CN116355820A - 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法，所述工程菌株以大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因中的一种或几种。本发明工程菌株克服了现有生产麦角硫因菌株需要多次敲除、过表达多个相关途径基因的问题，以半胱氨酸为底物，不仅使原来的egtABCDE五步酶促反应转变为三步酶促反应，也促进了半胱氨酸的利用。本发明中所构建的菌株产量高出传统途径的4倍多，而且不需要添加外源氨基酸如组氨酸、半胱氨酸等前体物质。

Description

一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine，ERG/EGT)是1909年从麦角菌(Clavicepspurpurea)中发现的一种由组氨酸衍生而来的特殊氨基酸，其咪唑环上含有一个硫原子，因此又名2-巯基组氨酸三甲基内盐，其在中性和碱性环境中稳定，在溶液中以硫醇－硫酮互变异构体的形式存在，生理pH值下以硫酮为主要存在形式。麦角硫因作为一种重要生理活性物质，具有清除自由基、抗氧化、维持DNA的生物合成、免疫调节等多种生理作用，因而也被认为是一种特有的、多功能的细胞生理保护剂，也被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域。至今尚未发现麦角硫因能在人体内合成，必须由膳食提供。它只由细菌和真菌生物合成，包括蓝藻、放线菌和担子菌蘑菇。在自然界中，麦角硫因通过两种不同的途径产生：细菌途径和真菌途径。在细菌途径如在分枝杆菌中，其生物合成途径被彻底揭示，并发现由5步反应催化完成，这些酶由基因簇egtABCDE编码。而在真菌生物合成途径中，有两个主要的合成酶基因负责麦角硫因的合成，分别为egt1和egt2。目前麦角硫因的生物合成研究多是异源表达麦角硫因合成所需的关键酶基因，以及通过基因工程手段强化参与麦角硫因合成的关键基因表达，再发酵生产麦角硫因，例如OsawaR(HeterologousandHighProductionofErgothioneine inEscherichia coli，J.Agric.Food Chem.2018,66:1191-1196)等将耻垢分枝杆菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达，优化表达相关重组酶来提高麦角硫因产量，并通过外源添加硫代硫酸盐，摇瓶发酵麦角硫因产量达到24mg/L；在此基础上，TanakaN(Gram-scalefermentativeproductionofergothioneinedrivenbyoverproductionofcysteinein Escherichiacoli,ScientificReports,2019,9:1895)对多个相关合成基因进行表达，然后进行发酵罐培养，并持续性补加半胱氨酸、组氨酸等前体物质，发酵周期高达216h，最终获得1.3g/L麦角硫因。以及马倩等(一种生产麦角硫因的基因工程菌株及其应用，CN 112251392A，2020年)在大肠杆菌底盘菌基因组上整合了耻垢分枝杆菌麦角硫因操纵子基因egtBCDE和其基因组上整合粗糙脉胞菌C-S裂解酶编码基因egtEncr、亚砜合酶突变体的基因egtB*msm，同时过表达前体物质组氨酸相关基因。在5L发酵罐中培养52h，同时外源流加半胱氨酸、蛋氨酸前体氨基酸，最终可产麦角硫因2.9g/L。但这些都涉及了多个基因的改造，方法较为复杂，操作周期长，需要外源添加前体物质如组氨酸、甲硫氨酸等氨基酸等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法，所述工程菌株将麦角硫因合成途径中的两个关键酶结合后共表达，提高了传统原核生物中五步酶促反应效率，可使麦角硫因的产量高出传统途径的4倍多，而且不需要添加外源氨基酸如组氨酸、半胱氨酸等前体物质。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高产麦角硫因工程菌株，所述工程菌株以大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因中的一种或几种。
优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌JM109，大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、过表达麦角硫因生物合成蛋白egt1和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因或过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1和egt2编码基因。
优选的，所述麦角硫因合成基因簇egtBDE由egtB基因、egtD基因、egtE基因组成，所述egtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述egtD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述egtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种合成麦角硫因的方法，将上述工程菌株进行活化培养后接种到种子培养基中培养，然后接种到发酵培养基中发酵培养得到麦角硫因。
优选的，所述活化培养的温度为35～40℃，所述活化培养的时间为10～16h。
优选的，所述接种到种子培养基中培养的温度为25～37℃，所述接种到种子培养基中培养的时间为10～16h。
优选的，所述接种到发酵培养基时的接种量为1～5％，所述发酵培养的温度为25～37℃，所述发酵培养的时间为20～30h。
优选的，在进行发酵培养3～5h后向发酵培养基中加入0.1～0.5mM IPTG进行后续培养。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明将麦角硫因合成基因egtBDE分别与异源的麦角硫因合成途径酶egt1、egt2、egt12组合，获得工程菌株egtBDE-egt1、egtBDE-egt2、egtBDE-egt12。工程菌株egtBDE与工程菌株egt12摇瓶产量分别为39.83mg/L、42.91mg/L，而两者的组合egtBDE-egt1、egtBDE-egt2、egtBDE-egt12在装液量为50ml摇瓶中麦角硫因产量分别为48.81mg/L、41.57mg/L、77.54mg/L。
2、本发明方法中无需额外添加组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等昂贵前体，显著降低了生产成本。
3、和传统的原核生物中egtABCDE五步酶促反应效率相比，本发明构建的工程菌株egtBDE在装液量为50ml摇瓶中麦角硫因产量可达39.83mg/L，其产量高出传统途径的2倍。
附图说明
图1为本发明麦角硫因合成路径图；
图2为重组质粒pET28a-egtBDE的质粒图谱；
图3为重组质粒pET28a-egt12的质粒图谱；
图4为重组质粒pET28a-egtBDE-egt1的质粒图谱；
图5为重组质粒pET28a-egtBDE-egt2的质粒图谱；
图6为重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE的质粒图谱；
图7为重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE的质粒图谱；
图8为在装液量为50ml时，重组菌株摇瓶发酵的麦角硫因产量图，egtBDE、egt12、egtBDE-egt1、egtBDE-egt2、egtBDE-egt12分别表示大肠杆菌egtBDE、大肠杆菌egt12、大肠杆菌egtBDE-egt1、大肠杆菌egtBDE-egt2、大肠杆菌egtBDE-egt12。
具体实施方式
本发明提供了一种高产麦角硫因工程菌株，所述工程菌株以大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因中的一种或几种。本发明麦角硫因合成路径图见图1。
在本发明中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌JM109，大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BL21(DE3)，上述大肠杆菌购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
在本发明中，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、过表达麦角硫因生物合成蛋白egt1和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因或过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1和egt2编码基因。
在本发明中，所述麦角硫因合成基因簇egtBDE由egtB基因、egtD基因、egtE基因组成，优选的采用化学合成法合成。
在本发明中，所述egtB基因来源为Methylobacterium pseudosasicola或Mycobacterium smegmatis，所述egtB基因的核苷酸序列如下所示：
egtB核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
agcaggatccatggccgctaccgccgctctgcgtagcggtgatacccgtgcccagaccgccgcagcatttccgccgcctccggtgaccgcccgtcctattgatcgtgccgcatggattgccgcatttcgctttgtgcgtagcgaaaccgaacgccgcgcagcaccgctgagcgcagaagatcagcaggtgcagagcatggcagatgcaagcccgaccaaatggcatcgtgcacatgttacctggttttttgaacagtttctgctgcgcgaacatctgccgggttatgcaatttatgatgaacgcctgcattatctgtttaatagttattatgtggccgcaggcccgcgtcagccgcgtattcagcgtggtatgattacccgtccgaccatggcagaagttaccgcctatcgcgcacatgtggatcgtgcagtggaaagtctgctgggccaggccgccgatggcgctttagaagcagttctgccgattctggaaattggtctgtatcatgaacagcagcatcaggaactgctgctgaccgatattctgcatgcatttgcacagaatccgctgggtccggtttatgatgcagaatggcgttttccggccgtggccggccagggtggtcaggcacctctggctcgcggcattgcatggattggtcatgaaggcgatggttttagctttgataatgaaagtccgcgtcatgaagcactgattctgccgggtcgcattgataaagcactggtgaccaatcgtgattggctgggctttatggaagcaggcggttatgccaaaccggaactgtggctgagcgatggctggtatgccggtcaggccgaaggttgggaagcaccgggttattggcgccgtgatggtgaaggctgggccaccatgaccctgggtggtgttcgtccggttgaactggatgcaccggtgacccatattagttattatgaagcagatgcctatgcccgctgggccggccgtaccttaccgacagaatttgaatgggaagtggccgcccgtgatggtgccctgccggatgcatttggtctggtgtggcagtggacccgtagcgcctatgttgcctatccgggttatcgtccgctgccgggcgcactgggtgaatataatggtaaatttatggtgagtcagttcgttctgcgtggtagtagtgtggcaaccccggaaggccatgcccgcctgccttatcgtaattttttttatccgcatcagcgttggcagtttaccggtctgcgcctggccgatgtggcccatcatcatcatcatcac
在本发明中，所述egtD基因来源为Mycobacterium smegmatis，所述egtD基因的核苷酸序列如下所示：
egtD核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
agcaggatcatgaccctgagcctggccaattatctggccgcagatagcgccgccgaagccctgcgtcgtgatgttcgtgcaggtctgaccgcagcaccgaaaagcctgccgccgaaatggttttatgatgccgtgggcagtgatctgtttgatcagattacccgtctgccggaatattatccgacccgcaccgaagcccagattctgcgtacccgtagcgcagaaattattgccgccgcaggtgccgataccctggtggaactgggtagcggcaccagcgaaaaaacccgcatgctgctggatgcaatgcgtgatgcagaactgctgcgtcgttttattccgtttgatgtggatgcaggtgttctgcgcagtgccggcgcagccattggtgccgaatatccgggtattgaaattgatgcagtgtgcggtgattttgaagaacatctgggtaaaattccgcatgttggccgtcgtctggtggtgtttctgggcagtaccattggtaatctgaccccggccccgcgcgccgaatttctgagcaccctggcagataccctgcagccgggtgatagcctgctgctgggcaccgatctggttaaagataccggccgcctggtgcgcgcatatgatgatgcagccggtgtgaccgcagcatttaatcgtaatgtgctggccgttgttaatcgtgaactgagcgccgattttgatctggatgcatttgaacatgtggccaaatggaatagcgatgaagaacgcattgaaatgtggctgcgcgcacgtaccgcacagcatgtgcgtgttgcagcactggatctggaagttgattttgccgcaggcgaagaaatgctgaccgaagttagttgcaaatttcgcccggaaaatgttgttgcagaactggcagaagcaggcctgcgccagacccattggtggaccgatccggccggcgattttggcctgagcctggcggttcgtcatcatcatcatcatcac
在本发明中，所述egtE基因来源为Mycobacterium smegmatis，所述egtE基因的核苷酸序列如下所示：
egtE核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：
ccgaaggacgtgatgctggcccagcagtggcgcgatgcacgccctaaagtggcaggcctgcatctggatagtggtgcctgcagccgccagagctttgccgtgattgatgccaccaccgcacatgcacgccatgaagccgaagttggcggttatgttgcagcagaagcagccaccccggccctggatgccggtagagcagccgttgccagtctgattggttttgcagcaagtgatgtggtttataccagcggtagcaatcatgccattgatctgctgctgagtagttggccgggtaaacgtaccctggcatgcctgccgggtgaatatggtccgaatctgagtgcaatggccgcaaatggttttcaggtgcgcgcactgccggttgatgatgatggtcgcgtgctggttgatgaagcaagtcatgaactgagcgcccatccggttgcactggttcatctgaccgcactggccagtcatcgtggcattgcccagccggccgcagaactggttgaagcctgccataatgccggtattccggttgtgattgatgcggcacaggccctgggccatctggattgtaatgttggtgcagatgcagtttatagtagtagtcgcaaatggctggccggtccgcgcggcgttggtgttctggctgtgcgcccggaactggccgaacgtctgcagccgcgtattccgccgagcgattggccgattccgatgagtgtgctggaaaaactggaactgggtgaacataatgccgccgcacgcgtgggttttagtgtggccgttggcgaacatctggccgcaggtccgaccgccgtgcgtgaacgtctggcagaagttggtcgtctgagccgtcaggtgctggccgaagttgatggttggcgcgtggttgaaccggttgatcagccgaccgcaattaccaccctggaaagcaccgatggtgcagatccggccagcgtgcgcagttggctgattgccgaacgcggtattgtgaccaccgcatgtgaactggcccgcgcaccgtttgaaatgcgcaccccggtgctgcgcattagtccgcatgttgatgtgaccgttgatgaactggaacagtttgcagccgccctgcgtgaagccccgcatcatcatcatcatcactaaaagctt
在本发明中，所述基因簇egtBDE的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)如下所示：
agcaggatccatggccgctaccgccgctctgcgtagcggtgatacccgtgcccagaccgccgcagcatttccgccgcctccggtgaccgcccgtcctattgatcgtgccgcatggattgccgcatttcgctttgtgcgtagcgaaaccgaacgccgcgcagcaccgctgagcgcagaagatcagcaggtgcagagcatggcagatgcaagcccgaccaaatggcatcgtgcacatgttacctggttttttgaacagtttctgctgcgcgaacatctgccgggttatgcaatttatgatgaacgcctgcattatctgtttaatagttattatgtggccgcaggcccgcgtcagccgcgtattcagcgtggtatgattacccgtccgaccatggcagaagttaccgcctatcgcgcacatgtggatcgtgcagtggaaagtctgctgggccaggccgccgatggcgctttagaagcagttctgccgattctggaaattggtctgtatcatgaacagcagcatcaggaactgctgctgaccgatattctgcatgcatttgcacagaatccgctgggtccggtttatgatgcagaatggcgttttccggccgtggccggccagggtggtcaggcacctctggctcgcggcattgcatggattggtcatgaaggcgatggttttagctttgataatgaaagtccgcgtcatgaagcactgattctgccgggtcgcattgataaagcactggtgaccaatcgtgattggctgggctttatggaagcaggcggttatgccaaaccggaactgtggctgagcgatggctggtatgccggtcaggccgaaggttgggaagcaccgggttattggcgccgtgatggtgaaggctgggccaccatgaccctgggtggtgttcgtccggttgaactggatgcaccggtgacccatattagttattatgaagcagatgcctatgcccgctgggccggccgtaccttaccgacagaatttgaatgggaagtggccgcccgtgatggtgccctgccggatgcatttggtctggtgtggcagtggacccgtagcgcctatgttgcctatccgggttatcgtccgctgccgggcgcactgggtgaatataatggtaaatttatggtgagtcagttcgttctgcgtggtagtagtgtggcaaccccggaaggccatgcccgcctgccttatcgtaattttttttatccgcatcagcgttggcagtttaccggtctgcgcctggccgatgtggcccatcatcatcatcatcactaattaagaaggagatataagcaggatcatgaccctgagcctggccaattatctggccgcagatagcgccgccgaagccctgcgtcgtgatgttcgtgcaggtctgaccgcagcaccgaaaagcctgccgccgaaatggttttatgatgccgtgggcagtgatctgtttgatcagattacccgtctgccggaatattatccgacccgcaccgaagcccagattctgcgtacccgtagcgcagaaattattgccgccgcaggtgccgataccctggtggaactgggtagcggcaccagcgaaaaaacccgcatgctgctggatgcaatgcgtgatgcagaactgctgcgtcgttttattccgtttgatgtggatgcaggtgttctgcgcagtgccggcgcagccattggtgccgaatatccgggtattgaaattgatgcagtgtgcggtgattttgaagaacatctgggtaaaattccgcatgttggccgtcgtctggtggtgtttctgggcagtaccattggtaatctgaccccggccccgcgcgccgaatttctgagcaccctggcagataccctgcagccgggtgatagcctgctgctgggcaccgatctggttaaagataccggccgcctggtgcgcgcatatgatgatgcagccggtgtgaccgcagcatttaatcgtaatgtgctggccgttgttaatcgtgaactgagcgccgattttgatctggatgcatttgaacatgtggccaaatggaatagcgatgaagaacgcattgaaatgtggctgcgcgcacgtaccgcacagcatgtgcgtgttgcagcactggatctggaagttgattttgccgcaggcgaagaaatgctgaccgaagttagttgcaaatttcgcccggaaaatgttgttgcagaactggcagaagcaggcctgcgccagacccattggtggaccgatccggccggcgattttggcctgagcctggcggttcgtcatcatcatcatcatcactaaggcgaatgctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccatactgctgttaagaaggagatataccgaaggacgtgatgctggcccagcagtggcgcgatgcacgccctaaagtggcaggcctgcatctggatagtggtgcctgcagccgccagagctttgccgtgattgatgccaccaccgcacatgcacgccatgaagccgaagttggcggttatgttgcagcagaagcagccaccccggccctggatgccggtagagcagccgttgccagtctgattggttttgcagcaagtgatgtggtttataccagcggtagcaatcatgccattgatctgctgctgagtagttggccgggtaaacgtaccctggcatgcctgccgggtgaatatggtccgaatctgagtgcaatggccgcaaatggttttcaggtgcgcgcactgccggttgatgatgatggtcgcgtgctggttgatgaagcaagtcatgaactgagcgcccatccggttgcactggttcatctgaccgcactggccagtcatcgtggcattgcccagccggccgcagaactggttgaagcctgccataatgccggtattccggttgtgattgatgcggcacaggccctgggccatctggattgtaatgttggtgcagatgcagtttatagtagtagtcgcaaatggctggccggtccgcgcggcgttggtgttctggctgtgcgcccggaactggccgaacgtctgcagccgcgtattccgccgagcgattggccgattccgatgagtgtgctggaaaaactggaactgggtgaacataatgccgccgcacgcgtgggttttagtgtggccgttggcgaacatctggccgcaggtccgaccgccgtgcgtgaacgtctggcagaagttggtcgtctgagccgtcaggtgctggccgaagttgatggttggcgcgtggttgaaccggttgatcagccgaccgcaattaccaccctggaaagcaccgatggtgcagatccggccagcgtgcgcagttggctgattgccgaacgcggtattgtgaccaccgcatgtgaactggcccgcgcaccgtttgaaatgcgcaccccggtgctgcgcattagtccgcatgttgatgtgaccgttgatgaactggaacagtttgcagccgccctgcgtgaagccccgcatcatcatcatcatcactaaaagctt
在本发明中，所述麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因的核苷酸序列如下所示，所述egt1基因来源为Neurospora crasa。
egt1核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：
atgccaagtgctgaatctatgacaccctcaagcgcattgggtcaattgaaggcgaccggtcaacatgtgctctccaagcttcaacagcagaccagcaacgccgatatcattgacatccgtcgtgttgcggttgaaatcaatctgaagacggagatcaccagcatgtttcgtccgaaagatggtccgcgccaactgccgaccttgcttctgtacaatgaacgcggtctgcaactcttcgagaggatcacctacttggaagaatattacctcacgaacgatgagattaaaattctgacgaaacacgctactgaaatggcatcctttattccgagcggcgcaatgatcatcgagttaggcagcggcaatctgcgcaaggtgaacctgttgctggaagcgttggacaacgcgggtaaagcgatcgactactatgcattagacttgagccgtgaagagctggaacgtactttggctcaagttccatcctataaacacgtaaaatgccacggcttactgggaacctacgacgacggccgtgattggctgaaggcccccgagaacattaacaagcaaaaatgtatccttcacttgggctcatcgattggtaactttaaccgtagcgacgctgcaacctttttgaagggcttcaccgatgttctcggtccgaatgataaaatgctgatcggcgtcgatgcgtgtaatgacccggcgcgtgtttaccatgcgtataatgacaaggtgggtataacccacgaatttattctgaatggtctgcgcaatgctaacgagatcattggggaaaccgctttcatcgagggtgattggcgtgttattggcgaatacgtgtacgatgaagagggtggccgtcatcaggcgttttatgctccgacccgtgacaccatggttatgggtgaactgattcgtagccatgatcgtatccagattgaacagtccctgaagtattcgaaagaagagtcagaacgactgtggagcaccgcaggcctggaacaggttagcgagtggacctacggcaacgagtacggtctccacctgctggcgaagagccgtatgagctttagcctgatcccgtcggtgtatgcgcgtagtgcattgcctactctggacgactgggaagctctgtgggcaacctgggatgtggtcacccgtcagatgctgccgcaggaggagctcttggaaaaaccgatcaaactgcgcaacgcctgcattttctacctgggtcacatcccgacgttcctggatatccagctgaccaaaaccaccaaacaggcgccctccgagccggcgcacttttgcaaaatcttcgagcgcggcatcgacccggatgttgataatccggagctgtgccatgcgcatagcgaaatcccagatgaatggcctccggtggaagaaattcttacctaccaggagacagtccgttctcgtttgcgcggtctgtacgcgcatgggatcgccaatatcccgcgcaatgtgggccgcgcaatttgggtcggtttcgagcacgagttaatgcatattgagacgctgttatacatgatgctgcagagcgataaaaccttgattccgacccatattccgcgccctgacttcgacaagctcgcacgcaaggcggaatctgagcgcgtgccaaaccagtggtttaaaatcccggcgcaagagattacgatcggtttggacgatccggaagacggctctgacatcaacaagcactatggttgggacaacgagaagccgccgcgcagagtgcaggttgcagcgtttcaggcgcaaggtcgtccgattaccaatgaggaatacgcacaatatctactggaaaagaacattgacaagctgcctgcgtcctgggcccgtctggacaacgaaaatatcagcaacggcaccaccaatagcgtctccggccatcattctaacagaacctcgaagcaacaactgccgtcctctttcttagaaaaaacggctgttagaaccgtgtacggccttgtgccgctgaagcacgcgctggattggccggtttttgcaagctatgacgagctagcgggttgcgcagcgtacatgggcggcagaattccgacctttgaggagacgcgttctatctacgcgtacgctgacgccctgaagaaaaaaaaagaggctgagcgtcagctgggccgtacggtgccggcggtgaacgcccacctgacgaacaacggtgttgagattaccccgccaagttcaccgtcgagcgaaaccccggcggaaagctcctccccgtctgatagcaataccacgctgattactactgaggatctgttctccgacctggatggtgcgaacgttggtttccacaattggcacccgatgccgatcaccagcaaaggcaacaccctggtcggccagggtgaattggggggggtgtgggaatggaccagcagcgtactgcgtaaatgggagggcttcgagccgatggaactgtacccgggttataccgccgacttcttcgatgagaagcacaacattgtgctgggtggtagctgggccacgcacccgcgcatcgcgggtcgcaagagcttcgttaactggtatcagcgtaactatccgtatgcttgggttggcgcgcgtgtggttcgtgaccttcatcatcatcatcatcactaa
在本发明中，所述麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因的核苷酸序列如下所示，所述egt2基因来源为Claviepspurpurea或Neurospora crasa。
egt2核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：
atggggctattagaaggagaagagttggtactgagaggccgcggtcaaggtggcgaaccgcgtccggagcgcgaaccggagctgaagctggagcacgtgccggagcgtgcgccggacggcgagccagagacagaaggtcaactgggtccacgtaaagaacccgaacacaaacttgaggcggaaagcgaaccgctccaagaaactccgcagcgtgaagtcctggcgtttggccgtgcttggaaatctgagttcctgttcgatccggcatggcgtaacctgaaccacggcagcttcggcacctacccgctttacatccgtgacaagctgagagcttatcaggaccaggcagaagcgcgtccggatcattttatccgttacgaggaatcaaaattactgcatcgtagccgcgcggcggtggctaaaatcgtgaatgccccgttggacaccgtcgtgttcgtgggtaacgccaccgaaggcgtgaacaccgtgctgcgtaatctgagatgggatagcctggagaagggtggtcaaaaagatgtcatcctgtcgttcagcacggtttatgaggcgtgtggcaacgcggcagactacatcgttgagtacttcgcaggtaaagtggagcaccgtaccattgaactggagtacccggtcgaagacgctgatgttattgctgctttacgcggagcggctacccaggttgcccgcgagggcaagcgcgcgcgtttggcaatgatggatgttgtgaccagccgtccgggcgttgtctttccgtgggaggctgcggttcgtgtttgccgtgagctgggcattttgtccctggtggacggtgcccagggtgttggtatggttcgtttggacctaaccgcagctgacccggacttctttgttagcaattgccataagtggctgctggtaccgcgcgggtgcgctatgctgtacaccccggcaagaactcaatgtctgctccggaccgcgttggccacctcccatggttatgtcccgcctagtgcggcgccggcgcctccgggttcgaagagccgctacgttgccaattttgaatttgtcggcaccagggataatggtccgtatctatgcgtagcggatgccatcgcgtggcgtgaacgcgtgtgcggtggcgaagagaacattctccgctatctgtgggcattgaataaaaaaggcattcgtatcgtggcccgtgcactgggtacgacccacctggacaacgaaaccgaaacgctgacgaactgcgccatgggtaacgtagctttgccgatgcgtgtggacgacgaagatgcctctacggcgctggacgcggcgccgtctgcagcgattgcggcgccagacgttgtggtggctcgtgagaacgtggccttggttgacaagtggatgcgtgagcgtctgtttgatgattacaagaccttcatgaccttgttcgtcatgcaggatcgttactgggttcgtttgtccgcgcagatttatttggacgagcaggattatgaagctgcgggtgatatcctcaaggcgctgtgtgaacgcatcagacgccgtgagtatctggttccgcaaccggtggagcatcatcatcatcatcactaa
在本发明中，所述基因簇egt12的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)如下所示：
atgccaagtgctgaatctatgacaccctcaagcgcattgggtcaattgaaggcgaccggtcaacatgtgctctccaagcttcaacagcagaccagcaacgccgatatcattgacatccgtcgtgttgcggttgaaatcaatctgaagacggagatcaccagcatgtttcgtccgaaagatggtccgcgccaactgccgaccttgcttctgtacaatgaacgcggtctgcaactcttcgagaggatcacctacttggaagaatattacctcacgaacgatgagattaaaattctgacgaaacacgctactgaaatggcatcctttattccgagcggcgcaatgatcatcgagttaggcagcggcaatctgcgcaaggtgaacctgttgctggaagcgttggacaacgcgggtaaagcgatcgactactatgcattagacttgagccgtgaagagctggaacgtactttggctcaagttccatcctataaacacgtaaaatgccacggcttactgggaacctacgacgacggccgtgattggctgaaggcccccgagaacattaacaagcaaaaatgtatccttcacttgggctcatcgattggtaactttaaccgtagcgacgctgcaacctttttgaagggcttcaccgatgttctcggtccgaatgataaaatgctgatcggcgtcgatgcgtgtaatgacccggcgcgtgtttaccatgcgtataatgacaaggtgggtataacccacgaatttattctgaatggtctgcgcaatgctaacgagatcattggggaaaccgctttcatcgagggtgattggcgtgttattggcgaatacgtgtacgatgaagagggtggccgtcatcaggcgttttatgctccgacccgtgacaccatggttatgggtgaactgattcgtagccatgatcgtatccagattgaacagtccctgaagtattcgaaagaagagtcagaacgactgtggagcaccgcaggcctggaacaggttagcgagtggacctacggcaacgagtacggtctccacctgctggcgaagagccgtatgagctttagcctgatcccgtcggtgtatgcgcgtagtgcattgcctactctggacgactgggaagctctgtgggcaacctgggatgtggtcacccgtcagatgctgccgcaggaggagctcttggaaaaaccgatcaaactgcgcaacgcctgcattttctacctgggtcacatcccgacgttcctggatatccagctgaccaaaaccaccaaacaggcgccctccgagccggcgcacttttgcaaaatcttcgagcgcggcatcgacccggatgttgataatccggagctgtgccatgcgcatagcgaaatcccagatgaatggcctccggtggaagaaattcttacctaccaggagacagtccgttctcgtttgcgcggtctgtacgcgcatgggatcgccaatatcccgcgcaatgtgggccgcgcaatttgggtcggtttcgagcacgagttaatgcatattgagacgctgttatacatgatgctgcagagcgataaaaccttgattccgacccatattccgcgccctgacttcgacaagctcgcacgcaaggcggaatctgagcgcgtgccaaaccagtggtttaaaatcccggcgcaagagattacgatcggtttggacgatccggaagacggctctgacatcaacaagcactatggttgggacaacgagaagccgccgcgcagagtgcaggttgcagcgtttcaggcgcaaggtcgtccgattaccaatgaggaatacgcacaatatctactggaaaagaacattgacaagctgcctgcgtcctgggcccgtctggacaacgaaaatatcagcaacggcaccaccaatagcgtctccggccatcattctaacagaacctcgaagcaacaactgccgtcctctttcttagaaaaaacggctgttagaaccgtgtacggccttgtgccgctgaagcacgcgctggattggccggtttttgcaagctatgacgagctagcgggttgcgcagcgtacatgggcggcagaattccgacctttgaggagacgcgttctatctacgcgtacgctgacgccctgaagaaaaaaaaagaggctgagcgtcagctgggccgtacggtgccggcggtgaacgcccacctgacgaacaacggtgttgagattaccccgccaagttcaccgtcgagcgaaaccccggcggaaagctcctccccgtctgatagcaataccacgctgattactactgaggatctgttctccgacctggatggtgcgaacgttggtttccacaattggcacccgatgccgatcaccagcaaaggcaacaccctggtcggccagggtgaattggggggggtgtgggaatggaccagcagcgtactgcgtaaatgggagggcttcgagccgatggaactgtacccgggttataccgccgacttcttcgatgagaagcacaacattgtgctgggtggtagctgggccacgcacccgcgcatcgcgggtcgcaagagcttcgttaactggtatcagcgtaactatccgtatgcttgggttggcgcgcgtgtggttcgtgaccttcatcatcatcatcatcactaaggcgaatggctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccctcaagtacttaagaaggagatataagcaggatcatggggctattagaaggagaagagttggtactgagaggccgcggtcaaggtggcgaaccgcgtccggagcgcgaaccggagctgaagctggagcacgtgccggagcgtgcgccggacggcgagccagagacagaaggtcaactgggtccacgtaaagaacccgaacacaaacttgaggcggaaagcgaaccgctccaagaaactccgcagcgtgaagtcctggcgtttggccgtgcttggaaatctgagttcctgttcgatccggcatggcgtaacctgaaccacggcagcttcggcacctacccgctttacatccgtgacaagctgagagcttatcaggaccaggcagaagcgcgtccggatcattttatccgttacgaggaatcaaaattactgcatcgtagccgcgcggcggtggctaaaatcgtgaatgccccgttggacaccgtcgtgttcgtgggtaacgccaccgaaggcgtgaacaccgtgctgcgtaatctgagatgggatagcctggagaagggtggtcaaaaagatgtcatcctgtcgttcagcacggtttatgaggcgtgtggcaacgcggcagactacatcgttgagtacttcgcaggtaaagtggagcaccgtaccattgaactggagtacccggtcgaagacgctgatgttattgctgctttacgcggagcggctacccaggttgcccgcgagggcaagcgcgcgcgtttggcaatgatggatgttgtgaccagccgtccgggcgttgtctttccgtgggaggctgcggttcgtgtttgccgtgagctgggcattttgtccctggtggacggtgcccagggtgttggtatggttcgtttggacctaaccgcagctgacccggacttctttgttagcaattgccataagtggctgctggtaccgcgcgggtgcgctatgctgtacaccccggcaagaactcaatgtctgctccggaccgcgttggccacctcccatggttatgtcccgcctagtgcggcgccggcgcctccgggttcgaagagccgctacgttgccaattttgaatttgtcggcaccagggataatggtccgtatctatgcgtagcggatgccatcgcgtggcgtgaacgcgtgtgcggtggcgaagagaacattctccgctatctgtgggcattgaataaaaaaggcattcgtatcgtggcccgtgcactgggtacgacccacctggacaacgaaaccgaaacgctgacgaactgcgccatgggtaacgtagctttgccgatgcgtgtggacgacgaagatgcctctacggcgctggacgcggcgccgtctgcagcgattgcggcgccagacgttgtggtggctcgtgagaacgtggccttggttgacaagtggatgcgtgagcgtctgtttgatgattacaagaccttcatgaccttgttcgtcatgcaggatcgttactgggttcgtttgtccgcgcagatttatttggacgagcaggattatgaagctgcgggtgatatcctcaaggcgctgtgtgaacgcatcagacgccgtgagtatctggttccgcaaccggtggagcatcatcatcatcatcactaa
本发明还提供了上述高产麦角硫因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建
构建重组质粒pET28a-egtBDE：以pET28a(购自九天基因科技(天津)有限公司)为载体，根据egtB基因、egtD基因、egtE基因化学合成基因簇egtBDE，由九天基因科技(天津)有限公司完成，从而得到重组质粒pET28a-egtBDE。egtB的GenBank：CP033231.1，egtD的GeneID：4537704，egtE的GeneID：4531386。
构建重组质粒pET28a-egt12：以pET28a为载体，根据egt1基因、egt2基因化学合成基因簇egt12，由九天基因科技(天津)有限公司完成，从而得到重组质粒pET28a-egt12。egt1的GeneID：3872471，egt2的proteinID：CCE33140.1(SEQ ID NO.6)。
构建重组质粒pET28a-egtBDE-egt1：酶切质粒pET28a获得载体线性片段，采用一步克隆法将基因簇egtBDE与载体线性片段进行同源重组连接得到重组质粒pET28a-egtBDE，线性化pET28a-egtBDE，采用一步克隆法将egt1基因与线性化pET28a-egtBDE载体进行同源重组连接得到重组质粒egtBDE-egt1。
构建重组质粒pET28a-egtBDE-egt2：酶切质粒pET28a获得载体线性片段，采用一步克隆法将基因簇egtBDE与载体线性片段进行同源重组连接得到重组质粒pET28a-egtBDE，线性化pET28a-egtBDE，采用一步克隆法将egt2基因与线性化的pET28a-egtBDE载体进行同源重组连接得到重组质粒pET28a-egtBDE-egt2。
构建重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE：酶切质粒pCDFDuet-1(购自长沙科文生物科技有限公司)获得载体线性片段，采用一步克隆法将基因簇egtBDE与载体线性片段进行同源重组连接得到重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE，线性化pCDFDuet-1-egtBDE，采用一步克隆法将基因簇egt12与线性化pCDFDuet-1-egtBDE载体进行同源重组连接得到重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtB DE。
(2)工程菌株获得
将上述已构建完成并验证正确的重组质粒pET28a-egtBDE、pET28a-egt12、pET28a-egtBDE-egt1、pET28a-egtBDE-egt2、pCDFDuet-1-egt12-egtBDE之一转入底盘菌株中获得高产麦角硫因工程菌株。
本发明还提供了一种生产麦角硫因的方法，将上述工程菌株进行活化培养后接种到种子培养基中培养，然后接种到发酵培养基中发酵培养得到麦角硫因。
在本发明中，所述活化培养的温度为35～40℃，优选为36～39℃，进一步优选为37～38℃；所述活化培养的时间为10～16h，优选为11～15h，进一步优选为12～14h。
在本发明中，所述接种到种子培养基中培养的温度为25～37℃，优选为26～35℃，进一步优选为28～32℃；所述接种到种子培养基中培养的时间为10～16h，优选为11～15h，进一步优选为12～14h。
在本发明中，所述接种到发酵培养基时的接种量为1～5％，优选为1.5～4.5％，进一步优选为2～4％；所述发酵培养的温度为25～37℃，优选为26～35℃，进一步优选为28～32℃；所述发酵培养的时间为20～30h，优选为22～28h，进一步优选为24～26h。
在本发明中，在进行发酵培养3～5h后向发酵培养基中加入0.1～0.5mM IPTG进行后续培养，所述IPTG浓度优选为0.15～0.45mM，进一步优选为0.2～0.4mM。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1重组质粒pET28a-egtBDE的构建及转化
构建重组质粒pET28a-egtBDE：以pET28a为载体，根据egtB基因、egtD基因、egtE基因化学合成基因簇egtBDE，由九天基因科技(天津)有限公司完成，从而得到重组质粒pET28a-egtBDE。egtB的GenBank：CP033231.1，egtD的GeneID：4537704，egtE的GeneID：4531386。
重组质粒pET28a-egtBDE的转化：取重组质粒pET28a-egtBDE 2μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌DH5α或JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egtBDE-F/egtBDE-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αegtBDE或E.coli JM109 egtBDE。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-egtBDE。重组质粒pET28a-egtBDE的质粒图谱见图2，重组质粒pET28a-egtBDE核苷酸序列如下。
pET28a-egtBDE(SEQ ID NO.24)：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatg
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实施例2重组质粒pET28a-egt12的构建及转化
构建重组质粒pET28a-egt12：以pET28a为载体，根据egt1基因、egt2基因化学合成基因簇egt12，由九天基因科技(天津)有限公司完成，从而得到重组质粒pET28a-egt12。egt1的GeneID：3872471，egt2的proteinID：CCE33140.1(SEQ ID NO.6)。
重组质粒pET28a-egt12的转化：取重组质粒pET28a-egt122μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌DH5α或JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt12-F/egt12-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αegt12或E.coliJM109 egt12。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-egt12。重组质粒pET28a-egt12的质粒图谱见图3，重组质粒pET28a-egt12核苷酸序列如下。
pET28a-egt12(SEQ ID NO.25)：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
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ggtttaaaatcccggcgcaagagattacgatcggtttggacgatccggaagacggctctgacatcaacaagcactatggttgggacaacgagaagcc
gccgcgcagagtgcaggttgcagcgtttcaggcgcaaggtcgtccgattaccaatgaggaatacgcacaatatctactggaaaagaacattgacaag
ctgcctgcgtcctgggcccgtctggacaacgaaaatatcagcaacggcaccaccaatagcgtctccggccatcattctaacagaacctcgaagcaac
aactgccgtcctctttcttagaaaaaacggctgttagaaccgtgtacggccttgtgccgctgaagcacgcgctggattggccggtttttgcaagctatga
cgagctagcgggttgcgcagcgtacatgggcggcagaattccgacctttgaggagacgcgttctatctacgcgtacgctgacgccctgaagaaaaa
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实施例3重组质粒pET28a-egtBDE-egt1的构建及转化
egt1片段的获得：在egt1基因两端分别引入酶切位点，设计引物egt1-FF1/egt1-RR1(引物序列见表1)，利用PCR技术扩增得到egt1的扩增片段，采用胶回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)将扩增的egt1片段进行纯化回收。PCR反应体系：2×phanta maxbuffer 10μL，dNTP mixture(10mM)0.4μL，以构建的pET28a-egt12质粒为模板，模板0.4μL(20ng/μl)，egt1-FF1引物(10μM)0.8μL，egt1-RR1引物(10μM)0.8μL，DMSO 0.4μL，phantamax×Super Fidelity DNA Polymerase 0.4μL，补超纯水至20μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸120s，变性、退火、延伸共循环30次；72℃延伸5min；4℃结束反应。
重组质粒pET28a-egtBDE-egt1的构建：用DNA限制性内切酶以酶切位点NotI和XHOI对质粒pET28a-egtBDE进行酶切，酶切条件为37℃，时间为30min，然后使用纯化回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)获得载体线性片段。采用一步克隆法，将扩增的egt1片段与双酶切后的pET28a-egtBDE载体线性片段进行同源重组连接，从而得到重组质粒pET28a-egtBDE-egt1。
重组质粒pET28a-egtBDE-egt1的转化：取重组质粒pET28a-egtBDE-egt12μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌DH5α或JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt1-F/egt1-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αegtBDE-egt1或E.coli JM109 egtBDE-egt1。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-egtBDE-egt1。重组质粒pET28a-egtBDE-egt1的质粒图谱见图4，重组质粒pET28a-egtBDE-egt1核苷酸序列如下。
pET28a-egtBDE-egt1(SEQ ID NO.26)：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctg
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实施例4重组质粒pET28a-egtBDE-egt2的构建及转化
egt2片段的获得：在egt2基因两端分别引入酶切位点，设计引物egt2-FF2/egt2-RR2(引物序列见表1)，利用PCR技术扩增得到egt2的扩增片段，采用胶回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)将扩增的egt2片段进行纯化回收。PCR反应体系：2×phanta maxbuffer 10μL，dNTP mixture(10mM)0.4μL，构建的pET28a-egt12质粒为模板，模板0.4μL(20ng/μl)，egt2-FF2引物(10μM)0.8μL，egt2-RR2引物(10μM)0.8μL，DMSO 0.4μL，phantamax×Super Fidelity DNA Polymerase 0.4μL，补超纯水至20μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸80s，变性、退火、延伸共循环30次；72℃延伸5min；4℃结束反应。
重组质粒pET28a-egtBDE-egt2的构建：用DNA限制性内切酶以酶切位点NotI和XHOI对质粒pET28a-egtBDE进行酶切，酶切条件为37℃，时间为30min，然后使用纯化回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)获得载体线性片段。采用一步克隆法，将扩增的egt2片段与双酶切后的pET28a-egtBDE载体线性片段进行同源重组连接，从而得到重组质粒egtBDE-egt2。
重组质粒pET28a-egtBDE-egt2的转化：取重组质粒pET28a-egtBDE-egt22μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌DH5α或JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt2-F/egt2-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αegtBDE-egt2或E.coli JM109egtBDE-egt2。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-egtBDE-egt2。重组质粒pET28a-egtBDE-egt2的质粒图谱见图5，重组质粒pET28a-egtBDE-egt2核苷酸序列如下。
pET28a-egtBDE-egt2(SEQ ID NO.27)：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcc
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实施例5重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE的构建及转化
egt12片段的获得：在egt12基因两端分别引入酶切位点，设计引物egt12-FF3/egt12-RR3(引物序列见表1)，利用PCR技术扩增得到egt12的扩增片段，采用胶回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)将扩增的egt12片段进行纯化回收。PCR反应体系：2×phantamax buffer 10μL，dNTP mixture(10mM)0.4μL，模板为已构建的质粒pET28a-egt12(20ng/μl)0.4μL，egt12-FF3引物(10μM)0.8μL，egt12-RR3引物(10μM)0.8μL，DMSO 0.4μL，phantamax×Super Fidelity DNA Pol ymerase 0.4μL，补超纯水至20μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸150s，变性、退火、延伸共循环35次；72℃延伸5min；4℃结束反应。
egtBDE片段的获得：在egtBDE基因两端引入酶切位点，设计引物egtBDE-FF4/egtBDE-RR4(引物序列见表1)，利用PCR技术扩增得到egtBDE的扩增片段，采用胶回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)将扩增的egtBDE片段进行纯化回收。PCR反应体系：2×phanta max buffer 10μL，dNTP mixture(10mM)0.4μL，以构建的质粒pET28a-egtBDE为模板，模板0.4μL(20ng/μl)，egtBDE-FF4引物(10μM)0.8μL，egtBDE-RR4引物(10μM)0.8μL，DMSO 0.4μL，phantama x×Super Fidelity DNA Polymerase 0.4μL，补超纯水至20μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸150s，变性、退火、延伸共循环35次；72℃延伸5min；4℃结束反应。
重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE的构建及转化：DNA限制性内切酶以酶切位点EcoRI和NotI对质粒pCDFDuet-1进行酶切，酶切条件为37℃，时间为30min，然后使用纯化回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)获得载体线性片段。采用一步克隆法，将扩增的egtBDE片段与双酶切后的pCDFDuet-1载体线性片段进行同源重组连接，从而得到重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE。
将重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE 2μl(100μg/ml)转化进大肠杆菌DH5α或JM109感受态中。将转化产物涂布于含有50μg/mL链霉素LB固体平板上，于37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egtBDE-F/egtBDE-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αpCDFDuet-1-egtBDE或E.coli JM109 pCDFDuet-1-egtBDE。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE。重组质粒pCDFDuet-1-egtBDE的质粒图谱见图6，重组质粒pCDFDu et-1-egtBDE核苷酸序列如下。
pCDFDuet-1-egtBDE(SEQ ID NO.28)：
ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgaattcagcaggatccatggccgctaccgccgctctgcgtagcggtgatacccgtgcccagaccgccgcagcatttccgccgcctccggtgaccgcccgtcctattgatcgtgccgcatggattgccgcatttcgctttgtgcgtagcgaaaccgaacgccgcgcagcaccgctgagcgcagaagatcagcaggtgcagagcatggcagatgcaagcccgaccaaatggcatcgtgcacatgttacctggttttttgaacagtttctgctgcgcgaacatctgccgggttatgcaatttatgatgaacgcctgcattatctgtttaatagttattatgtggccgcaggcccgcgtcagccgcgtattcagcgtggtatgattacccgtccgaccatggcagaagttaccgcctatcgcgcacatgtggatcgtgcagtggaaagtctgctgggccaggccgccgatggcgctttagaagcagttctgccgattctggaaattggtctgtatcatgaacagcagcatcaggaactgctgctgaccgatattctgcatgcatttgcacagaatccgctgggtccggtttatgatgcagaatggcgttttccggccgtggccggccagggtggtcaggcacctctggctcgcggcattgcatggattggtcatgaaggcgatggttttagctttgataatgaaagtccgcgtcatgaagcactgattctgccgggtcgcattgataaagcactggtgaccaatcgtgattggctgggctttatggaagcaggcggttatgccaaaccggaactgtggctgagcgatggctggtatgccggtcaggccgaaggttgggaagcaccgggttattggcgccgtgatggtgaaggctgggccaccatgaccctgggtggtgttcgtccggttgaactggatgcaccggtgacccatattagttattatgaagcagatgcctatgcccgctgggccggccgtaccttaccgacagaatttgaatgggaagtggccgcccgtgatggtgccctgccggatgcatttggtctggtgtggcagtggacccgtagcgcctatgttgcctatccgggttatcgtccgctgccgggcgcactgggtgaatataatggtaaatttatggtgagtcagttcgttctgcgtggtagtagtgtggcaaccccggaaggccatgcccgcctgccttatcgtaattttttttatccgcatcagcgttggcagtttaccggtctgcgcctggccgatgtggcccatcatcatcatcatcactaattaagaaggagatataagcaggatcatgaccctgagcctggccaattatctggccgcagatagcgccgccgaagccctgcgtcgtgatgttcgtgcaggtctgaccgcagcaccgaaaagcctgccgccgaaatggttttatgatgccgtgggcagtgatctgtttgatcagattacccgtctgccggaatattatccgacccgcaccgaagcccagattctgcgtacccgtagcgcagaaattattgccgccgcaggtgccgataccctggtggaactgggtagcggcaccagcgaaaaaacccgcatgctgctggatgcaatgcgtgatgcagaactgctgcgtcgttttattccgtttgatgtggatgcaggtgttctgcgcagtgccggcgcagccattggtgccgaatatccgggtattgaaattgatgcagtgtgcggtgattttgaagaacatctgggtaaaattccgcatgttggccgtcgtctggtggtgtttctgggcagtaccattggtaatctgaccccggccccgcgcgccgaatttctgagcaccctggcagataccctgcagccgggtgatagcctgctgctgggcaccgatctggttaaagataccggccgcctggtgcgcgcatatgatgatgcagccggtgtgaccgcagcatttaatcgtaatgtgctggccgttgttaatcgtgaactgagcgccgattttgatctggatgcatttgaacatgtggccaaatggaatagcgatgaagaacgcattgaaatgtggctgcgcgcacgtaccgcacagcatgtgcgtgttgcagcactggatctggaagttgattttgccgcaggcgaagaaatgctgaccgaagttagttgcaaatttcgcccggaaaatgttgttgcagaactggcagaagcaggcctgcgccagacccattggtggaccgatccggccggcgattttggcctgagcctggcggttcgtcatcatcatcatcatcactaaggcgaatgctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccatactgctgttaagaaggagatataccgaaggacgtgatgctggcccagcagtggcgcgatgcacgccctaaagtggcaggcctgcatctggatagtggtgcctgcagccgccagagctttgccgtgattgat
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tatagtagtagtcgcaaatggctggccggtccgcgcggcgttggtgttctggctgtgcgcccggaactggccgaacgtctgcagccgcgtattccgc
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acatctggccgcaggtccgaccgccgtgcgtgaacgtctggcagaagttggtcgtctgagccgtcaggtgctggccgaagttgatggttggcgcgtg
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ggtattgtgaccaccgcatgtgaactggcccgcgcaccgtttgaaatgcgcaccccggtgctgcgcattagtccgcatgttgatgtgaccgttgatgaa
ctggaacagtttgcagccgccctgcgtgaagccccgcatcatcatcatcatcactaaaagcttgcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaagtaat
cgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataaga
aggagatatacatatggcagatctcaattggatatcggccggccacgcgatcgctgacgtcggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcg
aaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcc
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agacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcatcgtggccggatcttgcggcccctcggcttgaacgaattgttagacat
tatttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaagataa
gcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggttact
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用DNA限制性内切酶以酶切位点BglII和XHOI对质粒pCDFDuet-1-egtBDE进行酶切，酶切条件为37℃，时间为30min，然后使用纯化回收试剂盒(天津为科生物技术有限公司)获得载体线性片段。采用一步克隆法，将扩增的egt12片段与双酶切后的pCDFDuet-1-egtBDE载体线性片段进行同源重组连接，从而得到重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE。
重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE的转化：取重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE 2μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌DH5α或JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL链霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt12-F/egt12-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到菌株E.coli DH5αegt12-eg tBDE或E.coli JM109 egt12-egtBDE。将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE。重组质粒pCD FDuet-1-egt12-egtBDE的质粒图谱见图7，重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE核苷酸序列如下。
pCDFDuet-1-egt12-egtBDE(SEQ ID NO.29)：
ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgaattcagcaggatccatggccgctaccgccgctctgcgtagcggtgatacccgtgcccagaccgccgcagcatttccgccgcctccggtgaccgcccgtcctattgatcgtgccgcatggattgccgcatttcgctttgtgcgtagcgaaaccgaacgccgcgcagcaccgctgagcgcagaagatcagcaggtgcagagcatggcagatgcaagcccgaccaaatggcatcgtgcacatgttacctggttttttgaacagtttctgctgcgcgaacatctgccgggttatgcaatttatgatgaacgcctgcattatctgtttaatagttattatgtggccgcaggcccgcgtcagccgcgtattcagcgtggtatgattacccgtccgaccatggcagaagttaccgcctatcgcgcacatgtggatcgtgcagtggaaagtctgctgggccaggccgccgatggcgctttagaagcagttctgccgattctggaaattggtctgtatcatgaacagcagcatcaggaactgctgctgaccgatattctgcatgcatttgcacagaatccgctgggtccggtttatgatgcagaatggcgttttccggccgtggccggccagggtggtcaggcacctctggctcgcggcattgcatggattggtcatgaaggcgatggttttagctttgataatgaaagtccgcgtcatgaagcactgattctgccgggtcgcattgataaagcactggtgaccaatcgtgattggctgggctttatggaagcaggcggttatgccaaaccggaactgtggctgagcgatggctggtatgccggtcaggccgaaggttgggaagcaccgggttattggcgccgtgatggtgaaggctgggccaccatgaccctgggtggtgttcgtccggttgaactggatgcaccggtgacccatattagttattatgaagcagatgcctatgcccgctgggccggccgtaccttaccgacagaatttgaatgggaagtggccgcccgtgatggtgccctgccggatgcatttggtctggtgtggcagtggacccgtagcgcctatgttgcctatccgggttatcgtccgctgccgggcgcactgggtgaatataatggtaaatttatggtgagtcagttcgttctgcgtggtagtagtgtggcaaccccggaaggccatgcccgcctgccttatcgtaattttttttatccgcatcagcgttggcagtttaccggtctgcgcctggccgatgtggcccatcatcatcatcatcactaattaagaaggagatataagcaggatcatgaccctgagcctggccaattatctggccgcagatagcgccgccgaagccctgcgtcgtgatgttcgtgcaggtctgaccgcagcaccgaaaagcctgccgccgaaatggttttatgatgccgtgggcagtgatctgtttgatcagattacccgtctgccggaatattatccgacccgcaccgaagcccagattctgcgtacccgtagcgcagaaattattgccgccgcaggtgccgataccctggtggaactgggtagcggcaccagcgaaaaaacccgcatgctgctggatgcaatgcgtgatgcagaactgctgcgtcgttttattccgtttgatgtggatgcaggtgttctgcgcagtgccggcgcagccattggtgccgaatatccgggtattgaaattgatgcagtgtgcggtgattttgaagaacatctgggtaaaattccgcatgttggccgtcgtctggtggtgtttctgggcagtaccattggtaatctgaccccggccccgcgcgccgaatttctgagcaccctggcagataccctgcagccgggtgatagcctgctgctgggcaccgatctggttaaagataccggccgcctggtgcgcgcatatgatgatgcagccggtgtgaccgcagcatttaatcgtaatgtgctggccgttgttaatcgtgaactgagcgccgattttgatctggatgcatttgaacatgtggccaaatggaatagcgatgaagaacgcattgaaatgtggctgcgcgcacgtaccgcacagcatgtgcgtgttgcagcactggatctggaagttgattttgccgcaggcgaagaaatgctgaccgaagttagttgcaaatttcgcccggaaaatgttgttgcagaactggcagaagcaggcctgcgccagacccattggtggaccgatccggccggcgattttggcctgagcctggcggttcgtcatcatcatcatcatcactaaggcgaatgctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccatactgctgttaagaaggagatataccgaaggacgtgatgctggcccagcagtggcgcgatgcacgccctaaagtggcaggcctgcatctggatagtggtgcctgcagccgccagagctttgccgtgattgat
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表1.引物的核苷酸序列
Figure BDA0004120013060000241
实施例6工程菌株的获得
将实施例1～5构建完成并验证正确的重组质粒pET28a-egtBDE、pET28a-egt12、pET28a-egt BDE-egt1、pET28a-egtBDE-egt2、pCDFDuet-1-egt12-egtBDE转入大肠杆菌BW25113中，得到5种高产麦角硫因工程菌株。
将实施例1验证后的重组质粒pET28a-egtBDE 2μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌BW25113感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egtBDE-F/egtBDE-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到大肠杆菌BW25113 egtBDE菌株。
将实施例2验证后的重组质粒pET28a-egt122μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌BW25113感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt12-F/egt12-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到大肠杆菌BW25113 egt12菌株。
将实施例3验证后的重组质粒pET28a-egtBDE-egt12μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌BW25113感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt1-F/egt1-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到大肠杆菌BW25113 egtBDE-egt1菌株。
将实施例4验证后的重组质粒pET28a-egtBDE-egt22μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌BW25113感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egt2-F/egt2-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到大肠杆菌BW25113 egtBDE-egt2菌株。
将实施例5验证后的重组质粒pCDFDuet-1-egt12-egtBDE 2μl(100μg/ml)加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌BW25113感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激60s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管10000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有50μg/mL链霉素LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，设计引物egtBDE-F/egtBDE-R、egt12-F/egt12-R(引物序列见表1)，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，得到大肠杆菌BW25113 egt12-egtBDE菌株。
实施例7生产麦角硫因的方法
将实施例6得到的工程菌株进行摇瓶发酵培养，方法如下：
(1)斜面培养：取-80℃保藏的工程菌株划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
(2)摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有5ml种子培养基的试管中，25～37℃，200rpm培养10～16h。种子培养基为：蛋白胨20g、酵母提取物10g、NaCl 10g，加水定容至1L。
(3)摇瓶发酵培养：按5％接种量接种种子液到装有发酵培养基的250mL三角瓶中，八层纱布封口，35℃，200r/min振荡培养。发酵培养基为：16～20g/LNa2HPO4·12H2O，5g/LKH2PO4，16g/L(NH4)2SO4，10mM MgSO4，0.5mM CaCl2，10g/L酵母提取物，15g/L葡萄糖，PH6.5-7.0。发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2，培养3h后加入0.2mM IPTG诱导培养，每24h取样，收集发酵液，发酵液中含有麦角硫因。
实施例8麦角硫因含量检测
标样准备：配置1g/L麦角硫因标样，分别稀释成浓度为5、25、50、100、200、400mg/L的标样，1mL过膜待测；
样品准备：取1mL实施例7得到的发酵液，在转速5000rpm下离心4min，固液分离，上清过膜待测；
麦角硫因的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent1260，UV检测器，Hypersil BDS C18柱(200×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相A：乙腈-水(3∶97)，流动相B：甲醇；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL；每个样品检测时长为20min；在使用液相检测目标产物过程中一直使用流动相A来检测样品，流动相B用于保柱子。
测得的不同高产工程菌株中麦角硫因含量见图8，工程菌株egtBDE与工程菌株egt12摇瓶产量分别为39.83mg/L、42.91mg/L，而两者的组合egtBDE-egt1、egtBDE-egt2、egtBDE-egt12在装液量为50ml摇瓶中麦角硫因产量分别为48.81mg/L、41.57mg/L、77.54mg/L。由图8可知，利用本发明工程菌株发酵得到的麦角硫因含量在39～78mg/L，而传统构建麦角硫因是采用egtABCDE五步酶促反应催化生成的方式，通过分别构建含有egtB、egtA共表达、egtC、egtE共表达以及egtD三个质粒，将这三个质粒转入大肠杆菌底盘菌株中。由于egtB不能直接利用半胱氨酸，只能催化γ-谷氨酰半胱氨酸(γGC)与组氨酸甜菜碱(Her)结合生成海西烯基-谷氨酰半胱氨酸亚砜(γGC-Her)，这种方式会造成半胱氨酸利用率低，从而导致摇瓶发酵麦角硫因产量只能达到17mg/L。
由以上实施例和实验例可知，本发明提供了一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法，所述工程菌株将麦角硫因合成途径中的两个关键酶egt1、egt2结合后共表达，提高了传统原核生物中egtABCDE反应效率，可使麦角硫因的产量高出传统途径的4倍多，而且不需要添加外源氨基酸如组氨酸、半胱氨酸等前体物质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高产麦角硫因工程菌株，其特征在于，所述工程菌株以大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的高产麦角硫因工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌JM109，大肠杆BW25113或大肠杆菌BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的高产麦角硫因工程菌株，其特征在于，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE、过表达麦角硫因生物合成蛋白egt1和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因或过表达麦角硫因合成基因簇egtBDE和麦角硫因生物合成蛋白egt1和egt2编码基因。
4.根据权利要求1或3所述的高产麦角硫因工程菌株，其特征在于，所述麦角硫因合成基因簇egtBDE由egtB基因、egtD基因、egtE基因组成，所述egtB基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述egtD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述egtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的高产麦角硫因工程菌株，其特征在于，所述麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述工程菌株进行活化培养后接种到种子培养基中培养，然后接种到发酵培养基中发酵培养得到麦角硫因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活化培养的温度为35～40℃，所述活化培养的时间为10～16h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种到种子培养基中培养的温度为25～37℃，所述接种到种子培养基中培养的时间为10～16h。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种到发酵培养基时的接种量为1～5％，所述发酵培养的温度为25～37℃，所述发酵培养的时间为20～30h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在进行发酵培养3～5h后向发酵培养基中加入0.1～0.5mMIPTG进行后续培养。
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CN116970546B (zh) * 2023-09-22 2023-12-26 江苏省中国科学院植物研究所 一种合成麦角硫因的工程菌株及其应用

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