CN111019877B - 一种产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种L‑半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径的丝氨酸模块，增强大肠杆菌对丝氨酸的利用能力，(2)减弱丝氨酸的转运，减弱副产物对L‑半胱氨酸合成的影响，(3)增加硫模块合成基因的表达(4)质粒上异源表达Corynebacterium glutamicum的serC基因，得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸产量从2.7g/L提高到3.83g/L。

Description

一种产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种产L-半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
(二)背景技术
L-半胱氨酸作为一种重要的含硫氨基酸，在生物体内起着重要的生理作用；既是某些氨基酸合成的前体物质；由于半胱氨酸含有特殊的化学键巯基，又在蛋白质的折叠、组装、稳定性等起着重要的作用。L-半胱氨酸的用途主要集中在4个行业：食品行业——用于面包的改良剂；化妆品行业——用于美容水、烫发液、防日晒的护肤膏霜；医药行业——用做化痰药，治疗支气管炎；饲料行业——用做饲料添加剂。据统计每年需要的L-半胱氨酸大约为5000吨，这个需求并不断地上涨。
目前国内L-半胱氨酸的生产主要有以下3种方法：化学合成法——以α-溴丙烯酸甲酯和硫脲为原料，反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸甲酯，在进一步水解得到；毛发水解法——将毛发或者羽毛加工形成胱氨酸后，溶解在盐酸中，然后通过电解还原制得；酶催化法——第一步与化学合成法相同通过反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)，在嗜噻唑假单胞菌的三种酶作用下不对称水解成L-半胱氨酸；综合考虑L-半胱氨酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产L-半胱氨酸受到越来越多的关注。而在德国Wacker公司实现了微生物发酵法产业化生产L-半胱氨酸。
随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢工程技术的日益发展，使用葡萄糖等为原料来生产包括L-半胱氨酸在内的多种有机物具备广阔的生产前景。但是，由于野生型菌株自身原因，胞内合成L-半胱氨酸途径受限，所以发酵法生产L-半胱氨酸最重要的是得到适当的L-半胱氨酸高产菌株。产L-半胱氨酸的菌株获得可以通过传统诱变筛选和代谢工程技术。在代谢工程改造过程中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关联，以及辅因子的与主代谢途径的竞争和协作关系，往往要从多角度来进行代谢工程改造。
在大肠杆菌中L-半胱氨酸的从头合成比较复杂，在半胱氨酸合成酶cysM或cysK的催化下进行:一分子O-乙酰丝氨酸和一分子S2-或S2O3 2-形成半胱氨酸。其中O-乙酰丝氨酸来源于葡萄糖，葡萄糖通过糖酵解途径生成3-磷酸甘油酸，3-磷酸甘油酸在磷酸甘油酸脱氢酶(serA)催化下生成3-磷酸丙酮酸，3-磷酸丙酮酸在磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)进一步催化下生成3-磷酸丝氨酸，3-磷酸丝氨酸在磷酸丝氨酸磷酸化酶(serB)进一步催化下生成丝氨酸，最后丝氨酸与乙酰-CoA在丝氨酸乙酰转移酶(cysE)的催化下生成O-乙酰丝氨酸。而S2-则通过大肠杆菌体内由SO4 2-还原而成，S2O3 2-则由胞外的S2O3 2-转运到胞内。L-半胱氨酸的生物合成还与NADPH有关，同时L-半胱氨酸、甘氨酸同属于丝氨酸族氨基酸，它们有着共同的前体物质丝氨酸，所以削弱竞争支路也是一种良好的策略。更重要的是L-半胱氨酸对细胞的生长具有一定的毒害作用。因此，过去对L-半胱氨酸的发酵生产尚未有深入细致的研究。
(三)发明内容
本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，提供一株产L-半胱氨酸的基因工程菌，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用
本发明采用的技术方案是：
一种产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株E.coli CCTCC NO：M 2019108为底盘菌株，将其基因组中的pgk基因的启动子替换为trc启动子，得到E coli W3110 EY(trc-pgk)；
(2)将E coli W3110 EY(trc-pgk)基因组中cycA基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)；
(3)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)基因组中gpmA、pykF基因敲除，得到Ecoli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)；
(4)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)基因组中的poxB基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)；
(5)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)基因组中的metR基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)；
(6)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)基因组中的cysB替换成鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的cysB并将149位的苏氨酸突变成脯氨酸(T149P)，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)；
(7)在质粒上过表达谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的serC，然后转化到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)中得到Ecoli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pC glu serC，即为所述产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明通过(1)强化大肠杆菌L-半胱氨酸合成途径的丝氨酸模块，增强大肠杆菌对丝氨酸的利用能力，(2)减弱丝氨酸的转运，减弱副产物对L-半胱氨酸合成的影响，(3)增加硫模块合成基因的表达(4)质粒上异源表达Corynebacterium glutamicum的serC基因，得到L-半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株。
优选的，所述菌株为大肠杆菌W3110 EYC glu serC(Escherichia coli W3110EYC glu serC)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2019年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M 20191026。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以菌株E.coli W3110 EY为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的gk基因的启动子替换为trc启动子，得到E coli W3110 EY(trc-pgk)；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk)基因组中cycA基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)基因组中gpmA、pykF基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)基因组中的poxB基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)基因组中的metR基因敲除，得到E coli W3110EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)基因组中的cysB替换成鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的cysB并将149位的苏氨酸突变成脯氨酸(T149P)，得到Ecoli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)；
(7)在质粒上过表达谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的serC，然后转化到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)中得到Ecoli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pC glu serC，即为所述产L-半胱氨酸的基因工程菌。
所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Salmonella typhimuriumcysBT149P基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Corynebacterium glutamicum的serC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中，25～30℃、180～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O32g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：0.15g/L Na2MoO4·2H2O,2.5g/L H3BO3,0.7g/LCoCl2·6H2O,0.25g/LCuSO4·5H2O,1.6g/L MnCl2·4H2O,0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
所述基因工程菌发酵前，通常先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明改造了大肠杆菌的L-半胱氨酸合成网络，通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换pgk的原有启动子，增强胞内丝氨酸的合成以及L-半胱氨酸合成途径；通过敲除丝氨酸外转运基因cycA，增加胞内丝氨酸的积累；通过敲除gpmA、pykF,通过敲除支路代谢基因poxB,通过敲除L-半胱氨酸降解途径的调控因子metR，来增加L-半胱氨酸的积累。运用CRISPR-Cas9将基因组上cysB基因替换成来自鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium的cysB并将149位的苏氨酸突变成脯氨酸(T149P)的突变基因。
本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中同时置换了pgk(编码磷酸甘油酸激酶)原有的启动子和RBS序列，强化了糖酵解路径，构建E.coli W3110EY(Trc-pgk)。
本发明敲除了cycA(编码)，减弱了丝氨酸的外转运，减少了丝氨酸的流失，构建Ecoli W3110 EY(trc-pgk△cycA)。
本发明敲除了gpmA和pykF基因(编码)，削弱了丝氨酸代谢支路，构建E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)。
本发明敲除了poxB基因(编码)，减少副产物乙酸的生成，构建E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)。
本发明敲除了metR基因(编码)，减少L-半胱氨酸转化为其他物质，构建E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)
本发明替换了cysB基因(编码)，增加硫模块与硫相关基因的表达，构建E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)
本发明在质粒上异源表达谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的serC基因(编码)，来增加丝氨酸的合成，构建了E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pEAm C glu serC。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明强化L-半胱氨酸生物生成途径中pgk、serC的表达，通过敲除cycA，减少合成L-半胱氨酸前体丝氨酸的转运，通过敲除gpmA和敲降pykF削弱丝氨酸代谢支路，通过敲除poxB和metR来减少副产物乙酸的生成和减少L-半胱氨酸转化为其他物质，通替换cysB基因来增加硫模块基因的表达，最后得到含有质粒的高产菌，L-半胱氨酸产量从2.7g/L提高到3.83g/L。
(四)附图说明
图1为L-半胱氨酸代谢途径图和改造位点；
图2为E.coli W3110EY(Trc-pgk)/pEAm记为trc-pgk的OD600和L-半胱氨酸效价变化；0.13
图3为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)/pEA记为△cycA的OD600和L-半胱氨酸效价变化；
图4为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)/pEAm记为△△gpmA△pykF的OD600和L-半胱氨酸效价变化；
图5为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)/pEAm记为△poxB和L-半胱氨酸效价变化；
图6为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)/pEAm记为△metR的OD600和L-半胱氨酸效价变化；
图7为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pEAm记为cysBT149P的OD600和L-半胱氨酸效价变化；
图8为E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pEAm C glu serC记为C glu serC的OD600和L-半胱氨酸效价变化。
图9为CCTCC NO：M 20191026菌株5L发酵罐的补料发酵的半胱氨酸产量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为0.10mg/L。
本发明亲本E.coli菌株W3110 EY来自中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2019108，已在CN110317766A中公开。
菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135 A1，US 2010/0248311 A1中公开。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
Figure GDA0003212625860000061
Figure GDA0003212625860000071
表2：引物序列
Figure GDA0003212625860000072
Figure GDA0003212625860000081
Figure GDA0003212625860000091
实施例1:L-半胱氨酸含量的测定
检测方法如下：
酸性茚三酮配制：称取250mg茚三酮加入6mL乙酸和4mL盐酸，配制成酸性茚三酮溶液。
样品处理：将样品浓度稀释到0.1～1g/L之间；
反应条件：分别取500μL样品、500μL乙酸和500μL酸性茚三酮混合，沸水浴10min；
检测条件：将反应样品在OD560nm处测定其OD560值。
实施例2：构建有效菌株E.coli W3110EY(Trc-pgk)及摇瓶发酵
以Escherichia coli W3110EY为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015 Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9 System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换pgk的原有启动子，以增强pgk的表达强度。
(1)构建pTarget-pgk质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-pgk-F/pT-pgk-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-pgk质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-pgk含Donor质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-pgk-up-F与pTD-pgk-up-R为引物扩增获得上游部分donor DNA(F1)，以pTD-pgk-down-F和pTD-pgk-down-R为引物扩增获得下游部分donor DNA(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；以pT-pgk质粒为模板，以pTD-line-F/pTD-line-R为引物扩增质粒线性化片段，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
Figure GDA0003212625860000101
(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化pTarget-pgk质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-pgk质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110EY中，挑选单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD6000.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(MolecularCloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取150ng pTD-pgk质粒与100μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养18-20h，以pgk-VF和Trc-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段600bp左右的片段，则证明是E.coli W3110EY(Trc-pgk)阳性菌落。
(5)pTarget和pCas质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-pgk质粒成功消除，挑取pTarget-pgk质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coli W3110EY(Trc-pgk)。
(6)将E.coli W3110EY(Trc-pgk)，以E.coli W3110EY为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜；接种1mL预培养物到装有20mL的MS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、200rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释5倍，根据实施例1进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
由图可见，基因组替换pgk基因启动子，L-半胱氨酸产量从2.7g/L增加到2.83g/L，这说明pgk表达的增强可有效增加前体物质Ser的合成，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：0.15g/L Na2MoO4·2H2O,2.5g/L H3BO3,0.7g/LCoCl2·6H2O,0.25g/L CuSO4·5H2O,1.6g/L MnCl2·4H2O,0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：丝氨酸外转运基因敲除菌E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-cycA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-cycA-F/pT-cycA-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-cycA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-cycA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-cycA-up-F、pTD-cycA-up-R、pTD-cycA-down-F和pTD-cycA-down-R为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-cycA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E.coli W3110EY(trc-pgk)感受态中，E.coli W3110EY(trc-pgk)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)。
(6)将构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)生产菌株以实施例2构建的EcoliW3110 EY(trc-pgk)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
由图可见，敲除Ser外转运基因，L-半胱氨酸产量从2.83g/L增加到3.08g/L，这说明敲除Ser外转运基因，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例4：丝氨酸降解途径基因E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)敲除菌的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-gpmA和pTarget-pykF质粒：以pTarget F质粒(AddgenePlasmid#62226)为模版，以pT-gpmA-F/pT-gpmA-R和pT-pykF-F/pT-pykF-R为引物分别PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-cycA和pTarget-pykF质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-gpmA和pTD-pykF质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-gpmA-up-F、pTD-gpmA-up-R、pTD-gpmA-down-F和pTD-gpmA-down-R为引物；以pTD-pykF-up-F、pTD-pykF-up-R、pTD-pykF-down-F和pTD-pykF-down-R为引物构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-gpmA和pTD-pykF质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E.coli E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA)感受态中，E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)。
(6)将构建的生产菌株E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)以实施例3构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图4所示。
由图可见，敲除Ser的降解基因，L-半胱氨酸产量从3.08g/L增加到3.21g/L，这说明敲除Ser降解基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例5：乙酸支路基因敲除菌E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-poxB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-poxB-F/pT-poxB-R为引物分别PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-poxB质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-poxB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-poxB-up-F、pTD-poxB-up-R、pTD-poxB-down-F和pTD-poxB-down-R为引物；构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-poxB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)感受态中，E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)。
(6)将构建的生产菌株E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)以实施例4构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图5所示。
由图可见，敲除乙酸支路基因，L-半胱氨酸产量从3.21g/L增加到3.36g/L，这说明敲除乙酸支路基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例6：调控因子E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)菌株的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-metR质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-metR-F/pT-metR-R为引物分别PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-metR质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-metR质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-metR-up-F、pTD-metR-up-R、pTD-metR-down-F和pTD-metR-down-R为引物；构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-metR质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)感受态中，E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)。
(6)将构建的生产菌株E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)以实施例5构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图6所示。
由图可见，L-半胱氨酸降解调控因子基因的敲除，L-半胱氨酸产量从3.36g/L增加到3.5g/L，这说明敲除L-半胱氨酸降解调控因子基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例7：异源表达硫代谢基因簇基因E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)菌株的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-cysBT149P质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-cysBT149P-F/pT-cysBT149P-R为引物分别PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-cysBT149P质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-cysBT149P质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-cysBT149P-up-F、pTD-cysBT149P-up-R、pTD-cysBT149P-down-F和pTD-cysBT149P-down-R为引物；构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-cysBT149P质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)感受态中，E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)。
(6)将构建的生产菌株E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)以实施例6构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图7所示。
由图可见，将E.coli原有的cysB基因簇替换成鼠伤寒门菌的cysB基因簇，L-半胱氨酸产量从3.5g/L增加到3.68g/L，这说明异源表达鼠伤寒门菌的cysB基因簇，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例8：过表达质粒pC glu serC菌株的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pC glu serC质粒：在以之前构建的PEAm质粒为模板，以PEAm-line-F/PEAm-line-R为引物获得PCR线性扩增产物PEAm-line质粒，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段；；在以Corynebacterium glutamicum的基因组为模板，以pserC-F/pserC为引物获得PCR扩增产物serC，Clean up试剂盒回收DNA片段；；按照
Figure GDA0003212625860000161
(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化PEAm-line质粒、片段serC连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过测序验证得到pC glu serC质粒。
(2)制备E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)化学转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(3)将构建好的pC glu serC质粒，通过化学转化法转化到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)感受态中，获得E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pEAm C glu serC。
(4)将构建的生产菌株E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pEAm C glu serC以实施例7构建的E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图8所示。
由图可见，在质粒上过表达Corynebacterium glutamicum的serC基因，L-半胱氨酸产量从3.68g/L增加到3.83g/L，这说明质粒上异源表达Corynebacterium glutamicum的serC基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例9：5L发酵罐的补料发酵
在平板上挑选一颗上述保藏菌株(CCTCC NO：M 20191026)的单菌落，接5mL LB培养基含Amp抗性的试管培养过夜，将培养过夜的种子液取1mL转接100mL LB培养基的摇瓶，培养12h，为上罐的种子液；
5L发酵罐培养基：C6H12O6 30g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨5g/L、1ml/L微量元素溶液；
补料培养基：C6H12O6 500g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨5g/L、1ml/L微量元素溶液；
配制2L发酵培养基，500mL补料培养基，用50％的氨水调节pH为7.0，将上罐种子液按体积比15％接种，培养72h；72h后L-半胱氨酸的产量为7.31g/L，如图9所示。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 981
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<400> 2
atggaaatga agctgcagca actgcgttac atcgttgagg tggttaacca caacctgaac 60
gttagcagca ccgcggaagg cctgtatacc agccagccgg gtattagcaa gcaagtgcgt 120
atgctggagg acgaactggg catccagatt ttcgcgcgta gcggtaaaca cctgacccag 180
gttaccccgg cgggccaaga gatcattcgt atcgcgcgtg aagtgctgag caaggttgac 240
gcgattaaaa gcgtggcggg tgaacacacc tggccggata agggtagcct gtacatcgcg 300
accacccaca cccaagcgcg ttatgcgctg ccgggcgtga tcaaaggttt cattgaacgt 360
tacccgcgtg ttagcctgca catgcatcaa ggtagcccga cccaaattgc ggaggctgtg 420
agcaagggta acgcggactt tgcgattgcg ccggaagcgc tgcacctgta cgacgatctg 480
gttatgctgc cgtgctatca ctggaaccgt agcattgttg ttaccccgga tcacccgctg 540
gcggcgacca gcagcgtgac cattgaggcg ctggcgcagt acccgctggt tacctatacc 600
ttcggcttta ccggtcgtag cgaactggac accgcgttca accgtgcggg tctgaccccg 660
cgtatcgtgt ttaccgcgac cgacgcggat gtgattaaga cctatgttcg tctgggtctg 720
ggcgtgggtg ttatcgcgag catggcggtg gatccgctgg cggacccgga tctggttcgt 780
atcgacgcgc acgatatttt cagccacagc accaccaaaa tcggtttccg tcgtagcacc 840
tttctgcgta gctacatgta tgacttcatt cagcgttttg cgccgcacct gacccgtgac 900
gtggttgata ccgcggttgc gctgcgtagc aacgaggaaa tcgaggcgat gtttcaagat 960
attaagctgc cggaaaaata a 981
<210> 3
<211> 1131
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
atgaccgact tccccaccct gccctctgag ttcatccctg gcgacggccg tttcggctgc 60
ggaccttcca aggttcgacc agaacagatt caggctattg tcgacggatc cgcatccgtc 120
atcggtacct cacaccgtca gccggcagta aaaaacgtcg tgggttcaat ccgcgaggga 180
ctctccgacc tcttctccct tccagaaggc tacgagatca tcctttccct aggtggtgcg 240
accgcattct gggatgcagc aaccttcgga ctcattgaaa agaagtccgg tcacctttct 300
ttcggtgagt tctcctccaa gttcgcaaag gcttctaagc ttgctccttg gctcgacgag 360
ccagagatcg tcaccgcaga aaccggtgac tctccggccc cacaggcatt cgaaggcgcc 420
gatgttattg catgggcaca caacgaaacc tccactggcg ccatggttcc agttcttcgc 480
cccgaaggct ctgaaggctc cctggttgcc attgacgcaa cctccggcgc tggtggactg 540
ccagtagaca tcaagaactc cgatgtttac tacttctccc cacagaagtg cttcgcatcc 600
gacggtggcc tgtggcttgc agcgatgagc ccagcagctc tcgagcgcat cgagaagatc 660
aacgcttccg atcgcttcat ccctgagttc ctcaacctgc agaccgcagt ggataactcc 720
ctgaagaacc agacctacaa caccccagct gttgctacct tgctgatgct ggacaaccag 780
gtcaagtgga tgaactccaa cggcggcctg gatggaatgg ttgctcgcac cacagcaagc 840
tcctccgccc tgtacaactg ggctgaggct cgcgaggagg catccccata cgtggcagat 900
gcagctaagc gctccctcgt tgtcggcacc atcgacttcg atgactccat cgacgcagca 960
gtgatcgcta agatactgcg cgcaaacggc atcctggaca ccgagcctta ccgcaagctg 1020
ggacgcaacc agctgcgcat cggtatgttc ccagcgatcg attccaccga tgtggaaaag 1080
ctcaccggag caatcgactt catcctcgat ggcggttttg caaggaagta a 1131
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
taatactagt ctatggctac tgttgctttc gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
gctctaaaac gaaagcaaca gtagccatag actagtatta tacctaggac 50
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
ctcgagttca tgtgcagctc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 7
ctgcaggtcg actctagaga 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 8
tctctagagt cgacctgcag tattgatgca taccatcctg 40
<210> 9
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 9
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaaagc aaagccccat 60
tcgttat 67
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 10
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg tctgtaatta 60
agatgac 67
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 11
gagctgcaca tgaactcgag ttacttctta gcgcgctctt c 41
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 12
taatactagt tggttctgct gggttgtaac gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 13
gctctaaaac gttacaaccc agcagaacca actagtatta tacctaggac 50
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 14
tctctagagt cgacctgcag ggtgaacccg ctgaattccc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 15
catccagcat gataatgcgg gtttttttct tcctgtacct 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 16
aggtacagga agaaaaaaac ccgcattatc atgctggatg 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 17
gagctgcaca tgaactcgag gccccgctgg cagaaatcat 40
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 18
taatactagt cgagaaagaa ctgccgctga gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 19
gctctaaaac tcagcggcag ttctttctcg actagtatta tacctaggac 50
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 20
tctctagagt cgacctgcag tcttgttaca ggccaaaggc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 21
tcattttaaa cgaatgacgt atacttactc ctcaaatcat 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 22
atgatttgag gagtaagtat acgtcattcg tttaaaatga 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 23
gagctgcaca tgaactcgag agagcctaac tacagcgcga 40
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 24
taatactagt atggaagtta ccgccattga gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 25
gctctaaaac tcaatggcgg taacttccat actagtatta tacctaggac 50
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 26
tctctagagt cgacctgcag caaaaatcaa acaaaatcag 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 27
attaattcac aaaagcaata gacagtctta gtctttaagt 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 28
acttaaagac taagactgtc tattgctttt gtgaattaat 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 29
gagctgcaca tgaactcgag gagctgcgtc atctttagca 40
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 30
taatactagt ttgcgagctg gtttccagcc gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 31
gctctaaaac ggctggaaac cagctcgcaa actagtatta tacctaggac 50
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 32
tctctagagt cgacctgcag gcggcccggc tccgtatatg 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 33
gacgggaaat gccacccttt ggttctccat ctcctgaatg 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 34
cattcaggag atggagaacc aaagggtggc atttcccgtc 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 35
gagctgcaca tgaactcgag aattcccatg cttctttcag 40
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 36
taatactagt ggtagagatg gattttaaat gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 37
gctctaaaac atttaaaatc catctctacc actagtatta tacctaggac 50
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 38
tctctagagt cgacctgcag atctttgttc tgatgacgcg 40
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 39
gccgcactgg ccaacgttta gaaagtcctt cacttcggca 40
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 40
tgccgaagtg aaggactttc taaacgttgg ccagtgcggc 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 41
gagctgcaca tgaactcgag ctacatcacg ctgatttatg 40
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 42
taatactagt tgccggagag cacacctggc gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 43
gctctaaaac gccaggtgtg ctctccggca actagtatta tacctaggac 50
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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tctctagagt cgacctgcag ttcgtgctgc gtgacggtgc 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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cgcagttgct gcagcttcat ggtctgtttc ctgtgtgaaa 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 46
tttcacacag gaaacagacc atgaagctgc agcaactgcg 40
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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ccgaaaataa cgcaagaaat tatttttccg gcagcttaa 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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ttaagctgcc ggaaaaataa tttcttgcgt tattttcgg 39
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 49
gagctgcaca tgaactcgag gcataatggt gacgactcca 40
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 50
ggctgttttg gcggatgaga gaag 24
<210> 51
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<213> 人工序列(Unknown)
<400> 51
ggtctgtttc ctgtgtgaaa ttaacttccc acctttaccg 40
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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tttcacacag gaaacagacc atgaccgact tccccaccct 40
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 53
tctcatccgc caaaacagcc ttacttcctt gcaaaaccgc 40

Claims (7)

1.一种产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株E.coli CCTCC NO：M 2019108为底盘菌株，将其基因组中的pgk基因的启动子替换为trc启动子，得到E coli W3110 EY(trc-pgk)；
(2)将E coli W3110 EY(trc-pgk)基因组中cycA基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)；
(3)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA)基因组中gpmA、pykF基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)；
(4)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF)基因组中的poxB基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)；
(5)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB)基因组中的metR基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)；
(6)将E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR)基因组中的cysB替换成鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的cysB并将149位的苏氨酸突变成脯氨酸(T149P)，得到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmAΔpykF△poxB△metR:cysBT149P)；
(7)在质粒上过表达谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的serC，然后转化到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)中得到E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pC glu serC，即为所述产L-半胱氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述菌株为大肠杆菌W3110 EYC gluserC(Escherichia coli W3110 EYC glu serC)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2019年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M 20191026。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以菌株E.coli W3110 CCTCC NO：M 2019108为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的gk基因的启动子替换为trc启动子，得到E coli W3110 EY(trc-pgk)；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgk)基因组中cycA基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycA)；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycA)基因组中gpmA、pykF基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykF)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykF)基因组中的poxB基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykFΔpoxB)；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykFΔpoxB)基因组中的metR基因敲除，得到E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykFΔpoxBΔmetR)；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E coli W3110 EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykFΔpoxBΔmetR)基因组中的cysB替换成鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的cysB并将149位的苏氨酸突变成脯氨酸，得到E coli W3110EY(trc-pgkΔcycAΔgpmAΔpykFΔpoxBΔmetR:cysBT149P)；
(7)在质粒上过表达谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的serC，然后转化到E coli W3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)中得到E coliW3110 EY(trc-pgk△cycA△gpmA△pykF△poxB△metR:cysBT149P)/pC glu serC，即为所述产L-半胱氨酸的基因工程菌。
4.权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中，25～30℃、180～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：0.15g/L Na2MoO4·2H2O,2.5g/LH3BO3,0.7g/LCoCl2·6H2O,0.25g/L CuSO4·5H2O,1.6g/L MnCl2·4H2O,0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
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