE-His、crtB-His、crtI-His，胶回收后使用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR片段和原核表达质粒pET22b进行双酶切，将之分别连接到质粒pET22b上，获得重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His；

pET22b-crtE-His引物设计：

crtE-His F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtE-His R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

pET22b-crtB-His引物设计：

crtB-His F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtB-His R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

pET22b-crtI-His引物设计：

crtI-His F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtI-His R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

步骤2)基于无细胞蛋白质合成体系的番茄红素合成方法：

利用优化型非透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒进行表达，通过外源添加合成关键酶的重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His，在体外分别合成关键酶GGPPS、PSY、PDS，检测总蛋白浓度并通过SDS-PAGE检测蛋白表达占比情况；合成关键酶的反应完成后，在含有100mM Tris-HCL缓冲体系中加入金属离子、辅因子以及关键酶反应液，随后添加底物以开始合成番茄红素的反应，即得；

步骤3)基于裂解液的番茄红素合成方法：

培养含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌，使编码GGPPS、PSY、PDS的基因获得过量表达；收集细胞，通过低温高压匀浆仪在4℃、20000psi条件下单次破碎细胞，在4℃、12000rpm下离心30min后获得细胞裂解液；在含有100mM Tris-HCL缓冲体系中添加底物、金属离子、辅因子，随后添加富含关键酶的细胞裂解液以开始合成番茄红素的反应，即得。

优选地，步骤1)所述GGPPS、PSY、PDS基因序列均来源于Deinococcuswulumuqiensis R12菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.8884。

优选地，步骤2)所述重组蛋白表达的温度为18～30℃，时间为4～10h。

优选地，步骤2)所述金属离子为Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺；所述辅因子为CoA、NAD、ATP；所述底物为FPP、IPP，浓度均为4μM；所述关键酶反应液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:1:1。

优选地，步骤2)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～20h。

优选地，步骤3)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

优选地，步骤3)所述底物为FPP与IPP，浓度均为10μM～0.5mM；所述金属离子为Mg² ⁺、K⁺、NH₄ ⁺；所述辅因子为CoA、NAD、ATP，浓度均为0～1mM；所述细胞裂解液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1～2:1～2:1～2。

优选地，所述底物的浓度均为0.3mM；所述辅因子的浓度均为0mM；所述细胞裂解液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:2:2。

优选地，步骤3)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～15h。

优选地，所述合成番茄红素的反应的温度为30℃。

本发明的有益效果如下：

本发明首次将无细胞自组装体系利用到体外合成番茄红素中，该方法缩短了底物传递距离，提高了反应速率和催化效率，强化了蛋白的稳定性。不仅探讨出番茄红素合成过程中关键酶之间的最适酶比，而且操作简单、稳定性强，为进一步优化番茄红素合成奠定了基础。

附图说明

图1为实施例1中菌落PCR(a)及双酶切检测结果(b)；

图2为实施例1中GGPPS、PSY、PDS的蛋白表达结果；

图3为实施例2中CFPS蛋白表达结果；

图4为实施例2的CFPS无细胞合成体系中番茄红素产量随时间的变化结果；

图5为实施例3的裂解液无细胞合成体系中番茄红素产量随时间的变化结果；

图6为实施例2和实施例3的番茄红素无细胞代谢工程示意图；

图7为实施例4中酶比例对番茄红素合成的影响；

图8为实施例4中底物浓度对番茄红素合成的影响；

图9为实施例4中反应的温度对番茄红素合成的影响；

图10为实施例4中辅因子CoA、NAD、ATP添加量对番茄红素合成的影响。

具体实施方式

以下结合附图与具体实施例对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1番茄红素关键酶重组质粒的构建及表达

1.含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)、八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的重组质粒的构建

以含有来源于Deinococcus wulumuqiensis R12菌株(市购，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.8884)的番茄红素合成关键酶基因的重组质粒pET-EBI为模板对下列引物分别进行PCR，分别得到片段crtE-His、crtB-His、crtI-His，胶回收后使用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR片段和原核表达质粒pET22b进行双酶切，将之分别连接到质粒pET22b上。

引物设计如下：

pET22b-crtE-His：

crtE-His F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点，具体为：

5’-TTCCATATGCGTCCCGAACTGCT-3’。

crtE-His R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点，具体为：

5’-ATTCTCGAGCTTCTCCCGCGTCG-3’。

pET22b-crtB-His：

crtB-His F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点，具体为：

5’-GGGCATATGGTGACGGAATTTTCGCC-3’。

crtB-His R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点，具体为：

5’-ATTCTCGAGGCCGTGGGCGGCGT-3’。

pET22b-crtI-His：

crtI-His F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点，具体为：

5’-GGGCATATGACATCCCCTCTTCCCT-3’。

crtI-His R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点，具体为：

5’-ATTCTCGAGGCGCCGGATGTCGG-3’。

利用热休克法将连接液转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过菌落PCR、测序及双酶切验证(如图1所示)后，获得重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His。然后将质粒转化到BL21(DE3)中进行表达。

图1(a)显示，分别在990bp、927bp和1647bp相应大小条带位置，扩增出特异性片段crtE，crtB和crtI，证明所挑取的单克隆中，基因已连接到载体，将阳性克隆测序并进行酶切验证，图1(b)显示，各条带与目的片段大小一致，证明重组质粒构建成功。

表1人工引物序列表

2.GGPPS、PSY、PDS的表达及验证

LB+A液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/mL。(下同)

将含有重组质粒的BL21(DE3)菌株接种于50mL的LB+A液体培养基，37℃、180rpm过夜培养作为母液。次日，接种1％的母液于新鲜的LB+A液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600到0.8左右时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在28℃、160rpm条件下诱导4h进行目的蛋白的表达。

诱导结束后，在10000rpm、4℃的条件下离心10min获取菌体，用预冷的S30缓冲液(10mM Tris-乙酸、14mM醋酸镁、60mM醋酸钾、2mM二硫苏糖醇(DTT)；pH 8.2)洗涤细胞颗粒2次，再悬浮于S30缓冲液(按照每g湿菌泥加入1mL的S30缓冲液进行悬浮)，用低温高压匀浆仪在20000psi压力下单次破碎菌体。在12000rpm、4℃离心30min，收集上清。SDS-PAGE检测蛋白的表达情况如图2所示。

图2显示，分别在36.3kDa、34.0kDa和60.3kDa处有蛋白的大量表达，与GGPPS、PSY和PDS蛋白大小一致，证明了GGPPS、PSY、PDS均已在大肠杆菌重组菌中实现了过量表达。

实施例2基于CFPS的番茄红素无细胞合成体系的构建

1.无细胞蛋白质合成(CFPS)反应

CFPS反应于50μL离心管中进行：体系反应组分包括17.2μL反应预混液(12mM谷氨酸镁；10mM谷氨酸铵；130mM谷氨酸钾；1.2mM腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)；0.85mM三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)；34μg/mL叶酸；170μg/mL大肠杆菌tRNA混合物；20种标准氨基酸各2mM；4mM草酸钠；33mM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)；0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；0.27mM辅酶A(CoA)；1.5mM亚精胺；1mM腐胺)；200ng重组质粒，7.4μL大肠杆菌裂解液，加灭菌超纯水至50μL。

随后向3个离心管中分别加入重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His。在18℃/30℃下分别表达6h，4℃离心取上清。SDS-PAGE检测表达结果如图3所示，通道2是含有空载体pET22b对照的大肠杆菌裂解液，和对照相比较，通道3、4、5是利用CFPS表达三个重组质粒，分别在36.3kDa、34.0kDa和60.3kDa处有蛋白的大量表达，证明了GGPPS、PSY、PDS蛋白成功在体外利用CFPS合成。

2.无细胞蛋白质合成-代谢工程(CFPS-ME)反应

番茄红素合成反应(200μL)包括8mM醋酸镁，10mM醋酸铵，134mM醋酸钾，100mMTris-HCL缓冲液，以及按照1:1:1酶浓度比例(总蛋白浓度10mg/mL)的由CFPS合成的GGPPS、PSY、PDS反应液，以加入4μM的法尼基焦磷酸(FPP)与异戊烯焦磷酸(IPP)开始合成，反应在30℃下进行16h。

检测样品中番茄红素的含量，采用丙酮萃取反应体系中的番茄红素，于12000rpm、4℃离心20min，取上清作为样品。

配备C18柱(4.6×150mm；5μm；Agilent Technologies)，柱温为30℃，检测474nm处的信号。样品用溶剂A(90％含水乙腈)和溶液B(甲醇-异丙醇(3:2，v/v)洗脱，流速为1.0mL/min：

0-15min，100％-10％溶剂A和0-90％溶剂B；

15-30min，10％溶剂A和90％溶剂B；

30-35min，10％-100％溶剂A和90％-0溶剂B。

番茄红素的合成量随着时间的增加而不断积累，如图4所示，在5min内，番茄红素的合成速率是最高的，达到62.15μg/L/min，在12h时达到了番茄红素合成的最大积累量，达到了401.27±0.14μg/L。

实施例3基于富含酶的裂解液的番茄红素无细胞合成体系的构建

含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌BL21(DE3)分别培养于LB+A培养基中，37℃、180rpm培养过夜；以2％接种量接种于新鲜的LB+A培养基中，200rpm、37℃培养至OD600为0.6～0.8时，分别加0.5mM、0.1mM、1mM的IPTG诱导5h，收集细胞。用预冷的S30缓冲液(10mM Tris-乙酸、14mM醋酸镁、60mM醋酸钾、2mM DTT；pH8.0)洗涤细胞颗粒2次，再悬浮于S30缓冲液(每g湿菌体加1mL S30缓冲液悬浮)，用低温高压匀浆仪在20000psi压力下单次破碎菌体。在12000rpm、4℃离心30min，收集上清，液氮速冻后-80℃储存。

基于裂解液的番茄红素无细胞合成体系组分(200μL)包括8mM醋酸镁，10mM醋酸铵，134mM醋酸钾，4μM IPP和4μM FPP，10mM K₂HPO₄(pH 7.2)，1mM NAD，1mM ATP，1mM CoA，10mg/mL总蛋白(控制蛋白浓度比例GGPPS：PSY：PDS＝1:1:1)，在30℃恒温条件下反应12h。如图5所示，由裂解液体系合成的番茄红素产量上升趋势和CFPS-ME体系基本相同，在5min内，合成番茄红素速率显著上升，5min之后合成速率逐渐趋于平缓，但可能是由于减少了蛋白合成的能量消耗，裂解液体系的产量较CFPS-ME有些许的提升，最终产生了533.12μg/L的番茄红素。

实施例2与实施例3中两种番茄红素合成方式的示意图如图6所示。

实施例4针对实施例3的番茄红素无细胞合成体系的优化

在基于实施例3的研究基础上，本实施例从反应的温度，辅因子NAD、ATP、CoA的添加量，酶比例以及底物浓度等方面对上述体系进行优化。

1.酶比例的调节对番茄红素合成的影响

为了研究GGPPS、PSY、PDS三种酶的添加比例对番茄红素合成的影响，分别选择了1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2等酶浓度比例(图7)，其余条件保持不变，在30℃反应了12h。通过图7的结果显示，酶比例控制在1:2:2时，番茄红素的产量提升到了2mg/L，相较之前提升了4倍。

2.反应温度以及底物浓度对番茄红素合成的影响

在上述的基础反应体系中，底物IPP和FPP的添加量均为4μM，后续分别增加10μM、40μM、0.1mM、0.3mM、0.5mM作为底物的添加浓度，探究底物浓度对番茄红素合成的影响(图8)，通过图8的结果显示，番茄红素产量随底物浓度增加而逐渐增加，当底物IPP和FPP浓度的添加量均为0.3mM时，番茄红素的产量达到最高，为124.23mg/L。当底物浓度进一步增加至0.5mM时，可能由于底物浓度太高导致抑制，番茄红素产量降低。这一结果说明底物浓度可能是影响番茄红素体外合成产量的一个重要关键性因素。

在这个基础之上，又选择了18℃、25℃、28℃、30℃、37℃五个温度节点，探究反应温度对番茄红素合成的影响，结果如图9所示，在30℃的条件下番茄红素的合成占优势。

3.辅因子CoA、NAD、ATP的添加量对番茄红素合成的影响

为了研究外源添加辅因子是否会影响番茄红素的合成，分别将辅因子浓度从原来的1mM降到了0.1mM，并设计变量研究CoA、NAD、ATP的添加对番茄红素合成的影响。

如图10所示，“－”代表未添加；“+”代表添加浓度为0.1mM；“++”代表添加浓度为1mM；图中从上至下顺序依次为CoA、NAD、ATP。从图10可以看出，在没有外源添加辅因子的时候取得了最大的番茄红素合成量，这可能由于细胞裂解液中含有丰富的辅因子以满足合成的需要，不需要去额外补充，过量的添加反而会起到抑制作用。

本实施例通过对实施例3中的体系的优化，最终获得了158.24±7.87mg/L的番茄红素产量，比实施例3的产量提升了400倍以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttccatatgc gtcccgaact gct 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attctcgagc ttctcccgcg tcg 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggcatatgg tgacggaatt ttcgcc 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attctcgagg ccgtgggcgg cgt 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggcatatga catcccctct tccct 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attctcgagg cgccggatgt cgg 23

Claims

1.一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)番茄红素关键酶重组质粒的构建：

pET22b-crtE-His引物设计：

crtE-His F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtE-His R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

pET22b-crtB-His引物设计：

crtB-His F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtB-His R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

pET22b-crtI-His引物设计：

crtI-His F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；

crtI-His R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；

步骤2)基于无细胞蛋白质合成体系的番茄红素合成方法：

所述金属离子为Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺；所述辅因子为CoA、NAD、ATP；所述底物为FPP、IPP，浓度均为4μM；所述关键酶反应液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:1:1；

步骤3)基于裂解液的番茄红素合成方法：

培养含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌，使编码GGPPS、PSY、PDS的基因获得过量表达；收集细胞，通过低温高压匀浆仪在4℃、20000psi条件下单次破碎细胞，在4℃、12000rpm下离心30min后获得细胞裂解液；在含有100mM Tris-HCL缓冲体系中添加底物、金属离子、辅因子，随后添加富含关键酶的细胞裂解液以开始合成番茄红素的反应，即得；所述底物为FPP与IPP，浓度均为0.3mM；所述金属离子为Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺；所述辅因子为CoA、NAD、ATP，浓度均为0mM；所述细胞裂解液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:2:2。

2.根据权利要求1所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，步骤1)所述GGPPS、PSY、PDS基因序列均来源于Deinococcus wulumuqiensis R12菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.8884。

3.根据权利要求1所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，步骤2)所述重组蛋白表达的温度为18～30℃，时间为4～10h。

4.根据权利要求1所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，步骤2)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～20h。

5.根据权利要求1所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，步骤3)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

6.根据权利要求1所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，步骤3)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～15h。

7.根据权利要求6所述的一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，所述合成番茄红素的反应的温度为30℃。