CN116970546B - 一种合成麦角硫因的工程菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成麦角硫因的工程菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的合成麦角硫因的工程菌株，由EgtD基因、EgtE基因、EgtB基因以及标签基因组成；所述EgtD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述EgtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述EgtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。重组菌株ERG1能够实现麦角硫因在大肠杆菌中的异源合成，与不添加标签基因相比，EgtB基因在添加MBP标签、GST标签和SUMO标签后，都能明显提高麦角硫因的产量，其中添加MBP标签后，麦角硫因产量提升的效果最好。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种合成麦角硫因的工程菌株及其应用。
背景技术
麦角硫因（Ergothioneine, ERG）是从麦角真菌中分离得到的一种组氨酸衍生的硫醇化合物，也是稀有的天然手性氨基酸类强氧化剂，目前发现的唯一的天然2-硫代咪唑氨基酸。由于其特殊的结构而具有多种生理活性，比如抗氧化、抗炎、抗衰老等功能，尤其在抗氧化损伤、维持氧化还原平衡、解毒等方面具有重要的应用价值，可应用于化妆品、食品、膳食补充剂等不同领域。
麦角硫因主要存在于放线菌（如分枝杆菌）和非酵母类真菌中（包括担子菌门和子囊菌门），人体组织和器官比如红细胞、骨髓、肝脏和眼睛中也含有麦角硫因，但是人体不能自身合成，只能通过饮食获得，蘑菇是主要膳食来源。
麦角硫因可以通过菌菇提取、化学合成和合成生物学获得，但是菌菇提取含量太低，成本高，化学合成存在手性异构体杂质和溶剂残留，成本高等缺点。因此亟需构建一种能够高效合成麦角硫因的大肠杆菌基因工程菌株。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种合成麦角硫因的工程菌株，用于高效合成麦角硫因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种合成麦角硫因的工程菌株的应用，用于筛选高效合成麦角硫因的菌株。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种合成麦角硫因的工程菌株，所述工程菌株为大肠杆菌，在所述的大肠杆菌体内含有用于合成麦角硫因的质粒，在所述的质粒上克隆有EgtD基因、EgtE基因、EgtB基因以及标签基因；所述EgtD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述EgtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述EgtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
所述的标签基因选自MBP标签基因、GST标签基因、SUMO标签基因。
EgtD基因、EgtE基因、EgtB基因以及标签基因的串联方式为pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB。
具体步骤包括：
1）将EgtD、EgtE、EgtB基因和标签基因构建到表达载体pCDP2上；
2）将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中；
3）培育筛选得到合成麦角硫因的工程菌株。
步骤1）的具体过程如下：
A、在EgtD基因前添加MBP标签基因，得到MBP-EgtD；在EgtE基因前添加MBP标签基因，得到MBP-EgtE；在EgtB基因前分别添加MBP标签基因、GST标签基因和SUMO标签基因，得到MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB基因片段；
B、将MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB基因片段以及EgtD、EgtE和EgtB基因片段连接至载体pCDP2上，得到载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB、pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB；
C、将载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB、pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB进行串联，构建得到表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB。
步骤2）中，所述构建的表达载体包括pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB。
步骤3）中，培育筛选的方法为：
分别挑取空载体对照菌株和转基因大肠杆菌菌株的单克隆于5mL含链霉素的LB试管中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养12h；然后按2%的接种量转接于含25mL发酵培养基的250mL带挡板的三角瓶中，并添加50mg/L的链霉素，置于37℃摇床，220rpm震荡培养2~3h后，添加IPTG至终浓度0.1mM开始诱导，同时添加组氨酸和甲硫氨酸至终浓度0.5g/L，再置于30℃摇床，220rpm发酵培养24h~72h；取发酵液1mL，12000rpm离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测分析筛选得到合成麦角硫因工程菌株。
合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，所述的HPLC分析条件：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18-AQ柱；流动相A相是超纯水，B相是乙腈；以95%A相和5%B相等度洗脱，流速0.6mL/min，进样量10μL，检测波长257mn。
具体步骤如下：
（1）在EgtD基因前添加MBP标签基因，得到MBP-EgtD；在EgtE基因前添加MBP标签基因，得到MBP-EgtE；在EgtB基因前分别添加MBP标签基因、GST标签基因和SUMO标签基因，得到MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB基因片段；
（2）将MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB基因片段以及EgtD、EgtE和EgtB基因片段连接至载体pCDP2上，得到载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB、pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB；
（3）将载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB、pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB进行串联，构建得到表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB；
（4）采用热激法将构建的表达载体包括pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，分别命名为ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6和ERG7；
（5）培育筛选：分别挑取空载体对照菌株和转基因大肠杆菌菌株的单克隆于5mL含链霉素的LB试管中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养12h；然后按2%的接种量转接于含25mL发酵培养基的250mL带挡板的三角瓶中，并添加50mg/L的链霉素，置于37℃摇床，220rpm震荡培养2~3h后，添加IPTG至终浓度0.1mM开始诱导，同时添加组氨酸和甲硫氨酸至终浓度0.5g/L，再置于30℃摇床，220rpm发酵培养24h~72h；取发酵液1mL，12000rpm离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测分析筛选得到合成麦角硫因工程菌株；
其中，HPLC分析条件为：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18-AQ柱；流动相A相是超纯水，B相是乙腈；以95%A相和5%B相等度洗脱，流速0.6mL/min，进样量10μL，检测波长257mn；
筛选得到合成麦角硫因工程菌株为ERG4、ERG5、ERG6和ERG7。
筛选得到的合成麦角硫因工程菌株ERG4、ERG5、ERG6和ERG7在合成麦角硫因中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的重组菌株ERG1能够实现麦角硫因在大肠杆菌中的异源合成，但其72h的产量仅为33.4mg/L，与ERG1相比，EgtB基因在添加MBP标签、GST标签和SUMO标签后，都能明显提高麦角硫因的产量，其中添加MBP标签后，麦角硫因产量提升的效果最好。重组菌株ERG2、ERG3和ERG4在摇瓶发酵72h的产量分别为37.8mg/L，38.5mg/L和383.6mg/L，可见在EgtB基因前添加MBP标签基因，可以明显提高大肠杆菌中麦角硫因的产量；ERG5在摇瓶发酵72h的产量为102.7mg/L，可见当EgtD，EgtE和EgtB基因前都带有MBP标签基因时，麦角硫因的产量相比ERG1菌株均有提高；重组菌株ERG6和ERG7在摇瓶发酵72h的产量分别达到307.4mg/L和253mg/L。该技术为在大肠杆菌中提升麦角硫因的产量奠定了较好的研究基础。
附图说明
图1为pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB表达载体的构建示意图；
图2为麦角硫因的HPLC检测结果图；
图3为空对照菌株和ERG1菌株在摇瓶发酵24h~72h的麦角硫因产量图；
图4为ERG1、ERG2 、ERG3和ERG4菌株在摇瓶发酵24h~72h的麦角硫因产量图；
图5为ERG1、ERG4和ERG5菌株在摇瓶发酵24h~72h后的麦角硫因产量图；
图6为ERG4、ERG6和ERG7菌株在摇瓶发酵24h~72h后的麦角硫因产量图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、选取Mycobacterium smegmati来源的EgtD（GenBank: WP_011731156.1）和EgtE基因（GenBank: WP_011731155.1）， Methylobacterium pseudosasicola来源的EgtB基因（GenBank: WP_092043900.1）。三个基因序列交由北京擎科生物科技有限公司合成，得到SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的基因序列，作为后续基因克隆的模板。
2、根据SEQ ID NO. 1所示的EgtD，SEQ ID NO. 2所示的EgtE和 SEQ ID NO. 3所示的EgtB序列，设计相关引物（表1），进行PCR克隆和相关载体构建，具体如下：
1）以EgtD为模板，分别利用引物EgtD-F/EgtD-R和EgtD-MF/EgtD-R，高保真酶PCR扩增得到EgtD和M-EgtD基因片段；
以EgtE为模板，分别利用引物EgtE-F/EgtE-R和EgtE-MF/EgtE-R，高保真酶PCR扩增得到EgtE和M-EgtE基因片段；
以EgtB为模板，分别利用引物EgtB-F/EgtB-R、EgtB-MF/EgtB-R、EgtB-GF/EgtB-R和EgtB-SF/EgtB-R，高保真酶PCR扩增得到EgtB、M-EgtB、G-EgtB、S-EgtB基因片段；
构建pET29a-MBP质粒，以该质粒为模板，分别利用引物MBP-F/EgtD-MR、MBP-F/EgtE-MR和MBP-F/EgtB-MR，高保真酶PCR扩增得到MBP-D、MBP-E和MBP-B基因片段；
构建pET29a-SUMO质粒，以该质粒为模板，利用引物SUMO-F/EgtB-SR，高保真酶PCR扩增得到SUMO-B基因片段；
以pGEX4t-1质粒为模板，利用引物GST-F/EgtB-GR，高保真酶PCR扩增得到GST-B基因片段；
以M-EgtD基因片段和MBP-D基因片段共同作为模板，利用引物MBP-F/EgtD-R重叠PCR扩增得到MBP-EgtD基因片段；
以M-EgtE基因片段和MBP-E基因片段共同作为模板，利用引物MBP-F/EgtE-R重叠PCR扩增得到MBP-EgtE基因片段；
以M-EgtB基因片段和MBP-B基因片段共同作为模板，利用引物MBP-F/EgtB-R重叠PCR扩增得到MBP-EgtB基因片段；
以SUMO-B基因片段和S-EgtB基因片段共同作为模板，利用引物SUMO-F/EgtB-R重叠PCR扩增得到SUMO-EgtB基因片段；
以GST-B基因片段和G-EgtB基因片段共同作为模板，利用引物GST-F/EgtB-R重叠PCR扩增得到GST-EgtB基因片段。
2）将以上PCR得到的基因片段EgtD、EgtE、EgtB、MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB，以及表达载体 pCDP2，分别通过快切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收酶切产物EgtD、EgtE、EgtB、MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB、GST-EgtB、SUMO-EgtB和线性化的pCDP2，利用T4连接酶将EgtD、EgtE、EgtB、MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB、GST-EgtB和SUMO-EgtB分别连接至表达载体pCDP2上，热激法转化到大肠杆菌DH5α中，验证并测序得到正确的阳性克隆，分别是载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB、pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB。
3）以pCDP-EgtD作为质粒供体，在NheⅠ和SalⅠ位点进行双酶切，同时以pCDP-EgtE作为基因供体，在AvrⅡ和SalⅠ位点进行双酶切，根据同尾酶连接原理，利用T4连接酶将双酶切得到的EgtE基因片段连接至线性化的pCDP-EgtD质粒上，得到质粒pCDP-EgtD-EgtE；
再以pCDP-EgtD-EgtE作为质粒供体，继续在NheⅠ和SalⅠ位点进行双酶切，分别以pCDP-EgtB，pCDP-MBP-EgtB，pCDP-GST-EgtB和pCDP-SUMO-EgtB作为基因供体，在AvrⅡ和SalⅠ位点进行双酶切，同理，将双酶切得到的EgtB，MBP-EgtB，GST-EgtB和SUMO-EgtB基因片段分别连接至线性化的pCDP-EgtD-EgtE质粒上，得到表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB；
以pCDP-EgtD作为质粒供体，以pCDP-MBP-EgtE作为基因供体，按照上述方法将MBP-EgtE基因片段连接至线性化的pCDP-EgtD质粒后，得到质粒pCDP-EgtD-MBP-EgtE，再将双酶切得到的EgtB基因片段连接至质粒供体pCDP-EgtD-MBP-EgtE上，得到表达载体pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB；
再以pCDP-MBP-EgtD作为质粒供体，分别将双酶切得到的EgtE和MBP-EgtE基因片段连接至线性化的pCDP-MBP-EgtD质粒后，得到质粒pCDP-MBP-EgtD-EgtE和pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE，最后将双酶切得到的EgtB基因片段连接至质粒供体pCDP-MBP-EgtD-EgtE，得到表达载体pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB，将双酶切得到的MBP-EgtB基因片段连接至质粒供体MBP-EgtD-MBP-EgtE，得到pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB。
3、将上述中得到的表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-GST-EgtB和pCDP-EgtD-EgtE-SUMO-EgtB（图1）热激法分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中获得大肠杆菌工程菌株，并分别命名为ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6和ERG7。
表1相关引物
实施例2
分别挑取空载体对照菌株和ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6和ERG7菌株的单克隆于5mL含链霉素的LB试管中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养12h；然后按2%的接种量转接于含25mL发酵培养基（组分：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，（NH4）2SO45 g/L，柠檬酸2 g/L，NaCl 3 g/L，FeSO4•7H2O 0.3 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L）的250mL带挡板的三角瓶中，并添加相应浓度的链霉素，置于37℃摇床，220rpm震荡培养2~3h后，添加IPTG至终浓度0.1mM开始诱导，同时添加组氨酸和甲硫氨酸至终浓度0.5g/L，再置于30℃摇床，220rpm发酵培养24h~72h；取发酵液1mL，12000rpm离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测分析麦角硫因产量。HPLC分析条件：色谱柱为岛津Shim-packGIST C18-AQ柱（5μm，4.6×250mm），流动相A相是超纯水，B相是乙腈；以95%A相和5%B相等度洗脱，流速0.6mL/min，进样量10μL，检测波长257mn。
结果如图2和图3所示，重组菌株ERG1能够实现麦角硫因在大肠杆菌中的异源合成，但其72h的产量仅为33.4mg/L。
结果如图4所示，重组菌株ERG2、ERG3和ERG4在摇瓶发酵72h的产量分别为37.8mg/L，38.5mg/L和383.6mg/L，可见在EgtD基因或EgtE基因前添加MBP标签基因时，并不能有效地提高大肠杆菌中麦角硫因的产量，而在EgtB基因前添加MBP标签基因时，可以明显提升大肠杆菌中麦角硫因的产量。
结果如图5所示，ERG5在摇瓶发酵72h的产量仅102.7mg/L，可见当EgtD，EgtE和EgtB基因前都带有MBP标签基因时，虽然相比ERG1菌株中麦角硫因的产量稍有提高，但仍明显低于ERG4菌株中麦角硫因的产量。
结果如图6所示，重组菌株ERG6和ERG7在摇瓶发酵72h的产量分别达到307.4mg/L和253mg/L。与ERG1相比，EgtB基因在添加MBP标签、GST标签和SUMO标签后，都能明显提高麦角硫因的产量，其中添加MBP标签后，麦角硫因产量提升的效果最好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种合成麦角硫因的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为大肠杆菌，在所述的大肠杆菌体内含有用于合成麦角硫因的质粒，在所述的质粒上克隆有EgtD基因、EgtE基因、EgtB基因以及标签基因；所述EgtD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述EgtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述EgtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述标签基因为MBP标签基因；
EgtD基因、EgtE基因、EgtB基因以及MBP标签基因的串联方式为pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB或pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB。
2.权利要求1所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将EgtD、EgtE、EgtB基因和标签基因构建到表达载体pCDP2上；
2）将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中；
3）培育筛选得到合成麦角硫因的工程菌株。
3.根据权利要求2所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤1）的具体过程如下：
（1）在EgtD、EgtE和EgtB基因前分别添加MBP标签基因，得到MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB基因片段；
（2）将MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB基因片段以及EgtD、EgtE和EgtB基因片段连接至载体pCDP2上，得到载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB；
（3）通过载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB将基因进行串联，构建得到表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB。
4.根据权利要求2所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述构建的表达载体包括pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB。
5.根据权利要求2所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤3）中，培育筛选的方法为：
分别挑取空载体对照菌株和转基因大肠杆菌菌株的单克隆于5mL含链霉素的LB试管中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养12h；然后按2%的接种量转接于含25mL发酵培养基的250mL带挡板的三角瓶中，并添加50mg/L的链霉素，置于37℃摇床，220rpm震荡培养2~3h后，添加IPTG至终浓度0.1mM开始诱导，同时添加组氨酸和甲硫氨酸至终浓度0.5g/L，再置于30℃摇床，220rpm发酵培养24h~72h；取发酵液1mL，12000rpm离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测分析筛选得到合成麦角硫因工程菌株。
6.根据权利要求5所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，所述的HPLC分析条件：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18-AQ柱；流动相A相是超纯水，B相是乙腈；以95%A相和5%B相等度洗脱，流速0.6mL/min，进样量10μL，检测波长257mn。
7.根据权利要求2所述的合成麦角硫因的工程菌株的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）在EgtD、EgtE和EgtB基因前分别添加MBP标签基因，得到MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB基因片段；
（2）将MBP-EgtD、MBP-EgtE、MBP-EgtB基因片段以及EgtD、EgtE和EgtB基因片段连接至载体pCDP2上，得到载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB；
（3）通过载体pCDP-EgtD、pCDP-EgtE、pCDP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD、pCDP-MBP-EgtE、pCDP-MBP-EgtB将基因进行串联，构建得到表达载体pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB；
（4）采用热激法将构建的表达载体包括pCDP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-MBP-EgtE-EgtB、pCDP-EgtD-EgtE-MBP-EgtB、pCDP-MBP-EgtD-MBP-EgtE-MBP-EgtB分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，分别命名为ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5；
（5）培育筛选：分别挑取空载体对照菌株和转基因大肠杆菌菌株的单克隆于5mL含链霉素的LB试管中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养12h；然后按2%的接种量转接于含25mL发酵培养基的250mL带挡板的三角瓶中，并添加50mg/L的链霉素，置于37℃摇床，220rpm震荡培养2~3h后，添加IPTG至终浓度0.1mM开始诱导，同时添加组氨酸和甲硫氨酸至终浓度0.5g/L，再置于30℃摇床，220rpm发酵培养24h~72h；取发酵液1mL，12000rpm离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测分析筛选得到合成麦角硫因工程菌株；
其中，HPLC分析条件：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18-AQ柱；流动相A相是超纯水，B相是乙腈；以95%A相和5%B相等度洗脱，流速0.6mL/min，进样量10μL，检测波长257mn；
通过比较产量筛选得到合成麦角硫因工程菌株为ERG4、ERG5。
8.权利要求7筛选得到的合成麦角硫因工程菌株ERG4、ERG5在合成麦角硫因中的应用。
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| Title |
|---|
| Heterologous and High Production of Ergothioneine in Escherichia coli;Ryo Osawa等;J. Agric. Food Chem.;第1191-1196页 * |
| In Vitro Reconstitution of Mycobacterial Ergothioneine Biosynthesis;Florian P. Seebec等;American Chemical Society;第1-2页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116970546A (zh) | 2023-10-31 |
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