CN113234652A - 高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用，属于代谢工程领域。本发明将麦角硫因合成基因egtBCDE与异源的麦角硫因合成途径酶egt1组合，同时表达大肠杆菌基因gshA的同工酶egtA，获得工程菌E1‑A1，使麦角硫因产量由70.87mg/L提高至125.8mg/L。在工程菌E1‑A1的基础上，进一步对宿主的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢改造，构建得到基因工程菌在摇瓶条件下，麦角硫因的产量进一步提高到244.97mg/L；将其接种至3L发酵罐进行分批补料发酵，培养108h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达1102.96mg/L。本发明提供了一种从改造各个氨基酸前体的代谢途径来提高麦角硫因产量的思路，且构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用，属于代谢工程领域。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，ERG)是一种由组氨酸衍生而来的天然氨基酸衍生物，是一种硫醇化合物。麦角硫因作为一种天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域。

目前，麦角硫因的生产方法主要有，提取法：从含有麦角硫因的植物、微生物中分离提取，但由于其中麦角硫因的含量较低，利用此方法制备得到的麦角硫因杂质多、成本高、产出比低，难实现工业化生产；化学合成法：原料2-巯基咪唑很难制备，合成过程中易发生外消旋作用，且由于安全性难以保证，不能在食品、医药以及化妆品等领域实现广泛的应用；传统微生物合成法：利用自身能合成麦角硫因的微生物，如分枝杆菌、放线菌、蓝细菌和裂殖酵母等，直接进行发酵培养，但此方法得到的麦角硫因浓度很低。于是通过在常用改造工程菌株中异源表达麦角硫因合成途径，并通过代谢途径改造来获得高效合成麦角硫因的工程菌，极具发展前景。

但是，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，例如，文献“Heterologous and HighProduction of Ergothioneine in Escherichia coli”中，Ryo Osawa等人构建了一株可产麦角硫因的重组大肠杆菌，将此重组大肠杆菌摇瓶发酵72h，仅可使发酵液中麦角硫因的含量达24mg/L，产量过低；文献“Gram-scale fermentative production ofergothioneine drivenby overproduction of cysteine inEscherichia coli”中，Naoyukitanaka等人在引进麦角硫因合成途径的基础上，改造部分代谢途径后，使菌株麦角硫因的产量提高到98mg/L，产量仍然偏低，不足以大规模生产。

因此，如何利用代谢工程手段调节大肠杆菌中的代谢流，提高麦角硫因的产量，实现麦角硫因的高效合成，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[技术问题]

为了提高麦角硫因的产量、实现麦角硫因的高效生产，使其适用于工业化生产。

[技术方案]

麦角硫因合成过程中，需要用到三种氨基酸前体，分别是组氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)，为了提高这三种前体氨基酸的积累，本发明对大肠杆菌进行代谢工程改造，用质粒pCDFDuet-1来过表达大肠杆菌基因组中原有的基因或突变基因，或者异源表达其他来源的基因。本发明选择了与组氨酸积累相关的谷氨酸棒杆菌来源的基因hisG以及它的突变体hisG^{G233H，T235Q}，与甲硫氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因metA、thrA，与半胱氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因nrdH、cysK和突变基因cysE^T167A，以及谷氨酸棒杆菌来源的截短基因serA^T410STOP。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了麦角硫因合成基因簇egtBCDE(γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶、γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶、L-组氨酸-α-甲基转移酶和炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶)、麦角硫因生物合成蛋白1(Egt1)的编码基因和/或谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EgtA)的编码基因，并表达一种或多种与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因。

在一种实施方式中，所述与组氨酸代谢相关基因包括表达ATP磷酸核糖基转移酶HisG的基因hisG以及突变体hisG^G233H,T235Q，与甲硫氨酸代谢相关基因包括高丝氨酸酰基转移酶MetA的编码基因metA、天冬氨酸激酶ThrA的编码基因thrA、与半胱氨酸代谢相关基因包括半胱氨酸合酶的编码基因nrdH和cysK、丝氨酸乙酰转移酶CysE的突变基因cysE^T167A、磷酸甘油酸脱氢酶SerA的截短基因serA^T410STOP。

在一种实施方式中，所述麦角硫因合成基因簇egtBCDE来源于Mycolicibacteriumsmegmatis。

在一种实施方式中，所述麦角硫因合成基因簇egtBCDE由egtB、egtC、egtD、egtE组成，所述egtB的GeneID:4533015，egtC的GeneID：4532675，egtD的GeneID：4537704，egtE的GeneID：4531386。

在一种实施方式中，将编码所述基因簇egtBCDE的核苷酸连接至载体pRSFDuet-1上进行表达。

在一种实施方式中，利用载体pCDFDuet-1表达编码麦角硫因生物合成蛋白1(Egt1)的基因、编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EgtA)的基因、以及与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因。

在一种实施方式中，所述编码麦角硫因生物合成蛋白1的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

在一种实施方式中，所述hisG的GeneID：1019477，所述hisG^G233H,T235Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述metA的GeneID：948513，所述thrA的GeneID：945803。

在一种实施方式中，所述serA^T410STOP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nrdH的GeneID：947161，cysK的GeneID：946877，cysE^T167A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供一种所述高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)质粒pRSF-egtBCDE，pCDF-egtA+1-gene构建：首先酶切载体获得载体片段，通过PCR扩增得到线性片段egtB，采用一步克隆法将线性片段egtB与线性载体连接，获得质粒pRSF-egtB；通过多次相同步骤，逐次将基因连接上去，从而获得质粒pRSF-egtBCDE，pCDF-egtA+1-gene；

(2)工程菌构建：将质粒pRSF-egtBCDE，pCDF-egtA+1-gene导入大肠杆菌宿主中，得到所述的工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种合成麦角硫因的方法，所述方法是利用所述基因工程菌发酵生产麦角硫因。

在一种实施方式中，所述方法将基因工程菌接种至摇瓶培养基中，在25-35℃下培养1-2h，加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导；或将工程菌接种至发酵培养基中，在25-35℃，1-5vvm通气量，30％溶氧，pH在6-7之间培养5-6小时，加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导培养。

在一种实施方式中，将所述基因工程菌加入反应体系中，在25-35℃、pH在6～7下培养，培养1-6h加入IPTG诱导，总共培养不少于48h。

在一种实施方式中，培养时间不少于72h。

在一种实施方式中，所述摇瓶培养基为15-20g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1-5g/L KH₂PO₄，15-20g/L(NH₄)₂SO₄，3-7mM MgSO₄，0.1-0.2mM CaCl₂，1-5g/L酵母粉，15-20g/L葡萄糖。

在一种实施方式中，所述发酵培养基为5-10g/L酵母粉，1-5g/L胰蛋白胨，20-30g/L Na₂HPO₄·12H₂O，5-10g/L(NH₄)₂SO₄，1-5g/L KH₂PO₄，1-3g/L柠檬酸，0.1-0.2mg/L V_H，1-5mL微量元素，15-20g/L葡萄糖。

在一种实施方式中，发酵10-12小时后流加葡萄糖溶液。

本发明提供了所述合成麦角硫因的工程菌在制备麦角硫因、含有麦角硫因的产品及麦角硫因衍生物中的应用。

[有益效果]

本发明将麦角硫因合成基因egtBCDE与异源的麦角硫因合成途径酶egt1组合，同时表达大肠杆菌基因gshA的同工酶egtA，获得工程菌E1-A1，使麦角硫因产量由70.87mg/L提高至125.8mg/L。在工程菌E1-A1的基础上，进一步对宿主的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢改造，构建得到基因工程菌在摇瓶条件下，发酵72h，发酵液中麦角硫因的产量可提高至244.97mg/L。在3L发酵罐条件下麦角硫因产量可达1102.96mg/L，有助于麦角硫因、或麦角硫因衍生物的工业化生产。

附图说明

图1为重组质粒pRSF-egtBCDE的质粒图谱。

图2为重组质粒pCDF-egtA+1-gene的质粒图谱。

图3为标样(i)和工程菌发酵获得的发酵液(ii)的LC-MS分析结果比对图。

图4为摇瓶条件下不同大肠杆菌工程菌发酵获得的发酵液中麦角硫因的含量图。

图5为大肠杆菌工程菌3L发酵罐分批补料发酵图。

具体实施方式

(一)菌株及质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、粟酒裂殖酵母、谷氨酸棒杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；下述实施例中涉及的pRSFDuet-1质粒和pCDFDuet-1质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司。

(二)培养基

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

摇瓶培养基：16g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，16g/L(NH₄)₂SO₄，5mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，2g/L酵母粉，20g/L葡萄糖。

3L发酵罐培养基：6g/L酵母粉，4g/L胰蛋白胨，25g/L Na₂HPO₄·12H₂O，6g/L(NH₄)₂SO₄，4g/L KH₂PO₄，2g/L柠檬酸，0.1mg/L V_H，1mL微量元素，20g/L葡萄糖。

(三)检测方法

(1)麦角硫因的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相比例：水:甲醇＝99:1，流速0.7mL/min，柱温30℃，紫外吸收：257nm，进样体积为5μL，检测时长：20min。

(2)葡萄糖浓度的测定：用葡萄糖分析仪检测。

实施例1：工程菌E1的构建

化学合成(金唯智公司)麦角硫因合成基因簇egtBCDE(egtB的GeneID:4533015，egtC的GeneID：4532675，egtD的GeneID：4537704，egtE的GeneID：4531386)，以egtB-F、egtB-R为引物，对基因egtB进行PCR扩增，得到egtB的扩增片段；用DNA内切酶NocI和HindIII对质粒pRSFDuet-1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段与线性载体连接，化转进大肠杆菌JM109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg.mL^-1卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pRSF-egtB；

将获得的重组质粒pRSF-egtB作为载体，重复上述实验操作，进一步连接基因egtC，以获得重组质粒pRSF-egtBC；以此类推，获得重组质粒pRSF-egtBCDE(质粒图谱见图1)。

将重组质粒pRSF-egtBCDE化转进大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株E1。(该实施例中用到的引物见表1)

表1引物的核苷酸序列

名称	序列
		egtB-F	tgtttaactttaataaggagatataccatgatcgcacgcgagaca
egtB-R	acttaagcattatgcggccgcaagctttcagacgtcccaggccag
		egtC-F	ttaagtataagaaggagatatacatatgatgtgccggcatgtggc
egtC-R	gcggtggcagcagcctaggttaattaatcacaggggtgtcacgac
		egtD-F	cgcctggcctgggacgtctgagaaggagatataccatgacgctctcactggccaa
egtD-R	ggcgcgccgagctcgaattctcaccgcaccgccag
		egtE-F	ccacgtcgtcgtgacacccctgtgagaaggagatataccatgctcgcgcagcagt
egtE-R	cagcagcctaggttaattaatcagggcgcctcacg

实施例2：工程菌E1-1、E1-A、E1-A1的构建

化合合成(金唯智公司)谷氨酸-半胱氨酸连接酶EgtA(其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，以egtA-F、egtA-R为引物，对基因egtA进行PCR扩增，得到egtA的扩增片段；用DNA内切酶NocI和HindIII对质粒pCDFDuet-1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段与线性载体连接，化转进大肠杆菌JM109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/mL链霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pCDF-egtA；

以粟酒裂殖酵母基因组为模板，以egt1-F、egt1-R为引物，对基因egt1进行PCR扩增，得到egt1的扩增片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；用DNA内切酶NocI和HindIII对质粒pCDFDuet-1进行酶切，用DNA内切酶HindIII对质粒pCDF-egtA进行酶切，分别获得载体线性片段，采用一步克隆法将egt1的扩增片段分别与线性载体pCDFDuet-1、pCDF-egtA连接，分别化转进大肠杆菌JM109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/mL链霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pCDF-egt1、pCDF-egtA+1；

将重组质粒pRSF-egtBCDE分别和pCDF-egt1、pCDF-egtA、pCDF-egtA+1共转化进BL21(DE3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg.mL^-1卡那霉素和50μg.mL^-1链霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株E1-1(含有pRSF-egtBCDE和pCDF-egt1)、E1-A(含有pRSF-egtBCDE和pCDF-egtA)、E1-A1(含有pRSF-egtBCDE和pCDF-egtA+1)，(本实施例中用到的引物见表2)。

表2引物的核苷酸序列

名称	序列
		egtA-F	TGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCTCTTCCTGCTCGC
egtA-R	CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCTCAAAGTTCGCCTTTAGCAAGT
		Egt1-F	TAAAGGCGAACTTTGAAAGGAGATATACCATGatgacagaaatagaaaacattgg
Egt1-R	CTTAAGCATTATGCGGCCGCttagtttttgactagtctagctcca

实施例3：代谢途径的改造

在大肠杆菌中异源表达谷氨酸棒杆菌来源的基因hisG以及它的突变体hisG^{G233H ,T235Q}，大肠杆菌基因组上的基因metA、thrA，nrdH、cysK和突变基因cysE^T167A，谷氨酸棒杆菌来源的截短基因serA^T410STOP。

用相应引物(见表3)去扩增上述基因片段，用DNA内切酶NdeI和PacI对质粒pCDF-egtA+1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段hisG、hisG^{G233H，T235Q}(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、metA、thrA、nrdH、cysK、cysE^T167A(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、serA^T410STOP(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，分别与得到的线性化的pCDF-egtA+1载体连接，分别得到重组质粒，将重组质粒分别化转进大肠杆菌JM109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/mL链霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得相关重组质粒(质粒图谱见图2)；

将获得重组质粒pRSF-egtBCDE分别和pCDF-egtA+1-hisG、pCDF-egtA+1-hisG^{G233H ，T235Q}、pCDF-egtA+1-metA、pCDF-egtA+1-thrA、pCDF-egtA+1-nrdH、pCDF-egtA+1-cysK、pCDF-egtA+1-cysE^T167A、pCDF-egtA+1-serA^T410STOP、pCDF-egtA+1-thrA+serA^T410STOP共转化进BL21(DE3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株E1-A1-hisG、E1-A1-hisG^G233H,T235Q、E1-A1-metA、E1-A1-thrA、E1-A1-nrdH、E1-A1-cysK、E1-A1-cysE^T167A、E1-A1-serA^T410STOP、E1-A1-thrA+serA^T410STOP。

表3引物的核苷酸序列

名称	序列
		hisG-F	TATAAGAAGGAGATATACATATGttgaaaatcgctgtcccaaaca
hisG-R	GCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTAActagatgcgggcgatgcg
		hisG<sup>G233H,T235Q</sup>-F	TATAAGAAGGAGATATACATATGttgaaaatcgctgtcccaaaca
hisG<sup>G233H,T235Q</sup>-R	GCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTAActagatgcgggcgatgcg
		metA-F	TTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGatgccgattcgtgtgcc
metA-R	CAGCAGCCTAGGTTAATTAAttaatccagcgttggattcatgtgc
		thrA-F	AGTATAAGAAGGAGATATACATATGatgcgagtgttgaagttcgg
thrA-R	CAGCAGCCTAGGTTAATTAAtcagactcctaacttccatgagagg
		nrdH-F	GAAGGAGATATACATATGatgcgcattactatttacactcgtaac
nrdH-R	AGCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTAAtcatgcactggccgcgt
		cysK-F	GAAGGAGATATACATATGatgagtaagatttttgaagataactcgctgac
cysK-R	CAGCAGCCTAGGTTAATTAAttactgttgcaattctttctcagtgaagag
		cysE<sup>T167A</sup>-F	GTATAAGAAGGAGATATACATATGatgtcgtgtgaagaactggaaattgt
cysE<sup>T167A</sup>-R	CAGCAGCCTAGGTTAATTAAttagatcccatccccatactcaaatgtatg
		serA<sup>T410Stop</sup>-F	AAGTATAAGAAGGAGATATACATATGatgagccagaatggccgtc
serA<sup>T410Stop</sup>-R	GGCAGCAGCCTAGGTTAATTAATTAaacagactcagagttggtcttcacg

实施例4：工程菌的摇瓶培养

将实施例3构建得到的13株工程菌进行摇瓶培养，摇瓶培养基为：16g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，16g/L(NH₄)₂SO₄，5mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，2g/L酵母粉，20g/L葡萄糖。摇瓶培养条件为：将培养了8～10h的菌株，以2mL/100mL的量添加至发酵体系中，在30℃下培养2小时，然后加入0.2mM IPTG进行诱导培养，培养过程中，用2M氢氧化钠溶液调控pH在6.8～7.0之间。培养72h后，收集细胞内外的产物，并进行麦角硫因含量检测。

如图3所示，(i)为麦角硫因标样的LC-MS检测结果图，(ii)为样品的LC-MS检测结果图，通过对比可知，构建的工程菌能合成麦角硫因。如图4所示，是各个工程菌的麦角硫因产量，只表达麦角硫因合成基因簇的工程菌麦角硫因产量为70.87mg/L，在只表达麦角硫因合成基因簇的基础上，再表达合成途径中的其他基因egt1、egtA或egt1+egtA，产量分别提高到90.74mg/L、104.55mg/L、125.8mg/L。在此基础上对前体氨基酸的代谢途径进行改造，由数据可知，表达hisG^G233H,T235Q、thrA、cysE^T167A、serA^T410STOP可使产量有所提高，分别提高到144.9mg/L、184.83mg/L、160.41mg/L、210.26mg/L。工程菌E1-A1-thrA+serA^T410STOP的产量提高至244.97mg/L。

实施例5：工程菌株E1-A1-thrA+serA^T410STOP的3L发酵罐的分批补料发酵培养

发酵培养基为：6g/L酵母粉，4g/L胰蛋白胨，25g/L Na₂HPO₄·12H₂O，6g/L(NH₄)₂SO₄，4g/L KH₂PO₄，2g/L柠檬酸，0.1mg/L V_H，1mL微量元素，20g/L葡萄糖。

3L发酵罐中装液量为1.5L，将培养至了8～10h的菌株E1-A1-serA^T410STOP-thrA，以10mL/100mL的量添加至发酵体系中，培养条件为：在30℃，1-5vvm通气量，30％溶氧，pH在6～7下培养4小时，加入0.2mM IPTG进行诱导培养。培养过程中，测定葡萄糖剩余量，计算出菌体消耗葡萄糖的速率，来确定流加葡萄糖溶液的量，以氨水调控pH保持在6.0～7.0之间，培养过程中，取样测定菌体生长情况、葡萄糖消耗情况及麦角硫因含量。

结果如图5所示，培养84h、96h、108h，发酵液中麦角硫因的产量分别为1094.2mg/L、1100.88mg/L、1102.96mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用

<130> BAA210260A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2322

<212> DNA

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 1

atgacagaaa tagaaaacat tggcgcatta gaagttctct tctctcctga atccatcgag 60

cagagcctca aacggtgtca actcccctcc actttattat acgatgaaaa aggtttacga 120

ctgtttgatg agattacgaa tttaaaagaa tactacctgt atgaaagtga gcttgatatt 180

ctgaagaagt tcagcgattc cattgccaac cagttactgt ctccagatct tcctaacacg 240

gttatagaat tagggtgtgg aaatatgcgc aaaacaaaac ttcttttaga tgcgtttgaa 300

aagaagggct gtgatgtgca tttttacgcc cttgacctta atgaagccga gttgcaaaaa 360

ggactgcagg agcttcgtca aactaccaat tatcagcatg ttaaggtgtc tggtatttgc 420

ggttgctttg aaagattgct acaatgtttg gacaggtttc gtagtgagcc caatagtcga 480

attagcatgt tgtacttggg tgcttcgatt ggtaattttg ataggaaatc cgcagcatca 540

tttttacgtt cgtttgccag tcgtttgaat attcatgaca accttttaat ctccttcgat 600

catagaaaca aggctgagct agtccaacta gcttacgatg atccttatcg tattactgaa 660

aagtttgaaa agaatatttt ggctagtgtc aatgcggttt ttggtgaaaa ccttttcgac 720

gaaaatgatt gggaatataa aagtgtctac gatgaagatc tcggtgttca tagggcctac 780

ttacaagcca aaaatgaagt tactgttatt aagggtccaa tgttttttca atttaaacct 840

agtcatttaa ttttgatcga agaaagttgg aagaatagcg atcaagaatg tcgtcaaatc 900

attgagaaag gtgattttaa attagtctct aagtatgaaa gtacgattgc agattactcg 960

acctatgtta ttaccaaaca atttcctgct atgcttcaac tccctcttca gccttgtcct 1020

tcgttagcag aatgggatgc tctacgcaaa gtatggcttt ttattacaaa taaattgctt 1080

aacaaagata acatgtacac cgcatggatt cctttgagac atcctccaat tttttacatc 1140

ggacatgtcc ctgtttttaa tgatatttat ctcacaaaga ttgtcaaaaa caaagcaact 1200

gctaacaaaa aacatttttg ggaatggttt caacgtggta tagatccgga cattgaagat 1260

ccctccaagt gccattggca ttctgaagtt cctgaaagct ggccttctcc tgaccaactt 1320

cgtgaatatg agaaagagtc ttgggaatat catattgtaa agttgtgcaa agcaatggat 1380

gaattgtcta cttctgaaaa gagaattctc tggctttgtt acgaacatgt agccatgcat 1440

gtggagacaa ctctttacat ctacgtacag tcatttcaaa atgcaaacca gactgtatca 1500

atttgcggat cacttcctga accagctgaa aaacttacga aagctccgtt atgggtgaat 1560

gtacctgaaa cggaaattgc agttggtatg cccttgacaa cacaatacac gagtgttgga 1620

tcaaatttgc aatcatccga tcttagtgcc catgaaaata cagatgaact tttttatttt 1680

gcgtgggata atgagaaacc aatgaggaag aaactggttt ctagcttttc tattgccaat 1740

cgtccaattt ctaacggtga atatttagat tttatcaata aaaagtcaaa aacagaaagg 1800

gtgtatccaa agcaatgggc ggagattgat ggaacgcttt acatacgaac catgtacggc 1860

ttattacccc ttgacgacta cttgggttgg cctgttatga cttcatacga cgatctaaac 1920

aattatgcga gctcccaagg atgcagacta ccaactgagg atgaactgaa ctgtttttac 1980

gatcgggttc tcgagagaac tgatgagcct tatgttagta ccgaaggaaa ggcaactggt 2040

tttcaacaat tgcacccttt agccctaagt gataattcaa gtaatcaaat attcacagga 2100

gcatgggaat ggacaagtac agttctggag aagcacgagg attttgaacc tgaagagctt 2160

tatccagatt atacacgaga tttctttgat ggaaagcata atgtcgtttt gggtggtagc 2220

tttgctacgg ctacgcgcat ttcaaataga agaagcttca ggaactttta ccaagctggc 2280

tataaatatg catggattgg agctagacta gtcaaaaact aa 2322

<210> 2

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctcttc ctgctcgctc agattcaggc tgtgccgtac ccgtagagtt cacatcagct 60

gaacaggctg ctgctcatat tggcgctaac tcacttcagg atggccctat tggccgcgtt 120

ggccttgaaa ttgaagctca ttgtttcgac ctctcaaacc cgacccgacg accgtcctgg 180

gatgaacttt cagctgttat tgctgatgtt cctcctcttc ctggcggctc acgcattaca 240

gttgaacctg gcggcgctgt tgaactttca ggccctcctt atgatggccc tcttgctgct 300

gttgctgctc ttcaggctga tcgggcagta ctaagagccg aatttgctcg ccgcaacctt 360

ggccttgttc ttcttggcac agatcctctt cgcccaactc gaagagtgaa tcctggcgct 420

cgctattcag ctatggaaca gttcttcact gcatcaggca cagctgaagc tggcgctgct 480

atgatgacag ctacagcttc agttcaggtt aaccttgatg ctggccctcg cgatggctgg 540

gctgaacgcg tgcgattggc gcacgcgctt ggccctacaa tgattgctat tacagctaac 600

tcacctatgc ttggcggcca gtttacaggc tggtgttcaa cacgccagcg cgtttggggt 660

caacttgatt cagctcgctg tggcccggtc ttaggtgtag acggcgatga tcctgcttca 720

gaatgggctc gctatgctct tcgcgctcct gttatgcttg ttaactcacc tgatgcggtc 780

cctgtcacca attgggttcc tttcgcggac tgggctgatg gccgggccgt cctaggtggg 840

cgtcgcccta cagaagctga tcttgattat catttaacga ctctgttccc gcccgttcgc 900

cctcgccgct ggcttgaaat tcgctatctt gattcagttc ctgatgctct ttggcctgct 960

gctgtgttca ctttgacgac tttgttggac gatcctgttg ctgctgaatc agctgctgaa 1020

gctacacgcc ctgttgctac agcttgggat cgcgctgctc gcatgggcct tacagatcgc 1080

catcttcata cagctgctct tacatgtgtg agattagcag ccgagcgcgc tcctgctgaa 1140

cttgaagaat caatgacact tcttatgcgc tcagttcagc agcgccgctc acctgctgat 1200

gatttcagcg accgcgttgt tgctcgcggc attgctgctg ctgttcgcga acttgctaaa 1260

ggcgaacttt ga 1272

<210> 3

<211> 846

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

atgttgaaaa tcgctgtccc aaacaaaggc tcgctgtccg agcgcgccat ggaaatcctc 60

gccgaagcag gctacgcagg ccgtggagat tccaaatccc tcaacgtttt tgatgaagca 120

aacaacgttg aattcttctt ccttcgccct aaagatatcg ccatctacgt tgctggtggc 180

cagctcgatt tgggtatcac cggccgcgac cttgctcgcg attcccaggc tgatgtccac 240

gaagttcttt ccctcggctt cggttcctcc actttccgtt acgcagcacc agctgatgaa 300

gagtggagca tcgaaaagct cgacggcaag cgcatcgcta cctcttaccc caaccttgtt 360

cgcgatgacc tcgcagcacg tgggctttcc gctgaggtgc tccgcctcga cggtgcagta 420

gaggtatcca tcaagcttgg tgtcgcagat gccatcgccg atgttgtatc caccggccgc 480

acgctgcgtc agcaaggtct tgcacctttc ggcgaggttc tgtgcacctc tgaggctgtc 540

attgttggcc gcaaggatga aaaggtcacc ccagagcagc agatcctgct tcgccgcatc 600

cagggaattt tgcacgcgca gaacttcctc atgctggatt acaacgtcga ccgcgacaac 660

ctggacgctg ccactgcagt aaccccaggc ttatcccatc cacaggtatc cccactggca 720

cgcgacaact gggttgctgt acgcgccatg gtgccacgca ggtcagctaa cgccatcatg 780

gataagcttg ctggactcgg cgctgaagcc atcctggctt ctgaaatccg catcgcccgc 840

atctag 846

<210> 4

<211> 1227

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

atgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60

gacgcgcttg gagatgcagt agaagtccgt tgggttgacg gacctaaccg cccagaactg 120

cttgatgcag ttaaggaagc ggacgcactg ctcgtgcgtt ctgctaccac tgtcgatgct 180

gaagtcatcg ccgctgcccc taacttgaag atcgtcggtc gtgccggcgt gggcttggac 240

aacgttgaca tccctgctgc cactgaagct ggcgtcatgg ttgctaacgc accgacctct 300

aatattcact ccgcttgtga gcacgcaatt tctttgctgc tgtctactgc tcgccagatc 360

cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420

gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480

cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc taaccctgct 540

cgtgcggctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600

tttgtcacca ttcaccttcc taagaccaag gaaactgctg gcatgtttga tgcgcagctc 660

cttgctaagt ccaagaaggg ccagatcatc atcaacgctg ctcgtggtgg ccttgttgat 720

gagcaggctt tggctgatgc gattgagtcc ggtcacattc gtggcgctgg tttcgatgtg 780

tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840

cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga cgttgctgat 900

tctgtgctca aggcgctggc tggcgagttc gtggcggatg ctgtgaacgt ttccggtggt 960

cgcgtgggcg aagaggttgc tgtgtggatg gatctggctc gcaagcttgg tcttcttgct 1020

ggcaagcttg tcgacgccgc cccagtctcc attgaggttg aggctcgagg cgagctttct 1080

tccgagcagg tcgatgcact tggtttgtcc gctgttcgtg gtttgttctc cggaattatc 1140

gaagagtccg ttactttcgt caacgctcct cgcattgctg aagagcgtgg cctggacatc 1200

tccgtgaaga ccaactctga gtctgtt 1227

<210> 5

<211> 822

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgtcgtgtg aagaactgga aattgtctgg aacaatatta aagccgaagc cagaacgctg 60

gcggactgtg agccaatgct ggccagtttt taccacgcga cgctactcaa gcacgaaaac 120

cttggaagtg cactgagcta catgctggcg aacaagctgt catcgccaat tatgcctgct 180

attgctatcc gtgaagtggt ggaagaagcc tacgccgctg acccggaaat gatcgcctct 240

gcggcctgtg atattcaggc ggtgcgtacc cgcgacccgg cagtcgataa atactcaacc 300

ccgttgttat acctgaaggg ttttcatgcc ttgcaggcct atcgcatcgg tcactggttg 360

tggaatcagg ggcgtcgcgc attggcaatc tttctgcaaa accaggtttc tgtgacgttc 420

caggtcgata ttcacccggc agcaaaaatt ggccgtggca ttatgctcga ccacgccacg 480

ggcatcgttg tgggtgaagc agcggtaatt gaaaacgacg tatcgattct gcaatctgtg 540

acgcttggcg gtacgggtaa atctggtggt gaccgtcacc cgaaaattcg tgaaggtgtg 600

atgattggcg cgggcgcgaa aatcctcggc aatattgaag ttggtcgcgg cgcgaagatt 660

ggcgcaggtt ccgtggtgct gcaaccggtg ccgccgcata caaccgccgc tggcgttccg 720

gctcgtattg tcggtaaacc agacagcgat aagccatcaa tggatatgga ccagcatttc 780

aacggtatta accatacatt tgagtatggg gatgggatct aa 822

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是在大肠杆菌中重组表达了麦角硫因合成基因簇egtBCDE、麦角硫因生物合成蛋白1的编码基因和/或谷氨酸-半胱氨酸连接酶的编码基因，并表达一种或多种与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，与组氨酸代谢相关的基因包括ATP磷酸核糖基转移酶HisG的基因及其突变体hisG^G233H,T235Q，与甲硫氨酸代谢相关的基因包括编码高丝氨酸酰基转移酶MetA的基因、编码天冬氨酸激酶ThrA的基因、与半胱氨酸代谢相关的基因包括编码半胱氨酸合酶的基因nrdH和cysK、丝氨酸乙酰转移酶CysE的突变基因cysE^T167A、磷酸甘油酸脱氢酶SerA的截短基因serA^T410STOP。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述麦角硫因合成基因簇egtBCDE来源于Mycolicibacterium smegmatis。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码麦角硫因生物合成蛋白1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变体hisG^G233H,T235Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述磷酸甘油酸脱氢酶SerA的截短基因serA^T410STOP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述丝氨酸乙酰转移酶CysE的突变基因cysE^T167A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的麦角硫因合成基因簇egtBCDE以pRSFDuet-1为表达载体；编码麦角硫因生物合成蛋白1的基因、编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的基因以及与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因以pCDFDuet-1为表达载体。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种合成麦角硫因的方法，所述方法是利用权利要求1-6任一所述基因工程菌发酵生产麦角硫因。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌接种至摇瓶体系中，在25-35℃下培养1-2h，加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导；或将所述基因工程菌接种至发酵罐体系中，在25-35℃，1-5vvm通气量，25-30％溶氧，pH在6-7之间培养5-6小时，加入0.1-0.5mMIPTG进行诱导培养。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌加入反应体系中，在25-35℃、pH在6～7下培养，培养1-6h加入IPTG诱导，总共培养不少于48h。

10.权利要求1-6任一所述合成麦角硫因的基因工程菌在制备麦角硫因、含有麦角硫因的产品及麦角硫因衍生物中的应用。

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