JP6415977B2 - 弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株およびその使用方法 - Google Patents
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Description
優先権の利益が、それぞれ、Aladar A. Szalay、Nanhai Chen、Yong A. YuおよびQian Zhangの、それぞれ「Clonal Strains of Attenuated Vaccinia Viruses and Methods of Use Thereof」の表題の2011年4月15日に出願された米国特許仮出願第61/517,297号および2011年11月4日に出願された米国特許仮出願第61/628,684号に対して主張される。
配列表の電子バージョンが本明細書と共に出願され、その内容はその全体が参照により組み込まれる。電子ファイルは、4.44メガバイトのサイズであり、4832seqPC1.txtのファイル名が付けられている。
ワクシニアウイルス単離物。
本発明には、以下の実施態様が挙げられる:
(1)ゲノムが配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含むクローン株以外の単離されたLIVPクローン株;
(2)GLV−1h68と比較してより高い抗腫瘍形成性および/または低下した毒性を有する、(1)に記載の単離されたLIVPクローン株であって、ここでGLV−1h68は配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有するものである、単離されたLIVPクローン株;
(3)そのゲノム中に、非ウイルス異種核酸またはオープンリーディングフレームの欠失をさらに含む、(1)または(2)に記載の単離されたLIVPクローン株;
(4)配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有するGLV−1h68と命名されたウイルスと比較して低下した毒性を有する、(1)から(3)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株;
(5)配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有するGLV−1h68と命名されたウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性を有する、(1)から(3)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株;
(6)配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有するGLV−1h68と命名されたウイルスと比較して低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を有する、(1)から(3)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株;
(7)配列番号10に記載のヌクレオチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むが、配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含まない、(1)から(6)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株;
(8)配列番号10に記載のヌクレオチド配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、(7)に記載の単離されたLIVPクローン株;
(9)配列同一性が、逆位末端反復(ITR)に対応するヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列のアラインメント、および末端ギャップがペナルティを受けないGAP配列アラインメントプログラムにより決定される全体的アラインメントの使用により決定される、(7)または(8)に記載の単離されたクローン株;
(10)a)配列番号1のヌクレオチド10,073〜180,095、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870;または
b)配列番号1のヌクレオチド10,073〜180,095、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870の配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む、(1)から(9)のいずれかに記載の単離されたクローン株;
(11)左および/または右の逆位末端反復を含む、(10)に記載の単離されたクローン株;
(12)配列番号1、2、4、5、6、7または8に記載のヌクレオチド配列、配列番号1、2、4、5、6、7または8に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、(1)から(11)のいずれかに記載の単離されたクローン株;
(13)(1)から(12)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株を増殖させることにより製造されたLIVP調製物;
(14)(1)から(12)のいずれかに記載のクローン株を含む細胞培養物または単離された細胞;
(15)(14)に記載の細胞または細胞培養物を増殖させること;および
得られた細胞からLIVPクローンを単離すること
により製造された単離されたクローン株;
(16)(1)から(12)または(15)のいずれかに記載のLIVPクローン株のゲノム;および前記ゲノム中の異種遺伝子産物をコードする核酸
を含む、組換えLIVPウイルス株;
(17)異種遺伝子産物をコードする核酸が、ウイルスのゲノム中の非必須遺伝子もしくは領域に挿入されるか、またはウイルスのゲノム中の非必須遺伝子もしくは領域の代わりに挿入される、(16)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(18)異種遺伝子産物をコードする核酸が、ウイルスのゲノム中のヘマグルチニン(HA)、チミジンキナーゼ(TK)、F14.5L、ワクシニア成長因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、K1L/K2L、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子座、7.5K、C7−K1L、B13R+B14R、A26Lまたは14L遺伝子座に挿入される、(16)または(17)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(19)異種遺伝子産物が治療剤または診断剤である、(16)から(18)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(20)異種遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変するかまたは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、PET画像化のための遺伝子ならびにMRI画像化のための遺伝子から選択される、(16)から(19)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(21)抗転移剤が、転移定着を阻害するか、またはインビトロ(in vitro)細胞浸潤アッセイにおいて細胞浸潤を阻害する、(20)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(22)抗血管新生剤が腫瘍における血管形成を阻害する、(20)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(23)異種遺伝子産物が、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスRNA、プロドラッグ変換酵素、siRNA、マイクロRNA、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子から選択される治療剤である、(16)から(22)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(24)異種遺伝子産物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−24(IL−24)、インターフェロンγ誘導性タンパク質10(IP−10)、Tリンパ球上で発現される受容体であるHVEMについてHSV糖タンパク質Dと競合するリンホトキシン誘導性発現物(LIGHT)、p60スーパー抗原、OspF、OspG、シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT1α)、STAT1β、プラスミノゲンk5ドメイン(hK5)、色素上皮分化因子(PEDF)、一本鎖抗VEGF抗体、一本鎖抗DLL4抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、NM23、カドヘリン1(ECADまたはcdh1)、リラキシン1(RLN1)、マトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)、エリスロポエチン(EPO)、マイクロRNA126(miR−126)、マイクロRNA181、マイクロRNA335、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)、E3ユビキチンタンパク質リガーゼ1(HACE1)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(nppa1)、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、CDC6、および骨形成タンパク質4(BMP4)から選択される治療剤である、(16)から(23)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(25)一本鎖抗VEGF抗体がG6と命名される、(24)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(26)異種遺伝子産物が、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質である診断剤である、(16)から(20)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(27)異種遺伝子産物が、ルシフェラーゼ;蛍光タンパク質;生物発光タンパク質;検出することができる造影剤、発色団、化合物もしくはリガンドに結合する、および/またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質から選択される診断剤である、(16)から(20)または(26)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(28)造影剤に結合する、および/またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質が鉄受容体、鉄輸送体、銅取込み輸送体である、(27)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(29)異種遺伝子産物が、ヒカリコメツキムシ(geen click beetle)ルシフェラーゼ、luxオペロン、赤外蛍光タンパク質、フラビンリダクターゼタンパク質、mNeptune近赤外蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、セレンテラジン結合タンパク質(CBP)、ヒトエピネフリン受容体(hNET)、ヨウ化ナトリウム共輸送体(NIS)タンパク質、シトクロムp450ファミリー酵素、アロスタチンA受容体(AlstR)、Pep1受容体(PEPR−1)、LAT−4、ステロール14α−デメチラーゼ(Cyp51)、トランスフェリン受容体(TR)、フェリチン、二価金属輸送体(DMT)、マグネトタクティックA(MagA)およびシスプラチン流入輸送体(CTR1)から選択される診断剤である、(27)または(28)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(30)組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子が、newtAG(nAG)、Oct4、NANOG、Ngn3、Pdx1およびMafaから選択される、(20)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(31)異種遺伝子産物をコードする核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、(16)から(30)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(32)プロモーターが哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターである、(31)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(33)プロモーターが、P 7.5K 、P 11K 、P SE 、P SEL 、P SL 、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4bまたはK1プロモーターから選択される、(31)または(32)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(34)(1)から(33)のいずれかに記載のウイルス株を含む組成物;
(35)(1)から(33)のいずれかに記載のウイルス株を含む医薬組成物;
(36)薬学的に許容される担体をさらに含む、(35)に記載の医薬組成物;
(37)局部または全身投与のために製剤化された、(35)または(36)に記載の医薬組成物;
(38)1つまたは複数の異なるウイルス株を含む、(34)から(37)のいずれかに記載の組成物または医薬組成物;
(39)抗ウイルスまたは抗がんワクチンとしての投与のために製剤化された、(35)から(38)のいずれかに記載の医薬組成物;
(40)(35)から(39)のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、対象における増殖性障害を処置する方法;
(41)増殖性障害の処置のための第2の治療剤を投与することをさらに含む、(40)に記載の方法;
(42)増殖性障害ががんである、(40)または(41)に記載の方法;
(43)がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、(42)に記載の方法;;
(44)増殖性障害が腫瘍または転移である、(40)から(42)のいずれかに記載の方法;
(45)対象がヒトまたは非ヒト動物である、(40)から(44)のいずれかに記載の方法;
(46)非ヒト動物がウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、およびモルモットから選択される、(45)に記載の方法;
(47)ウイルスが、投与の1サイクルにわたって少なくとも1回、少なくとも1x10 5 pfuまたは約1x10 5 pfuまたは1x10 5 pfuである量で投与される、(40)から(46)のいずれかに記載の方法;
(48)ウイルスが、投与の1サイクルにわたって少なくとも1回、少なくとも1x10 5 pfu、少なくとも1x10 6 pfu、少なくとも1x10 7 pfu、少なくとも1x10 8 pfu、少なくとも1x10 9 pfu、少なくとも1x10 10 pfu、少なくとも1x10 11 pfu、少なくとも1x10 12 pfu、少なくとも1x10 13 pfuもしくは少なくとも1x10 14 pfu、または約1x10 5 pfu、約1x10 6 pfu、約1x10 7 pfu、約1x10 8 pfu、約1x10 9 pfu、約1x10 10 pfu、約1x10 11 pfu、約1x10 12 pfu、約1x10 13 pfuもしくは約1x10 14 pfu、または1x10 5 pfu、1x10 6 pfu、1x10 7 pfu、1x10 8 pfu、1x10 9 pfu、1x10 10 pfu、1x10 11 pfu、1x10 12 pfu、1x10 13 pfuもしくは1x10 14 pfuである量で投与される、(40)から(47)のいずれかに記載の方法;
(49)ウイルスの量が、投与のサイクルにわたって、2回、3回、4回、5回、6回または7回投与される、(47)または(48)に記載の方法;
(50)ウイルスの量が、サイクルの1日目、サイクルの1および2日目、サイクルの最初の連続する3日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する4日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する5日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する6日間のそれぞれ、またはサイクルの最初の連続する7日間のそれぞれに投与される、(47)から(49)のいずれかに記載の方法;
(51)投与のサイクルが7日間、14日間、21日間または28日間である、(47)から(50)のいずれかに記載の方法;
(52)投与のサイクルが複数回反復される、(47)から(51)のいずれかに記載の方法;
(53)手術、放射線療法、免疫抑制療法および抗がん剤の投与から選択される他の処置をさらに含み、さらなる処置がウイルスを用いる前に、後に、同時に、または間欠的に行われる、(40)から(52)のいずれかに記載の方法;
(54)さらなる処置が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤およびそれらの任意の組合せから選択される抗がん剤の投与である、(53)に記載の方法;
(55)抗がん剤がシスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗EGFR抗体および抗VEGF抗体から選択される、(53)または(54)に記載の方法;
(56)ウイルスと抗がん剤が連続的、同時的、または間欠的に投与される、(54)または(55)に記載の方法;
(57)ウイルスが、全身的、静脈内的、動脈内的、腫瘍内的、内視鏡的、病変内的、筋肉内的、皮内的、腹腔内的、膀胱内的、関節内的、胸膜内的、経皮的、皮下的、経口的、非経口的、鼻内的、気管内的、吸入的、頭蓋内的、前立腺内的、硝子体内的、局所的、眼内的、経膣的、または直腸的に投与される、(40)から(56)のいずれかに記載の方法;
(58)ウイルスが静脈内投与される、(40)から(57)のいずれかに記載の方法;
(59)ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、(1)から(33)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株を対象に投与すること;および
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出すること
を含み、それによって検出が対象における腫瘍または転移の存在を示す、対象における腫瘍または転移を検出する方法;
(60)検出が、対象を画像化することにより行われる、(59)に記載の方法;
(61)検出が、組織または体液試料中の前記タンパク質またはシグナルを検出することにより行われる、(59)に記載の方法;
(62)検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質が、ルシフェラーゼ;蛍光タンパク質;生物発光タンパク質;検出することができる造影剤、発色団、化合物もしくはリガンドに結合する、および/もしくはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質から選択される、(59)から(61)のいずれかに記載の方法;
(63)検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、鉄受容体、鉄輸送体、ヒトエピネフリン受容体(hNET)およびヨウ化ナトリウム共輸送体(NIS)タンパク質から選択される、(62)に記載の方法;
(64)検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルが、高感度画像化、蛍光分光法、X線画像化、磁気共鳴画像化(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、ポジトロン放出断層撮影(PET)または単光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)により検出される、(59)から(63)のいずれかに記載の方法;
(65)ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、(1)から(33)のいずれかに記載のウイルスを対象に投与すること;および
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出すること
を含み、検出が、ウイルスが対象において複製していることを示す、宿主におけるウイルス複製を検出する方法;
(66)対象が腫瘍またはがんを有する、(65)に記載の方法;
(67)ウイルスの投与後に、対象から体液試料を取得すること;および体液中の検出可能なタンパク質またはシグナルを検出することを含む、(65)または(66)に記載の方法;
(68)体液が尿、血液、涙または脳脊髄液から選択される、(67)に記載の方法;
(69)(1)から(33)のいずれかに記載のLIVPウイルス株を含む、単離された宿主細胞または細胞培養物;
(70)(1)から(33)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株を含む、対象における増殖性疾患を処置するための使用のための組成物;
(71)対象における増殖性障害の処置のための医薬組成物の調製のための(1)から(33)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株の使用;
(72)ウイルス株の濃度が1x10 6 〜1x10 16 pfu/mlであるか、または少なくとも1x10 6 pfu/ml、少なくとも1x10 7 pfu/ml、少なくとも1x10 8 pfu/ml、少なくとも1x10 9 pfu/ml、少なくとも1x10 10 pfu/ml、少なくとも1x10 11 pfu/ml、少なくとも1x10 12 pfu/ml、少なくとも1x10 13 pfu/ml、少なくとも1x10 14 pfu/ml、少なくとも1x10 15 pfu/mlもしくは少なくとも1x10 16 pfu/mlである、または約1x10 6 pfu/ml、約1x10 7 pfu/ml、約1x10 8 pfu/ml、約1x10 9 pfu/ml、約1x10 10 pfu/ml、約1x10 11 pfu/ml、約1x10 12 pfu/ml、約1x10 13 pfu/ml、約1x10 14 pfu/ml、約1x10 15 pfu/mlもしくは約1x10 16 pfu/mlである、または1x10 6 pfu/ml、1x10 7 pfu/ml、1x10 8 pfu/ml、1x10 9 pfu/ml、1x10 10 pfu/ml、1x10 11 pfu/ml、1x10 12 pfu/ml、1x10 13 pfu/ml、1x10 14 pfu/ml、1x10 15 pfu/ml、もしくは1x10 16 pfu/mlである、(70)または(71)に記載の組成物または使用;
(73)組成物が抗がん剤をさらに含む、(70)から(72)のいずれかに記載の組成物または使用;
(74)抗がん剤がサイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管形成阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤およびそれらの任意の組合せから選択される、(73)に記載の組成物または使用;
(75)抗がん剤がシスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、ならびに抗EGFR抗体および抗VEGF抗体から選択される、(73)または(74)に記載の組成物または使用;
(76)増殖性障害ががんである、(70)から(75)のいずれかに記載の組成物または使用;
(77)がんが乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、(76)に記載の組成物または使用;
(78)がんが固形腫瘍がんまたは転移がんである、(70)から(77)のいずれかに記載の組成物または使用;
(79)腫瘍または転移が乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である、(78)に記載の組成物または使用;
(80)組成物が全身または局部投与のために製剤化される、(70)から(79)のいずれかに記載の組成物または使用;
(81)組成物が静脈内投与のために製剤化される、(70)から(80)のいずれかに記載の組成物または使用;
(82)(i)異なるゲノム配列を有するウイルス粒子の混合物を含有する第1のLIVPウイルス試料を用意すること;
(ii)試料から単一のクローン単離物を選択および単離すること;
(iii)毒性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること;
(iv)抗腫瘍形成性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること;ならびに
(v)参照LIVPウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性および低下した毒性を示すクローン株を選択すること
を含み、それによって低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を示すクローン単離物が、がんの治療または診断のためのLIVPクローン株であると同定される、がん療法およびがん診断のためのLIVPクローン株を選択する方法;
(83)参照LIVPウイルスが弱毒化組換えLIVPウイルスである、(82)に記載の方法;
(84)参照LIVPウイルスが、ゲノムが配列番号9に記載のヌクレオチド配列を含むGLV−1h68と命名されたウイルス(GLV−1h68)である、(82)または(83)に記載の方法;
(85)第1のLIVPウイルス試料が、配列番号10に記載のゲノムまたは配列番号10と少なくとも99%同一であるゲノムを有するLIVPを含むLIVPウイルス株である、(82)から(84)のいずれかに記載の方法;
(86)第1のLIVPウイルス試料が、LIVP株および他のウイルス株、ゲノムDNAまたはクローニングされたDNAに感染した細胞の増殖、次いで、培養物からのウイルス試料の単離により得られた混合物であり、前記試料が前記感染により生成された子孫ウイルスを含む、(82)から(85)のいずれかに記載の方法;
(87)他のウイルス株が、DNAウイルス、二本鎖RNAウイルス、一本鎖プラスセンスRNAウイルスおよび一本鎖マイナスセンスRNAウイルスから選択される、(86)に記載の方法;
(88)DNAウイルスが、アビポックスウイルス、粘液腫ウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス;単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、ヘパドナウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのヘルペスウイルス;ならびにパルボウイルスなどの一本鎖DNAウイルスから選択される、(87)に記載の方法;
(89)他のウイルス株がワクシニア株である、(86)から(88)のいずれかに記載の方法;
(90)二本鎖RNAウイルスが、ロタウイルスなどのレオウイルスである、(87)に記載の方法;
(91)一本鎖プラスセンスRNAウイルスが、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルスまたはポリオウイルス、エンテロウイルスなどのピコルナウイルス;セムリキ森林熱ウイルスなどのトガウイルス;ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV)、マウスモロニー白血病ウイルス(MMLV)およびレンチウイルスなどのレトロウイルスから選択される、(87)に記載の方法;
(92)一本鎖マイナスセンスRNAウイルスが、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス;ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルスまたはムンプスウイルスなどのパラミクソウイルス;および水疱性口内炎ウイルス(VSV)などのラブドウイルスから選択される、(91)に記載の方法;
(93)試料からの単一クローン単離物がプラークアッセイにより選択される、(82)から(92)のいずれかに記載の方法;
(94)プラークアッセイにおける最大のプラークが選択される、(93)に記載の方法;
(95)少なくとも最大の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個のプラークがクローン単離物として選択および単離され、それぞれがステップ(iii)および(iv)で毒性および抗腫瘍形成性についてアッセイされる、(94)に記載の方法;
(96)選択されるプラークがLIVPウイルス試料により生成されるプラークの平均プラークサイズよりも大きい、(93)から(95)のいずれかに記載の方法;ならびに
(97)(82)から(96)のいずれかに記載の方法により製造されるクローン株。
本発明には、さらに、以下の実施態様が挙げられる。
(1’)ゲノムが配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含むクローン株以外の単離されたLIVPクローン株であって、
クローン株が非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有するように改変されず;かつ
クローン株がGLV−1h68と比較してより高い抗腫瘍形成性および/または低下した毒性を有し、ここでGLV−1h68は配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有する、
単離されたLIVPクローン株;
(2’)配列番号10に記載のヌクレオチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むが、配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含まない、(1’)に記載の単離されたLIVPクローン株;
(3’)a)配列番号1のヌクレオチド2256〜181,114、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870;または
b)配列番号1のヌクレオチド10,073〜180,095、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870の配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む、(1’)または(2’)に記載の単離されたクローン株;
(4’)配列番号1、2、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列、または配列番号1、2、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、(1’)から(3’)のいずれかに記載の単離されたクローン株;
(5’)(1’)から(4’)のいずれかに記載の単離されたLIVPクローン株を増殖させることにより製造された、LIVP調製物;
(6’)(1’)から(4’)のいずれかに記載のクローン株を含む、細胞培養物または単離された細胞;
(7’)(6’)に記載の細胞または細胞培養物を増殖させること;および
得られた細胞からLIVPクローンを単離すること
により製造された、単離されたクローン株;
(8’)(1’)から(4’)または(7’)のいずれかに記載のLIVPクローン株のゲノム;および
前記ゲノムにおいて異種遺伝子産物をコードする核酸
を含む、組換えLIVPウイルス株;
(9’)異種遺伝子産物が治療剤または診断剤である、(8’)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(10’)異種遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変する、あるいは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、PET画像化のための遺伝子ならびにMRI画像化のための遺伝子から選択される、(8’)または(9’)に記載の組換えLIVPウイルス株;
(11’)異種遺伝子産物が、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスRNA、プロドラッグ変換酵素、siRNA、マイクロRNA、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子から選択される治療剤である、(8’)から(10’)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(12’)異種遺伝子産物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−24(IL−24)、インターフェロンγ誘導性タンパク質10(IP−10)、Tリンパ球上で発現される受容体であるHVEMについてHSV糖タンパク質Dと競合するリンホトキシン誘導性発現物(LIGHT)、p60スーパー抗原、OspF、OspG、シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT1α)、STAT1β、プラスミノゲンk5ドメイン(hK5)、色素上皮分化因子(PEDF)、一本鎖抗VEGF抗体、一本鎖抗DLL4抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、NM23、カドヘリン1(ECADまたはcdh1)、リラキシン1(RLN1)、マトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)、エリスロポエチン(EPO)、マイクロRNA126(miR−126)、マイクロRNA181、マイクロRNA335、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)、E3ユビキチンタンパク質リガーゼ1(HACE1)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(nppa1)、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、CDC6、および骨形成タンパク質4(BMP4)から選択される治療剤である、(8’)から(11’)のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株;
(13’)薬学的に許容される担体において(1’)から(5’)または(7’)から(12’)のいずれかに記載のウイルス株を含む、医薬組成物;
(14’)(8’)から(12’)のいずれかに記載のLIVPウイルス株を含む、単離された宿主細胞または細胞培養物;
(15’)対象における腫瘍または転移の検出において使用するための組成物であって、
組成物が(8’)から(10’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株を含み;かつ
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、
組成物;
(16’)対象における腫瘍または転移を検出するための医薬組成物の調製における使用のための(8’)から(10’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株の使用であって、ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用;
(17’)宿主におけるウイルス複製の検出において使用するための組成物であって、
組成物が(8’)から(10’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株を含み;かつ
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、
組成物;
(18’)宿主におけるウイルス複製を検出するための医薬組成物の調製における使用のための(8’)から(10’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株の使用であって、ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用;
(19’)(1’)から(5’)または(7’)から(12’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株を含む、対象における増殖性疾患を処置するための使用のための組成物;
(20’)対象における増殖性障害の処置のための医薬組成物の調製のための、(1’)から(5’)または(7’)から(12’)のいずれかに記載のLIVPウイルスまたはクローン株の使用;
(21’)増殖性障害ががんである、(19’)に記載の組成物または(20’)に記載の使用;
(22’)がんが乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、(21’)に記載の組成物または使用;
(23’)がんが固形腫瘍がんまたは転移がんである、(21’)または(22’)に記載の組成物または使用;
(24’)腫瘍または転移が乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である、(23’)に記載の組成物または使用;
(25’)(i)異なるゲノム配列を有するウイルス粒子の混合物を含有する第1のLIVPウイルス試料を用意すること;
(ii)試料から単一のクローン単離物を選択および単離すること;
(iii)毒性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること;
(iv)抗腫瘍形成性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること;ならびに
(v)参照LIVPウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性および低下した毒性を示すクローン株を選択すること
を含み、それによって低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を示すクローン単離物が、がん療法またはがん診断のためのLIVPクローン株であると同定される、がん療法およびがん診断のためのLIVPクローン株を選択する方法;
(26’)参照LIVPウイルスが弱毒化組換えLIVPウイルスである、(25’)に記載の方法;
(27’)参照LIVPウイルスが、ゲノムが配列番号9に記載のヌクレオチド配列を含むGLV−1h68と命名されたウイルス(GLV−1h68)である、(25’)または(26’)に記載の方法;
(28’)試料からの単一クローン単離物がプラークアッセイにより選択され、プラークアッセイにおける最大のプラークが選択される、(25’)から(27’)のいずれかに記載の方法;ならびに
(29’)(25’)から(28’)のいずれかに記載の方法により製造される、クローン株。
A.定義
B.ワクシニアウイルスクローン株を単離する方法
1.親ウイルス調製物または混合物
2.クローン株の単離
3.抗腫瘍形成性
a.腫瘍関連複製指示因子
b.細胞傷害性
c.腫瘍成長
4.毒性/安全性
5.ゲノム分析
C.単離されたウイルスクローン株
1.LIVP
2.LIVPクローン株
LIVPクローン株の例
D.LIVP株の改変
1.異種核酸
2.改変例
a.診断遺伝子産物
b.治療遺伝子産物
c.抗原
d.ウイルスの弱毒化を変化させるための改変
3.異種遺伝子発現の制御
4.改変ウイルスの作製方法
E.ウイルスの増殖および生成
1.増殖のための宿主細胞
2.濃度決定
3.保存方法
4.ウイルスの調製
F.医薬組成物、組合せおよびキット
1.医薬組成物
2.宿主細胞
3.組合せ
4.キット
G.治療、診断およびモニタリング方法
1.治療方法
2.診断およびモニタリング方法
3.投与
a.ウイルスを投与する前の工程
b.投与の様式
c.用量および投薬レジメン
d.同時投与
i.複数のウイルスの投与
ii.治療化合物
iii.免疫療法および生物療法
e.対象の状態
4.モニタリング
a.ウイルス遺伝子発現のモニタリング
b.腫瘍サイズのモニタリング
c.抗体力価のモニタリング
d.一般的健康診断のモニタリング
e.処置と協調したモニタリング
H.実施例
別途定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示を通じて言及されるすべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ウェブサイトならびに他の公開された材料は、別途注記しない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の用語について複数の定義が存在する場合、本セクションに記載のものが優先する。URLまたは他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報は現れては消えることもあるが、インターネットおよび/または好適なデータベースを検索することなどにより、等価な情報は公知であり、容易にアクセスすることができると理解される。それに対する参照は、そのような情報の利用可能性および公共への普及を証明する。
出発ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株もしくは単離物よりも良好な抗腫瘍応答ならびに類似するか、または低い病原性/毒性を有するワクシニアウイルス調製物または混合物から、ウイルスのクローン単離物を単離する方法が本明細書で提供される。この方法は、存在するウイルス株と比較して低下した毒性および改善されたか、またはより高い抗腫瘍形成特性を有するワクシニアウイルス株の選択および同定において用いられる。
前記方法において、ワクシニアウイルスの出発もしくは親調製物またはワクシニアウイルスの混合物および配列において同種であるゲノムを有さない他のウイルスが、方法における使用のために選択される。前記調製物または混合集団中のワクシニアウイルスは、典型的には、異種遺伝子を含有するように遺伝子操作されていない非組換えウイルス株である。したがって、前記方法は、挿入された遺伝子とは無関係に抗腫瘍形成性および最小限の毒性を示すワクシニアウイルスクローン株の同定を可能にする。以下に考察される通り、得られる選択された株は、ウイルスの特性をさらに調節するための外来遺伝子の挿入によりさらに改変または遺伝子操作することができる。
ワクシニアウイルスの混合集団を含有するウイルス調製物から、クローン単離物を選択する。ウイルス混合物から個々のクローンを単離する方法は、当業者には周知である。そのような方法の例は、標準的なプラークアッセイである。プラークアッセイは、ウイルスによる細胞単層の感染後の細胞のウイルス溶解の領域であるウイルスプラークの形成を測定する。それぞれ個々のプラークは、単一のウイルスクローン株を表す。
単離されたウイルスを、その抗腫瘍形成特性を示すパラメータについてさらに試験する。一般的には、選択されるパラメータは、腫瘍または転移の処置などの増殖性疾患および障害の処置にとって望ましいものである。例えば、ウイルスは、ウイルスの連続的増幅が隣接する細胞の感染およびその後のそれらの破壊をもたらすように複製することにより、腫瘍細胞を破壊することができる。腫瘍崩壊ウイルスもまた、がん細胞に対して細胞傷害性であるタンパク質の発現により抗腫瘍形成性を示す。さらなる例においては、ウイルスは、特異的および非特異的な抗腫瘍免疫応答の開始、例えば、感染した細胞(例えば、TNF)からの、または特異的応答を介する(例えば、CTL応答)サイトカイン発現の開始により、抗腫瘍形成性を示すことができる。したがって、上記パラメータのいずれかを、ウイルスの抗腫瘍形成性を示すものとして評価することができる。
治療の候補としての選択のため、ウイルスは一般的には腫瘍細胞中での複製および/または感染性を示す。したがって、腫瘍細胞中で複製するクローン株が選択される。測定される複製指示因子は、典型的には、腫瘍細胞への投与の1日以内のウイルス複製のレベルまたは量または相対量を評価するか、または推測することができる任意のパラメータである。いくつかの例においては、例えば、ウイルス力価(すなわち、プラークアッセイにおいて生成されるプラークの数により評価される)またはウイルス遺伝子発現もしくは宿主遺伝子発現の変化(例えば、米国特許出願公開第2009−0136917号を参照されたい)などの、ウイルス複製指示因子の測定により、複製を評価することができる。例えば、試験ウイルスを腫瘍細胞中に感染させるか、または導入し、特定の時間に、または時間の関数として複製指示因子を評価することにより、複製を決定することができる。これを、所定の標準物、例えば、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株(例えば、組換えウイルス)と比較するか、または他の試験候補クローン株と比較することができる。インビトロまたはインビボで評価した場合に腫瘍細胞中で複製するウイルスを選択する。特定の例においては、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で選択的に複製するウイルスを選択する。
治療のための候補としての選択のために、ウイルスは一般的には、腫瘍細胞に対する細胞傷害性細胞変性活性を示す。したがって、細胞傷害性であるか、または腫瘍細胞を殺傷するクローン株を選択する。クローン単離物を、細胞死および/または腫瘍細胞の溶解(すなわち、腫瘍崩壊)の誘導により腫瘍細胞を排除するその能力について選択することができる。ウイルスの細胞殺傷活性を、限定されるものではないが、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイおよび他の関連するテトラゾリウム塩に基づくアッセイ(例えば、XTT、MTSもしくはWST)などの、ウイルス感染後の細胞壊死および/またはアポトーシスを測定するのに用いることができる細胞傷害性/細胞生存能力アッセイ、ATPアッセイ、感染細胞のTUNEL染色などのアポトーシスアッセイ、DNA断片化アッセイ、DNAラダリングアッセイ、およびシトクロムC放出アッセイなどの、当技術分野で公知の様々な技術により評価することができる。そのようなアッセイは、当業者には周知である。
治療のための候補としての選択のために、ウイルスは、それが腫瘍サイズの縮小を引き起こす、および/または腫瘍進行を遅延させる場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。したがって、腫瘍成長またはサイズの減少を示すクローン株が選択される。腫瘍サイズは、腫瘍を担持するヒトまたはウイルスで処理された動物モデルにおいてインビボで評価することができる。腫瘍の縮小または腫瘍サイズを、体重、体積または身体測定などの当技術分野で公知の様々なアッセイにより評価することができる。
単離されたウイルスを、その毒性/安全性特性を示すパラメータについてさらに試験する。ウイルスは、宿主の健康状態を悪化させる1つまたは複数の化合物を製造することによってその宿主に対して毒性となり得る。宿主に対する毒性は、敗血性ショック、神経学的作用、または筋肉作用などの様々な様式のいずれかで現れ得る。宿主に対して低下した毒性を有する本明細書で提供されるウイルスが選択される。本発明の方法および組成物のウイルスの低下した毒性は、宿主が毒性効果を経験しない毒性から、宿主が典型的には微生物の毒性効果で死亡しない毒性までの範囲であってよい。
所望により、クローン単離物を精製し、ゲノムを分析して選択された単離物の配列の同種性を評価することができる。一般的には、配列が同種であるクローン株が選択される。限定されるものではないが、配列決定、制限酵素分析、PCR、サザンブロットまたはタンパク質発現などの様々な方法を用いて、ウイルスの同一性および/または同種性を確認することができる。例えば、選択されたクローン単離物を、許容状態の細胞中で増殖させ、細胞を収穫し、ウイルス粒子を回収することができる。ゲノムウイルスDNAを、当業者には公知の様々な手順を用いて抽出することができる。例えば、プロテイナーゼK、次いで、フェノール−クロロホルム抽出を用いて、精製されたビリオンからDNAを抽出することができる(Earl et al., in Ausubel et al., (eds) Current protocols in molecular biology, vol. 3, pages 16.17.1−16.19−7 (1998)を参照されたい)。DNAの配列決定を、当業者には公知の任意の方法により完了することができる。例えば、ショットガン手法、次いで、様々なソフトウェア、例えば、TIGR Assemblerソフトウェア(Sutton et al. (1995) Genome Science & Tech., 1:9−19)またはLinuxプラットフォーム上のStadenソフトウェアパッケージ(Staden (1991) Nucleic Acids Res. 19:3907−3911; Bonfield et al. (1995) Nucleic Acids. Res., 23:4992−4999)を用いる、および様々なギャップ充填戦略(例えば、Flint et al. (1998) DNA Seq., 8:241−245を参照されたい)を用いるアセンブリーにより;ランダムプライミング法(例えば、Djikeng et al. (2008) BMC Genomics, 9:5)により;または全ゲノム増幅および直接配列決定技術(Mizutani et al. (2007) Emerging Infectious Diseases, 13:322−324)により、配列決定を行うことができる。
ワクシニアウイルス株LIVPの単離されたウイルスクローンが本明細書で提供される。このクローン株は、ワクシニアウイルス株LIVPに由来する。
LIVPは、Lister(ATCCカタログ番号VR−1549)に由来するワクシニア株である。ワクシニアウイルスは、単一の連続ポリヌクレオチド鎖から作られる約180,000塩基対の長さの線状二本鎖DNAゲノムを有する(Baroudy et al. (1982) Cell, 28:315−324)。その構造は10,000塩基対の逆位末端反復(ITR)の存在に起因する。ITRはゲノム複製に関与する。ゲノム複製は、高分子量コンカテマー(感染細胞から単離される)の形成を誘導し、続いて、それが切断され、修復されてウイルスゲノムを作る自己プライミングを含むと考えられる。例えば、Traktman, P., Chapter 27, Poxvirus DNA Replication, pp. 775−798, in DNA Replication in Eukaryotic Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)を参照されたい。そのゲノムは、約250個の遺伝子をコードする。一般的には、中央に位置する遺伝子がウイルス複製にとって必須である(かくして、保存される)が、2つの末端の近くの遺伝子が宿主範囲およびビルレンスなどのより末梢の機能を行うように、セグメント化されていない非感染性ゲノムが配置される。ワクシニアウイルスは、一般的原理として、重複しないセット中に配置されるオープンリーディングフレーム(ORF)を用いることにより示差的遺伝子発現を実施する。
本明細書で提供されるクローン株は、LIVPに由来し、配列番号10に記載の親配列とは異なるゲノムを有する。本明細書で提供されるクローン株は、GLV−1h68と命名された組換えまたは改変ウイルス株(配列番号9に記載のゲノムを有する)と比較してより高い抗腫瘍形成性および/または低下した毒性を示す。特に、本明細書で提供されるクローン株は、LIVPから増殖させたウイルス調製物中に存在する。したがって、このクローン株は、非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有しない。
本明細書で提供されるLIVPクローン株としては、配列番号1のヌクレオチド10,073〜180,095、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870、またはその相補体に対応するヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。本明細書で提供されるLIVPクローン株は、一般的には、左および/または右の逆位末端反復(ITR)に対応する末端ヌクレオチドも含む。本明細書で提供されるLIVPクローン株の例としては、配列番号1、2、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列を有するもの、またはその相補体、または配列番号1、2、3、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列を有するクローン株と類似する毒性および抗腫瘍形成性を示すものが挙げられる。
そのゲノム配列が改変された改変LIVPウイルス株が本明細書で提供される。ワクシニアウイルスの線状dsRNAウイルスゲノムは約200kbのサイズであり、合計約250個の遺伝子をコードする。ワクシニアウイルスゲノムは、外来遺伝子の大きい運搬能力を有し、最大で25kbの外因性DNA断片(ワクシニアゲノムサイズの約12%)を挿入することができる。いくつかのワクシニア株のゲノムは完全に配列決定されており、多くの必須および非必須遺伝子が同定されている。異なる株間での高い配列相同性に起因して、あるワクシニア株からのゲノム情報を、他の株において改変ウイルスを設計および作製するために用いることができる。最後に、遺伝子操作による改変ワクシニア株の製造のための技術は、確立されている(Moss, Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 86−90 (1993); Broder and Earl, Mol. Biotechnol. 13: 223−245 (1999); Timiryasova et al., Biotechniques 31: 534−540 (2001))。
本明細書で提供されるウイルスなどの、大きいゲノムサイズのポックスウイルスは、異種DNAの大きい挿入物および/または異種DNAの複数の挿入物をゲノム中に組み込むことができる(Smith and Moss (1983) Gene 25(1):21−28)。本明細書で提供されるウイルス、例えば、本明細書で提供される任意のクローン株を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上の異種DNA分子の挿入により改変することができる。一般的には、1つまたは複数の異種DNA分子が、ウイルスゲノムの非必須領域中に挿入される。例えば、1つまたは複数の異種DNA分子が、腫瘍細胞などの増殖している細胞中での複製にとって非必須であるウイルスゲノムの遺伝子座中に挿入される。例示的な挿入部位は以下に提供され、当技術分野で公知である。
a2,cacnb1,cacnb2,cacnb3,cacnb4,cacng,cacnl1a1,cacnl1a2,cacnl1a3,cacnl1a4,cacnl1a5,cacnl1a6,cacnl2a,cacnlb1,cacnlg,cacp,cact,cacy,cad,cad11,cadasi1,cae1,cae3,caf,caf1a,caga,cagb,cain,cak,cak1,cal11,calb1,calb2,calb3,calc1,calc2,calca,calcb,calcr,cald1,calla,calm1,calm2,calm3,calm11,calm13,calna,calna3,calnb,calnb1,calr,cals,calt,calu,cam,camk4,camkg,caml1,camlg,camp,can,canp3,canx,cap2,cap3,cap37,capb,capg,cap1,capn1,capn2,capn3,capn4,cappa2,cappb,capr,caps,capza2,capzb,car,carp,cars,cart1,cas,cas2,casi1,casp1,casp10,casp2,casp3,casp3,casp4,casp5,casp6,casp7,casp8,casq1,casq2,casr 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,hyfB,hyfC,hyfD,hyfE,hyfF,hyfG,hyfH,hyfI,hyfJ,hyfR,hypA,hypB,hypC,hypD,hypE,hypF,iadA,iap,ibpA,ibpB,icd,iclR,ihfA,ihfB,ileR,ileS,ileT,ileU,ileV,ileX,ileY,ilvA,ilvB,ilvC,ilvD,ilvE,ilvF,ilvG,ilvH,ilvI,ilvJ ilvM,ilvN,ilvR,ilvU,ilvY,imp,inaA,inaR?,infA,infB,infC,inm,insA(IS1),intA,isb(IS1),isfA,ispA,ispB,KanR,katE,katG,kba,kbl,kch,kdgK,kdgR,kdgT,kdpA,kdpB,kdpC,kdpD,kdpE,kdpF,kdsA,kdsB,kdtA,kdtB,kefB,kefC,kgtp,ksgA,ksgB,ksgC,ksgD,lacA,lacI,lacY,lacZ,lamB,lar,ldcC,ldhA,lepA,lepB,leuA,leuB,leuC,leuD,leuJ,leuO,leuP,leuQ,leuR,leuS,leuT,leuU,leuV,leuW,leuX,leuY,leuZ,lev,lexA,lgt,lhr,ligA,ligT,linB,lipA,lipB,lit,livF,livG,livH,livJ,livK,livM,lldD,IldP,lldR,lolA,lon,lpcA,lpcB,lpd,lplA,lpp,lpxA,lpxB,lpxC,lpxD,lpxK,lrb,lrhA,lrp,Irs 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serS,serT,serU,serV,serW,serX,sfa,sfcA,sfiC,sfsA,sfsB,shiA,sipC,sipD,sir,sixA,sloB,slp,slr,slt,slyD,slyX,smp,smtA,sodA,sodB,sodC,sohA,sohB,solA,soxR,soxS,speA,speB,speC,speD,speE,speF,speG,spf,spoT,sppA,spr,srlA,srlB,srlD,srlE,srlR,srmB,srnA,ssaE,ssaG,ssaH,ssb,sseA,sseB,sspA,sspB,ssrA,ssrS,ssyA,ssyD stfZ,stkA,stkB,stkC,stkD,stpA,strC,strM,stsA,sucA,sucB,sucC,sucD,sufI,sugE,suhA,suhB,sulA,supQ,surA,surE,syd,tabC,tag,talA,talB,tanA,tanB,tap,tar,tas,tauA,tauB,tauC,tauD,tbpA,tdcA,t
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a.診断遺伝子産物
いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスは、産物が検出可能であるか、または産物が検出可能なシグナルを誘導することができる1つまたは複数のさらなる遺伝子を発現することができる。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスは、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導することができるタンパク質をコードする核酸を含有する。そのようなタンパク質の発現は、インビトロおよびインビボでのウイルスの検出を可能にする。検出可能なタンパク質などの、様々な検出可能な遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供されるウイルスと共に用いることができる。
本明細書で提供されるウイルスは、1つまたは複数の治療遺伝子産物をコードする異種核酸分子をも含んでもよい。治療遺伝子産物としては、細胞死を引き起こすか、または抗腫瘍免疫応答を引き起こす生成物が挙げられる。毒性もしくはアポトーシスタンパク質、またはsiRNAなどの様々な治療遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供されるウイルスと共に用いることができる。治療遺伝子は、例えば、チャネル形成もしくは他の溶解タンパク質として、宿主細胞を直接殺傷することにより、またはアポトーシスを誘発させることにより、または必須細胞プロセスを阻害することにより、または細胞に対する免疫応答を誘発することにより、または同様の効果を有する化合物と相互作用することにより、例えば、活性の低い化合物を細胞傷害性化合物に変換することにより作用することができる。
本明細書で提供されるウイルスを改変して1つまたは複数の抗原を発現させることができる。抗原の例としては、限定されるものではないが、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原およびマイトジェンが挙げられる。スーパー抗原は、T細胞の多数の反応によりもたらされることが多い、多数の免疫応答を活性化することができる抗原である。様々なスーパー抗原が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ジフテリア毒素、ブドウ球菌内毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEEおよびSEH)、毒素ショック症候群毒素1、剥離毒素(Exft)、連鎖球菌発熱性外毒素A、BおよびC(SPE A、BおよびC)、マウス乳頭腫瘍ウイルスタンパク質(MMTV)、連鎖球菌Mタンパク質、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridial Perfringens)腸毒素(CPET)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)抗原p60、およびマイコプラズマ関節炎スーパー抗原が挙げられる。
本明細書で提供されるウイルスを、ウイルスゲノム中の核酸の付加、欠失および/または改変によりさらに弱毒化することができる。一例においては、ウイルスを、1つまたは複数の遺伝子産物(例えば、本明細書の他の場所に記載の診断遺伝子産物または治療遺伝子産物)をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸の付加により弱毒化する。別の例においては、ウイルスを、1つまたは複数の遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸の改変により弱毒化する。さらなる例においては、異種核酸を、オープンリーディングフレームの長さの増加、オープンリーディングフレームの全部もしくは一部の除去またはオープンリーディングフレームの全部もしくは一部の置き換えにより改変する。そのような改変は、1つもしくは複数のウイルス遺伝子の破壊によるか、またはウイルス上での転写および/もしくは翻訳量の増加もしくは減少により、ウイルス毒性に影響し得る(例えば、国際特許出願公開第WO2008/100292号を参照されたい)。
いくつかの例においては、異種核酸はまた、異種RNAおよび/またはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの発現を調節するための1つまたは複数の調節配列を含有してもよい。例えば、哺乳動物宿主細胞中で機能的である好適な調節配列は、当技術分野で周知である。また、ウイルスにより発現される1つもしくは複数のタンパク質またはRNA分子により、発現は影響され得る。プロモーターおよびエンハンサーなどの遺伝子調節エレメントは、細胞型特異的活性を有し、応答エレメントを介して特定の誘導因子(例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、照射、熱ショック)により活性化することができる。これらの遺伝子の制御された、および制限された発現を、ウイルスベクターコンストラクト中の治療遺伝子の発現を駆動する内部プロモーターとしてそのような調節エレメントを用いて達成することができる。
本明細書で提供されるウイルスを、ウイルスを改変するための当業者には周知の標準的な方法を用いて、本明細書に記載の挿入、欠失、置き換えまたは突然変異、例えば、異種核酸の挿入または置き換えにより改変することができる。改変のための方法としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor NY (1989)および本明細書に開示される実施例に記載のような、例えば、インビトロ組換え技術、合成方法、直接的クローニング、およびインビボ組換え法が挙げられる。
本明細書で提供されるウイルスを、当業者には公知の方法により生成させることができる。得られる本明細書で提供されるウイルスを、以下のセクションFに記載のように治療および診断適用において用いることができる。
本明細書で提供されるクローンウイルス株またはその組換えウイルス株を、好適な宿主細胞中で増殖させることができる。そのような細胞は、単一の種類の細胞の群または異なる種類の細胞の混合物であってよい。宿主細胞としては、培養細胞系、一次細胞、および増殖性細胞が挙げられる。これらの宿主細胞は、ニワトリ胚、ウサギ、ハムスター、およびサル腎臓細胞などの、ワクシニアウイルスなどのウイルスの感染に罹りやすい哺乳動物、鳥類および昆虫の細胞および組織などの様々な動物細胞のいずれかを含んでもよい。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞(全能細胞、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、APC、樹状細胞、非ヒト細胞など)、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞(例えば、骨格筋、心筋または平滑筋)、線維芽細胞、ならびに例えば、CV−1、BSC40、VeroおよびBSC−1などの細胞系、およびヒトHeLa細胞が挙げられる。典型的には、単層で、または懸濁液中で増殖させることができる細胞系中でウイルスを増殖させる。例えば、ワクシニアウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、CV−1、BSC40、Vero、BGM、BSC−1およびRK−13細胞が挙げられる。アデノウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、HeLa、MK、HEK293およびHDF細胞が挙げられる。ヘルペスウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、WI−38およびHeLa細胞が挙げられる。様々なウイルスの増殖にとって好適な他の細胞系は当技術分野で周知である。系からの培養株の精製を、標準的な方法を用いて行うことができる。
溶液中のウイルスの濃度、またはウイルス力価を、当技術分野で公知の様々な方法により決定することができる。いくつかの方法においては、感染性ウイルス粒子数の決定が行われるが(典型的には、プラーク形成単位(PFU)と呼ばれる)、他の方法においては、感染性であるか、またはそうではないウイルス粒子の総数の決定が行われる。感染性ビリオン数を算出する方法としては、限定されるものではないが、ウイルスの力価測定を細胞単層上で増殖させ、数日後から数週間後にプラーク数を計数するプラークアッセイ、および1logなどの特定範囲内で力価を決定するエンドポイント希釈法が挙げられる。感染性および非感染性粒子を含むウイルス粒子の総数を決定する方法としては、限定されるものではないが、ウイルス抗原を認識する抗体を利用し、顕微鏡観察またはFACS分析により可視化することができる免疫組織化学染色法;260nmなどでの吸光度;ならびにPCR、RT−PCR、または蛍光染料を用いて標識することによる定量などによるウイルス核酸の測定が挙げられる。
一度、ウイルスが精製され(または所望の純度まで)、その力価が決定されたら、その感染完全性を最適に維持する条件でウイルスを保存することができる。典型的には、光は時間と共にウイルスを不活化するように働くため、ウイルスは暗室中で保存される。保存液中でのウイルスの安定性は通常、温度に依存する。いくつかのウイルスは熱安定性であるが、多くのウイルスは室温で2日以上で安定ではなく、生存能力の低下を示す(Newman et al., (2003) J. Inf. Dis. 187:1319−1322)。短期間、例えば、1日、2日、4日または7日のウイルス保存のためには、約4℃の温度が一般的に推奨される。長期間の保存のためには、多くのウイルスを−20℃、−70℃または−80℃で保持することができる。これらの温度でPBSまたはTris溶液(20mM Tris pH8.0、200NaCl、2〜3%グリセロールもしくはスクロース)などの簡単な溶液中で凍結された場合、ウイルスは6カ月から1年、またはさらにより長い期間、安定であってよい。しかしながら、反復的凍結−解凍サイクルはウイルス力価の減少を引き起こし得るため、一般的にはそれを避ける。ウイルスはまた、ウイルスの完全性をさらに保つことができる保存溶液中に他の補給物質を含有する媒体中で凍結することもできる。例えば、−80℃で保存されたウイルス溶液への血清またはウシ血清アルブミン(BSA)の添加は、長期間にわたって、および数回の凍結−解凍サイクルを通してウイルスの生存能力を保持するのに役立ち得る。他の例においては、ウイルス試料を、周囲温度での長期保存のために乾燥させる。限定されるものではないが、凍結乾燥、気泡乾燥、噴霧乾燥および脱水などの様々な技術を用いてウイルスを乾燥させることができる。周囲温度、冷蔵温度または冷凍温度でのウイルスの保存のための他の方法は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、米国特許第5,149,653号;第6,165,779号;第6,255,289号;第6,664,099号;第6,872,357号;および第7,091,030号;ならびに米国特許出願公開第2003−0153065号、第2004−003841号および第2005−0032044号に記載のものが挙げられる。
使用の直前に、ウイルスを好適な媒体中で好適な濃度で調製し、使用まで氷上などの低温で維持することができる。保存のためにウイルスを凍結乾燥したか、またはさもなければ乾燥した場合、それを好適な水性溶液中で再構成させることができる。ウイルスが調製される水性溶液は、典型的には、アッセイにおいて用いられる媒体(例えば、DMEMもしくはRPMI)または緩衝化塩溶液(例えば、PBS、TBS、Hepes溶液)などの適合するものである。医薬適用のためには、ウイルスを直接調製するか、または医薬溶液中で再構成させることができる。使用のためのいくつかの薬学的に許容される溶液が当技術分野で周知である(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th edition) ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Paを参照されたい)。一例においては、ウイルスを、アジュバントもしくは担体と共に、またはそれを用いずに、滅菌食塩水もしくは滅菌緩衝化食塩水などの生理的に許容される溶液中に希釈することができる。他の例においては、医薬溶液は、粘度をもたらす成分(例えば、グリセロール)および/または殺菌特性を有する成分(例えば、フェノール)を含有してもよい。いくつかの例においては、ウイルスは、アッセイにおいて少量のみが必要とされるように比較的濃縮された溶液中で調製される。例えば、1x106pfuのウイルスが96ウェルプレート中の腫瘍細胞に添加される場合、10μlだけが各ウェルに添加されるように、1x108pfu/mLの濃度でウイルスを調製することができる。当業者であれば、特定の用途に応じて、特定の濃度を経験的に決定することができる。
本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物、組合せおよびキットが本明細書で提供される。医薬組成物は、本明細書で提供されるウイルスと、医薬担体とを含んでもよい。組合せは、例えば、2種以上のウイルス、ウイルスと検出可能な化合物、ウイルスと治療化合物、ウイルスとウイルス発現調節化合物、またはその任意の組合せを含んでもよい。キットは、1つもしくは複数の本明細書で提供される医薬組成物もしくは組合せ、および使用のための説明書などの1つもしくは複数の構成要素、対象に医薬組成物もしくは組合せを投与するためのデバイス、対象に治療もしくは診断化合物を投与するためのデバイスまたは対象におけるウイルスを検出するためのデバイスを含んでもよい。
本明細書で提供されるウイルスと、好適な医薬担体とを含有する医薬組成物が本明細書で提供される。薬学的に許容される担体としては、ウイルスのための媒体担体または培地として作用する固体、半固体または液体材料が挙げられる。本明細書で提供される医薬組成物を、様々な形態、例えば、固体、半固体、水性、液体、粉末または凍結乾燥形態で製剤化することができる。本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物の例としては、限定されるものではないが、滅菌注射溶液、滅菌包装粉末、点眼剤、錠剤、ピル、粉末、ロゼンジ剤、サチェット剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル(固体として、もしくは液体培地中)、軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、ならびに坐剤が挙げられる。
本明細書で提供されるウイルスを含有する宿主細胞が提供される。そのような細胞を、例えば、本明細書で提供される診断または治療方法に記載のように、インビトロでの使用またはインビボでの使用において用いることができる。宿主細胞は、単一の種類の細胞の群または異なる種類の細胞の混合物であってよい。宿主細胞としては、培養細胞系、一次細胞および増殖性細胞が挙げられる。宿主細胞は、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスターもしくはウサギ)およびニワトリ胚細胞などの、ウイルスによる感染に罹りやすい哺乳動物、鳥類および昆虫の細胞および組織などの様々な動物細胞のいずれかを含んでもよい。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞(全能性細胞、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、APC、樹状細胞、非ヒト細胞など)、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞(例えば、骨格筋、心筋または平滑筋)、線維芽細胞、腫瘍細胞ならびに例えば、CV−1、BSC40、Vero、BSC40およびBSC−1などの細胞系、ならびにヒトHeLa細胞が挙げられる。宿主細胞を感染させ、および/または形質転換し、感染細胞または形質転換体を表現型により選択する方法、ならびに他のそのような方法は当技術分野で公知である。
本明細書で提供されるウイルスと、第2のウイルスまたは他の治療剤もしくは診断剤などの第2の薬剤との組合せが提供される。組合せは、本明細書で提供されるウイルスと、例えば、1つまたは複数のさらなる診断または治療ウイルスなどの1つまたは複数のさらなるウイルスとを含んでもよい。組合せは、本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物または本明細書に記載のウイルスを含有する宿主細胞を含んでもよい。組合せはまた、例えば、抗ウイルス剤または化学療法剤などの、本明細書で提供される方法に従うその弱毒化を行うための任意のウイルスまたは試薬を含んでもよい。組合せはまた、ウイルスによりコードされる内因性または異種遺伝子からの遺伝子発現の調節のために用いられる化合物を含有してもよい。
本明細書で提供されるウイルス、細胞、医薬組成物または組合せをキットとして包装することができる。キットは、所望により、使用のための説明書、デバイスおよびさらなる試薬などの1つまたは複数の構成要素、ならびに方法の実施のためのチューブ、容器およびシリンジなどの構成要素を含んでもよい。例示的キットは、本明細書で提供されるウイルスを含んでもよく、所望により、使用のための説明書、対象中のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを対象に投与するためのデバイス、またはさらなる薬剤もしくは化合物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。
本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、診断、モニタリングおよび治療方法において用いることができる。例えば、治療方法においては、ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、新生物、腫瘍、転移および他の免疫特権細胞または組織、例えば、創傷もしくは炎症組織の処置などの増殖性障害または状態の処置に用いることができる。本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、腫瘍および転移モニタリング処置の検出および画像化のための診断方法において用いることができる。他の例においては、ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、宿主中でのウイルス活性を検出するための診断またはモニタリング方法において用いることができる。本明細書で提供される診断および治療方法としては、限定されるものではないが、腫瘍および/または転移を含む対象への本明細書で提供されるウイルスの投与が挙げられる。他の例においては、本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、ワクチン接種方法におけるワクチンとして用いることができる。
ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、例えば、がん細胞、新生物、腫瘍、転移、がん幹細胞、および他の免疫特権細胞または組織、例えば、創傷もしくは炎症組織の処置(阻害など)などの増殖性障害または状態の処置に用いることができる。本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍または転移に選択的に蓄積する。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスの投与は、腫瘍成長の遅延をもたらす。他の例においては、本明細書で提供されるウイルスの投与は、腫瘍の排除または根絶などの、腫瘍体積の減少をもたらす。しかしながら、本明細書で提供される治療方法および使用は、投与されたウイルスが腫瘍細胞を殺傷するか、または腫瘍サイズを減少させる必要はない。その代わりに、本明細書で提供される方法は、対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含む。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスを、対象においてウイルス誘導性疾患を引き起こすことなく対象に投与することができる。いくつかの例においては、ウイルスは対象における抗腫瘍免疫応答を惹起することができ、典型的には、ウイルス媒介性抗腫瘍免疫応答は、例えば、数日、1週間以上、10日以上、2週間以上、または1カ月以上にわたって生じてもよい。いくつかの例示的方法においては、ウイルスは、腫瘍中に存在してもよく、腫瘍成長を防止するために十分な腫瘍細胞死をウイルス自体が引き起こすことなく、抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができる。いくつかの例においては、腫瘍は、単剤治療用の腫瘍または単剤治療用のがんであり、その腫瘍またはがんはウイルスまたは治療剤のみで処置された場合、体積が減少しない。
本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、腫瘍、がん幹細胞および転移モニタリング処置の検出および画像化のための診断方法において用いることができる。上記で考察された通り、本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍または転移に蓄積することができる。したがって、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードするウイルス株を投与することにより対象における腫瘍または転移を検出する方法であって、それにより検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質の検出が腫瘍または転移の存在を示す前記方法が、本明細書で提供される。検出可能なタンパク質または検出可能なシグナリングを誘導するタンパク質は、当業者には公知の任意の画像化技術により検出することができる。
本明細書で提供されるウイルスを、腫瘍を有するか、もしくは新生物細胞を有する対象、または免疫しようとする対象などの対象に投与することができる。投与されるウイルスは、本明細書で提供されるウイルスまたは本明細書で提供される方法を用いて作製された任意の他のウイルスであってよい。いくつかの例においては、投与されるウイルスは、弱毒化された病原性、低い毒性、腫瘍における選択的蓄積、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化する能力、高い免疫原性、複製能力および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにその組合せなどの特徴を含むウイルスである。
いくつかの例においては、対象へのウイルスの投与の前に、1つまたは複数の工程を実施することができる。限定されるものではないが、ウイルス投与にとって好適な状態を有する対象の診断、対象の免疫能力の決定、対象の免疫化、化学療法剤による対象の処置、放射線による対象の処置、または対象の外科的処置などの、任意の様々な先行工程を実施することができる。
投与の様式がウイルスの腫瘍または転移への進入を可能にするという条件で、ウイルスの対象への投与の任意の様式を用いることができる。投与の様式としては、限定されるものではないが、全身、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経真皮、皮内、動脈内(例えば、肝動脈注入)、膀胱内かん流、胸膜内、関節内、局所、腫瘍内、病変内、内視鏡、多穿刺(例えば、天然痘ワクチンについて用いられる)、吸入、経皮、皮下、鼻内、気管内、経口、腔内(例えば、カテーテルを介する膀胱への投与、坐剤もしくは浣腸による腸への投与)、経膣、直腸、頭蓋内、前立腺内、硝子体内、耳内、または眼内投与が挙げられる。いくつかの例においては、本明細書の他の場所に記載の診断剤または治療剤も同様に投与することができる。
投薬レジメンは、任意の様々な方法および量であってよく、当業者であれば公知の臨床因子に従って決定することができる。医学界では公知のように、任意の一人の患者のための用量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫能力、および一般的健康、投与しようとする特定のウイルス、投与の期間および経路、疾患の種類および段階、例えば、腫瘍サイズ、ならびに他の処置または化合物、例えば、同時に投与される化学療法剤などの多くの因子に依存し得る。上記因子に加えて、当業者であれば決定できるように、そのようなレベルは、ウイルスの感染性、およびウイルスの性質により影響され得る。
また、異なる治療ウイルスまたは治療化合物などのさらなる治療物質を投与する方法も提供される。これらのものを、第1のウイルスと同時に、連続的に、または間欠的に投与することができる。さらなる治療物質は、ウイルスもしくはその遺伝子産物と相互作用するか、またはさらなる治療物質はウイルスとは無関係に作用することができる。
2つ以上のウイルスを対象に投与する方法が提供される。投与を、同時的に、連続的に、または間欠的に行うことができる。複数のウイルスを、単一の組成物として、または2つ以上の組成物として投与することができる。2つ以上のウイルスは、少なくとも2つのウイルスを含んでもよい。特定の例においては、2つのウイルスが存在する場合、両ウイルスはワクシニアウイルスである。別の例においては、1つのウイルスはワクシニアウイルスであり、第2のウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、フォーミーウイルス、インフルエンザウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、または本明細書に記載の、もしくは当技術分野で公知の任意の他のウイルスのいずれか1つである。ウイルスを、それらが作用する経路に基づいて選択することができる。例えば、活性化Ras経路を標的とするウイルスを、p53発現が欠損した腫瘍細胞を標的とするウイルスと組み合わせることができる。
任意の治療剤または抗がん剤を、本明細書で提供される組合せがん処置方法における第2の治療剤または抗がん剤として用いることができる。前記方法は、対象へのウイルスまたは複数のウイルスの投与に加えて、対象への1つまたは複数の治療化合物を投与することを含んでもよい。治療化合物は、腫瘍治療効果のために、独立して、またはウイルスと一緒になって作用してもよい。
治療化合物としては、限定されるものではないが、免疫療法効果を示す化合物、免疫系を刺激もしくは抑制する化合物、治療化合物を運搬する化合物、またはその組合せも挙げられる。所望により、治療剤は、本明細書の他の場所に記載のような画像化剤としてのその使用を可能にする特性などの、さらなる特性を示すか、または明示することができる。そのような治療化合物としては、限定されるものではないが、抗がん抗体、放射線療法、siRNA分子および免疫系を抑制する化合物(すなわち、免疫抑制因子、免疫抑制剤)が挙げられる。いくつかの事例においては、ウイルスに対する有害反応を最小化するためのウイルスの投与の前に、免疫系を抑制するために対象に免疫抑制剤を投与することが望ましい。免疫抑制剤の例としては、限定されるものではないが、糖質コルチコイド、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターフェロンおよび免疫抑制抗体(例えば、抗CD3および抗IL2受容体抗体)が挙げられる。
別の例においては、対象にウイルスを投与するための本明細書で提供される方法を、麻酔された対象、警戒した対象、体温が上昇した対象、体温が低下した対象、または腫瘍中でのウイルスの蓄積に影響することが知られる他の状態の対象などの、任意の様々な状態の対象に対して実施することができる。本明細書で提供されるように、麻酔された対象は麻酔されていない対象と比較して腫瘍中のウイルスの低下した蓄積速度を有し得ることが決定された。さらに本明細書で提供されるように、体温が低下した対象は、正常な体温を有する対象と比較して、腫瘍中のウイルスの低下した蓄積速度を有し得ることが決定された。したがって、対象が、全身麻酔などの麻酔下にない対象にウイルスを投与することを含んでもよい、対象にウイルスを投与する方法が本明細書で提供される;例えば、対象は局部麻酔下にあるか、または麻酔されていなくてもよい。また、体温が変化した対象にウイルスを投与することを含んでもよく、体温の変化が腫瘍中にウイルスが蓄積する能力に影響し得る、対象にウイルスを投与する方法も本明細書で提供される;典型的には、体温の低下は、腫瘍中にウイルスが蓄積する能力を低下させ得る。かくして、例示的な一例においては、対象の体温を正常より高い温度に上昇させ、対象にウイルスを投与することを含み、ウイルスが正常な体温を有する対象の腫瘍中にウイルスが蓄積する能力と比較してより高い体温を有する対象においてより容易に腫瘍中にウイルスが蓄積することができる、対象にウイルスを投与するための方法が提供される。別の例においては、腫瘍周囲の領域における温度の局部的上昇を用いて、腫瘍中でのウイルスの蓄積を増加させることができる。
本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および/または対象に投与されたウイルスをモニタリングする1つまたは複数の工程をさらに含んでもよい。限定されるものではないが、腫瘍サイズのモニタリング、抗(腫瘍抗原)抗体力価のモニタリング、転移の存在および/またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーなどの他の健康指示因子のモニタリング、抗(ウイルス抗原)抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物のウイルス発現のモニタリング、ならびに対象の腫瘍、組織もしくは臓器中のウイルス力価の直接的モニタリングなどの、任意の様々なモニタリング工程を、本明細書で提供される方法に含有させることができる。
いくつかの例においては、本明細書で提供される方法は、1つまたは複数のウイルスに発現された遺伝子をモニタリングすることを含んでもよい。ウイルスは、限定されるものではないが、検出可能なタンパク質(例えば、発光もしくは蛍光タンパク質)または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質(例えば、検出可能な化合物を結合するか、もしくは輸送するか、またはシグナルを生成するように基質を改変するタンパク質)などの1つまたは複数の検出可能な遺伝子産物を発現することができる。かくして、感染した細胞/組織を、1つまたは複数の光学または非光学画像化法により画像化することができる。
また、腫瘍および/または転移のサイズおよび位置をモニタリングする方法も本明細書で提供される。腫瘍および/または転移のサイズを、外部評価方法または断層撮影法もしくは磁気画像化方法などの当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによりモニターすることができる。当技術分野で公知の方法に加えて、例えば、ウイルス遺伝子発現をモニタリングする、本明細書で提供される方法を、腫瘍および/または転移のサイズをモニタリングするために用いることができる。
本明細書で提供される方法はまた、対象へのウイルスの投与に応答して生成される抗体などの、対象における抗体力価をモニタリングすることを含んでもよい。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスは、内因性ウイルス抗原に対する免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスはまた、ウイルスにより発現された外因性遺伝子に対する免疫応答を惹起することもできる。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスはまた、腫瘍抗原に対する免疫応答を惹起することもできる。ウイルス抗原、ウイルスにより発現される外因性遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングを、ウイルスの毒性をモニタリングする方法、処置方法の効果をモニタリングする方法、または生成および/もしくは収穫のために遺伝子産物もしくは抗体のレベルをモニタリングする方法において用いることができる。
本明細書で提供される方法はまた、対象の健康をモニタリングする方法を含んでもよい。本明細書で提供されるいくつかの方法は、新生物疾患治療方法などの治療方法である。対象の健康のモニタリングを用いて、当技術分野で公知のように、治療方法の効果を決定することができる。本明細書で提供される方法はまた、対象にウイルスを投与する工程を含んでもよい。対象の健康のモニタリングを用いて、対象に投与されるウイルスの病原性を決定することができる。新生物疾患、感染症、または免疫関連疾患などの疾患をモニタリングするための様々な健康診断方法のいずれかを、当技術分野で公知のようにモニターすることができる。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、顔色、体温または他の観察可能な状態は、対象の健康を示し得る。さらに、対象からの試料中に1つまたは複数の構成要素の存在または非存在またはレベルは、対象の健康を示し得る。典型的な試料は、血液および尿試料を含んでもよく、1つまたは複数の構成要素の存在または非存在またはレベルを、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断テストを実施することにより決定することができる。対象の健康を示す構成要素の例としては、限定されるものではないが、白血球計数、ヘマトクリット、または反応性タンパク質濃度が挙げられる。
また、治療決定がモニタリングの結果に基づくものであってよい、治療をモニタリングする方法も本明細書で提供される。本明細書で提供される治療方法は、腫瘍および/または転移中に選択的に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができるウイルスを対象に投与することを含んでもよい。そのような治療方法は、特定のウイルスの複数回の投与、第2のウイルスの投与、または治療化合物の投与を含む様々な工程を含んでもよい。対象に投与するためのウイルスまたは化合物の量、タイミングまたは種類の決定は、対象のモニタリングからの1つまたは複数の結果に基づくものであってよい。例えば、対象における抗体力価を用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、投与するウイルスもしくは化合物の種類、例えば、低い抗体力価がさらなるウイルスを投与する望ましさを示し得る場合、異なるウイルス、またはウイルス遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を決定することができる。別の例においては、対象の全体的な健康状態を用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、および投与するウイルスもしくは化合物の種類、例えば、対象が健康であることの決定が、さらなるウイルスを投与する望ましさを示し得る場合、異なるウイルス、またはウイルス遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を決定することができる。別の例においては、検出可能なウイルスにより発現された遺伝子産物のモニタリングを用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、および投与するウイルスもしくは化合物の種類を決定することができる。そのようなモニタリング方法を用いて、治療方法が有効であるかどうか、治療方法が対象に対して病原性であるかどうか、ウイルスが腫瘍または転移中に蓄積したかどうか、およびウイルスが正常な組織または臓器中に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定に基づいて、さらなる治療方法の望ましさおよび形態を誘導することができる。
H.実施例
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞CV−1細胞[ATCC番号CCL−70;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]を、ウェル当たり5×105細胞で6ウェルプレート中で平板培養し、細胞が90%の培養密度に達した場合に、5%のCO2を供給した加湿インキュベーターにおいて、37℃で、一晩、1%抗菌−抗真菌溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)および10%ウシ胎児血清(FBS、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)中で成長させた。CV−1細胞は、ワクシニアウイルスLIVP[子ウシ皮膚にLister株(ATCCカタログ番号VR−1549)を適合させることによって元々誘導したワクシニアウイルス株]の10倍段階希釈溶液により二通り感染させた(Institute of Viral Preparations, Moscow, Russia, Al’tshtein et al., (1983) Dokl. Akad. Nauk USSR 285:696−699))。段階希釈溶液は、十分に分離されたプラークの単離を確実にするために感染のために用いた。感染の2日後、プレート上の他のプラークに比べて大きなプラーク表現型を示す、8つの十分に単離されたプラークを採集した。これらのプラークは、CV−1細胞において、さらに2回のプラーク精製にかけ、それぞれ、LIVPクローン単離物1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、および8.1.1と呼んだ。LIVP 1.1.1および4.1.1は、CV−1細胞において、他の単離物よりも大きなプラークを形成した。
様々な正常およびがん細胞型におけるLIVPクローン単離物の成長を分析し、親LIVP株、LIVPの2つの誘導株、GLV−1h68(米国特許第7,588,767号を参照されたい)ならびにGLV−1h74(米国特許出願公開第2009−0098529号および第2009−0053244号を参照されたい)、ならびにワクシニアウイルスWR(ATCCカタログ番号VR−1354)の成長と比較した。GLV−1h68は、LIVP株の遺伝子座中にDNA挿入を含有する(配列番号9)。GLV−1h68は、F14.5L(LIVPにおいてF3とも呼ばれる)、チミジンキナーゼ(TK)、および赤血球凝集素(HA)遺伝子座において検出可能なマーカータンパク質をコードする発現カセットを含有する。ワクシニア合成初期/後期プロモーターPSELの制御下のRuc−GFP cDNA分子(ウミシイタケルシフェラーゼをコードするDNAおよびGFPをコードするDNAの融合物)を含有する発現カセット((PSEL)Ruc−GFP)を、F14.5L遺伝子座の中に挿入した;ワクシニア初期/後期プロモーターP7.5kの制御下にベータ−ガラクトシダーゼをコードするDNA分子((P7.5k)LacZ)およびワクシニア合成初期/後期プロモーターPSELに関して転写について逆向きに位置するラットトランスフェリン受容体をコードするDNA((PSEL)rTrfR)を含有する発現カセットを、TK遺伝子座の中に挿入した(タンパク質をコードするDNA分子がカセットにおいてプロモーターに関して転写について逆向きに位置するので、結果として生じるウイルスは、トランスフェリン受容体タンパク質を発現しない);ワクシニア後期プロモーターP11kの制御下にβ−グルクロニダーゼをコードするDNA分子を含有する発現カセット((P11k)gusA)を、HA遺伝子座の中に挿入した。F14.5L、J2R、およびA56R遺伝子座の3つの挿入物すべての欠失によってGLV−1h68から誘導したGLV−1h74。GLV−1h74は、(PSEL)Ruc−GFPの代わりにF14.5L遺伝子座の中に挿入された非コードDNA分子、(PSEL)rTrfRおよび(P7.5k)LacZの代わりにTK遺伝子座の中に挿入された非コードDNA分子、ならびに(P11k)gusAの代わりにHA遺伝子座の中に挿入された非コードDNA分子を含有する。
1. MEFマウス胚線維芽細胞
MEF細胞(StemCell Technologies、Vancouver、Canada;カタログ#00321)は、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシン抗菌−抗真菌溶液[Mediatech, Inc.、Herndon(VA)]、3.5μL/L β−メルカプトエタノール(Sigma #M3148−25ml)、および10%ウシ胎児血清(FBS、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)を補足した、4.5g/LグルコースおよびL−グルタミンを含み、ピルビン酸ナトリウムを含まない、ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)(Cellgro#10−017−CV)中で成長させた。細胞は、5%CO2を供給した加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。
1. B16−F10マウスメラノーマ細胞
マウスメラノーマB16−F10細胞[ATCC番号CRL−6475;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]は、1%抗菌−抗真菌溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)および10%ウシ胎児血清(FBS、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)中で成長させた。細胞は、5%CO2を供給した加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。
ヒト前立腺癌DU 145細胞[ATCC番号HTB−81;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]は、1%ピルビン酸ナトリウム(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%抗菌−抗真菌溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%非必須アミノ酸(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、および10%FBSを含有するEMEM(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)中で成長させた。細胞は、5%CO2を供給した加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。
マウスCT26.WT結腸癌細胞[ATCC CRL−2638;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]は、1%ピルビン酸ナトリウム(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%ストレプトマイシン/アムホテリシン抗菌/抗真菌溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%HEPES(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、5.6mL/L 45%グルコース溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、および10%FBSを含有するRPMIにおいて成長させた。細胞は、5%CO2を供給した加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。
マウスMC−38腺がん細胞(Jochen Stritzker、University of Wuerzburg)1%ピルビン酸ナトリウム(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%ストレプトマイシン/アムホテリシン抗菌−抗真菌溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、1%HEPES(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、5.6mL/L 45%グルコース溶液(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)、および10%FBSを含有するRPMIにおいて成長させた。細胞は、5%CO2を供給した加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。
1. GLV−1h164
本実施例において、VACV合成後期プロモーターの制御下のA56R遺伝子座に挿入された単鎖抗VEGF抗体遺伝子(G6;配列番号73)を含む遺伝子(GLAF−2)を含有するGLV−1h164を、二重相互乗換えによってGLV−1h100から生成した。GLV−1h100は、インビボ(in vivo)相同組換えを通して、hNET発現カセットと、J2R遺伝子座のβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを交換することによって、GLV−1h68から誘導した(米国特許第7,588,767号および米国特許公開第2009−0117034を参照されたい)。
GLV−1h109の生成は、米国特許第8,052,968号において記載される。GLV−1h109は、A56R遺伝子座の中へのGLAF−1(配列番号12および21)をコードする遺伝子によるLacZ遺伝子(ベータ−ガラクトシダーゼ)の交換によってGLV−1h68株(配列番号9)から誘導した。GLAF−1遺伝子は、抗VEGF単鎖抗体G6をコードするが、VACV合成後期(SL)プロモーターの制御下にある。
GLV−1h158は、J2R遺伝子座の中へのGLAF−2(配列番号22)をコードする遺伝子によるgusA遺伝子(ベータ−グルクロニダーゼ)の交換によってGLV−1h68株(配列番号9)から誘導した。GLAF−2遺伝子は、抗VEGFR単鎖抗体G6をコードするが、VACV合成初期/後期(SEL)プロモーターの制御下にある。
GLV−1h163は、A56R遺伝子座の中へのGLAF−2(配列番号22)をコードする遺伝子によるgusA遺伝子(ベータ−グルクロニダーゼ)の交換によってGLV−1h100株(上記、実施例3.1において記載される)から誘導した。GLAF−2遺伝子は、VACV合成初期/後期(SEL)プロモーターの制御下にある。さらに、GLV−1h163は、J2R遺伝子座の中にVACV合成初期(SE)プロモーターの制御下のヒトノルエピネフリントランスポーター(NET)を持つ。
本実施例において、いくつかのがん細胞株におけるLIVP単離物1.1.1のインビトロウイルス複製を検査し、ワクシニアウイルスGLV−1h68(実施例1および米国特許第7,588,767号において記載される)ならびにGLV−1h164(実施例3において上述される)と比較した。さらに、ウイルスはそれぞれ、下記に記載されるように、照射による前処理の後に評価した。
マウスメラノーマB16−F10細胞[ATCC番号CRL−6475;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]は、DMEM培地中で成長させ、37℃で、24、48、または72時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVPクローン単離物1.1.1により感染させた。
ヒトA549肺癌細胞(ATCC)は、F−12K培地中で成長させ、37℃で、24、48、または72時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において二通り、力価を測定した。
ヒトMDA−MB−231乳癌細胞(ATCC)は、LeibovitzのL−15培地中で成長させ、37℃で、24、48、または72時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において二通り、力価を測定した。
ヒトMIA PaCa−2膵癌細胞(ATCC)は、DMEM培地中で成長させ、37℃で、24、48、または72時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において二通り、力価を測定した。
ヒトPC−3前立腺がん細胞(ATCC)は、F−12K培地中で成長させ、37℃で、24、48、および72時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において二通り、力価を測定した。
ヒトU−87MG膠芽腫星状細胞腫細胞(ATCC)は、DMEM中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において二通り、力価を測定した。
本実施例において、LIVP単離物5.1.1のインビトロウイルス複製を、A549ヒト肺癌および4T1マウス乳がん細胞において検査し、ワクシニアウイルスGLV−1h68(実施例1および米国特許第7,588,767号において記載される)と比較した。ウイルス成長は、上清および細胞溶解物において評価した。
ヒトA549肺癌細胞(ATCC)は、F−12K培地中で24ウェルプレートにおいて成長させ、37℃で、0.1のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68またはLIVP単離物5.1.1により感染させた。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の1、6、12、24、48、72、および96時間後に収集し、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において三通り、力価を測定した。
マウス4T1乳がん細胞(ATCC)は、RPMI−1640培地中で24ウェルプレートにおいて成長させ、37℃で、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68またはLIVP単離物5.1.1により感染させた。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の2、6、12、24、48、72、および96時間後に収集し、標準的な方法を使用して、CV−1細胞において三通り、力価を測定した。
本実施例において、LIVP単離物1.1.1および5.1.1のウイルス細胞傷害性は、XTT細胞増殖アッセイを使用して、様々ながん細胞株においてインビトロにおいて測定した。毒性は、事前の放射線処理ありまたはなしで測定した。
1. B16−F10マウスメラノーマ細胞
マウスメラノーマB16−F10細胞[ATCC番号CRL−6475;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]は、DMEM培地中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVPクローン単離物1.1.1により感染させた。
ヒトA549肺癌細胞(ATCC)は、F−12K培地中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の1、3、5、および7日後に測定した。
ヒトMDA−MB−231乳癌細胞(ATCC)は、LeibovitzのL−15培地中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の1、3、5、および7日後に測定した。
ヒトMIA PaCa−2膵癌細胞(ATCC)は、DMEM培地中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射したまたは放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の1、3、5、および7日後に測定した。
ヒトPC−3前立腺がん細胞(ATCC)は、F−12K培地中で成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の1、3、5、および7日後に測定した。
ヒトU−87MG膠芽腫星状細胞腫細胞(ATCC)は、成長させ、37℃で、24時間、0.01のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h164、またはLIVP単離物1.1.1により感染させた。細胞は、上述されるように、6Gyのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の1、3、5、および7日後に測定した。
1. A549ヒト肺癌細胞
ヒトA549肺癌細胞(ATCC)は、F−12K培地中で四通り24ウェルプレートにおいて成長させ、37℃で、24時間、0.1のMOIで、ワクシニアウイルスGLV−1h68、LIVP単離物5.1.1、PBS、GLV−1h68+5μM ST−246、LIVP 5.1.1+5μM ST−246、またはPBS+5μM ST−246により感染させた。細胞毒性は、上述されるように、Cell Proliferation Kit II(XTT)、Rocheにより感染の24、48、および72時間後に測定した。
A. DU145ヒト前立腺癌異種移植片に対するウイルスの効果
LIVPクローン単離物1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、および8.1.1のインビボ効果は、ヒト前立腺がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;4〜5週齢)に、DU145細胞[ATCC番号HTB−81;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]を皮下注射し(100μL PBS中1.0×107細胞を右外側大腿にs.c.)、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の13日後に、マウスのグループに、7.0×105pfu LIVPクローン単離物1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、もしくは8.1.1、GLV−1h68、GLV−1h74 または野生型LIVP(100μLのPBS中)、またはPBSのみを後眼窩注射(retro orbital injection)を介して投与した。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の13、20、27、34、41、48、55、62、および69日後に測定した。
LIVP 1.1.1、5.1.1、および6.1.1の用量の増加についてのインビボにおける効果は、ヒト前立腺がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの様々な用量についての安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;4〜5週齢;グループ当たりn=8)に、DU145細胞[ATCC番号HTB−81;American Type Culture Collection(Manassas、VA)]を皮下注射し(100μL PBS中6.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の13日後に、グループのマウスに、LIVP単離物1.1.1(7.0×105pfu、2.0×106pfu、もしくは1×107pfu)、5.1.1(7.0×105pfu、2.0×106pfu、もしくは1×107pfu)、または6.1.1(7.0×105pfu、2.0×106pfu、もしくは1×107pfu)、GLV−1h68(7.0×105pfu、2.0×106pfu、もしくは1×107pfu(100μLのPBS中)、または、PBSのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の13、20、27、34、41、48、55、62、および69日後に測定した。AUC、治療指標、および生存率は、上の実施例7Aにおいて記載されるように計算した。
LIVP 1.1.1のインビボにおける効果は、ヒト食道がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;4〜5週齢;グループ当たりn=5)に、OE19細胞(Sigma Aldrich)を皮下注射し(100μL PBS中2.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の13日後に(腫瘍サイズ>300mm3)、グループのマウス(n=5)に、2.0×106pfu LIVP単離物1.1.1、GLV−1h68、またはGLV−1h164(100μLのPBS中)、またはPBSのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の13、20、27、34、41、48、55、および62日後に測定した。
LIVP 1.1.1のインビボにおける効果は、ヒト神経膠腫のマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;4〜5週齢)に、U−87MG膠芽腫星状細胞腫細胞(ATCC)を皮下注射し(100μL PBS中5.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の14日後に(腫瘍サイズ>200mm3)、グループのマウス(n=8)に、2.0×106pfu LIVP単離物1.1.1もしくはGLV−1h68(100μLのPBS中)またはPBSのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の−1、2、6、9、13、16、20、23、27、30、34、37、41、44、48、51、および55日後に測定した。
LIVP 1.1.1のインビボにおける効果は、ヒト神経膠腫のマウスモデルを使用して評価した。実験の詳細は、下記の表42に記載する。腫瘍は、オスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;4〜5週齢)に、U−87MG膠芽腫星状細胞腫細胞(ATCC)を皮下注射することによって(100μL PBS中5.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の13日後に、いくつかのグループのマウスは、6Gyもしくは3.5Gyで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍細胞移植の14日後に(腫瘍サイズ>200mm3)、グループのマウスに、2.0×106pfu LIVP単離物1.1.1もしくはGLV−1h68(100μLのPBS中)またはPBSのみを後眼窩注射を介して投与した。ウイルス注射の1日後に、いくつかのグループのマウスは、6Gyもしくは3.5Gyで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の−1、3、6、9、13、16、20、23、27、30、34、37、41、および44日後に測定した。健康な器官におけるLIVP 1.1.1のウイルス分布は、感染後3および7日目にウイルス力価(pfu)を測定することによって評価した。
LIVP 1.1.1のインビボにおける効果は、メラノーマの同種移植片マウスモデルを使用して評価した。実験の詳細は、下記の表51に記載する。腫瘍は、メスマウス(Harlan)に、B16−F10マウスメラノーマ細胞(ATCC)を皮下注射(100μL PBS中2.0×105細胞を右外側大腿にs.c.)することによってC57BL/6マウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の13日後に、いくつかのグループのマウスは、6Gyもしくは4Gyで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍細胞移植の14日後に(腫瘍サイズ>200mm3)、グループのマウスに、5.0×107pfu LIVP単離物1.1.1もしくはGLV−1h68(100μLのPBS中)またはPBSのみを後眼窩注射を介して投与した。いくつかのグループのマウスは、ウイルス注射の1、6、および8日後にさらに4Gyの用量の放射線を受けた、または処理を受けなかった。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射の−1、2、6、8、13、16、および20日後に測定した。
LIVP 5.1.1のインビボにおける効果は、ヒト肺がんのマウスモデルを使用してさらに評価した。腫瘍は、メスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;6〜8週齢)に、A549細胞(ATCC)を皮下注射(100μL PBS中5.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)することによってヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の17日後に(腫瘍サイズ>250mm3)、グループのマウスに、5.0×106pfu LIVP 5.1.1、GLV−1h68(100μLのPBS中)、LIVP 1.1.1+2.5μM ST−246、GLV−1h68+2.5μM ST−246、またはPBSのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積(mm3)は、がん細胞注射後、週に二度測定した。マウスは、移植の42日後に安楽死させ、ウイルス力価は、標準的な技術を使用して腫瘍および器官において決定した。
A. A459肺癌細胞におけるプラーク形態
A549肺癌細胞におけるプラーク形態は、ワクシニアに対する抗体およびHoechstにより染色することによって決定した。ヒトA549肺癌細胞は、10%FCSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI−1640培地中で培養した。A549細胞は、24ウェルプレートにおいてカバースリップ上に接種した。100%のコンフルエンス時に、細胞に、50pfu/ウェルのGLV−1h68またはLIVP単離物5.1.1を感染させた。感染の3日後に(dpi)、細胞は、10分間、500μL 4%PFAにより固定し、1×PBSにより3回洗浄した。遮断および透過処理のために、細胞は、ウェル当たり500μL遮断溶液(1×PBS/5% FCS/0.1% Triton−X 100)と共に15分間インキュベートした。ワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗体[遮断溶液中で1:500に希釈、(ab35219、abcam)]を追加し、細胞を、振盪機上で4℃で一晩インキュベートした。続いて、プレートは、1×PBSにより3回洗浄した。遮断および透過処理のために、細胞は、ウェル当たり500μL 1×PBS/5% FCS/0.1% Triton−X 100と共に15分間インキュベートした。二次抗体[Cy2コンジュゲートAffiniPureロバ抗ウサギIgG、遮断溶液中で1:200に希釈した(711−225−152、Jackson ImmunoResearch)およびHoechst(1:400に希釈したHoechst 33258(861405、Sigma Aldrich)]を追加し、45分間インキュベートした。最終的に、細胞は、1×PBSにより3回洗浄し、カバースリップは、プレート上に包埋した。結果は、GLV−1h68感染細胞と比較した、LIVP 5.1.1感染細胞におけるプラークサイズの増加を示す。
腫瘍は、メスヌードマウス(Hsd:Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、Ind.;6〜8週齢)に、A549細胞(ATCC)を皮下注射(100μL PBS中5.0×106細胞を右外側大腿にs.c.)することによってヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の17(17)日後に(腫瘍サイズ>250mm3)、マウスに、5.0×106pfu LIVP 5.1.1、GLV−1h68(100μlのPBS中)、またはPBSのみを尾静脈注射を介して投与した。マウスは、移植の42日後に安楽死させ、腫瘍は収集し、凍結させた。凍結させた腫瘍は、振盪機上で4℃で4%PFA中で一晩固定した。その後、腫瘍は、1×PBSにより30分間、5回洗浄した。腫瘍を半分にし、6ウェルプレートの中に1×PBS中5%低融点アガロースにより包埋した。アガロース切片(100μm)をvibratomeにより調製し、1×PBSと共に48ウェルプレートに直接移した。染色のために、切片は、ウェル当たり500μL遮断溶液(1×PBS/0.2% Triton−X 100/5%FCS)により1時間遮断し、透過処理した。一次抗体を、振盪機上で室温で一晩インキュベートした。一次抗体は、ワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗体[遮断溶液中で1:100に希釈した、(ab35219、abcam)]およびラット抗マウスMHCクラスII抗体[遮断溶液中で1:200に希釈した、(14−5321−85、eBioscience)]を含んだ。1×PBSによる3回の洗浄後に、二次抗体およびHoechst 33258(遮断溶液中で1:400に希釈した)を追加し、振盪機上で室温で4時間インキュベートした。二次抗体は、Cy2コンジュゲートAffiniPureロバ抗ウサギIgG[遮断溶液中で1:200に希釈した(711−225−152、Jackson ImmunoResearch)]、Cy3コンジュゲートAffiniPureロバ抗ラットIgG[遮断溶液中で1:200に希釈した(712−165−153、Jackson ImmunoResearch)]を含む。腫瘍は、1×PBSにより3回洗浄し、Moviol中に包埋した。結果は、GLV−1h68およびLIVP 5.1.1に感染した腫瘍の間で、ウイルス拡散または免疫細胞誘引もしくは局在化において有意差を示さなかった。
本実施例において、LIVP 1.1.1およびGLV−1h68の治療効果を、異種移植片マウスモデルにおけるイヌ軟部組織肉腫において検査した。
1. 細胞培養
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞(CV−1)は、American Type Culture Collection(ATCC)から得た。Morris(MTH52c)は、軟部組織肉腫に由来する[Any MacNeill、非公開データ]。細胞は、5%CO2下、37℃で、CV−1については抗菌性溶液(100U/mlペニシリンG、100ユニット/mlストレプトマイシン)および10%ウシ胎児血清(FBS;Invitrogen GmbH、Karlsruhe、Germany)を、また、MTH52cについては20%FBSを補足したDMEM中で培養した。
GLV−1h68およびLIVP 1.1.1ワクシニア株は、本研究に使用した、また、実施例1において記載される。
細胞は、24ウェルプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)中に接種した。培養の24時間後に、細胞は、0.1および1.0の感染多重度(MOI)を使用して、LIVP 1.1.1およびGLV−1h68により感染させた。細胞は、1時間、37℃でインキュベートし、感染培地を除去し、続いて、細胞を新鮮な成長培地中でインキュベートした。感染後の生細胞の量は、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)(Sigma、Taufkirchen、Germany)を使用して測定した。感染の24、48、72、または96時間後に、培地は、フェノールレッドなしのRPMI 1640中に溶解した、2.5mg/ml MTTの濃度の0.5ml MTT溶液と交換し、5%CO2大気中、37℃で2時間インキュベートした。MTT溶液の除去の後に、発色反応は、イソプロパノール中に希釈した1N HClを追加することによって停止させた。光学濃度は、570nmの波長で測定した。非感染細胞は基準として使用し、100%生存可能であると見なした。
ウイルス複製アッセイのために、24ウェルプレートにおいて成長させられた細胞を、0.1のMOIでLIVP 1.1.1およびGLV−1h68により感染させた。20分毎の緩やかな撹拌を伴う37℃でのインキュベーションの1時間後に、感染培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。1、6、12、24、48、72、および96時間後に、細胞および上清を収集した。3回の凍結融解サイクルの後に、溶解物の段階希釈溶液をCV−1細胞に対する標準的なプラークアッセイによって力価を測定した。試料はすべて、三通り測定した。
感染の3日前に、Morris細胞を24ウェルプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)中に接種した。その他に示されない限り、90%コンフルエントな細胞層を偽感染させた,または37℃で1時間、1.0のMOIでLIVP 1.1.1またはGLV−1h68により感染させた。ウイルス含有培地を吸引し、20%FBSを含有する新鮮な培地と交換した。タンパク質単離および検出のために、感染の1、12、24、48、72、および96時間後に(hpi)、細胞を収集し、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)試料バッファー中に再懸濁した。タンパク質試料は、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜(Whatman GmbH、Dassel、Germany)上にブロットした。その後、膜は、抗ベータアクチンマウスモノクローナル抗体(ab6276、Abcam、Cambridge、UK)またはポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス(抗VACV)抗体(Abcam、Cambridge、UK)と共にインキュベートし、検出は、マウス(ab6728、Abcam、Cambridge、UK)またはウサギ(ab6721、Abcam、Cambridge、UK)に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して得、その後、増強化学発光(enhanced chemiluminescence)を続けた。
ウイルス感染細胞および動物のGFPシグナルは、蛍光顕微鏡(Leica DM IRB;Wetzlar、Germany)および蛍光立体顕微鏡(Leica MZ 16 FA;Wetzlar、Germany)によりそれぞれ分析した。画像はデジタルカメラにより取り込み、META−MORPH(Universal Imaging;Downingtown、PA、USA)およびPhotoshop 7.0(Adobe Systems、Mountain View、CA、USA)を使用して処理した。
腫瘍は、6〜8週齢メスヌードマウス(NCI/Hsd/Athymic Nude−Foxn1nu、Harlan Winkelmann GmbH、Borchen、Germany)の右後肢に100μl PBS中の1×106細胞を皮下に移植することによって生成した。腫瘍成長は、デジタルキャリパーを使用して、二次元で毎週モニターした。腫瘍体積は、[(長さ×幅2)/2]として計算した。28日目に、LIVP1.1.1または、GLV−1h68ウイルス(100μl PBS中1×107プラーク形成単位[pfu])の単一用量を、尾静脈(i.v.)の中に注射した。対照動物は、PBSのみをi.v.注射した。
1. 培養におけるイヌ肉腫細胞に対するLIVP 1.1.1およびGLV−1h68の細胞傷害性
Morris細胞は、24ウェルプレート中に感染の3日前に接種した。その後、細胞は、それぞれ1.0および0.1のMOIを使用してLIVP 1.1.1またはGLV−1h68により感染させた。細胞生存度は、セクションAにおいて記載されるように、MTTアッセイによって、感染の24、48、72、および96時間後(hpi)に分析した。結果は、表58に示す。値は、それぞれの非感染対照のパーセンテージとして示す。
「Morris」細胞は、上述されるように、0.1のMOIでLIVP 1.1.1またはGLV−1h68により感染させた。ウイルス力価は、CV−1細胞単層において、標準的なプラークアッセイによって、三通り、ウェル当たりpfuとして感染の経過の間に様々な時点で決定した。結果は、表59に示す。
Morris細胞に対するLIVP 1.1.1−またはGLV−1h68感染の有効性はまた、それぞれ0.1および1.0のMOIで蛍光顕微鏡検査法によっても分析した。この目的のために、感染の経過の間に、ウイルスにより処理したMoris細胞は、Hoechst−12222染色(核に対して青色)またはヨウ化プロピジウム染色(死細胞に対して赤色)によって可視化し、蛍光顕微鏡Leica DM IRBを使用して、様々な時点(1、24、48、72、および96hpi)で分析した。その後、画像は、感染および細胞の溶解の程度を示すためにマージした。GLV−1h68感染の場合には、組換えウイルスマーカー遺伝子GFP(緑色蛍光タンパク質)の発現についてさらに分析した。
細胞は、24ウェルプレート中に接種し、90%のコンフルエンスに達するまで成長させた。その後、細胞は、37℃で、1時間、1.0のMOIでLIVP 1.1.1またはGLV−1h68により感染させた。上清を、吸引し、Morris細胞のための新鮮な成長培地と交換した。タンパク質単離および検出のために、細胞は、様々な時点(1、24、48、72、および96hpi)で収集し、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)バッファー中に再懸濁した。試料は、37℃で30分間、Benzonaseにより処理した。タンパク質試料は、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜上にブロットした。その後、膜は、抗ベータアクチンマウスモノクローナル抗体(1:10,000)または抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体(1:1000)と共にインキュベートし、マウス(1:2,000)またはウサギ(1:10,000)に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して検出し、その後、増強化学発光を続けた。ウエスタンブロット分析もまた、LIVP1.1.1感染試料におけるワクシニアウイルス抗体のより強力なシグナルによって示されるように、Morris細胞における、GLV−1h68と比較した、LIVP 1.1.1のより効率的な複製を確認した。
6〜8週の12匹のメス無胸腺ヌードFoxN1マウスに、1×106 Morris細胞を移植した。移植の4週間後に、ヌードマウスはすべて、約700〜1100mm3の体積を有する腫瘍を発達させた。動物は、3つのグループ(n=4)に分離し、それぞれGLV−1h68、LIPV1.1.1、またはPBS(対照)を注射した。腫瘍サイズは、毎週測定した。
本実施例において、LIVPクローン単離物1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、および8.1.1を配列決定し、分析し、結果は、ワクシニアウイルス株GLV−1h68、Western Reserve、およびCopenhagenについての知られている配列と比較した。
本実施例において、異種タンパク質をコードする遺伝子は、1)直接的なクローニングまたは2)相同組換えによってLIVPクローン単離物の中に挿入する。
本実施例において、異種タンパク質をコードするLIVPウイルスは、Scheiflinger et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9977−9981および米国特許第6,265,183号において記載される方法に従って直接的なクローニングによって構築する。この方法において、異種タンパク質をコードする核酸は、ウイルスゲノムにおける非必須領域に位置するユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位の中に挿入される。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、LIVP 1.1.1、LIVP 2.1.1、LIVP 3.1.1、LIVP 4.1.1、LIVP 5.1.1、LIVP 6.1.1、LIVP 7.1.1、LIVP 8.1.1、およびGLV−1h68のNotI部位の中に挿入される(GL−ONC1)。例示的なコード異種タンパク質およびコード核酸配列(配列番号)のリストを、下記の表66に記載する。
本実施例において、異種タンパク質(表66中に記載される)をコードする遺伝子を、米国特許第7,588,767号、米国特許公開第2009−0117034号、およびFalkner and Moss (1990) J. Virol. 3108−3111に記載されるものに類似する方法に従って、インビボ相同組換えによって、LIVPウイルス、例えばLIVP 1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1、およびGLV−1h68(GL−ONC1)の中に挿入する。この方法において、異種タンパク質をコードする遺伝子は、LIVPクローン単離物中の特定の遺伝子座を標的とするシャトルプラスミド中にクローニングする。その後、遺伝子は、二重相互乗換えによってクローン単離物のゲノムの中に挿入する。
本実施例において、それぞれのLIVPウイルス1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1、またはGLV−1h68を、進行がんを有する患者に対して静脈注射として投与する。ウイルスはそれぞれ、28日間のサイクルにわたり、8(8)つの投薬計画またはコホートを使用して投与し、毒性効果および応答を決定し、コホートの間で比較する。それぞれのコホートに3人の患者がいる。
1. 転写分析およびデータ処理のための方法
メラノーマ細胞株888−MELおよび1936−MEL(Sabatino et al. (2008) Cancer Res., 68:122−131およびMonsurro et al. (2010) J. Transl. Med., 8:10において記載されるように誘導した時間的に別個の皮膚転移由来のよく知られているメラノーマ細胞株;例えばRobbins et al. (2002) J. Immunol., 169:6036−47;およびWang et al. (2006) J. Invest. Dermatol., 126:1372−7もまた参照されたい)を、0.01の感染多重度(MOI)でワクシニア単離物GLV−1h68、LIVP 1.1.1、LIVP 5.1.1、またはLIVP 6.1.1により感染させた。ネガティブ対照として、細胞株はまた、ウイルスなしの感染培地によっても処理した。感染の後に、細胞は、収集まで、示す時間、37℃で細胞培養培地中でインキュベートした。細胞は、感染の2、6、10、24、および48時間後に(hpi)収集した。ウイルス力価は、複製効率を決定するためにCV−1細胞単層上で標準的なプラークアッセイによって決定した。全RNAを、標準的な手順を使用して単離し、増幅し、精製し、標識した。
a. ヒト遺伝子転写の変化
様々な時点で採取した非感染試料は、標準的な統計(ANOVA)を適用した後でさえ、培養の時間(細胞培養の作用)に従って感染試料と一緒に分離した。STDEV包含/除外基準を使用して、ワクシニアウイルス感染によって特異的に影響を及ぼされた遺伝子のリストを得た(表67および68を参照されたい)。詳細には、設計した連続的な統計アプローチから、507および480の遺伝子が、それぞれ、888および1936株においてウイルスによって影響を及ぼされた。90%フィルターの適用後、888−MEL細胞株において変化した400の遺伝子が同定され、1936−MEL細胞株において変化した370の遺伝子が同定され、全体で、ウイルス感染により特異的に変化した703のヒト遺伝子が同定された。ウイルスにより影響を及ぼされた遺伝子は、細胞死、細胞の成長および増殖、タンパク質合成およびフォールディング、ならびにDNA複製、組換え、および修復などのような広範囲の細胞の機能に関与した。
3つのアレイクラスターを分析した(対照、2hpi;初期遺伝子、および10hpi;後期遺伝子)。さらに、4つの主な遺伝子クラスターもまた、分析した(C1、C2、C3a/3b、およびC4)。アレイクラスターは、時点および感染が、対照、2hpi、および10hpiの間の分離に基づいて示されるように、遺伝子発現パターンに最も影響を及ぼすことを示した。遺伝子クラスターは、特異的なパターンを示し、それによって、VACV侵入および伝播、VACV構造およびアセンブリー、VACV DNA複製およびRNA転写、宿主相互作用および免疫調整、ならびに他の/未知の機能などのような、様々な一時的な発現クラスおよび機能カテゴリーを反映した。結果は、初期/後期遺伝子の2および10時間のhpiで同様の低度の発現があり、遺伝子が、すべてのカテゴリーの全体にわたって散在したことを示した。構造およびアセンブリークラスにおいて豊富な遺伝子と共に、後期遺伝子について10hpiで発現が増加した。初期およびDNA複製/RNA転写クラスにおいて豊富な初期/後期遺伝子について10hpiで発現が減少した。DNA複製/RNA転写および宿主相互作用/免疫修飾因子において豊富であった初期および初期/後期遺伝子について2および10hpiで同様の高度な発現もまたあった。したがって、結果は、感染後のある期間にわたるワクシニアウイルス遺伝子転写の変化が、ワクシニアウイルス侵入および伝播、構造およびアセンブリー、DNA複製/RNA転写、宿主相互作用/免疫調整に関与する遺伝子に関係することを示した。機能が未知の他の遺伝子もまた、転写の変化に関連した。
複製効率は、0〜10hpiの時点で得たウイルス力価についての成長曲線から決定した。力価は、106細胞当たりのプラーク形成単位とした。試験したすべてのウイルスについて、複製効率は、最初、2hpiで減少したが、10hpiで時間依存性の様式で着実に増加した。GLV−1h68は、最も低い複製効率を示した。LIVP 1.1.1、LIVP 5.1.1、およびLIVP 6.1.1は、同様の複製効率を示したが、LIVP 6.1.1は、最も高度な力価を示した。LIVP 5.1.1およびLIVP 1.1.1は、同等の複製効率を示した。
結果は、ウイルス複製、初期遺伝子発現、およびそれぞれの宿主応答の間の直接的な相関を示す。
細胞株STSA−1は、左の前肢上に、固く、痛みを伴う、紅斑性の腫瘤の症状を示した7歳のオスの去勢したゴールデンレトリーバー犬の腫瘍から誘導した。腫瘤は、深い指の屈筋および屈筋手根筋肉に腫瘍が広範囲に浸潤していたので、それらの切除により外科的に減量した。対象は、全過程の放射線療法を受けた。3カ月で、再確認検査、胸部の放射線写真、および腹部の超音波は、転移の形跡を示さなかったが、左前肢の放射線写真は、遠位尺骨、尾状遠位橈骨、および手根骨の重症の溶解を明らかにした。肥大した左肩甲骨前リンパ節の細針穿刺液を、細胞診によって転移性間葉系新形成と診断した。この時に、肢を切断し、肥大したリンパ節を摘出した。肢および腋窩および肩甲骨前リンパ節のホルマリン固定試料に対する組織学的検査により、病変が、血管侵入、骨髄腔の中への腫瘍細胞の浸潤、および流入領域リンパ節への転移を有する中等度の分類の軟部組織肉腫と一致していたことを確認した。
1. イヌがん細胞株のパネルに対するインビトロにおけるLIVP 1.1.1、LIVP 5.1.1、およびLIVP 6.1.1の治療効果
24ウェルプレートにおいて成長させた様々なイヌがん細胞株を、表70において記載されるように、0.1または1.0の感染多重度(MOI)で、ワクシニアウイルスGLV−1h68、GLV−1h109、GLV−1h163、LIVP 1.1.1、LIVP 5.1.1、および/またはLIVP 6.1.1のうちの1つにより別々に感染させた。試験したイヌがん細胞株は、STSA−1(Example 14において記載される)、DT08/40(Dr. Nolte、Small Animal Clinic、University of Veterinary Medicine Hannover、Germanyにより提供された)、D17(ATCC# CCL−183)、またはCHAS(Dr. Greg Ogilvie、Angel Care Center、Carlsbad、CAにより提供された)であった。細胞は、20分毎の緩やかな撹拌と共に1時間37℃でインキュベートした。その後、感染培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の1、6、24、48、72、および96時間後に収集し、ウイルス複製および細胞傷害性を含む、治療効果に関連する様々なパラメータを、評価した。
収集した細胞溶解物3回の凍結融解サイクルの後に、溶解物の段階希釈溶液を、上記に記載されるように、CV−1細胞に対する標準的なプラークアッセイによって力価を測定した。試料はすべて、三通り測定した。結果は、効率的なウイルス複製が、すべての細胞株において、すべての試験したウイルス株によって観察されたことを示した。一般的に、48時間または72時間にわたり100倍を超える力価の増加があった。
細胞傷害性は、MTTアッセイ(Sigman、Taufkirchen、Germany)を使用して、感染細胞の生存度を測定することによって評価した。細胞の感染の24、48、72、または96時間後に、培地は、フェノールレッドなしのRPMI 1640中に溶解した、2.5mg/ml MTTの濃度の0.5ml MTT溶液と交換し、5%CO2大気中、37℃で2時間インキュベートした。MTT溶液の除去の後に、発色反応は、イソプロパノール中に希釈した1N HClを追加することによって停止させた。その後、光学濃度は、570nmの波長で測定した。非感染細胞は基準として使用し、100%生存可能であると見なした。結果は、表71に示し、感染の72時間後(hpi;96hpiで評価したDT08/40に対するLIVP 6.1.1の細胞傷害性の活性を除く)に死滅した細胞のパーセントを記載する。
軟部組織肉腫異種移植片モデル(STSA−1)、イヌメラノーマ異種移植片モデル(CHAS)、イヌ骨肉腫異種移植片モデル(D17)、およびイヌ前立腺癌異種移植片成長モデル(DT08/40)を、インビボにおけるウイルス株の効果を試験するために生成した。
軟部組織肉腫腫瘍皮下異種移植片の進行に対するGLV−1h68、GLV−1h109、LIVP 1.1.1、LIVP 5.1.1、およびLIVP 6.1.1の治療効果は、8週間(ウイルス感染後42日間)、週に二度、ウイルスにより処理した腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、6〜8週齢メスヌードマウス(NCI/Hsd/Athymic Nude−Foxn1nu)の右後肢に1×106STSA−1のイヌの軟部組織肉腫細胞を皮下に移植することによって生成した。移植の4週間後に、マウスはすべて、約400〜500mm3の体積を有する腫瘍を発達させた。
28日目に、GLV−1h68、LIVP 1.1.1、またはLIVP 5.1.1の単一用量(1×107pfu)を、外側尾静脈に静脈注射した(i.v.)。対照動物は、PBSのみをi.v.注射した(n=6/グループ)。腫瘍体積は、週に二度、測定した。過度の腫瘍量(>3000mm3)により、対照グループの動物はすべて、ウイルス感染の21日目に殺された。結果は、GLV−1h68、LIVP 1.1.1、またはLIVP 5.1.1の全身投与が、対照マウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害につながったことを示す。LIVP 5.1.1およびGLV−1h68の両方が対照動物と比較して腫瘍成長を遅らせたが、これらの処理グループのそれぞれの6匹のマウスのうちの2匹は、ウイルスの感染の35日後までに3000mm3を超える体積を有する腫瘍を発達させた。これらのデータは、LIVP 1.1.1が、イヌ軟部組織肉腫異種移植片に対して、GLV−1h68またはLIVPの5.1.1よりも高度な腫瘍崩壊の可能性を有したことを示す。
GLV−1h109およびLIVP 6.1.1の治療効果は、上述されるものと同じモデルにおいて評価した。この場合、ウイルスの注射前の平均出発腫瘍体積は、腫瘍発達の後期段階に相当する、マウスがすべて、600〜1000mm3の用量を有する腫瘍を発達させた移植後5週間後であった。動物は、4つのグループ(n=6/グループ)に分離し、単一用量のGLV−1h68(1×107pfu)、LIVP 6.1.1(1×107pfu)、LIVP 6.1.1(5×106pfu)、またはPBSを外側尾静脈に静脈注射した。腫瘍体積は、週に二度、測定した。過度の腫瘍量(>3000mm3)により、対照PBSのグループの動物はすべて、感染の14日後に安楽死させた。対照動物と比較した、腫瘍成長の阻害は、すべての試験した時点で、すべてのウイルスにより処理したグループについて一般的に同じであり、対照と比較して、腫瘍成長における有意差をもたらした。例えば、感染の21、28、および35日後に、すべての、ウイルスにより処理したグループについての腫瘍体積は、約500mm3から約1000mm3の間であり、対照動物と比較して、腫瘍量において実質的な低下を証明した。結果は、1×107pfuまたは5×106pfu LIVP 6.1.1により処理した動物の間で同様であった。
イヌメラノーマ腫瘍異種移植片の進行に対するGLV−1h163およびLIVP 6.1.1の治療効果は、8週間を超える間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、オスヌードマウス(Hsd/Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、IN)の右外側大腿に対して5×106CHAS細胞を皮下注射することによって生成した。移植の3間後に、マウスはすべて、約400〜500mm3の体積を有する腫瘍を発達させた。移植の3週間後に、グループのマウス(n=5〜6)に、2×106pfuのLIVP 6.1.1またはGLV−1h163またはPBSを後眼窩注射した。腫瘍体積は、毎週1回測定した。結果は、LIVP 6.1.1ではなくGLV−1h163が、感染の42日後に、腫瘍成長における有意な遅延をもたらしたことを示す。感染の42日後に、GLV−1h63により処理したマウスの腫瘍体積は、約2000mm3であったが、対照マウスまたはLIVP 6.1.1により処理したマウスの腫瘍体積は、約4000mm3であった。対照およびLIVP 6.1.1により処理したグループ由来のマウスは、42日目に安楽死させた。
イヌ骨肉腫異種移植片の進行に対するGLV−1h163およびLIVP 6.1.1の治療効果は、8週間を超える間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、オスヌードマウス(Hsd/Athymic Nude−Foxn1nu;Harlan、Indianapolis、IN)の右外側大腿に対して5×106 D17細胞を皮下注射することによって生成した。移植の44日後に、グループのマウス(n=5〜6)に、2×106pfuのLIVP 6.1.1またはGLV−1h163ウイルスを後眼窩注射した。対照グループのマウスにPBSを投与した。結果は、LIVP 6.1.1およびGLV−1h163の両方による処理が、骨肉腫成長を遅延させ、感染の21日後から始まったことを示す。例えば28〜42日目に(28、35、および42日目に測定)、LIVP 6.1.1またはGLV−1h163により処理した動物の腫瘍体積は、約1200mm3〜2500mm3の範囲であったのに対して、対照動物は、これらの時点で、腫瘍成長において安定した増加を示し、腫瘍体積は、それぞれ、約2800mm3、3800mm3、および7800mm3であった。
イヌ前立腺腫瘍異種移植片の進行に対するGLV−1h109およびLIVP 6.1.1の治療効果は、7週間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、6〜8週齢ヌードマウス(NCI/Hsd/Athymic Nude−Foxn1nu、Harlan Winkelmann GmbH、Borchen、Germany)の右後肢に5×106 DT08/40細胞を皮下に移植することによって生成した。腫瘍細胞移植の49日後に、グループのマウス(n=7/グループ)に、5×106pfuのLIVP 6.1.1またはGLV−1h109ウイルスを外側尾静脈に静脈注射(i.v.)した。対照グループのマウスにPBSを投与した。結果は、LIVP 6.1.1またはGLV−1h109ワクシニアウイルスによる単一の注射が、感染の14日後から始まる対照PBS動物と比較して、腫瘍成長の有意な阻害につながり、2つのウイルスにより処理した動物グループの間で同様であったことを示す。例えば、21〜49日目に(21、28、35、42、および49日目に測定)、ウイルスにより処理した動物グループの腫瘍体積は、一般的に、約250mm3〜300mm3であった。これらの時点の間の動物の対照グループについて、腫瘍成長は、着実に増加し、腫瘍体積は、それぞれ、約380mm3、440mm3、480mm3、580mm3、および750mm3であった。
Claims (22)
- ゲノムが配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含むクローン株以外の単離されたLIVPクローン株であって、
クローン株が非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有するように改変されず;
クローン株が配列番号10に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み;かつ
クローン株がGLV−1h68と比較してより高い抗腫瘍形成性および/または低下した毒性を有し、ここでGLV−1h68は配列番号9に記載のヌクレオチド配列を有する、
単離されたLIVPクローン株。 - 配列番号10に記載のヌクレオチド配列と少なくとも97%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むが、配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含まない、請求項1に記載の単離されたLIVPクローン株。
- a)配列番号1のヌクレオチド2256〜181,114、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870;または
b)配列番号1のヌクレオチド2256〜181,114、配列番号2のヌクレオチド11,243〜182,721、配列番号4のヌクレオチド6,264〜181,390、配列番号5のヌクレオチド7,044〜181,820、配列番号6のヌクレオチド6,674〜181,409、配列番号7のヌクレオチド6,716〜181,367もしくは配列番号8のヌクレオチド6,899〜181,870の配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の単離されたクローン株。 - 配列番号1、2、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列、または配列番号1、2、4、5、6、7もしくは8に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1から3のいずれかに記載の単離されたクローン株。
- 請求項1から4のいずれかに記載のクローン株を含む、細胞培養物または単離された細胞。
- 請求項1から4のいずれかに記載のLIVPクローン株のゲノム;および
前記ゲノムにおいて異種遺伝子産物をコードする核酸
を含む、組換えLIVPウイルス株。 - 異種遺伝子産物が治療剤または診断剤である、請求項6に記載の組換えLIVPウイルス株。
- 異種遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変する、あるいは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、PET画像化のための遺伝子ならびにMRI画像化のための遺伝子から選択される、請求項6または7に記載の組換えLIVPウイルス株。
- 異種遺伝子産物が、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスRNA、プロドラッグ変換酵素、siRNA、マイクロRNA、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子から選択される治療剤である、請求項6から8のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株。
- 異種遺伝子産物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−24(IL−24)、インターフェロンγ誘導性タンパク質10(IP−10)、Tリンパ球上で発現される受容体であるHVEMについてHSV糖タンパク質Dと競合するリンホトキシン誘導性発現物(LIGHT)、p60スーパー抗原、OspF、OspG、シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT1α)、STAT1β、プラスミノゲンk5ドメイン(hK5)、色素上皮分化因子(PEDF)、一本鎖抗VEGF抗体、一本鎖抗DLL4抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、NM23、カドヘリン1(ECADまたはcdh1)、リラキシン1(RLN1)、マトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)、エリスロポエチン(EPO)、マイクロRNA126(miR−126)、マイクロRNA181、マイクロRNA335、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)、E3ユビキチンタンパク質リガーゼ1(HACE1)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(nppa1)、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、CDC6、および骨形成タンパク質4(BMP4)から選択される治療剤である、請求項6から9のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株。
- 薬学的に許容される担体において請求項1から4のいずれかに記載の単離されたクローン株または請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株を含む、医薬組成物。
- 請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株を含む、単離された宿主細胞または細胞培養物。
- 対象における腫瘍または転移の検出において使用するための組成物であって、
組成物が請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株を含み;かつ
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、組成物。 - 対象における腫瘍または転移を検出するための医薬組成物の調製における使用のための請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株の使用であって、ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用。
- 宿主におけるウイルス複製の検出において使用するための組成物であって、
組成物が請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株を含み;かつ
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、組成物。 - 宿主におけるウイルス複製を検出するための医薬組成物の調製における使用のための請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株の使用であって、
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用。 - 請求項1から4のいずれかに記載の単離されたクローン株または請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株を含む、対象における増殖性疾患を処置するための使用のための組成物。
- 対象における増殖性障害の処置のための医薬組成物の調製のための、請求項1から4のいずれかに記載の単離されたクローン株または請求項6から10のいずれかに記載の組換えLIVPウイルス株の使用。
- 増殖性障害ががんである、請求項17に記載の組成物または請求項18に記載の使用。
- がんが乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、請求項19に記載の組成物または使用。
- がんが固形腫瘍がんまたは転移がんである、請求項19または20に記載の組成物または使用。
- 腫瘍または転移が乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である、請求項21に記載の組成物または使用。
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